Immunoassay

Pemeriksaan Penunjang Imunologi

Putu Oky Ari T.

1. Definisi Immunoassay 2. Prinsip Immunoassay 3. Titer 4. Antiserum 5. Komponen Penting Dalam Immunoassay 6. Kategori Immunoassay 7. Macam Immunoassay 8. Imunohistokimia

1. Definisi Immunoassay
Immuno respon imun yang mengendalikan tubuh untuk memproduksi Ab assay test atau uji Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untuk mengukur konsentrasi suatu substansi pada cairan (spesimen bilogikal) menggunakan reaksi antibodi terhadap antigen spesifiknya Immunoassay dapat menggunakan satu atau lebih Ab untuk mendeteksi analyte yang diinginkan Analyte sesuatu yg diukur dengan tes laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum

2. Prinsip Immunoassay (Immunological testing)

Diagnosa suatu penyakit ikatan spesifik Ab-Ag membentuk kompleks Ag-Ab (Imun) Serology : menggunakan serum dari Antibodi utk mendeteksi dan mengukur Antigen, atau sebaliknya Immunoassay: test atau uji yang memanfaatkan reaksi antara Ag dengan Ab Pada immunoassays baik Ab monoklonal ataupun polikonal mendeteksi Ag kompleks Imun (Ag-Ab) tsb dapat diukur secara kualitatif atau kuantitatif

 Pengumpulan sampel yang diuji dapat berasal dari : Antigen sample Cairan tubuh yang mengandung mikroba penginfeksi dan toksin mikroba Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, mucous, etc. Blood antiserum sample Antisrum/ antisera darah mengandung Ab yang dibentuk host terhadap infeksi tertentu jika pasien terinfeksi oleh patogen yang dicurigai maka pada serumnya akan mengandung Ab terhadap patogen tsb.

3. Titer
Titer : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana suatu penyakit mengalami peningkatan pada infeksinya Tes Aglutinasi Direct dapat digunakan untuk mendeteksi titer Ab pada seseorang Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab sama sekali lalu Ab meningkat seroconversion.

4. Antiserum (antisera)
Ketika suatu Ag tertentu (Ag X) diinjeksikan ke hewan coba darah dikoleksi serum diisolasi dari darah mengandung banyak Ab spesifik Ag X Antiserum Penggunaan antiserum cukup efektif terhadap patogen yg mampu menginvasi sistem imun

5. Komponen Penting Dalam Immunoassay

1. 2. 3. 4. Spesifisitas Antibodi Valensi Antibodi Aviditas Antibodi Ukuran Kuantitas Antibodi

Spesifisitas Antibodi
Ikatan Ag-Ab spesifik key-lock Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip terjadi jika kemurnian Ag rendah Ab yang sangat spesifik : yang memiliki bimding site yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul yang unik Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi : 1. Spesifisitas Ab 2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg mengkontaminasi)

Valensi Antibodi
Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yg spesifik Valensi Ab minimal 2 umumnya

Aviditas Antibodi
Besarnya kemampuan Ab untuk mengikat Ag Ab dg Aviditas besar kecenderungan mengikat Ag yang banyak Aviditas refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site (valensi)

Ukuran Kuantitas Antibodi

Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan tertentu dalam serum harus dapat diukur dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu Beberapa cara penentuan kadar Ab : 1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu bahan/ Ab dalam serum (uji + atau -) cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahan warna pada penentuan Hbs Ag secara ELISA

2. Semikuantitatif : kadar Ab atau bahan lain pada serum dengan cara pengenceran serum secara progresif Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer Cth : uji Widal 3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD) didapat nilai korelasi

6. Kategori Immunoassay
Competitive Noncompetitive Homogeneous Heterogeneous

Competitive Format
Analyte (umumnya Ag) pada sampel yg diuji diukur kemampuannya untuk berkompetisi dengan Ag yg dilabel pd immunoassay Ag yg tidak berlabel memblok Ag berlabel utk berikatan dengan Ab Pada kompetitif Immunoassay, lebih sedikit label yang terukur ditemukan lebih banyak Ag tidak terlabel (sampel tes). Jumlah Ag pada sampel tes berhubungan terbalik dg jumlah label yg terukur

Noncompetitive (Sandwich) Method

Noncompetitive assay secara umum menunjukkan level tertinggi dlm tingkat sensitivtas dan spesifisitas appicable pada pengukuran marker cardiac dan hepatitis Format ini mengacu pada uji sandwich analyte berikatan antara 2 reagen Ab yg spesifik juga dapat menggunakan metode one or two step uji two step menggunakan pencucian dimana sandwich mengikat kompleks yang diisolasi dan dicuci utk menghilangkan reagen terlabel yg tidak berikatan atau substansi pengangu lainnya two step noncompetitive biasanya memberikan hasil dengan spesifisitas dan sensitivitas yg

7. Macam Immunoassay
A. Immunoassay tak berlabel : 1. Uji Presipitasi 2. Uji Aglutinasi 3. Uji Hemaglutinasi 4. Lisis Imun 5. Uji Netralisasi

B. 1. 2. 3. 4.

Immunoassay berlabel : Berlabel Flouresens Berlabel Radioisotop Luminescent Assay (LIA) Berlabel Enzim

Immunoasay tak berlabel

1. Uji presipitasi Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai : 1. Uji presipitasi lempeng/ slide cth : uji VDRL mikro 2. Uji presipitasi tabung 3. Uji presipitasi tabung kapiler cth : uji CRP 4. Uji presipitasi cincin terbentuj cincin presipitasi (uji +) 5. Imunoelektroforesis prinsip sama dengan elektroforesis

2. Uji Agutinasi
Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel Macam-macam uji Aglutinasi : 1. Uji Aglutinasi lempeng cth : uji Widal Lempeng deteksi Ab thd S. Paratyphi 2. Uji Aglutinasi tabung - Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat 3. Uji Hambatan Aglutinasi utk menentukan Ag larut yg tdk diketahui identitasnya cth : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuan HBs Ag

3. Uji Hemaglutinasi
Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah Ab diletakkan pada well pada konsentrasi yg tepat ditambahkan sel darah merah amati presipitasi yg terjadi antara Ag dan Ab Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes agutinasi Cth : uji penentuan golongan darah Jika darah memiliki Ag bergolongan A aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

Anti-B

Anti-A Sample1 Sample 2 Sample 3 Sample 4

Which blood group?

A B O AB

4. Lisis imun dan Fiksasi Komponen

Aglutinasi tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel Aglutinasi baru terjadi jika ditambahkan antiimunoglobulin/ Ab thd Abx Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen lisis pada dinding sel Macam uji lisis imun : 1. Uji Fiksasi Komplemen cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit 2. Uji Hambatan Fiksasi Kompelemen

5. Uji Netralisasi
Jarang digunakan mahal dan sukar Prinsip dasar : Berbagai pengenceran serum dicampur dg sejumlah tertentu toksin dan suspensi mikrobacampuran tsb dibiarkan bereaksi uji reaktivitas toksin dan viabilitas mikroba Antiktoksin + toksin netralisasi toksin

 Macam uji Netralisasi : 1. Netralisasi toksin 2. Netralisasi virus : a. Uji in vivo b. uji in Ono c. Uji Pembenihan Jaringan d. Plague Reduction Test e. uji Hambatan Metabolik Uji Netralisasi menggunakan hewan coba-- > experimental Researsch

Immunoassay berlabel
1. Berlabel flourescent Uji immunoflourescent (IFA) ikatan/ kompleks Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaran flouresen dibawah mikroskop Immunoflourecent : 1. Direct immunoflourescent : Ab dilabel dg marker flourescent Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan 2. In-direct immunoflourescent Menggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama) Semakin banyak ikatan Ab sekunder sinyal floresen semakin menngkat

Direct Immunoflourescent
Fluorescent marker antibody

antigen

Frozen tissue section

Indirect immunofluorescece
2nd antibody with label

antigen

1st antibody

Immunofluorescence microscopy of kidney glomeruli

2. Berlabel radioisotop uji laboratoris yg sensitif utk penentuan kadar beberapa bahan (hormon) Diperlukan sampel dg bahan yg sedikit sudah dpt terdeteksi Cth : Uji RIA (Radioimmunoassay) Radioisotop yg dipakai pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I Semakin sedikit Ag pada sampel semakin sedikit Radioaktif yang ada di presipitat

3. Berlabel luminescent uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dg RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksi Ag-Ab menggunakan luminescent luminescent : a. bioluminescent : kunang2 b. chemiluninescent 4. Berlabel enzim pemberian label enzim pada Ag (ELISA) Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk reaksi berwarna (chromogen) intensitas warna menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase

ELISA

First antibody attached to solid support

Add sample containing antigen Incubate Wash to remove unbound molecules

Add second antibody with attached enzyme

Wash to remove unbound second antibody Incubate with enzyme substrate colourless

E
coloured

8. Imunohistokimia
Immunohistochemistry (IHC) mengkombinasikan teknik histologi, imunologi dan biokimia identifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksi spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label Ab mengikat Ag secara spesifik Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada jaringan/ organ di preparat/ slide Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2 selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis

 The demonstration of a tissue or cellular constituen by detecting spesific antibodyantigen interactions where antibody has been tagged with a visible label/marker

Ranging from fresh frozen cell and sections to heavily fixed paraffinor resin-embeded whole tissue sample

- fluorescent dye -hapten - radioactive marker - enzyme

Pemberian Label Immunolabeling

1. Direct Method
Ab Primer

2. Indirect Method

P = peroxidase AP = alkaline phosphatase = secondary antibody = link antibody

ABC Method

P = peroxidase B = biotin A = avidin

Visualized antigen-antibody reaction by adding SUBSTRATE & CHROMOGENS

Deteksi apoptosis sel

Pustaka
Baratawijaya Handojo, I., 2003, Pengantar Imunoasai Dasar, Airlangga University Press, Surabaya