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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN DE AREQUIPA.

FACULTAD DE INGENIERIA DE PROCESOS ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO: BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS DOCENTE: ING. SONIA JACKELINE ZANABRIA GALVEZ TEMA: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGIA EN LA ELABORACION DE VINO PRESENTADO POR: ARIAS VIZCARRA RUTH CHIPA HUAMANI ANA MARIA CUBA VILCA ANA MARIA LOVON CASTILLO YOVANA QUISPE CERPA GARMEN PILAR

2013 AREQUIPA

Universidad Nacional de San Agustn de Arequipa Escuela Profesional de Ingeniera de Industrias Alimentarias Curso de Biotecnologa de los Alimentos Docente: Ing. Mg. Sc. Sonia J. Zanabria Glvez

APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA PRODUCCIN DE LICORES USO DE LA LEVADURA SACHAROMICES CEREVICIAE EN LA PRODUCCIN DE VINO

Universidad Nacional de San Agustn de Arequipa Escuela Profesional de Ingeniera de Industrias Alimentarias Curso de Biotecnologa de los Alimentos Docente: Ing. Mg. Sc. Sonia J. Zanabria Glvez

I.

INTRODUCCIN
La produccin de bebidas alcohlicas es, un proceso que se remonta a las civilizaciones ms antiguas. Aun as, el mecanismo en que se basan estos procesos se descubri mucho ms tarde. Hoy se sabe que en estos procesos intervienen microorganismos que transforman componentes del jugo de frutas o de cereales en alcohol, en el proceso de fermentacin. Desde entonces, el hombre pudo intervenir y obtener una variedad ms amplia de productos. La mayora de los jugos de frutas son fermentados por levaduras salvajes presentes naturalmente en las frutas, muchas de ellas pertenecientes a la especie Saccharomoyces cerevisiae. A partir de esas fermentaciones naturales, se han ido seleccionando levaduras para llevar a cabo procesos ms controlados, y actualmente la produccin del vino y otras bebidas alcohlicas es una industria extensa en todo el mundo. Las bebidas alcohlicas ms importantes son: el vino, producto de la fermentacin de jugos frutales, la cerveza, producto de la fermentacin de granos malteados, y las bebidas destiladas, productos de la concentracin por destilacin del alcohol obtenido de una fermentacin. La fermentacin del mosto es un proceso bioqumico muy complejo, en el que intervienen e interaccionan levaduras, mohos y bacterias, siendo las primeras los microorganismos clave en la vinificacin, ya que son los responsables de la fermentacin alcohlica, la principal reaccin en la conversin del mosto en vino. Tanto las levaduras como las bacterias pueden ejercer una accin beneficiosa o ir en detrimento de la calidad de los vinos. En una uva sana y madura prensada aspticamente la poblacin microbiana total en el mosto puede variar entre 103 y 105 UFC/ mL(Walker, 1999). La transformacin del mosto en vino es un proceso espontneo llevado a cabo por las levaduras, principalmente de la especie Saccharomyces cerevisiae. El origen de stas constituye un tema controvertido, tradicionalmente se asuma que todas las especies involucradas en la fermentacin vnica provenan de la superficie de la uva. Algunos estudios posteriores evidencian que slo especies de Saccharomyces estn presentes en la superficie de la fruta, mientras que S. cerevisiae proviene fundamentalmente del entorno de las bodegas (Torijaet al., 2002).

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II.

OBJETIVOS
Objetivo General Estudiar el comportamiento de la levadura saccharomyces cerevisiae durante la etapa de fermentacin en la elaboracin de vino Objetivos Especficos Describir el mtodo de la utilizacin de la levadura S. Cerevisiae en la etapa de fermentacin en la obtencin del vino.

III.

DEFINICIONES GENERALES
Saccahromyces cerevisiae. Es la especie de levaduras utilizada por excelencia para la obtencin de etanol a nivel industrial puesto que es un microorganismo de fcil manipulacin y recuperacin, no es exigente en cuanto a su cultivo, no presenta alto costo , tolera altas concentraciones de etanol , en la fermentacin produce bajos niveles de subproductos, es osmotolerante, capaz de utilizar altas concentraciones de azcares, presenta alta viabilidad celular para el reciclado y caractersticas de floculacin y sedimentacin para el procesamiento posterior (Fajardo y Sarmiento, 2007). Requerimientos nutricionales: Saccharomyces cerevisiae requiere ciertos nutrientes y condiciones ambientales para su apropiado crecimiento y reproduccin. Algunos elementos son bsicamente necesarios como por ejemplo carbono, hidrogeno, oxigeno, nitrgeno y fsforo. El carbono sirve como fuente de energa y como material constitutivo de la masa celular. El nitrgeno se encuentra en la clula formando parte esencial de las protenas, aminocidos y cidos nucleicos; el fsforo se encuentra en los cidos nucleicos en la lecitina y en diversos compuestos fosforilados que participan activamente en los procesos de degradacin oxidativa y de intercambio energtico (ATP, ADP, AMP, NADP). Para que las fuentes de nitrgeno, fsforo y carbono presentes en el sustrato sean aprovechados por la levadura se requiere que se encuentren en forma asimilable (Fajardo y Sarmiento, 2007).

Requerimientos fisicoqumicos.

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El crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se ve favorecido por un pH aproximado de 4.0 a 5.0 y no se desarrollan bien en medio alcalino a menos que se hayan adaptado al mismo. A pesar de la tolerancia bastante amplia de esta para las variaciones de pH a partir de los sustratos habitualmente usados en los medios de cultivo forman productos en especial cidos que influyen en el crecimiento celular, produccin enzimtica y utilizacin de glucosa. As por ejemplo, algunas investigaciones han observado que con un pH inicial del medio a valores entre 4.0 y 4.5 se obtiene mejor crecimiento (Fajardo y Sarmiento 2007). SUSTRATO El nitrgeno en el mosto es utilizado por las levaduras para reproducirse (produccin de biomasa) durante la fermentacin alcohlica y asegurar un nmero de clulas suficientes para consumir todos los azcares del mosto. Por lo tanto, el contenido en nitrgeno condiciona la realizacin de la fermentacin alcohlica, tanto en su velocidad como en su culminacin. Adems, la mayora de las fuentes nitrogenadas del mosto (amonio y aminocidos) son a su vez precursores aromticos, determinando igualmente la calidad aromtica del vino. Puede estar presente en dos formas claramente diferenciadas: la inorgnica, bsicamente como amonio, y la orgnica formada por aminocidos, pptidos y protenas. El amonio suele ser altamente disponible para las levaduras, por lo que es una forma qumica que se suele utilizar de forma abundante en la industria enolgica. La presencia de nitrgeno en cualquiera de estas formas qumicas es fuertemente variable, dependiendo de diversos factores, entre ellos la variedad de uva, su grado de maduracin, caractersticas edafoclimticas y diversos aspectos tecnolgicos (tipo de vinificacin, prensado, etc.). Como parte de una estrategia adaptativa a la fermentacin del mosto, la levadura vnica Saccharomyces cerevisiae consume este nitrgeno asimilable con un orden de preferencia por las distintas fuentes de nitrgeno. S. cerevisiae ha desarrollado diferentes mecanismos moleculares que le permiten utilizar preferentemente aquellas fuentes que mantienen un mejor crecimiento. En el actual contexto de cambio climtico, la excesiva maduracin de la uva tiene dos consecuencias muy directas en la composicin del mosto: el aumento de los azcares a fermentar y la disminucin del contenido nitrogenado. Esto dificulta todava ms si cabe la tarea fermentativa de la levadura y hace muy

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necesario el conocimiento sobre las necesidades nitrogenadas de las diferentes levaduras vnicas utilizadas en la industria enolgica. BIOMASA Saccharomyces cerevisiae es una levadura cuya colonia es color crema o blanco, apariencia hmeda y brillante de bordes irregulares (Figura 6). La temperatura ptima de crecimiento es de 25 a 30 C. Puede producir ascosporas cuando hay requerimientos nutricionales adecuados (Fajardo y Sarmiento, 2007). (Manual de medios de cultivo. Merk 2000).

Figura 3: Crecimiento Celular En el grafico se representa la variacin de la biomasa o numero de clulas de un cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En ese cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa Fermentacin La fermentacin es la parte principal del proceso de la elaboracin del vino, en realidad el vino no puede elaborarse de forma alguna sin la fermentacin. La fermentacin tiene como principal efecto la conversin de los azcares del mosto en alcohol etlico. El organismo capaz de elaborar la fermentacin son las levaduras del gnero de las Saccharomyces y las especies ms abundantes son la S. cerevisiae y la S. bayanus (asociada con la produccin del vino de jerez), estas especies tienen a su vez otras sub-especies como la montrachet, la epernay, la steinberger, etc. cada una de ellas objeto de una seleccin artificial hecha

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durante tiempo con el objeto de mejorar aspectos sutiles de la tolerancia a ciertos niveles de pH, contenido de alcohol, dixido de azufre (SO2), etc. La fermentacin se hace en recipientes (hoy en da en cubas de acero inoxidable) y pasa por cuatro fases: 1. Fase de demora - En la que las levaduras se aclimatan a las condiciones del mosto, a las altas concentraciones de azcares, bajo valor de pH (acidez), temperatura y SO2. Suele ocupar un perodo entre dos y tres das. 2. Crecimiento exponencial - las levaduras ya acondicionadas al entorno, empiezan a multiplicarse en crecimiento exponencial, alcanzando el mximo de su densidad de poblacin, que suele estar en torno a los 100 millones de levaduras por centmetro cbico. Debido al consumo que hacen las levaduras del azcar presente en el mosto, las concentraciones del mismo declinan rpidamente. La duracin de esta fase es de aproximadamente cuatro das. 3. Fase estacionaria - Es la fase en la cual la poblacin de levaduras que ha llegado a su mximo valor admisible, lo que hace que se alcance un valor estacionario y que la fermentacin se mantenga a una velocidad constante. El calor formado por la fermentacin hace que la temperatura de la cuba durante esta fase sea igualmente constante. 4. Fase declinante - En esta fase la caresta de azcares o la elevada concentracin de alcohol etlico empieza a matar las levaduras y la poblacin disminuye, con ello la velocidad de fermentacin. BIOQUMICA DE LA FERMENTACIN La levadura metaboliza la glucosa y la fructosa, dando piruvato, por la ruta glicoltica. En primer lugar, para reciclar cofactor, el piruvato se descarboxila a acetaldehdo, el cual se reduce a etano. Una molcula de glucosa o fructosa da dos molculas de etanol y dixido de carbono. En una fermentacin normal, comenzando de 10 a 24 % de azcar (22 a 24 Brix); el 95% de azcar se convierte en etanol y dixido de carbono, el 1% en material celular y el resto ,4% da lugar a otros productos.(flanzy,2000). La fermentacin respecto a productos finales formados, es deficiente, porque una gran cantidad de energa se pierde en calor. En general ha; hay un aumento de 1.3 C de temperatura por cada Brix consumido, por litro, si el calor no se elimina por difusin o enfriamiento. Aproximadamente el 50% del azcar en una fermentacin vnica normal se consume por las clulas durante la fase estacionaria, aunque este porcentaje variara dependiendo del tamao del inoculo, la temperatura de fermentacin y

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la disponibilidad de nutrientes (tejada 2004), se puede observar en la figura numero 5 la bioqumica de la reaccin. Glucosa a. Ruta glicoltica La primera reaccin citoplasmtica es la fosforilacion de la glucosa a 6fosfato, catalizada por una de estas tres enzimas: hexoquinasa PI(A), hexoquinasa PII (B) es donador de fosfato, en esta reaccin. Estas tres enzimas tambin catalizan la fosforilacion de manosa, pero solo las hexoquinasas catalizan la fosforilacion de glucosa. La hexoquinasa PII es la principal, y est presente inicialmente en las fermentaciones de mosto de uva; la hexoquinasa PI aparece cuando el proceso llega a la fase estacionaria de crecimiento y de fermentacin. El paso siguiente es conversin de glucosa 6- fosfato a fructosa 6-fosfato sufre una segunda fosforilacion a fructosa-1, 6-difosfato, catalizada por la enzima fosfofructoquinasa. El donador de fosfato es el ATP nuevamente: la siguiente enzima aldolasa, cataliza la hidrolisis de la fructosa -1,6-difosfato a fosfato de hidroxiacetona y gliceraldehido-3-fosfato, que se convierte en piruvato, y la enzima triosafosfatoisomerasa acta intercambiando el fosfato dihidroxiacetona y el gliceraldehido-3-fosfato. El gliceraldehido-3-fosfato se convierte en ,3-difosfogliceratopor la enzima gliceraldehido-3fosfatodeshidrogenasa. Los fosfatos inorgnicos son donantes e fosfato en esta reaccin. Ya que se trata de una oxidacin, es necesario el cofactor NAD , que se reduce a NADH. Los pasos siguientes de la glicolisis dan como resultado, formacin de un enlace de fosfato rico en energa, que se puede usar para sintetizar otra molcula de ATP. La fosfoglicericomutasa a partir de 3-fosfoglicerico. La piruvatoquinasa cataliza la produccin de ATP a partir de ADP y fosfoenolpiruvato, dando lugar a piruvato como producto final. El resultado neto es la produccin de dos molculas de ATP por cada molcula de glucosa o fructosa metabolizada. Sin embargo, se ha formado un cofactor reducido NADH, que ha de ser reciclado para que contine la fermentacin. (Tejada, 2004). Tipos de levadura en la fermentacin de vino Las levaduras que participan en la fermentacin del vino son de dos tipos: 1) las llamadas levaduras silvestres que se encuentran en las uvas cosechadas y que se transfieren al jugo 2) las levaduras de vino cultivadas, las cuales se adicionan al jugo para iniciar la fermentacin.

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Una diferencia importante entre las levaduras silvestres y las levaduras de vino cultivadas es su tolerancia al etanol. La mayor parte de las levaduras silvestres pueden tolerar solamente alrededor de un 4 % v/v de etanol; cuando la concentracin de alcohol llega a este punto, la fermentacin se detiene. La levadura de vino puede tolerar hasta un 12 % a 14 % de etanol antes de detener su desarrollo. En los vinos no fortificados, el contenido alcanzado de este alcohol est determinado parcialmente por la tolerancia de la levadura al mismo y en parte por la cantidad de azcar contenida en el jugo. Papel de las levaduras en la elaboracin del vino Responsables de la fermentacin alcohlica Alcohol + CO2 + otros Azc ar Formacin de metabolitos secundarios (>680 ) cidos: No-voltiles (tartrico, mlico, ctrico, lctico, succnico)Voltiles (actico, propinico, hexanoico) Alcoholes:Etanol, glicerolAlcoholes superiores (isoamil alcohol, 2-feniletanol) steres (notas afrutado) Compuestos carbonlicos (Acetaldehido, diacetilo) Fenoles (Brettanomyces)-sudor, establo Compuestos derivados del sulfuro (negativos)

Las levaduras que llevan a cabo la fermentacin determinan la composicin del vino y sus caractersticas organolpticas Sucesin de la poblacin de levaduras durante la fermentacin Anivelcuantitativo : Uva-mosto:102-105UFC/ml Faseinicial:106cl/ml Fasetumultuosa:108-109cl/ml Fasefinal:semantieneodesciende

A nivel cualitativo:

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Uva-mosto: distintas especies de levaduras ( Rhodotorula, Kloeckera/Hanseniasporasp., Candidasp, Pichiasp.) Fase inicial: ( Kloeckera/Hanseniaspora, Candidasp, Metschnikowiasp, Pichiasp) Aumento de la concentracin de etanol Fase tumultuosa: Saccharomyces cerevisiae Fase final: Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae en la produccin de vino Saccharomyces cerevisiaevar. bayanus, ideal para la produccin de vinos blancos y rosados pero, sobre todo, para las bases espumantes y para la refermentacin, bien sea con el mtodo clsico que en autoclave. Se distingue por una ptima tolerancia al alcohol y por su capacidad de fermentar a bajas temperaturas. Permite producir vinos muy elegantes exaltando la tipicidad varietal. Particularmente indicado para la reactivacin de la fermentacin. CONSIDERACIONES EN LA ELABORACION DEL VINO Durante la fermentacin, hay varios factores que los fabricantes de vino deben tener en cuenta. El ms notable es el de la temperatura interna del mosto. El propio proceso bioqumico de la fermentacin crea una gran cantidad de residuos de calor que puede sacar el mosto del rango de la temperatura ideal para el vino. Normalmente, el vino blanco se fermenta entre 18 y 20C aunque un fabricante de vino puede optar por utilizar una temperatura ms alta para llevar a cabo parte de la complejidad del vino. El vino tinto es usualmente fermentado a temperaturas ms altas de hasta 29C. La fermentacin a temperaturas ms altas puede tener efectos perjudiciales para el vino, aturdiendo la levadura y dejarla en inactividad e incluso "evaporizando" algunos de los sabores de los vinos. Algunos fabricantes de vino pueden fermentar el vino tinto a temperaturas ms frescas, tpico de los vinos blancos, con el fin de sacar a relucir ms sabores de la fruta. Para controlar el calor generado durante la fermentacin, el fabricante de vino tiene que elegir un recipiente de tamao adecuado o usar dispositivos de enfriamiento de distintos tipos, desde las antiguas tradiciones de Burdeos de colocar la cuba de fermentacin en la parte superior de los bloques de hielo hasta el moderno uso, en la actualidad, de los sofisticados tanques de fermentacin con anillos de enfriamiento integrados.

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Un factor de riesgo implicado en la fermentacin es el desarrollo de residuos qumicos y el deterioro que pueden ser corregidos con la adicin de dixido de azufre (SO 2), aunque el exceso del mismo puede conducir a defectos del vino. OPORTUNIDADES DE LA BIOTECNOLOGIA EN LA INDUSTRIA VITIVINCOLA Durante los ltimos 20 aos, como resultado de la difusin del nuevo paradigma tecnolgico, el proceso de vinificacin se han transformado, el enlogo necesita herramientas eficaces para conseguir los vinos que ha planificado. Los avances biotecnolgicos en enologa permiten resolver tres tipos de problemas tcnicos en el proceso de fermentacin (Combina, 2007): La seleccin de levaduras y bacterias lcticas: la levadura es la responsable de la mayor parte de la transformacin de azcar del mosto de la uva en etanol durante la primera fermentacin La seleccin de levaduras permite aumentar la calidad y consistencia del vino. Durante la elaboracin del vino, se realiza una segunda fermentacin a partir de bacterias lcticas. Por estos motivos las bodegas utilizan en forma creciente levaduras y bacterias comerciales. El mejoramiento del proceso de fermentacin a partir del desarrollo de enzimas La I+D en enzimas busca reducir los tiempos de produccin y lograr mejores caractersticas del producto final. Al acelerar los procesos de clarificacin durante la fermentacin y la maduracin, las enzimas aumentan la rentabilidad, y al mejorar las caractersticas de color y aroma durante la maceracin permiten lograr una diferenciacin de producto consistente en el tiempo. Desarrollo de bio-controladores para evitar la formacin de compuestos txicos y defectos en los vinos: Existen levaduras que pueden inhibir el desarrollo de ciertos microorganismos en el mosto del vino que generan defectos en el gusto del vino.

IV.

MATERIALES Y METODOS Materiales


Uva Refractmetro Azcar Ph Vasos precipitados Matraz Levadura Recipientes para el fermentado

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Metodologa
Recepcin: consiste en cuantificar la fruta que entrar a proceso. Esta operacin debe hacerse utilizando recipientes adecuados y balanzas calibradas y limpias. Lavado: se hace para eliminar bacterias superficiales, residuos de insecticidas y suciedad adherida a la fruta. Se debe utilizar agua clorada. Seleccin: se elimina la fruta que no tenga el grado de madurez adecuado o presente golpes o magulladuras. Estrujado de la pulpa : se hace por medio de un despulpador o una prensadora. Preparacin del mosto: el mosto obtenido 2% en relacin al mosto. El nutriente, que puede ser fosfato de amonio, se agrega en una proporcin de 1 gramo por litro aproximadamente. Fermentacin: en este paso se coloca en un recipiente , para evitar su oxidacin a vinagre. La mezcla se deja fermentar en valde , entre 3 y 7 das como mnimo, a una temperatura de 30C. La fermentacin se interrumpe cuando ya no hay produccin de gas. Trasiego: consiste en separar la parte superior del fermento, mediante succin. Durante el fermento existe una separacin de fases, quedando el vino en la parte superior y residuos de fruta o levadura en la parte inferior. Filtrado: se hace pasar la mezcla fermentada por una tela fina o colador, previamente esterilizado, para eliminar la levadura y la pulpa residuales. Estandarizado: es una etapa opcional que se hace agregando alcohol, en diferentes proporciones, segn la clase de vino que se requiera. Si es un vino generoso, el volumen de alcohol est entre el 15 y 25%, pero si es una bebida espirituosa el contenido es de 30 a 50%. Envasado: por lo general, se hace en botellas de vidrio. Los envases deben esterilizarse sumergindolos en agua caliente (95 C) durante 10 minutos. Sellado: el sellado puede hacerse manual o mecnicamente. Es frecuente que el tapn de la botella sea de corcho.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIONES

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CUADRO DE CONTROLES DE LA ETAPA DE FERMENTACION


FECHA 18/11/13 19/11/13 20/11/13 21/11/13 22/11/13 24/11/13 25/11/13 27/11/13 HORA 8:30am 2:00pm 8:00am 2:00pm 8:00am 2:00pm 8:30 am 8:40am BRIX 18 21 16 14 13 10 8.5 8.0 DENSIDAD 1.095 1.088 1.050 1.045 1.032 1.012 1.000 1.000 TEMPERATURA 20C 21C 20C 21C 20C 21C 19.5C 21C

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Se realizaron cinco muestras al azar para medir los slidos solubles de total del vino obteniendo un promedio de 12.76. Los valores recomendados de slidos solubles cubre un rango, que depende del pH, de la acidez total y de la evolucin del aroma en el mosto. En las ltimas etapas de maduracin de la uva, el contenido de azcares vara muy poco mientras que el contenido aromtico aumenta considerablemente.

VI. CONCLUSIONES En las fermentaciones con levadura S. cerevisiae indico una buena adaptacin en el mosto de la uva a las condiciones de fermentacin y a la variedad de la uva .