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Protocolo para el conteo

conteo total de Bacterias en
tejido de manto y hemolinfa de Octopus maya.

Honorio Cruz, Gabriel Lizama y Cristina Pascual.

Laboratorio Central 1 Bioquímica, Inmunología y Biología Molecular” UMDI, Fac.
Ciencias, UNAM.
Sisal, Yucatán.
Protocolo para el conteo total de Bacterias en tejido de manto y hemolinfa de Octopus maya.
2008
Introducción.
Introducción.

La piel de los pulpos está constituida por una delgada capa de células con
mucopolisacaridos, la cual sirve como medio de defensa ante algún agente
patógeno, esta suele presentar lesiones debido a la captura, el contacto con las
paredes de los estanques y la interacción con otros pulpos (Leibovitz et al., 1977;
Hanlon et al., 1984; Hulet et al., 1979; Feral, 1988).

La infección de muchas de estas lesiones está asociada a bacterias oportunistas que
pueden generar desde ulceras hasta la muerte de los organismos. (Hanlon et al. 1990)
reportan una serie de condiciones patológicas, experiencia de más de 10 años de
manejo de 14 especies de cefalópodos. La infección puede afectar diversas partes
del organismo y generalmente es causada por bacterias gram-negativo. La infección
puede genera ulceras epidérmicas que, poco a poco van aumentando y
destruyendo los nervios y musculatura en manto y brazos y una septicemia la que
puede llegar a provocar la muerte de los organismos en tan solo 72 hrs (Hanlon et al.,
1990).

También se ha reportado que Vibrio carchariae puede infectar los tejidos de los
corazones branquiales y la glándula digestiva, sin apenas aparecer úlceras epiteliales,
causando la muerte “repentina” de Octopus bimaculoides y O. maya en apenas 8
horas. Estudios previos han identificado a Vibrio lentus como una nueva especie
oportunista capaz de colonizar lesiones de la piel, branquias, corazones e inducir a la
mortalidad de pulpos silvestres de Octopus vulgaris (Farto R., 2003).
Protocolo para el conteo total de Bacterias en tejido de manto y hemolinfa de Octopus maya.
2008
Protocolo para el conteo
conteo total de Bacterias en tejido de manto y hemolinfa de Octopus
maya.

Material
Material:

• Cajas petri desechables o de cristal estériles.
• Agar Marino (AM).
• Tubos de ensaye con roscas (10 o 20 ml).
• Tubos Eppendoff 1.5 mL.
• Agua Marina estéril.
• Puntas estériles de 200 y 1000 µl.
• Micropipetas.
• Tijeras.
• Estufa de incubación a 27ºC.
• Marcador indeleble.
• Cinta de papel.
• Autoclave.
• Campana de flujo laminar.
• Varilla acodada.
• Mechero de alcohol.
• Guantes.
• Etanol al 70 %.

1 Preparación del equipo.
1.1 Esterilización del material y del área de trabajo.

Se esterilizan el material que será utilizado: puntas, tijeras y los tubos de ensaye con
rosca, previamente llenados con 5 ml de agua de mar, (no cerrarlos por completo
porque pueden estallar). En la autoclave usando el programa de acuerdo al material
a esterilizar.

Para la esterilización de la campana de flujo laminar, se asperja etanol al 70% y se
limpia con un paño el interior de la campana, posteriormente se cierra la cubierta de
la campana y se acciona el interruptor de luz UV dejando actuar durante 15 min, al
terminar el tiempo de esterilización se apaga la luz UV y se abre la cubierta hasta la
marca roja y se acciona el aire de flujo laminar.
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1.2 Preparación del medio de cultivo.

Seguir instrucciones del fabricante del medio (AM) clarificar y esterilizar, enfriar en
baño de agua hasta alcanzar una temperatura de 40 °C aproximadamente.
Adicionar el medio en las placas de petri, aproximadamente 20 ml por caja, dejar
gelificar y una vez geledificada la placa se conserva a una temperatura de 4 °C
hasta su uso. El llenado de las cajas se realiza en una campana de flujo laminar o
esteril.

Nota: Durante el llenado de las cajas petri asegurarse que después de gelificar estén
frías antes de cerrarlas para su almacenaje ya que de no ser así se condensaran y
tendrán agua.

2) Extracción de las muestras.
2.1) Tratamiento del tejido.
tejido.

Del tejido de O. maya seleccionado se toma aproximadamente 1 g, y se enjuaga
con agua de mar estéril, los tejidos se secan con un paño limpio y estéril para eliminar
el excedente de agua, se coloca en un tubo de ensaye previamente llenado con 5
ml de agua de mar estéril. Las muestras se agitan en el Vortex.

2.2) Siembra de las muestras.

Se toman 100 µl del tejido inmerso en el tubo de ensaye y se siembran en las placas
con medio Agar Marino (AM) por plaqueo con la varilla acodada (asa) (Fig. 1). Las
placas se incuban a 27 °C durante 48 hrs.

Fig. 1. Plaqueo con la varilla acodada.

2.2.1. Diluciones de las muestras.
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Dado que la carga bacteriana es variable se recomienda hacer diluciones. Para ello,
del tubo de ensaye en donde se deposito el tejido se toma 1 ml de la muestra y se
diluye en 9 ml de agua de mar estéril esta dilución corresponde a 1 x 10-1, realizar al
menos cuatro diluciones mas hasta 10-5 y sembrar las diluciones -2
2 y -5, esto con el fin
de tener un aproximado de la carga bacteriana. El rango para el conteo debe de
estar entre 30 y 300 U
UFC.

En la siguiente figura se esquematiza el procedimiento de las diluciones.

Lectura.

Con ayuda de un Estereoscopio se cuentan las unidades formadoras de colonias
(UFC).

Ejemplo en tejido:
tejido

Carga bacteriana Dilución -7
7 Dilución -9
9
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3. Determinación de la carga bacteriana en Hemolinfa.

Se extrae aproximadamente 500 µl de hemolinfa (más información en Manual de
métodos para la evaluación de componentes sanguíneos del pulpo rojo Octopus
maya). Se toman 100 µl de esa muestra y se siembran en placas con medio Agar
Marino (AM). Con la ayuda de una varilla acodada se distribuye la muestra en toda
la caja. Las placas se incuban a 27 °C durante 48 hrs.

Lectura.

Con ayuda de un Estereoscopio se contaran las unidades formadoras de colonias
(UFC). Se describe las estructuras morfológicas de cada colonia.

Procedimiento:

a) b) c)

a) Extracción de la hemolinfa.

b) sembrado.

c) conteo de UFC.
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Bibliografía.

Anstalt Helgoland, Hamburg, Germany, pp. 21–39. Farto R., 2003. Vibrio lentus
associated with diseased wild octopus (Octopus vulgaris) Journal of Invertebrate
Pathology 83 (2003) pp149–156.
Cruz López, H, Sosa, V., Sánchez, A., Rosas, C., y Pascual C. 2008. Manual de métodos
para la evaluación de componentes sanguíneos del Octopus maya. pp. 24.
Hanlon, R.T. and Forsythe, J.W., 1990. In: Kinne, O., Editor, , 1990. Diseases of Marine
Animals vol. III, Biologische.
Halon R. T., Forsythe, J. W. and Cooper, K. M., 1984. Fatal penetratin skin ulcers in
laboratory reared octopuses. J. Invertebr. Pathol. 44, pp. 67–83.
Nombre de archivo: Protocolo de Bacterias O[1]
Directorio: C:\Users\Honorio\Documents
Plantilla:
C:\Users\Honorio\AppData\Roaming\Microsoft\Plantillas\Normal.
dotm
Título: Protocolo para el conteo total de Bacterias
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Fecha de creación: 02/10/2008 09:04:00 a.m.
Cambio número: 15
Guardado el: 31/08/2009 11:02:00 p.m.
Guardado por: Honorio
Tiempo de edición: 68 minutos
Impreso el: 31/08/2009 11:03:00 p.m.
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