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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS “Francisco García Salinas”

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

“EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES FISICOQUÍMICAS EN LA FERMENTACIÓN DURANTE LA PRODUCCIÓN DEL MEZCAL DE Agave weber EN ZACATECAS”

TESIS
PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGÍA
PRESENTA

MARÍA DE JESÚS HERNÁNDEZ ARTEAGA

ZACATECAS, ZAC. DICIEMBRE, 2013

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS “Francisco García Salinas”

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
“EVALUACIÓN DE LAS CONDICIONES FISICOQUÍMICAS EN LA FERMENTACIÓN DURANTE LA PRODUCCIÓN DEL MEZCAL DE Agave weber EN ZACATECAS”

TESIS
PARA OBTENER EL NIVEL DE

LICENCIADA EN BIOLOGÍA
PRESENTA

MARÍA DE JESÚS HERNÁNDEZ ARTEAGA

DIRECTOR DE TESIS: M. en C. Edgar León Esparza Ibarra Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano

CO-DIRECTORES DE TESIS: M. en C. Lucía Delgadillo Ruíz Dra. en C. María del Rocío Rodríguez Aguirre

ZACATECAS, ZAC. DICIEMBRE, 2013

AGRADECIMIENTOS
A las instituciones:    A la Universidad Autónoma de Zacatecas. A la Unidad Académica de Ciencias Biológicas de la UAZ por su brillante desempeño en mi formación profesional. Al Laboratorio de Biotecnología de la Unidad Académica de Ciencias Biológicas de la Universidad Autónoma de Zacatecas. A mis asesores:    Al M. en C. Edgar León Esparza Ibarra por su confianza, asesoría y revisión del presente trabajo de investigación. Al Dr. en C. Francisco Javier Cabral Arellano por la asesoría y facilidades para culminar este trabajo. A la M. en C. Lucía Delgadillo Ruiz por el tiempo brindado, por su paciencia y por todas las facilidades otorgadas desde el inicio y hasta la culminación de mi tesis experimental.    Al Dr. en C. Francisco Javier Macías Rodríguez por la revisión y asesoría en el análisis estadístico del presente trabajo. A la Dra. en C. Dra. en C. María del Rocío Rodríguez Aguirre, por su participación en los comentarios realizados a mi trabajo de tesis. Al M. en C. Miguel Alvarado Rodríguez por la revisión de la presente tesis experimental.

 A mis hermanos. Guadalupe por todo su apoyo y cariño. por el amor y la confianza que me han brindado. gracias al cual he culminado esta etapa de mi vida profesional. Gerardo y Ma. Francisco Javier.  A Salvador Héctor Acevedo Rodríguez por su compañía y apoyo durante toda la carrera profesional. Juanita. . así como por su esfuerzo y apoyo incondicional.DEDICATORIA  A mis padres José Hernández Macías y María de Jesús Arteaga Padilla. José Luis. Ernestina.

....................................................................................3...2...1 Fermentación alcohólica.....................INTRODUCCIÓN ...................... 24 6.........OBJETIVOS .........3................. 21 III.................................................. i LISTA DE TABLAS ...............................................................................................2 Condiciones para la fermentación............................................. ...... ............... V I...................................................................................................... 12 2........................................................................................................... 18 IV...................................................................... 14 2.......................................................................................................................................................................................2...........................................................3 Azúcares...............................2 Azúcares reductores totales........................... ........................... ........ 22 V..............HIPÓTESIS ............................... ............... 18 2................ÍNDICE GENERAL LISTA DE FIGURAS .......................................................................3 Crecimiento y división celular de las levaduras.........................2 Proceso de fermentación....................ANTECEDENTES .............................................................3...................................................................... 10 2............... .......... 10 2................................................................................ ..... 3 2........ 3 2.............. iii RESUMEN ................. 1 II............. ii LISTA DE GRÁFICAS ........ 16 2... 24 ..... 23 VI......3 Inulina...................... ....................................................... 17 2.....................1 Clasificación de los azúcares.............................................................................................JUSTIFICACIÓN ..................1 Lugar de trabajo......... .......1 Producción de Mezcal en el Sur de Zacatecas...........................................2.........................MATERIAL Y MÉTODOS ................ iv ABSTRACT .

........ ........ 31 6......................... 25 6......... ........................................................4...2 Determinación del pH........................ 28 6....RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................6 Determinación del porcentaje de viabilidad....... 30 6...........................................................1.....7 Determinación de los grados Brix ....4.... 24 6... 28 6..................4.......... ................................................................................... ............................................LITERATURA CITADA ...........................................9 Diferencia mínima significativa (Prueba de Tukey)...............................................................2 Obtención de los jugos de Agave.............3 Proceso de fermentación........4 Pruebas realizadas .......... Determinación de temperatura ................................. ..................................... 69 ....................... 37 VIII...4.... 36 VII...................... 63 IX.............. 28 6..................................................................8 Determinación del porcentaje de alcohol... ................4........4 Determinación de azúcares reductores totales (ART’s)......................... 33 6...............................4..........3 Determinación del porcentaje de acidez. ........ 34 6...4.......APÉNDICE .............CONCLUSIONES .......6..............................4.............. 64 X...... 35 6................. 29 6.... ................................5 Determinación de la densidad celular .........4.......

LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 21. Figura 14. Reacciones de la glucólisis y la fermentación alcohólica. Estados con denominación de origen Mezcal. Maduración del Mezcal en barricas de 200 litros. Figura 4. Autoclave de acero inoxidable. Fermentación en tina de acero inoxidable. Fases típicas del crecimiento celular de una levadura. Figura 8. Piñas de Agave weber. Figura 15. Figura 3. Jima del Maguey en el Teúl de González Ortega. Cámara de Neubauer. Figura 19. Zac. Figura 16. Figura 17. Refractómetro. Figura 22. Potenciómetro marca Corning. Figura 5. Figura 9. Estructura base de la inulina. Jugos de Agave fermentando dentro de la incubadora. Medición de la temperatura. Regiones Sur y Sureste del estado de Zacatecas productoras de Mezcal. Figura 12. Figura 6. Envasado y etiquetado. Figura 13. Figura 18. Prueba del porcentaje de acidez en relación al ácido acético. Figura 20. Ciclo de la división celular (reproducción asexual) en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Figura 2. Partes de la cámara de Neubauer. Alambique de destilación. Figura 23. Figura 10. Figura 1. Figura 11. Prueba del porcentaje de azúcares reductores totales. 2 3 4 5 6 7 8 9 9 11 14 15 19 24 25 28 29 30 31 32 33 34 35 I . Molinos con banda transportadora. Prueba de la viabilidad celular. Figura 7.

Tabla 8. Tabla 11.05). Valores determinados del pH. Determinación del porcentaje de acidez. Determinación de la viabilidad celular. Valores iniciales de la fermentación en cada uno de los tratamientos empleados. Análisis estadístico del porcentaje de acidez de las fermentaciones (P< 0. Análisis estadístico de la densidad celular en las fermentaciones (P<0. Tabla 5. Tabla 6. Análisis estadístico de la viabilidad celular de las fermentaciones (P< 0. Tabla 9. 37 38 41 42 45 46 49 50 53 54 56 57 60 61 II . Tabla 1. Determinación de la densidad celular (células/ml).05). Tabla 12. Tabla 2.05). Análisis estadístico de los grados Brix de las fermentaciones (P< 0. Determinación de los grados Brix. Tabla 3.05). Análisis estadístico del pH de las fermentaciones (P< 0.LISTA DE TABLAS Pág. Tabla 4. Tabla 7. Determinación del porcentaje de alcohol volumen a 20 °C. Análisis estadístico de los azúcares reductores totales de las fermentaciones (P< 0. Determinación del porcentaje de azúcares reductores totales (ART’s). Tabla 14.05). Tabla 13.05). Tabla 10.

Grafica 4. Determinación del porcentaje de alcohol volumen a 20 °C. Determinación de la viabilidad celular. Grafica 7. Determinación de los grados Brix. Grafica 3. Grafica 5. Determinación de la densidad celular (células/ml). Determinación del porcentaje de acidez. 51 55 58 62 39 43 47 III . Determinación del pH. Grafica 2. Determinación del porcentaje de azúcares reductores totales (ART’s). Grafica 1.LISTA DE GRÁFICAS Pág. Grafica 6.

se cuenta con al menos 20 empresas dedicadas a la elaboración de Mezcal. ésta disminuyó al igual que los azúcares desde el inicio de la fermentación. a una temperatura de 30 °C. se modificaron varios parámetros fisicoquímicos tales como. porcentaje de azúcares y temperatura durante la fermentación del Mezcal. acidez. en donde se utilizan los jugos de Agave weber. En las plantas ubicadas al Sur del Estado. con el fin de evaluar y tener las condiciones óptimas para su producción en el Sur de Zacatecas. éste se mantuvo sin muchos cambios. pH. grados Brix. el Mezcal se elabora de manera industrial. así como también se obtiene un producto con características organolépticas variables y es por eso que este trabajo está orientado principalmente en determinar y estandarizar las condiciones a las cuales debe llevarse a cabo la fermentación del jugo de Agave de tal forma que se optimicen los recursos y llevar a cabo la fermentación en las mejores condiciones para obtener mayor producción de Mezcal y que tenga alta calidad con características homogéneas. En el Estado. IV . lo elaboran de manera artesanal. mientras que las plantas productoras de Mezcal ubicadas en el Sureste. En cuanto a la viabilidad celular en todas las condiciones de fermentación.RESUMEN Zacatecas es el segundo productor de Mezcal a nivel nacional con alrededor de diez millones de litros de producción anual. Los resultados obtenidos fueron que a mayor concentración de levadura. predomina la fermentación espontánea. Para ello en el presente trabajo. Éstas se ubican en el Sur y Sureste de la entidad. siendo el mejor para la producción de alcohol. pero la acidez aumentó conforme transcurría la fermentación debido a la producción de ácido acético. concentración de levadura. En la mayoría de las fábricas mezcaleras de todo el País. la fermentación es más rápida a un pH ligeramente ácido en el rango de 4. por lo que al producir el Mezcal. se recomienda destilar a las 96 horas el mosto fermentado antes de que se acidifique y disminuya la concentración de alcohol para elaborar el Mezcal. lo que tiene como consecuencia bajos rendimientos y altos costos de producción. En cuanto al pH.

while in the production plants of the Southeastern part of the State. which are located in the South and Southeast of the entity. spontaneous fermentation predominates. In the State there are at least 20 companies engaged in production of Mezcal. where Agave weber juices are used. which results in low yield and high production costs. it decreased. Mezcal is industrially produced. Mezcal is made by hand. In the most of Mezcal factories nationwide. in the present work were modified several parameters such as yeast concentration. degrees Brix. acidity. Therefore. to produce Mezcal. V . Results obtained were that a higher concentration of yeast fermentation is faster and a slightly acid pH in the range of 4 is the best for the production of alcohol at a temperature of 30 °C. and carry out the fermentation in the best conditions to increase production of Mezcal with high quality and homogeneous characteristics. sugar percentage and temperature during the Mezcal fermentation in order to have the optimal conditions of production in the South of Zacatecas. so that when producing the Mezcal. pH. Regarding the cell viability under all conditions of fermentation. before it acidifies and before decreases the concentration of alcohol.ABSTRACT Zacatecas is the second largest producer of Mezcal nationwide with about ten million liters of annual production. but acidity increased as fermentation progressed due to the production of acetic acid. it remained largely unchanged. In plants located in the South of the State. it is recommended to distill for 96 hours the fermented mash. Regard to pH. as well as decreased the reducing sugars from the beginning of fermentation. and also is obtained a product with organoleptic variables. that's why this work is mainly oriented to standardize conditions under which the agave juice fermentation should be conducted in such a way as to optimize resources.

El Mezcal se define como una bebida alcohólica regional obtenida por destilación y rectificación de mostos preparados directa y originalmente con los azúcares extraídos de los tallos maduros “piñas”. el tequila y el Mezcal entre otros (Granados. Guerrero.INTRODUCCIÓN El género Agave. fue publicada en el Diario Oficial de la Federación el 28 de noviembre de 1994. región o localidad cuando sus características y calidad obedecen exclusivamente al medio geográfico. cuyo significado es “admirable o noble” fue descrito por Carlos Linneo en 1753 y es uno de los grupos de plantas que identifican a México en el mundo y que ha jugado un papel importante en el desarrollo de la cultura Mexicana y de otros pueblos de América (Gentry. entre las que destacan la producción de bebidas como el aguamiel. 2010). La familia Agavaceae está compuesta de 8 géneros con 273 especies aproximadamente. cultivadas o no. como entidades productoras de 1 . incluyéndose a: Durango. En Mesoamérica. 1993). o cuando se aboque sin reposarlo o añejarlo (NOM-070-SCFI. Oaxaca. 1982). Tamaulipas y Zacatecas. Además según descripciones tiene más de 100 usos y actualmente se reportan por lo menos 70 formas de empleo.000 años y desde el punto de vista de grupos étnicos como los Huicholes. el pulque. de diferentes especies del género Agave.I. La Denominación de Origen para el Mezcal. la denominación de origen permite designar y hacer el reconocimiento de que un producto es originario de una región geográfica de un País. San Luis Potosí. previamente hidrolizados o cocidos. El Mezcal. es un líquido de olor y sabor sui géneris de acuerdo a su tipo e incoloro o ligeramente amarillento cuando es reposado o añejado en recipientes de madera de roble blanco o encino. el Agave o Maguey ha sido importante desde hace 9. Por otra parte. incluidos los factores naturales y humanos (Errázuriz.. y sometidos a fermentación alcohólica con levaduras. 205 crecen en México (75%) y 151 son endémicas (55%). 1994). fue la primera planta creada por Dios.

en el año 2012. Estados con denominación de origen Mezcal. Suiza. (Sistema Producto Maguey . 2004) 2 . En el año 2001 se incorpora a la denominación de origen “Mezcal” el Municipio de San Felipe. se incluye también 27 municipios del estado de Michoacán (DOF. Figura 1. 2004). que cuentan con las características que establece esta denominación que fue registrada el 9 de marzo de 1995 por la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual con sede en Ginebra. (Sistema Producto Maguey-Mezcal. Guanajuato y en el 2003 se incluyen 11 municipios del estado de Tamaulipas. por gestiones del Instituto Mexicano de la Propiedad Industrial (IMPI) a petición de los productores de Oaxaca y por conducto de la Secretaria de Desarrollo Industrial y Comercial (SEDIC) del Gobierno del Estado de Oaxaca.Mezcal. 2012) (Figura 1).Maguey y de Mezcal. Posteriormente.

Tabasco. Florencia de Benito Juárez. donde se utiliza el Agave weber y que la producción del Mezcal es totalmente tecnificada su elaboración. A continuación se mencionan las etapas que se llevan a cabo en la producción del Mezcal en la región Sur: 3 . Teúl de González Ortega y Tlaltenango (Martínez et al.II. Regiones Sur y Sureste del Estado de Zacatecas productoras de Mezcal. tiene una antigua tradición Mezcalera y con ello una importante oportunidad de desarrollo económico para sus regiones. García de la Cadena. Huanusco. En el 2004 se logró la conformación del Consejo Mexicano Regulador de la Calidad del Mezcal (COMERCAM). Nochistlán. 2005) (Figura 2). La Región centro norte del País.. Moyahua. ya que presenta dos regiones: en la región Sureste que se elabora el Mezcal con Agave salmiana de manera rústica y en el Sur. Mezquital del Oro.. Jalpa. Apulco. Figura 2. Los municipios productores de Mezcal en la región Sur de Zacatecas son: Apozol. Juchipila. el cual es el organismo que regula el cumplimiento de la NOM-070SCFI-1994 para la elaboración del Mezcal.1 Producción de Mezcal en el Sur de Zacatecas. El proceso para la producción del Mezcal en Zacatecas es diferente.ANTECEDENTES 2.

Figura 3.amarillenta en la base de las pencas y parda en la base del Maguey. extracción de la piña y rasurado. Sus hojas se disponen en rosetas y tienen forma lanceolada (forma de lanza). que tienen la función de completar la eliminación de las pencas de tal forma que sólo quede el corazón de la piña (Castillo. tales como una coloración verde . son necesarias ciertas condiciones o características. 1998). carnosas. Jima del Maguey en el Teúl de González Ortega. 2003). La materia prima que se utiliza en la elaboración del Mezcal. procede de diferentes especies del género Agave. Al tallo de la planta donde reside la base de las hojas o “pencas” se le denomina comúnmente como “piña” (Quiroz. acabadas en espina y con los márgenes dentados y espinosos. así como la presencia de pencas secas en esta zona (Nobel. Para la recolección de la materia prima (Agave). que reciben el nombre común de Maguey y que pertenecen a la familia Agavaceae. el cual se caracteriza por ser una planta suculenta perenne con tallo corto. 2000). 4 .a) Materia prima. rígidas. la especie que generalmente se utiliza es el Agave weber. La recolección o jima del Maguey (Figura 3) sigue tres operaciones principales: corte de las pencas. En la región Sur de Zacatecas. Zac. b) Recolección.

El cocimiento se realiza con vapor de agua a presión en autoclaves de acero inoxidable (Figura 4) con capacidad de 15 hasta 40 toneladas. Durante la cocción de las piñas de Maguey. por lo que esta etapa es fundamental en el rendimiento del proceso ya que se realiza con diferentes equipos automatizados (desgarradores. se extrae el jugo de las piñas cocidas (Figura 5). molinos. d) Molienda. 2002). 1996). etc. prensa. Autoclave de acero inoxidable. 5 . cuyos monosacáridos son más disponibles por la acción de la levadura para favorecer la fermentación.c) Cocimiento. Figura 4. el tiempo de cocción dura de 9 a 12 horas aproximadamente a una temperatura promedio de 105 grados centígrados (Mancilla y López. En la molienda o trituración. se generan azúcares fermentables (fructosa y glucosa) por hidrólisis de la inulina (fructano) presente en el Agave.) y sistemas que tienen que ver con el rendimiento de extracción del jugo (Badui.

Adición de agua fría: Alcanzado el estado anterior.Figura 5. Adición de agua caliente: Cuando se termina de colocar el jugo de la molienda. los azúcares extraídos de las piñas se transforman en etanol por medio de la fermentación alcohólica. es necesario regular el crecimiento de las levaduras con la finalidad de que no exista una transformación acelerada a alcohol. e) Fermentación. Los pasos a seguir durante la fermentación son los siguientes: 1. de forma que pueda originarse ácido acético de manera posterior (Mancilla y López. debe esperarse aproximadamente 24 horas para que alcance el estado apropiado o “punto” para la etapa siguiente. En la fermentación. ruta metabólica propia de las levaduras. se adiciona agua caliente con la finalidad de crear el ambiente apropiado para el crecimiento de las levaduras. 6 . 2. Este estado se caracteriza por la presencia de espuma que cubre la tina y por la existencia del sonido característico de un burbujeo intenso y uniforme en toda la tina de fermentación (Figura 6). Finalizada esta operación. 2002). Molinos con banda transportadora.

1992). El dispositivo utilizado para la destilación es el alambique (Figura 7). f) Destilación. El etanol. la fermentación se puede prolongar hasta más de 10 días. Detención de la fermentación: En este paso la intención es disminuir el ritmo de trabajo de las levaduras lo más posible. Aquí es muy importante el control de la temperatura. 1990). Revoltura: Ya controlado el crecimiento microbiano.3. debe efectuarse una homogeneización de tal forma que no existan zonas donde la fermentación sea menor o no exista. se separa de ésta al alcanzar esa temperatura (Kister. por lo tanto. En esta operación se efectúa la separación del alcohol del agua aprovechando para ello sus diferentes puntos de ebullición. 7 . Este equipo está conformado por cuatro elementos fabricados en acero inoxidable o cobre debido a su alta conductividad térmica. debido a su estructura molecular. de tal forma que facilita la transferencia de calor calentándose y enfriándose fácilmente alcanzando así la temperatura apropiada de separación (Leauté. Para esto se permite la entrada de oxígeno a las tinas de fermentación efectuando el levantamiento de la capa superior de la pulpa que cubre la demás materia fermentada. El tiempo de fermentación varía de acuerdo con la temperatura ambiental y esta a su vez cambia con cada época del año.5 ºC a nivel del mar). tiene un punto de ebullición más bajo que el agua (78. Fermentación en tina de acero inoxidable. Sometida a bajas temperaturas en invierno. Figura 6. 4.

corazón y colas (Solís y Trujillo. como suavizar el sabor y conferirle una 8 . h) Composición del Mezcal. Figura 7. se le llama Mezcal de primera destilación (ordinario). El Mezcal en la primera destilación tiene una graduación de alcohol baja para los requerimientos del envasado. Debido a las variaciones de la graduación alcohólica del Mezcal obtenido en las operaciones de destilación y refinación. i) Maduración. 2002). g) Refinación. 2001).debido a que una temperatura muy alta o muy baja tiene repercusiones negativas en la obtención del Mezcal (Prado. es necesario mezclar los productos de la primera destilación (puntas y colas) con aquellos obtenidos en la refinación (incluyendo el agua destilada) hasta alcanzar el grado alcohólico requerido para la venta. Este paso consiste en el almacenamiento del Mezcal en barricas hechas de roble blanco o encino (Figura 8) con la finalidad de dar un aporte especial a las características organolépticas del Mezcal. Al Mezcal obtenido en la operación anterior. Cabe mencionar que cada empresa tiene su particular manera de llevar a cabo la destilación. Alambique de destilación. 2008). en los llamados cortes de puntas. de ahí que necesiten refinarse (redestilar) para elevar su contenido de alcohol (Dávila.

1994). Envasado y etiquetado. plata y Mezcal 2004). reposado o añejo (Figura 9). Figura 8. 1994). ya que el Mezcal reposado se almacena por un período de dos meses y el Mezcal añejo se almacena por un período de un año (NOM-070-SCFI.coloración obscura agradable a la vista (NOM-070-SCFI. ya sea Mezcal blanco (minero). Maduración del Mezcal en barricas de 200 litros. Figura 9. El período de maduración varía según el tipo de Mezcal que se desee obtener. j) Envasado. 9 . Finalmente se realiza el envasado en distintos tipos de recipientes dependiendo de lo que se vaya a envasar (Zacatecas: tierra.

2003).1 Fermentación alcohólica. 2004) (Figura 10). es decir. el estudio de los microorganismos como bacterias.2 Proceso de fermentación. se asocia con el desarrollo del microscopio en el siglo XVII. investigaciones realizadas por Louis Pasteur sobre la fermentación de cerveza y vino demostró que las levaduras fermentaban el azúcar en etanol y dióxido de carbono. A partir de entonces se empezó a desarrollar la microbiología. Al alcohol lo conoce la humanidad desde hace muchos siglos. b) la transformación de los azúcares en piruvato por medio de la glucólisis y c) la conversión de piruvato en etanol (Suárez. La primera persona que descubrió su existencia. fabricante aficionado de microscopios. su origen fue la fermentación natural de los azúcares para la producción de bebidas y licores. En 1857. Esto se logró sin tener idea en ese tiempo de la existencia de los microorganismos. al. el hombre supo fermentar mostos que contenían carbohidratos con técnicas muy depuradas. en 1680.2. Consta de tres etapas principales: a) el transporte de los azúcares al interior de la célula. elementos clave de los procesos fermentativos (Hernández et. ni del papel clave que desempeñan (Robinson. fue el holandés Antonie Van Leeuwenhoek. pero que juegan un papel importante en las características finales del producto. 2010). e incluso a partir del siglo XV aprendió a destilar el alcohol para aumentar su concentración en las bebidas. La fermentación alcohólica.2. 1994). 10 . consiste en la transformación de los azúcares en alcohol y en otros compuestos en cantidades menores. cuando eran obligadas a vivir en ausencia de aire (Páez.. 2. El descubrimiento de los microorganismos. Existen evidencias arqueológicas del uso de la fermentación desde hace más de 8000 años de antigüedad. desde entonces. hongos y levaduras.

que llevan a cabo el transporte de los monosacáridos.Figura 10. Se le considera a esta etapa el elemento limitante del metabolismo de los azúcares. 1990). puede provocar la interrupción espontánea de la fermentación. 1990). y cada transportador tiene una afinidad diferente para estos azúcares. Reacciones de la glucólisis y la fermentación alcohólica (Lehninger. 11 . incluso con azúcares fermentables todavía presentes en el mosto (Lehninger. ya que la inhibición del transporte de los azúcares. principalmente fructosa y glucosa. a) Transporte de los azúcares Esta etapa depende de las proteínas transportadoras de la membrana de la célula.

los enlaces de fosfato actúan como grupos enlazantes o de reconocimiento en los compuestos enzima . Rb+ o Cs+) (Lehninger. ya que al final se transforman en grupos fosfato terminal del ATP en el transcurso de la glucolisis. La transformación de piruvato a etanol tiene solo un intermediario. La etapa crítica para la productividad y la calidad del Mezcal. producción de alcohol y metabolitos secundarios (Suárez. cationes divalentes (Mg2+ o Mn2+).b) Glucólisis La glucólisis es catalizada por la acción consecutiva de al menos diez enzimas. nucleótidos en forma oxidada o reducida (NAD+ y NADH) y cationes de metal alcalino (K+. c) Conversión del piruvato a etanol. La glucólisis requiere de diversos compuestos para llevar a cabo las reacciones como: compuestos fosforilados. 1990). 2004). esta reacción requiere de NADH y Mg2+ y genera CO2 (Lehninger.sustrato y finalmente la conservación de la energía. iones metálicos divalentes (Ca2+ o Fe2+). 1990). 2. los cuales tienen tres funciones fundamentales: en primer lugar proveen a la molécula un grupo polar cargado negativamente que le impide pasar a través de la membrana celular. es en la fermentación que se realiza en forma natural con las levaduras nativas presentes en el mosto y en el medio ambiente en donde se realiza. La enzima que lleva a cabo esta reacción es la alcohol .2 Condiciones para la fermentación. Dentro de las condiciones necesarias para que se lleve a cabo la fermentación se encuentran: 12 . La importancia del conocimiento de la microflora radica en que está formada por especies de diferentes géneros.deshidrogenasa (ADH). el acetaldehído.2. Posteriormente. que coexisten en el tiempo y se suceden secuencialmente en función de su resistencia a la concentración de azúcares. Todos los compuestos intermediarios son fosforilados.

sino agua y anhídrido carbónico debido a que las levaduras. es un hecho erróneo ya que requieren una cierta aireación.5 y en el transcurso de la fermentación tiende a bajar hasta alcanzar en el mosto muerto. Dentro de este intervalo. 2003). cuanto mayor sea la temperatura. c) pH. La disminución de la concentración de los azúcares. El pH inicial del mosto es de 4. la capacidad de las levaduras para fermentar disminuye. Cuanto menor es el pH. b) Aireación. valores de alrededor de 3. d) Concentración de azúcares. a menor temperatura es más fácil conseguir un mayor grado alcohólico. ya que parece que las altas temperaturas que hacen fermentar más rápido a las levaduras llegan a agotarlas antes (Arellano. debía realizarse la fermentación en ausencia de oxígeno. para obtener con ello mucha más energía (Cedeño. esto hace que la fermentación pueda tener lugar en un rango de temperaturas desde los 13 .14 ºC hasta los 33-35 ºC. Sin embargo. Con una aireación sumamente excesiva no se obtendría alcohol. se pensó que las levaduras eran microorganismos anaerobios estrictos. Durante mucho tiempo. aunque más protegido se encuentra el mosto ante posibles ataques bacterianos que pueden generar pérdidas en los rendimientos de conversión de los azúcares en alcohol (Cedeño 2003).a) Temperatura. 1999).9. es decir. no utilizan los azúcares por vía fermentativa si no oxidativa. La concentración inicial de azúcares varía entre el 11 y 14 por ciento y finaliza con un 3 a 5 por ciento cuando la fermentación se desarrolla de manera adecuada.5 a 3. Sin embargo. Las levaduras son microorganismos mesófilos. incrementa la concentración de 13 . cuando viven en condiciones aeróbicas. mayor será la velocidad del proceso fermentativo siendo también mayor la proporción de productos secundarios.

cuando las condiciones son favorables.. Las levaduras entran en una fase de reproducción sexual cuando las condiciones nutricionales no son ideales. es la asexual o por gemación.2. como se observa en la Figura 11.. al tiempo que se separan de la célula madre (Tortora et al. las cuales alcanzan el tamaño de la célula madura. 2001). El crecimiento de las levaduras se asocia con la formación de las gemas. Figura 11. Por otra parte. por ejemplo: en caso de una carencia prolongada de nitrógeno (Tortora et al. La forma más común de reproducción de las levaduras.etanol y de otros compuestos que se generan durante la fermentación (Arrizon. 2. 2004). 1993). como es el caso de las fermentaciones para la obtención de bebidas alcohólicas. éstas se reproducen asexualmente y con facilidad se puede observar al 14 . también se puede observar fisión binaria. 1993).3 Crecimiento y división celular de las levaduras. Ciclo de la división celular (reproducción asexual) en la levadura Saccharomyces cerevisiae (CIATEJ. seguida de formación del micelio por elongación de la cadena.

1993). 2) Fase exponencial o logarítmica de crecimiento. 15 . cuando las células se dividen a una velocidad constante. 3) Fase estacionaria.geocities.html). Es importante conocer las fases de crecimiento de las levaduras. antes de que la división celular comience.com/roberto_raul/crecimiento. En general todas las cepas presentan un comportamiento similar. (http://www. Fases típicas del crecimiento celular de una levadura. Figura 12. Su crecimiento puede dividirse en cuatro fases (Werner et al.. aunque con características específicas para cada cepa. La formación de las gemas ocupa la totalidad del ciclo celular (Pringle et al. cuando la división celular cesa. 1) Fase log o de retraso.. 4) Fase de muerte. las cuales se representan en la Figura 12. 1993).microscopio sus gemas.

principalmente en las plantas. además todos los carbohidratos presentan grupos funcionales C = O ó –OH. Cn(H2O)n + nO2 nCO2 + n(H2O) + energía Los azúcares son de gran importancia en la naturaleza ya que son el almacén químico principal de la energía del Sol. en un proceso denominado fotosíntesis (Badui. presentan la fórmula general Cn(H2O)n y tienen estructura de polihidroxialdehído o de polihidroxiacetona. se almacenan en forma de “inulinas”. La energía retenida en estas reservas de azúcares se moviliza cuando se parten los azúcares solubles de que están hechos. De esta forma. A partir del dióxido de carbono y agua. éstos se almacenan en formas insolubles. las plantas sintetizan los carbohidratos. En este proceso tienen lugar numerosas reacciones catalizadas por enzimas (no todas las reacciones enzimáticas se comprenden). Azúcares. también son importantes como compuestos estructurales. La energía almacenada en los azúcares se libera 16 . El pigmento verde de las plantas. sobre todo en forma de almidón.3. Una vez fabricados en forma de carbohidratos solubles durante la fotosíntesis. los carbohidratos constituyen la principal fuente de energía tanto para las plantas como para los animales que se alimentan de ellas. Los azúcares o carbohidratos son compuestos formados por carbono. la clorofila. Los azúcares o carbohidratos. hidrógeno y oxígeno.2. los cuales metabolizan los carbohidratos realizando la operación inversa y utilizando la energía para diversos fines (Solomons. la energía que absorbe de la luz solar. 2004). pone a disposición del vegetal. Así la energía solar quedó transformada en energía química a disposición de las plantas y de animales. 2006). En el caso particular del Agave. queda el CO2 reducido como carbohidrato y a su vez se libera oxígeno.

que nuestro organismo procesa y transforma con sus enzimas para nuestro beneficio (Solomons. La palabra viene del griego. Los humanos ingerimos cereales como fuente de carbohidratos. 17 . etcétera. El metabolismo de los carbohidratos también se lleva cabo a través de una serie de reacciones catalizadas por enzimas. 2006). el maíz. por hidrólisis producen muchos monosacáridos.1 Clasificación de los azúcares. Digamos el azúcar que utilizamos es un disacárido y por tanto un oligosacárido. como el arroz. contienen los carbohidratos en forma de almidones. por ejemplo glucosa. H / H 2O o Enzimas + Sacarosa Glucosa + Fructosa Monosacáridos Los polisacáridos. Los carbohidratos se clasifican en monosacáridos.3. oligosacáridos y polisacáridos. 2004). Dentro los polisacáridos se encuentran la inulina. pero estos cereales. el almidón y la celulosa (Badui. en las cuales cada paso generador de energía es una oxidación (o la consecuencia de una oxidación). son macromoléculas con alto grado de polimerización. Un monosacárido. fructosa o galactosa. Los oligosacáridos están constituidos por dos a diez unidades de monosacáridos. es una unidad que ya no se subdivide más por hidrólisis ácida o enzimática. Enzimas Almidón Glucosa 2. entre 100 y 90 000 unidades. oligo = pocos.cuando los animales o las plantas a través de su metabolismo transforman los azúcares en dióxido de carbono y agua. éstos son macromoléculas poliméricas de glucosa.

la levadura no fermenta. que en este caso se espera encontrar de 1 a 5 °Bx. es un carbohidrato de reserva presente en determinadas familias de monocotiledoneas como las Agaváceas. Estos incluyen a todos los monosacáridos y los disacáridos maltosa. 2. De hecho. nos indica cuanta cantidad de alcohol podremos obtener a partir de la cantidad exacta de azúcares fermentables. Se encuentra en cantidades significativas en vegetales usados habitualmente para el consumo humano como: trigo. ya que a mostos con un valor mayor a 18 grados Brix (°Bx).2 Azúcares reductores totales. 2001). Amarilidáceas.3 Inulina.Almidón Hidrólisis ácida prolongada Glucosa (muchas moléculas) 2. Gramíneas y dicotiledóneas como la familia de las Asteráceas. La importancia de los azúcares reductores en la industria Mezcalera. achicoria. se ha 18 . La inulina. alcachofa. banana. también para la formulación de los mostos de fermentación. si no que se inhibe la fermentación.3. lactosa y celobiosa.3. Finalmente cuando se requiere conocer el mosto muerto (cuando la fermentación ha llegado a su fin) y detener el proceso antes de que continúe la formación de ácido acético. mientras que un mosto de 13 -16 °Bx es fácil llevar un control adecuado de la fermentación (Miller. es necesario saber qué cantidad de azúcares reductores aún están presentes en el mosto. La determinación precisa de los azúcares reductores fermentables. espárrago. 2004). Liliáceas. como indicativo de que la fermentación alcohólica ha llegado a su fin (CIATEJ. son el sustrato para que las levaduras efectúen la fermentación de estos para la producción del Mezcal. Los azúcares que contienen en su estructura grupos aldehídicos o cetónicos libres reaccionan como agentes reductores débiles y se llaman azúcares reductores. radica en que al ser monosacáridos provenientes de las inulinas que previamente fueron hidrolizadas por vapor durante la etapa del cocimiento en hornos o autoclaves. cebolla y ajo.

Figura 13. es de un polisacárido heterocíclico con una D-glucopiranosa o D-fructopiranosa (anillo de 6 carbonos) y de una cadena lineal compuesta de varias unidades de D-fructosa (anillo de 5 carbonos) unidos por enlaces β -(2. 2010). De ahí que existan diferencias considerables en su contenido de azúcares (inulina). conforme éste madura. La longitud de la cadena polimérica puede variar de 20 a 200 monómeros de fructosa. 2004). Estructura base de la inulina (CIATEJ. 19 . el tipo de agave y la época de año en que es jimado. 2004). Su estructura química.1) (Figura 13). La inulina en la fisiología del agave tiene la función de ser almacén de energía como producto de la fotosíntesis en las hojas o pencas del agave. la inulina es transportada de las pencas al tallo de la planta (o piña como se le conoce una vez jimada). dependiendo el grado medio de polimerización de la fuente de donde se obtiene. siendo para el caso de los agaves de 30 a 35 unidades de D-fructosa (CIATEJ. es de un promedio de 6 a 8 % para Agave salmiana y de 24 a 30 % para el Agave weber (Delgadillo. La cantidad de inulina presente en las piñas varía según la edad de la planta. para el caso de los Agaves Zacatecanos. 2004).estimado que los americanos consumen de 1 a 4 gramos diarios de inulina y los europeos de 3 a 11 gramos diarios (CIATEJ.

2004).Como se mencionó anteriormente. los microorganismos utilizan azúcar y otros constituyentes de las materias primas como sustratos para su crecimiento. 2004). la inulina no fermenta en forma directa. en especial los monosacáridos. 20 . la cual se da por vía fisicoquímica durante el cocimiento en hornos o autoclaves. Como producto de esta hidrólisis por medio de vapor. dióxido de carbono y otros metabolitos que contribuyen a la composición química y calidad sensorial del producto (CIATEJ. obtenemos carbohidratos más simples. se requiere de una hidrólisis previa. convirtiéndolos en etanol. Durante la fermentación alcohólica. ya que para la obtención de azúcares fermentables (mono o disacáridos) en la producción de Mezcal. ya que son la materia prima fundamental para que los microorganismos produzcan el Mezcal (CIATEJ.

V.A de C.V.V.V. S. Existen dos regiones productoras de Mezcal en el Estado de Zacatecas. 2010). se estiman alrededor de 20 empresas en el Estado. que este trabajo está orientado principalmente en estandarizar las condiciones a las cuales debe llevarse a cabo la fermentación de los jugos de Agave.V. Guerrero.C. predomina la fermentación espontánea. de C.A. Y es por ello.A. S.III. S. Empresa Integradora La Caxcanía SA de CV. Mezcales de Calidad Don Aurelio Lamas.V. SPR de RI. de C. Actualmente. dedicadas a la producción y comercialización de Mezcal (Destiladora El Zacatecano S. Sociedad Mezcalera Saldaña. 21 . de R.A..V. Industrias Mezcaleras Bañuelos. de C. Mezcales del Cañón SPR de RL) (De Anda. Guanajuato. Mezcal El Caxcan.V.JUSTIFICACIÓN Zacatecas produce cerca del 40 por ciento del Mezcal que se consume en el País (10 millones de litros). de C. de C. Michoacán. superando a otras entidades como Durango. Industrializadora de Agave Mezcalero El Chino S. de C.A. San Luis Potosí y Tamaulipas. Compañía Vinícola La Pendencia. S. S. Empresa Integradora Tres Pueblos SA de CV. Grupo San José de Allende. de tal forma que se optimicen los recursos y lleven a cabo la fermentación en las mejores condiciones para obtener mayor producción de Mezcales con características organolépticas homogéneas y de alta calidad. de C.V. de C. de C. En las fábricas Mezcaleras de Zacatecas y todo el País.A. 2013). Piñón Gigante SPR de RL.C.A. Mezcal de Agave Huitzila. Diamante del Desierto S.V. S. Envasadora y Distribuidora La Perla S. mientras que para el Sur lo es de manera tecnificada con el Agave weber.L. así como también se obtiene un producto con características organolépticas variables (Reyes 2008). Cristeros Santuarios Jalpa.A. Escorpión la Estancuela SPR de RI. Para el Sureste del Estado se produce de Agave salmiana de manera rústica o artesanal. Magueyeros y Mezcaleros de Zacatecas. que presentan diferencias en la producción y en el proceso de elaboración del Mezcal. S. Agrícola Curiel. De C.A. SPR de RI.V. Empresa Integradora Regional de Organizaciones Magueyeras de Zacatecas. SPR de RL. lo que tiene como consecuencia bajos rendimientos y altos costos de producción. por lo que la bebida obtiene un sabor característico dependiendo de la región y el proceso en la que es elaborado (Esparza. S.

temperatura.HIPÓTESIS La variación de características fisicoquímicas como lo son: el pH. porcentaje de acidez.IV.. 22 . afectan la producción del Mezcal. concentración de levaduras y azúcares. durante el proceso de fermentación.

concentración de levaduras y azúcares.V. pH. durante el proceso de fermentación en la producción del Mezcal. viabilidad. grados Brix. azúcares reductores totales y porcentaje de alcohol. 23 .OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Evaluar el comportamiento de la fermentación al variar diferentes condiciones fisicoquímicas que intervienen en el proceso de producción del Mezcal de Agave weber en Zacatecas. determinando la densidad celular. OBJETIVOS ESPECÍFICOS   Obtener jugos hidrolizados de las piñas de Agave weber Modificar de manera independiente las condiciones de pH.. acidez.  Evaluar el comportamiento de cada fermentación dadas las modificaciones. porcentaje de acidez. temperatura.

el tiempo que permaneció en la autoclave fue de 5 horas a una temperatura de 120 °C.. de la Universidad Autónoma de Zacatecas ubicado en el campus II en Zacatecas. 24 .MATERIAL Y MÉTODOS 6.VI. 6. Transcurrido el tiempo de cocimiento.1 Lugar de trabajo. Piñas de Agave weber. Se recolectaron piñas jimadas de Agave weber las cuales provenían del Sur del estado de Zacatecas y fueron partidas en 5 y 8 partes (Figura 14) para introducirlas en la autoclave para su hidrólisis y la cual se llevó a cabo en un tiempo de 7 horas a 120 °C.2 Obtención de los jugos de Agave. Figura 14. se dejaron enfriar los trozos de piñas para después extraer los jugos de Agave de manera manual. Para las piñas cortadas en 5 y 8 partes. El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Biotecnología de la Unidad Académica de Ciencias Biológicas. Zac.

6.3 Proceso de fermentación. Durante el proceso de fermentación, se modificaron diferentes condiciones fisicoquímicas para observar su comportamiento y las cuales se enlistan a continuación:

Condiciones de fermentación: 1) Fermentación No. 1 (Concentración de levaduras).

En ese experimento, se modificaron las concentraciones de levaduras, en concentraciones de 0.05, 0.07, 0.10, 0.14 y 0.18 gramos de levadura por cada 100 ml de medio. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les añadió la levadura (Saccharomyces cerevisiae), después fueron sometidos a aireación durante cinco minutos y fueron llevados a la incubadora a una temperatura de 35 °C (Figura 15). Cada fermentación, se realizó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas después del inicio de la fermentación, determinándole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azúcares reductores totales.

Figura 15. Jugos de Agave fermentando dentro de la incubadora.

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2)

Fermentación No. 2 (pH).

En este experimento, se modificó el pH inicial en valores que fueron en el rango de: 3, 4, 6 y 8. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les añadió 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireación durante cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 °C. Cada fermentación, se realizó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 °Bx) y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas después del inicio de la fermentación, determinándole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azúcares reductores totales. Para aumentar el pH, se utilizó hidróxido de potasio (KOH) 5N, y para disminuirlo se utilizó ácido cítrico al 30 %.

3)

Fermentación No. 3 (Porcentaje de acidez).

En este experimento, se modificó la acidez inicial en los valores que fueron de: 0.0202 %, 0.0813 %, 0.2751% y 1.3116 %. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les añadió 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireación durante cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 °C. Cada fermentación, se realizó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 ºBx) y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas después del inicio de la fermentación, determinándole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azúcares reductores totales, Para modificar la acidez, se utilizó KOH 5N y para disminuirla, se utilizó ácido cítrico al 30 % para aumentar la acidez.

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4)

Fermentación No. 4 (Temperatura).

En este experimento, se modificó la temperatura en valores que fueron de: 20, 25, 30, 35 y 37 °C. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les añadió 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, siendo sometidos a aireación durante cinco minutos en distintas estufas, a temperaturas de 20, 30, 35 y 37 °C respectivamente. También se dejó un fermento a temperatura ambiente (alrededor de 25 °C). Las fermentaciones, se realizaron en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave (17 ºBx) y fueron monitoreadas cada 24 horas hasta las 96 horas después del inicio de la fermentación, determinándoles acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azúcares reductores totales.

5)

Fermentación No. 5 (Azúcares).

En este experimento, se modificó la concentración de azúcares mediante la adición de miel de Agave, obtenida durante la cocción de las piñas con el fin de aumentar la concentración de los mismos y adicionando agua como diluyente para reducir su concentración. Los valores iniciales de los azúcares en el jugo de Agave fueron de: 10 %, 11 %, 14 %, 18 % y 27 %. Para llevar a cabo esto, se tomaron 500 ml de jugo de Agave y se les añadió 0.07 gramos de levadura por cada 100 ml, después fueron sometidos a aireación por cinco minutos en la incubadora a una temperatura de 35 °C. Cada fermentación se realizó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml con 500 ml de jugo de Agave y fue monitoreada cada 24 horas hasta las 96 horas después del inicio de la fermentación, determinándole acidez, pH, viabilidad, grados Brix y azúcares.

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6.4 Pruebas realizadas 6.4.1 Determinación de temperatura. Se empleó un termómetro de mercurio con escala de 0 a 100 °C para medir la temperatura en el jugo de Agave, tomando las lecturas al inicio de la fermentación y cada 24 horas, para de esta manera identificar el rango de temperatura en el que se lleva a cabo toda la fermentación (Figura 16).

Figura 16. Medición de la temperatura.

6.4.2 Determinación del pH. El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos caras de una membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su valor de pH. En primera aproximación, a temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones (NMX-AA-008-SCFI-2000). La calibración consiste en efectuar los ajustes apropiados del medidor de pH para que las lecturas proporcionadas por dicho equipo, sean las mismas que los valores de pH asignados a los patrones operacionales utilizados. Las soluciones reguladoras o “buffer” son capaces de mantener la acidez o basicidad de un sistema dentro de un intervalo reducido de pH, por lo cual tienen múltiples aplicaciones, tanto en la 28

4. Se utilizó un potenciómetro marca Corning (Figura 17). haciendo tres determinaciones por muestra. Para la determinación del porcentaje de acidez. NOTA: Se anotó el volumen gastado en la titulación para los cálculos. Por último se agregaron de 2 a 3 gotas de azul de bromotimol (ver apéndice) y se titularon con hidróxido de sodio al 0. Figura 17. Este procedimiento de calibración permite compensar las deficiencias de respuesta del electrodo de vidrio. tomándose lectura de las alícuotas por muestra. se pesaron 10 gramos de muestra y se mezclaron con 25 ml de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 100 ml.3 Determinación del porcentaje de acidez. 29 . Potenciómetro marca Corning.1 N (ver apéndice) hasta que la muestra tomó una coloración ligeramente azul (Figura 18). 6. Para determinar el pH de la disolución problema.industria como en los laboratorios. se sumergen los mismos electrodos ya calibrados en dicha disolución (NMX-AA-008-SCFI-2000). para determinar el pH del jugo de Agave.

que está compuesto por una sal de cobre. 6. el cual está basado en la reducción de sales metálicas en solución alcalina. Esto se filtró con un embudo y un papel filtro. el cobre del estado cúprico (Cu+2) al estado cuproso (Cu+1) y por ende la cantidad de cobre reducido es proporcional a la cantidad de azúcares reductores presentes. del filtrado se tomaron unas gotas para medir los grados Brix en el refractómetro.4 Determinación de azúcares reductores totales (ART’s). Al pasar este tiempo se dejó .70 °C de temperatura. Prueba del porcentaje de acidez en relación al ácido acético. entonces se tomaron 50 ml y se pasaron a un matraz de aforo de 100 ml. 3) Cuando se obtuvo la muestra en 1 °Bx. al 30 llegar a esta temperatura se mantuvo durante 15 min. comúnmente se usan las sales de cobre. Esta debe tener 1 °Bx. Los azúcares se pueden determinar mediante el método volumétrico de Lane Eynon. Por esto se hace uso del reactivo de Fehling. se le adicionaron 20 ml de agua y por las paredes lentamente 10 ml de ácido clorhídrico concentrado. y así la capacidad de reducir en soluciones alcalinas. 4) En un baño maría se dejó hasta que alcanzó 68°.Figura 18. si tiene más de 1 grado se hacen diluciones hasta obtenerlo.4. 1) 2) Se pesaron 25 g de la muestra y esta se aforó a 250 ml con agua destilada.

Figura 19. contándose los microorganismos presentes 31 . Al vire azul se dejó de agregar el hidróxido de sodio y se aforó con agua destilada hasta 100 ml. Este matraz se puso a calentar hasta ebullición y en ese momento se comenzó a añadir la muestra de 5 a 10 ml. Se agregó hidróxido de sodio (NaOH) al 50 % para neutralizar la solución verificándolo con azul de bromotimol.enfriar hasta una temperatura ambiente. entonces se le agregó el azul de metileno y se continuó con la titulación hasta que apareció un precipitado rojo y el sobrenadante fue transparente (Figura 19).4. 5 ml de la solución Fehling B y 20 ml de agua destilada. 5) Con esta solución se llenó la bureta (50 ml). Para esto se utilizó la cámara de Neubauer (Figura 20) que tiene una cavidad de dimensiones conocidas. se observó directamente al microscopio utilizando una cámara de conteo. Los resultados se calcularon a partir de la fórmula para el cálculo de los ART’s que viene dentro de la técnica oficial del COMERCAM (NMX-F-496-1987 y NOM-V-61993). Prueba del porcentaje de azúcares reductores totales.5 Determinación de la densidad celular Para la densidad celular. en otro matraz se preparó con 5 ml de la solución Fehling A. 6.

Sobre las dos partes laterales se coloca un cubre objetos que deja un espacio de 0. 32 . Si hay menos de esa cantidad de células se deben contar más de cinco cuadros y cuando el número de células es superior a 150 se hace una dilución. El conteo se realizó en cinco cuadros grandes de la cámara. 1993). La cámara está dividida en tres partes: dos laterales y una central. el cual es llenado con la suspensión celular (Figura 21). La principal ventaja de los recuentos microscópicos es que no necesitan ningún tiempo de incubación. La parte central es la más baja (0. comúnmente cuatro de los extremos y el central.en una porción de volumen. Este método permite determinar el número de microorganismos contenidos en un volumen conocido de líquido (UNAM. la cual se distribuyó por capilaridad.1 mm) que las dos laterales. por lo que su utilización se reserva habitualmente para aplicaciones en que el tiempo es el factor principal (Tortora et al. aproximadamente 30 células por cuadro grande. Figura 20. Estos 400 cuadros están agrupados a su vez en 25 cuadros grandes que hacen el total de la cuadricula. Además tiene una cuadrícula de 1mm que está dividido en 400 pequeños cuadros de 1/20 mm de lado. 1986).1 mm de profundidad para la cámara de Neubauer. La muestra se colocó por un costado de la cámara.. Cámara de Neubauer. La cuenta total debe ser de al menos 150 células.

Posteriormente se cargó la cámara de Neubauer con 20 µl de muestra con la ayuda de una micropipeta y se observó al microscopio con el objetivo de 40X. Después. Partes de la Cámara de Neubauer.ca/openebooks/147-7/). de células contadas / No. de cuadros contados x D x (25 x 105) D = Dilución de la muestra. fue necesario hacer primero la dilución y después se realizó el conteo de las células.6 Determinación del porcentaje de viabilidad.4. Para el ensayo de viabilidad celular. 6. 33 . contando las células incoloras (vivas) y las células teñidas de azul (muertas). se mezcló homogéneamente y se esperó 5 minutos manteniendo las muestras a temperatura ambiente (Figura 22).4 %.Figura 21. La concentración de células por mililitro (X). se tomó 1 ml de cada muestra y se le agregó 2 gotas del colorante azul de Tripano al 0. (http://www. está dada por la fórmula siguiente: X = No. Cuando la concentración de células presentes se mostró alta.idrc.

los refractómetros de mano son utilizados para hallar la concentración de sólidos disueltos en una solución y pueden ser usados para una amplia gama de soluciones. corresponde a 1 gramo de sacarosa en 100 gramos de solución y por tanto representa la fuerza de la solución como un porcentaje en peso en sentido estricto.4. como otros azúcares. jugos de fruta. azúcar. anticongelante. 1996).Cálculos: (%) Porcentaje (Células totales X 100). en masa (% w/w). de Viabilidad = (Células totales – Células muertas) / Figura 22. la concentración de salsas. champú. 6. sal marina. La determinación del grado Brix. 34 . aceites industriales. minerales. Los grados Brix se determinan por refractómetría (Figura 23). leche. son un representante de la unidad de azúcar contenido en una solución acuosa. Prueba de la viabilidad celular. como la concentración de azúcar en zumos y bebidas. etc.7 Determinación de los grados Brix Los grados Brix (°Bx). Si la solución contiene sólidos disueltos excepto la sacarosa pura. Un grado Brix. (Badui. entonces el grado Brix sólo aproxima el contenido de sólidos disueltos. miel y otras industrias (Badui. 1996). tradicionalmente se ha empleado en vinos.

se suspendió la destilación y se completó el volumen con agua a la temperatura que se midió la muestra. simplemente se coloca una gota de la muestra sobre el prisma y se lee el resultado en la escala. En un matraz volumétrico se midieron 200 cm3 de la muestra a la temperatura de 293 K (20 °C). por lo que en segundos se obtiene el resultado. luego se transfirieron cuantitativamente con 40 cm3 de agua al matraz de destilación con perlas de vidrio y se conectó al refrigerante mediante el adaptador. Se tomó la temperatura del líquido y cuando ésta se encontró a 288 K 35 . utilizado para medir la muestra y en el que previamente se puso un poco de agua para que el destilado borboteara evitando pérdidas por falta de condensación. Cuando la cantidad del destilado contenida en el matraz volumétrico se acercó al aforo. Es recomendable que el matraz volumétrico se encuentre sumergido en un baño de hielo durante el curso de la destilación (NMX-V-013-S-1980).Figura 23. después se homogenizó y transfirió a la probeta. Refractómetro.8 Determinación del porcentaje de alcohol. 6.4. El destilado se recibió en el matraz volumétrico (200 ml). Su manejo es rápido y sencillo.

(15°C). la cual permite “controlar las fuentes de variación presentes en el material experimental” de manera que se puedan hacer comparaciones entre los efectos de los tratamientos libres de interferencias. de manera que globalmente la probabilidad de cometer al menos un error de tipo I. se manipularon mediante un diseño experimental completamente al azar y se manejaron mediante una diferencia mínima significativa (prueba de Tukey). 36 . Este valor crítico es Donde qα (t. Otra manera de evitar el problema de errores acumulados en las conclusiones del experimento. Para la realización del análisis estadístico. se hace para cada prueba individual más conservadora. los datos obtenidos en los resultados numéricos del experimento.1. aunque esto implique que para cada comparación tomada individualmente la probabilidad disminuya. se desarrolla con esta idea en mente y consiste en usar un nivel crítico mayor que el de diferencia mínima significativa. Es decir. es usar métodos alternativos a la prueba de diferencia mínima significativa. La idea fundamental es que la probabilidad de cometer el error de tipo I (declarar falsamente diferencias significativas) se mantenga en el nivel especificado (α) para todo el experimento.4.9 Diferencia mínima significativa (Prueba de Tukey).3 portable. Y se trabajó con un α=0. v) se busca en la tabla con t tratamientos y grados de libertad en el cuadrado medio del error. Los datos se analizaron con el paquete estadístico SAS versión 9. La prueba de Tukey. se mantenga razonablemente cerca del nivel especificado (usualmente 5 %). se introdujo el alcoholímetro y se efectuó la determinación (NMX-V-013-S1980). 6.05 %.

0203 % 0.08 % Acidez 0.12 4. Tratamiento °Bx 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 22 15 28 11 17 T (°C) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 20 25 30 35 37 35 35 35 35 35 pH 4.08 4.84 4.5 % ART´s Fermento No.94 7.2751 % 0.2751 % 0.2751 % 0. temperatura. concentración de levaduras y azúcares.VII.18 gr 3.2751 % 0.2751 % 0.08 4.2751 % 0.08 4.84 1.5 1680 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 Fermento No. pH.2751 % 0.0813 % 0.08 4. 10 y 12 donde se observan las determinaciones de cada parámetro medido (Densidad celular.0813 % 0.14 gr 0. acidez.2751 % 0.07 gr 0. Valores iniciales de la fermentación en cada uno de los tratamientos empleados. 72 y 96 horas). En la tabla 1 podemos observar las condiciones iniciales de cada fermentación. porcentaje de azúcares.2 pH 37 .RESULTADOS Y DISCUSIÓN La levadura empleada en las fermentaciones fue la Saccharomyces cerevisiae y se trabajó modificando las condiciones de pH. grados Brix y pocentaje de viabilidad celular).08 4.08 4.2751 % % ART´s 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 14 % 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % Densidad celular (cel´s/ml) 2310 1365 682. 24.84 3.2751 % 0.0203 % 1.3 % de acidez Fermento No. porcentaje de acidez.4 Temperatura Fermento No.08 4.12 4.94 7. 6.2751 % 0.5 682.1 Concentración de levaduras 0. 48.3117 % 0.0813 % 0.2751 % 0.94 7.08 5.2751 % 0.2751 % 0. Tabla 1.12 4.. las cuales fueron monitoreadas a diferentes tiempos (0.3117 % 0.08 4.08 5.2751 % 1.3117 % 0.2751 % 0.08 3.08 4.08 4. 8.0203 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % Fermento No.08 4.2751 % 0.2751 % 0. como se muestra en las tablas 2.08 5.05 gr 0.1 gr 0. 4.08 4.08 4.

la fase logarítmica se retrasa debido al pH tan bajo presente.0203 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % En la gráfica 1 se observa.3117 % 0. ya que presentan de manera muy similar las fases del crecimiento celular de una levadura y las cuales Fermento No.12 4. Tabla 2. mientras que los mejores resultados se obtuvieron en el tratamiento con 0.2 Porcentaje de Concentración de pH acidez levaduras 0 hrs 2310 1365 682 682 1680 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 1365 24 hrs 3202 735 1522 2887 5827 210 735 1470 1680 210 735 1470 1680 4147 3045 2572 735 1207 735 2047 735 1050 1417 48 hrs 2782 2467 6720 3255 5722 525 2467 1417 3360 525 2467 1417 3360 6142 3360 2940 2467 1575 1522 2677 2467 1942 2100 72 hrs 1050 2362 2257 1260 2782 5040 2362 1470 2887 5040 2362 1470 2887 5302 4462 2625 2362 1575 2047 2677 2362 2362 2835 96 hrs 630 630 1732 262 1260 1155 630 840 787 1155 630 840 787 2100 2782 1365 630 735 1627 577 630 1155 2205 0.05 gr 0.14 gr 0. 1 y a una temperatura de 20 °C en el fermento no.94 7. 4.1 gr 0. las cuales son posteriormente mostradas de forma gráfica.0813 % 0.4 Temperatura 38 .18 gr 3. Tratamiento Fermento No.84 1. Determinación de la densidad celular (células/ml). determina las variaciones de densidad celular en cada una de las fermentaciones.5 % ART´s Fermento No.La tabla 2.1 Fermento No. que en el primer tratamiento de las fermentaciones 2 y 3.2751 % 0.3 Fermento No.07 gr 0.18 gr de levadura del fermento no.08 5.

Gráfica 1. fase exponencial. fase estacionaria y por último fase de muerte. 39 . Determinación de la densidad celular (células/ml).son las cuales son fase de retraso.

4 presentan un comportamiento de fases típicas del crecimiento celular de las levaduras.En la tabla 3. Estos resultados se pueden observar también en la gráfica 1. 3 y no. mientras que en el fermento no. aún cuando no presenta diferencias significativas entre los demás tratamientos del mismo fermento. no. En cada tratamiento el número de células iniciales fue de 1365 células/ml. se muestran los resultados del análisis estadístico de la densidad celular. así como éste último tratamiento (25 °C) es diferente al de 30 °C y al de 35 °C. así como el tratamiento de 20 °C. Además puede observarse que también numéricamente. 2.18 gr de levadura. los mejores tratamientos fueron el de 0.1. no. 4 existe diferencia significativa entre los tratamientos con temperaturas de 20 °C y 25 °C. las cuales incrementaron en diferentes rangos y terminaron con un número entre 630 y 2782 de células/ml (más de 2000 células de diferencia). y a su vez éste último tratamiento (35 °C) presenta deferencias al de 37 °C. 40 . 5. donde se puede observar que en las fermentaciones no. donde los tratamientos del fermento no. el cual sí presenta diferencias. no hay diferencia significativa entre los tratamientos.

5 % ART´s Fermento No.07 gr 7.4 1868.8 1291. 3 Acidez B B B B B Fermento No.8 1659 1511.3117 % 0. Análisis estadístico de la densidad celular de las fermentaciones (P< 0.8 1312.8 1511.84 3.2 1511.4 3811.8 1659 1511.08 5.8 1669.05 gr 0. 1 Concentración de Levaduras 41 .6 1994.8 1312.0813 % 0.18 gr 0.8 1459.94 1.8 2173.2 3002.400 1984.8 2015.Tabla 3.4 2015.1 gr 0.6 1574.200 Tratamiento 0.14 gr 0.0203 % 0.4 1511.2751 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 27 % 11 % 19 % 14 % 10 % Fermento No.2 pH Fermento No.2 2582.12 4.05). *Tukey A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A C C C C C A A A A A A A A A Media células/ml 3454. 4 Temperatura Fermento No.

3 Porcentaje de acidez Fermento No.98 3.15 3.02 3.95 3.98 3.00 4.0813 % 0.03 4.05 gr 0.07 gr 0.1 gr 0.08 4. Tabla 4.08 4.98 3.18 gr 3.98 4.08 4.12 4.03 3.12 4.84 4.97 3.94 7.1 Concentración de levaduras 0 hrs 4.98 4.00 4.01 0.04 3.98 3.08 4.14 gr 0.05 4.00 3.22 4.54 4.2 pH Fermento No.98 3.47 4.08 5.81 3.00 4.22 4.3117 % 0.08 4.59 5.95 3.98 3.94 3.97 4.18 3.97 4.03 4.84 1.98 3.98 3.99 3.96 3.54 4.98 4.98 4.81 3.2 3.98 3.08 24 hrs 3.2 3.98 4.98 4.03 3.03 48 hrs 3.97 4.00 3.12 4.08 4.98 4.98 4.02 4.00 4.95 3.00 4.08 3.94 7.08 4.84 3.15 3.18 3.02 72 hrs 3.47 4.88 3.02 4.00 4.81 3.08 5.98 4.03 4.00 4.02 3.08 4.98 3.00 3.98 3.81 3.98 4.01 96 hrs 3.0203 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C Fermento No.08 4. cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentación.52 4.15 3.15 3.96 3.88 3.4 Temperatura Fermento No.94 7.98 3.98 3.5 % ART´s 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % 42 .08 5.03 4.00 4.98 4.98 4. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma gráfica.2751 % 0.02 4.08 4.97 4.59 5. Valores determinados del pH Tratamiento Fermento No.98 4.96 3.08 4.52 4.En la tabla 4. se muestran los valores que se determinaron al medir el pH de cada una de las fermentaciones.08 4.98 4.08 4.

esto significa que en los diferentes tiempos. En los demás tratamientos puede observarse que el pH presentó una conducta casi lineal. 43 . 2 y no. 3. se observa que en las fermentaciones no. manteniéndose constante durante las 48. se mantiene con los valores iniciales de la fermentación Gráfica 2. Determinación de pH. se presenta una disminución del pH en el último y penúltimo tratamiento a partir de las 24 hrs después de que inició la fermentación.En la gráfica 2. 72 y 96 horas.

donde se puede observar que las fermentaciones no. manteniéndose constantes en las 48. mientras que las fermentaciones no. 44 . 3 tienen un comportamiento que tiende a disminuir conforme transcurre el tiempo. se muestran los resultados estadísticos del comportamiento del pH determinado durante la fermentación.En la tabla 5. Numéricamente. el tratamiento con la media más alta determinada en el análisis estadístico del pH de las diferentes fermentaciones. es el tratamiento del 10 % de ART’s ya que presenta una media de 10. sin embargo. donde el último y penúltimo tratamiento de las fermentaciones no. no. 72 y 96 horas. 3 presentan una diferencia significativa y un comportamiento similar entre ellos. Estos resultados también pueden observarse en la gráfica 2. aún cuando no presenta diferencias significativas con los demás tratamientos y a pesar de que gráficamente tampoco se encuentra una relevancia diferente de los demás tratamientos graficados. 2 y no. 1. los demás tratamientos mantienen un comportamiento casi lineal. 2 y no.56. 4 y no. en base a la prueba de Tukey. 5 no muestran diferencias significativas entre los tratamientos.

2751 % 0. Tukey A A A A A A A A A A A B A B A B C C C A A B A B A B C C C A A A A A A A A A A A A A A A A A A Media pH 4.004 3.842 Tratamiento 0.012 4.498 4.18 gr 0.12 1.84 5.994 3.1 gr 0.812 4.Tabla 5.28 9.04 3.174 4.992 3. Análisis estadístico del pH de las fermentaciones (P< 0.05 gr 7.498 4.136 8.94 4.07 gr 0.898 7.986 10.174 5.024 4.14 gr 0.004 4.0203 % 35 °C 37 °C 30 °C 25 °C 20 °C 10 % 11 % 27 % 19 % 14 % Fermento 5 % ART´s Fermento 4 Temperatura Fermento 3 Acidez Fermento 2 pH Fermento 1 Concentración de Levaduras 45 .004 3.56 9.3117 % 0.986 3.012 4.08 3.05).0813 % 0.812 4.000 5.

2751 % 0.2751 % 0.2333 % 0.4663 % 0.4208 % 0.4832 % 0.4401 % 0.3117 % 0.4116 % 0.2171 % 0.1955 % 0.4205 % 0.3890 % 0.4801 % 48 hrs 0.2972 % 0.2751 % 0.3328 % 0.4914 % 0.3340 % 0.4292 % 0.4208 % 0.2914 % 1.6001 % 96 hrs 0.0203 % 0.1 Concentración de levaduras 0.4238 % 0.3960 % 0.94 pH 7.0203 % 1. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma gráfica.3298 % 0.4112 % 0.4044 % 0.4624 % 0.4208 % 0.3890 % 0.18 gr pH 3.4 Temperatura Fermento No.12 pH 4.4832 % 0.4832 % 0.0813 % 0.2751 % 0.5424 % 0.2171 % 1.1955 % 0.4044 % 0.2 pH 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10 % Fermento No. se muestran los valores que se determinaron al medir el porcentaje de acidez de cada una de las fermentaciones.0203 % 20 °C Fermento No.3014 % 0.3842 % 0.0813 % 0.4983 % 72 hrs 0.2330 % 0.14 gr 0.4999 % 1.4044 % 0.2751 % 0.5144 % 0. 3.4751 % 0.2751 % 0.0905 % 0.2665 % 1.3117 % 0.2751 % 0.3014 % 0.4044 % 0.2751 % 0.4533 % 0. el primer tratamiento de ambos (pH 3.4612 % 0.4208 % 0.4393 % 0.2751 % 1.5004 % 0.3487 % 0.5303 % 0.2751 % 0.3 Porcentaje de acidez Fermento No.2181 % 0.2181 % 0.4950 % 0.2751 % 0.4832 % 0.07 gr 0. Tabla 6.4633 % 1.4616 % 0.2751 % 0.84 1.3487 % 0.2972 % 0. tienen un comportamiento 46 .4546 % 0.3117 % 0.2751 % 0.4606 % 0.En la tabla 6.4412 % 0.3700 % 0.3719 % 0.3089 % 0.2665 % 0.3117 % de acidez).05 gr 0.2751 % 0.3719 % 0. 2 y no.3712 % 0.3719 % 0.5 % ART´s 11 % 14 % 19 % 27 % En la gráfica 3.08 pH 5.2751 % 0.0813 % 0.2914 % 0.2751 % 0. Determinación del porcentaje de acidez Tratamiento 0 hrs 0.3001 % 0.6331 % Fermento No.0905 % 1.5104 % 0.5513 % 0.3805 % 0.3374 % 0.4850 % 0.4588 % 1.5177 % 1.3719 % 0.3902 % 0.3719 % 0.4044 % 0.12 y 1.1 gr 0.3001 % 0.3678 % 0.4593 % 0.4208 % 0.2751 % 0.5028 % 0.4832 % 0. se observa que en las fermentaciones no.2751 % 24 hrs 0.4341 % 0.

4.irregular. Gráfica 3. mientras que los otros tratamientos presentan un aumento gradual. el fermento no. esto debido a que el pH es muy bajo. es el que presenta mejor comportamiento ya que su incremento es de manera uniforme. Gráficamente. Determinación del porcentaje de acidez 47 .

El fermento no. pero sin presentarla en los tratamientos restantes del mismo fermento. mientras que en el fermento no. 48 . siendo diferentes entre ellos. muestran diferencias significativas y éstos a la vez son diferentes significativamente al tratamiento de a pH de 5. 0. un comportamiento casi igual y el cual aumenta constantemente conforme transcurre el tiempo. es el que presenta una media más alta en cuanto al análisis de acidez y gráficamente también se observa que este tratamiento es el que termina en un nivel relativamente más elevado.12 y 4. 4 no la hay entre ninguno de ellos. En el fermento no. hay diferencia significativa entre sus tratamientos. hay diferencia significativa entre sus tratamientos. 4 presenta en todos sus tratamientos. pero no presenta diferencia significativa al tratamiento de pH de 7. donde se observa que en el fermento no.3. 2.07).08. se muestran los resultados estadísticos del análisis de diferencia mínima significativa con prueba de Tukey.84. 2. ya que produce una mayor acidez al final de la fermentación y esto no es lo más adecuado en la producción del Mezcal. 1 existen diferencias significativas entre los tratamientos de concentración de levaduras (0. el tratamiento con 27 % de ART’s.1 y 0. en la cual se observan los resultados del comportamiento del porcentaje de acidez.9. con lo cual se determina que este tratamiento podría ser el menos adecuado. donde el fermento no.En la tabla 7.14. el fermento no. Numéricamente. presenta el mismo comportamiento que el fermento no. Los resultados anteriores pueden compararse en la gráfica 3. Por último. 5 presenta una diferencia significativa entre los tratamientos con 11 % y 19% de ART’s. ya que los tratamientos con pH de 3. por lo tanto.

Media Acidez 0.43 0.482 0.31 % 37 °C 30 °C 20 °C 25 °C 35 °C 27 % 19 % 11 % 14 % 10 % Fermento No.498 0.05 gr 3.12 4. 1 Acidez pH Concentración de levaduras B B B B B B B A B C C C A B C C C A A A A A A A A A Tratamiento 0. 4 Temperatura A A A A A A A A A Fermento No.178 0.08 5.1 gr 0.392 0.406 0.39 0.264 0.05).14 gr 0.178 1.39 0.272 0.444 0.414 0.272 0.08 % 0.264 0.39 0.02 % 0.18 gr 0.39 0.382 1.41 0.39 0.Tabla 7. Análisis estadístico del porcentaje de acidez de las fermentaciones (P< 0.2 Fermento No.28 % 1. 3 Fermento No.84 0.39 0. 5 % ART´s A B B B B B 49 .07 gr 0.94 7.338 Tukey Fermento No.396 0.

02 % 14.96 % 4.05 % 4.79 % 72 hrs 6.02 % 14.72 % 14.69 % 11. Tratamiento Fermento No.50 % 7.34 % 2.41 % 12.18 % 12.67 % 19.3 Porcentaje de acidez 1.66 % 7.02 % 14.02 % 14.53 % 3.01 % 3.12 pH 4.02 % 9.43 % 0.51 % 9.61 % 7.50 % 9.79 % 96 hrs 6.0203 % 20 °C Fermento No.53 % 4.64 % 27.02 % 14.41 % 4.02 % 14.96 % 4.34 % 3.02 % 14.1 gr 0.En la tabla 8.22 % 3.18 % 9.22 % 12.01 % 4.60 % 11.02 % 14.52 % 3.18 % 12.83 % 5. Determinación del porcentaje de azúcares reductores totales (ART’s).49 % 5.06 % 9.02 % 18.60 % 16.96 % 4.60 % 48 hrs 10.25 % 8.96 % 4.18 gr Fermento No.49 % 24 hrs 11.2751 % 0.21 % 5.94 pH 7.35 % 10.4 Temperatura 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10 % Fermento No.54 % 13. Tabla 8.02 % 14.59 % 22.18 % 5.90 % 10.48 % 3. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma gráfica.38 % 13.15 % 3.3117 % 0.14 gr 0.41 % 2.1 Concentración de levaduras 0 hrs 14.2 pH pH 3.07 gr 0.84 Fermento No.44 % 4.5 % ART´s 11 % 14 % 19 % 27 % 50 .18 % 11.02 % 14.48 % 3.41 % 4.50 % 7.62 % 12.69 % 6.79 % 13.02 % 14.49 % 14.96 % 4.02 % 14.69 % 4.04 % 10.96 % 4.02 % 14.34 % 2.98 % 3.02 % 14.83 % 5.62 % 3.01 % 9.61 % 25.25 % 7.69 % 2.0813 % 0.22 % 11.41 % 7.02 % 14.34 % 5.60 % 9.02 % 18.60 % 11.53 % 7.43 % 4.49 % 4.65 % 13. se muestran los valores que se determinaron al medir el porcentaje de azúcares reductores totales de cada una de las fermentaciones cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentación.52 % 3.49 % 11.08 pH 5.02 % 14.36 % 9.34 % 2.05 % 3.60 % 13.83 % 5.49 % 4.02 % 14.18 % 2.35 % 10.69 % 4.05 % 4.04 % 9.08 % 6.05 gr 0.54 % 13.51 % 9.

3 (pH de 3.En la gráfica 4. se observó en el fermento no.12 y 1. 51 . porque presentan una disminución gradual de los ART ’s.3117 de acidez) se comporta de manera distinta a los demás debido a su pH bajo. 1 y no. Determinación del porcentaje de azúcares reductores totales. El mejor comportamiento. el comportamiento es aceptable. 5. 4. el cual inhibe a la levadura y ésta no lleva a cabo la fermentación de manera correcta. mientras que en el fermento no. 2 y no. puede observarse que el primer tratamiento de las fermentaciones no. Gráfica 4.

El fermento no. En las fermentaciones no. es el de 27 % de ART’s. pero este no es constante.12 es diferente al de pH de 5. mientras que en el fermento no. el tratamiento con la media más alta. es decir. donde el fermento no. en la cual.05 gr de levadura. Numéricamente. son iguales entre sí.18 gr y 0. donde solamente la acidez al 0. 5.2751 % y en el resto de los tratamientos se encuentran similares. 5 se observan las mayores diferencias significativas entre sus tratamientos correspondientes. sin embargo. 4 presenta una notoria diferencia entre los tratamientos con temperaturas de 25 °C.En la tabla 9. 3. 30 °C. hay un comportamiento de disminución conforme transcurre el tiempo. 4 y no. se observan los resultados del análisis estadístico en base a la prueba de Tukey. los tratamientos restantes pertenecientes a este fermento. esto es porque es el tratamiento que se modificó con la mayor cantidad de azúcares. El mismo caso es presentado para el fermento no. relativamente también se debieron consumir en gran cantidad. en los resultados del análisis estadístico de los ART’s.0203 % es diferente a la de 0. donde pueden observarse diferencias significativas en cada una de las fermentaciones. el comportamiento irregular es más notorio al observarlo gráficamente. no se encuentran diferencias significativas. Lo cual significa que tienen un comportamiento irregular. En el fermento no. por lo que cada uno expresa una marcada diferencia. Estos resultados los podemos observar también en la gráfica 4.94. aquí solamente el tratamiento a pH de 3. ya que todos son diferentes entre ellos. 2 presenta el mismo comportamiento que el anterior. 1 se observa que los tratamientos con 0. 52 . por lo tanto. son diferentes entre ellos. 35°C y 37 °C.

82 B C C C 14.72 8.18 gr 0.05 7.12 5.05 7.84 0. 3 Fermento No.842 6.84 7.692 0.898 7.136 8.7 7. 1 Concentración de levaduras 53 .0203 % 0. Tukey A A A A A A A B A B B B B B A B B B B B A A B B B B B B B A A A A A A Media ART 7.08 7. Análisis estadístico de los azúcares reductores totales de las fermentaciones (P< 0.096 12.42 10.690 Tratamiento 0.05).42 12.94 4.842 22.424 5.07 gr 0.842 7.28 9.56 9.Tabla 9.72 8. 2 Acidez pH B B D D D Fermento No.14 gr 0.842 7. 4 Temperatura Fermento No.0813 % 1.33 5. 5 % ART´s Fermento No.3117 % 37 °C 25 °C 30 °C 20 °C 35 °C 27 % 19 % 14 % 11 % 10 % Fermento No.2751 % 0.1 gr 0.05 gr 3.718 6.

35 8. puede observarse.24 12.07 11.15 25.3 Fermento No.64 10 16.29 9.07 96 hrs 11.2 21. que en el fermento no.2 48 hrs 14.77 16.17 13.45 6.6 15. mientras que en el fermento no.69 13.1 gr 0.2 13.2 11.0203 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C Fermento No.8 10.57 10.5 % ART´s 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % En la gráfica 5.2 18.2 9.18 72 hrs 12.2 16.07 gr 0.4 14.88 8. Determinación de los grados Brix.2 11.2 10 9.3117 % 0.97 14.2 9.2 9. 54 .89 13.2 11.2 13.05 gr 0.2 12.6 11.2 Porcentaje de Concentración de pH acidez levaduras 0.2 12.14 7.24 12.6 9.44 9.12 16.4 16.48 16.25 15.49 15.6 10.6 9. se muestran los valores que se determinaron al medir los grados Brix de cada una de las fermentaciones cada 24 horas hasta las 96 horas de la fermentación.94 pH 7.2 11 15.6 18.72 11.2 19.4 14.75 23.77 16.6 15.14 5. Tratamiento 0 hrs 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 17 11 15 17 22 28 24 hrs 15.4 13.84 13.4 14.12 es muy bajo (ácido).4 19.14 gr 0.87 5.8 10.2 15. Estos resultados pueden observarse posteriormente de forma gráfica.2 12 12.35 Fermento No.07 11.12 13.4 15 8.4 15.45 15. 4 la disminución de grados Brix fue de manera uniforme en cada uno de los tratamientos.97 14.6 9.12 pH 4. Tabla 10. 2 y no.0813 % 0.48 11.68 10.6 9.2 9. 3.2 16.84 1.52 9. se observa una pequeña disminución en el tratamiento 1 de ambas fermentaciones.18 gr pH 3.85 16.68 10.29 12.4 Temperatura Fermento No.1 Fermento No.2751 % 0. esto se debe a que el pH de 3.34 9.08 pH 5.4 13.6 16.En la tabla 10.45 12.17 26.27 7.14 9.

5 se observa que todos los 55 . 5. Determinación de los grados Brix En la tabla 11. encontrándose éstas entre los tratamientos de 0.1 gr y 0. 0.07 gr. 1 y no. se observa el análisis estadístico en base a la prueba de Tukey de los grados Brix de las fermentaciones. En el fermento no. donde puede observarse la existencia de diferencias significativas más evidentes en los fermentos no.Gráfica 5.14 gr de concentración de levadura. en el primer fermento. siendo éstos diferentes entre sí.

94 0. Numéricamente.84 5. esto puede observarse también en la gráfica 5.48 13. Tukey A A B A B C B C B C C C A B B B B B A B B B B B A A A B B B B B B A B C D E Media Brix 14.954 12.45 13.986 24. 2 Acidez pH Fermento No. 4 Temperatura Fermento No.600 16.190 Tratamiento 0.05).48 13. el tratamiento con la media más alta es el de 27 % de ART’s.56 12.378 11.82 7.08 7.738 16.28 12. Tabla 11.994 3.14 gr 0.986 3.238 13.1 gr 0. esto es debido a que con la concentración más alta de azúcares.2751 % 25 °C 20 °C 37 °C 35 °C 30 °C 27 % 19 % 14 % 11 % 10 % Fermento No.954 12. ya que estos también disminuirán relativamente junto con el consumo de azúcares.76 19. 1 Concentración de levaduras 56 . 3 Fermento No.3117 % 0.04 3.18 gr 3.28 12.12 4.738 4.0203 % 0. hay relati vamente un mayor consumo de los mismos y esto se ve reflejado al momento de determinar los grados Brix.tratamientos son diferentes el uno del otro.28 12. 5 % ART´s Fermento No. donde todos los tratamientos de éste último fermento tienen mayor dispersión entre los valores graficados.07 gr 0.05 gr 0. Análisis estadístico de los grados Brix de las fermentaciones (P< 0.28 9.0813 % 1.992 3.

Tratamiento 0 hrs 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 24 hrs 90.00 % 78.74 % 78. Determinación de la viabilidad celular.11 % 87.1 gr 0.95 % 93. Los tratamientos que presentan mayor porcentaje de viabilidad al finalizar la fermentación.05 gr de levadura) del fermento no.66 % 89.12 % 78.33 % 81.12 pH 4.2751 % 0.23 % 95.23 % 93.5 % ART´s 0.72 % Fermento Fermento Fermento No.00 % 94.33 % 89.42% 16.07 gr 0.73 % 94.14 gr 0.58 % 92.28 % 82.05 gr 0.75 % 96. 4 el cual corresponde a las temperaturas de 20 °C y 30 °C respectivamente. 57 .36 % 90.66 % 89.La tabla 12.33 % 16. Tabla 12.29 % 96 hrs 50.23 % 90.75 % 78.66 % 90. las cuales pueden observarse posteriormente de forma gráfica.23 % 93.33 % 90.2 Concentración Temperatura Porcentaje pH de levaduras de acidez Fermento No.28 % 93.84 1.28 % 93.03 % 98.23 % 93.88 % 86.33 % 86.57 % 94.75 % 90.57 % 86. 1.51 % 89.00 % 92.36 % 95.75 % 88.88 % 86.57 % 79.0203 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10 % 11 % 14 % 19 % 27 % En la gráfica 6.94 pH 7.82 % 86.93 % 97.66 % 33.66 % 16.59 % 96.12 % 78.75 % 90.46 % 33.57 % 89.4 No.33 % 64.75 % 96.50 % 72 hrs 80. Mientras que el menor índice de viabilidad se presenta en el tratamiento 5 (0.36 % 78.29 % 48 hrs 90. determina las variaciones del porcentaje de viabilidad celular en cada una de las fermentaciones.75 % 93.08 pH 5.66 % 33.10 % 94.27 % 40.3117 % 0.48 % 86.1 Fermento No.18 % 88.66 % 90.32 % 94.48 % 86. son los tratamientos 2 y 3 del fermento no.45 % 96.81 % 33.18 gr pH 3.0813 % 0.28 % 93.16 % 86.57 % 89.50 % 88.81 % 79.43 % 94. puede observarse que el comportamiento es similar en todas las fermentaciones.00 % 87.31 % 81.55 % 96.00 % 97.42 % 78.92 % 81.3 No.16 % 78.66 % 87.87 % 83.66 % 95.30 % 96.11 % 86.00 % 87.00 % 6.33 % 81.00 % 33.56 % 87.56 % 87.55 % 87.28 % 93.

Gráfica 6. 58 . Determinación de la viabilidad celular.

2 y no. donde se muestra el comportamiento del porcentaje de viabilidad. 5 presentan diferencias significativas entre sus tratamientos. Al igual que en los casos anteriores. mientras que en el fermento no. lo cual significa que es recomendable usar esta temperatura durante el proceso de fermentación del Mezcal. o sea casi al final de que ésta se produjo totalmente. 59 . 4. donde la expectativa es que conforme transcurre el tiempo de fermentación. puede observarse en la tabla 13 de los resultados del análisis estadístico para la determinación de la viabilidad celular. ya que mantiene una viabilidad celular relativamente constante. sólo el tratamiento con una concentración de levadura de 0. Puede determinarse que en el fermento no.Los resultados del último análisis estadístico realizado en este trabajo. 1.18 gr y esto puede relacionarse a que el primero presenta la menor concentración de levadura al inicio de la fermentación. los tratamientos a temperaturas de 25 °C. si no hasta aproximadamente las 90 horas de la fermentación. Los fermentos no. estadísticamente tiene diferencias significativas en relación con los demás tratamientos.5 gr es diferente al de 0. 37°C y 35°C son todos diferentes entre ellos. Numéricamente. 3 que no presentan diferencias significativas entre sus tratamientos. 4 y no. exista una mínima disminución del porcentaje de viabilidad de las células. que la media más alta la encontramos con el tratamiento de temperatura de 30 °C. sin que exista muerte o disminución de viabilidad de las células de manera considerable. estos resultados pueden observarse en la gráfica 6. 20 °C. mientras que el segundo es el que presenta la concentración en mayor cantidad. el cual. en el cual los fermentos no. por medio de la prueba de Tukey pueden observarse en la tabla 13.

938 86.818 0.3 A A A 92.104 90.94 4.84 5.1 gr 0.758 77.0203 % 30 °C 25 °C 20 °C 37 °C 35 °C 10 % 19 % 27 % 11 % 14 % Fermento No.092 77.158 94.14 gr 0.76 91.822 94. 3 Fermento No.954 77. 5 % ART´s A A A A B B B B B 60 .0813 % 0.3117 % 0.104 90.758 77.246 77.158 74. Análisis estadístico de la viabilidad celular de las fermentaciones (P< 0.098 93. 2 Acidez pH B B B B B B B Fermento No.158 94.25 94. Tukey Media Viabilidad 79.732 96.158 75.05).18 gr 0. 1 Concentración de levaduras A A A A A A A B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Fermento No.Tabla 13. 4 Temperatura Fermento No.05 gr 7.38 94.08 1.07 gr 0.44 73.2751 % 0.158 Tratamiento 0.

1 Concentración de levaduras 0.94 pH 7.6 9.9 17.8 17.07 gr 0.31 % 0.5 10.4 Temperatura Fermento No.18 gr pH 3.05 gr 0. dicha determinación es mostrada en la tabla 14.6 15.6 13.Por último.2 17.1 gr 0. Tabla 14.90 % 10.6 13.4 No Determinado 17.8 23.5 1. Determinación del porcentaje de alcohol volumen a 20 °C Tratamiento Fermento No.0 Fermento No.08 % 0.5 % ART´s 9.7 15.2 pH Fermento No.49 % 61 . se realizó la determinación del porcentaje del grado alcohólico mediante las especificaciones de la NMX-V-013-NORMEX-2005.6 6.3 Porcentaje de acidez Fermento No.08 pH 5.1 16.14 gr 0.02 % 18.7 14.7 No Determinado 17.72 % 14.6 16.84 1.12 pH 4.4 13.02 % 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C Grado alcohólico 16.28 % 0.6 16.6 16.64 % 27.

28% 3. 4 Concentración de pH Acidez Temperatura Levaduras 0. se observan los resultados mostrados en la tabla anterior. Vol. en la cual se puede observar que se obtuvo un rendimiento mayor en la muestra del fermento no.En la gráfica 7. 2 Fermento No.02% Fermento No. Gráfica 7.8 % de alcohol.94 7.14 gr Fermento No. a 20°C 0.12 4.31% 0. 1 Fermento No.1 gr 0.5 % alcohol.18 gr 0.05 gr 0. Mientras que la muestra del fermento no. donde se obtuvo 23. Determinación del porcentaje de alcohol volumen a 20 °C.07 gr 0. Grado Alcohólico 25 20 15 10 5 0 % Alc. 3 Fermento No. 5 ART 27% 62 .9 % de ART’s. En dos muestras no fue posible medir el grado alcohólico porque la cantidad de muestra obtenida no fue la suficiente para hacer la determinación. solo se obtuvo 1. 5 del tratamiento de 9.08% 0. 4 en el tratamiento a temperatura de 30 °C.84 20 °C 25 °C 30 °C 35 °C 37 °C 10% 11% 14% 19% 1.08 5.

07 %. fueron a una concentración de levadura de 0. con 0. pH. grados Brix. con 14 % de azúcares y a una temperatura de 30 °C. obteniendo con estas condiciones. con el fin de evaluar el comportamiento que llevó a cabo la concentración de levaduras. se observó que las mejores condiciones a las que las fermentaciones reaccionaron. acidez. con un pH de 4.. azúcares y porcentaje de viabilidad celular. temperatura. el mayor grado alcohólico para la producción de Mezcal 63 .2751 % de acidez.VIII.CONCLUSIONES Después de haber modificado las condiciones fisicoquímicas a las que se produjo la fermentación de cinco mostos con valores iniciales iguales.08. a 17 °Brix.

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APÉNDICE Acidez  Solución de Fenolftaleína Pesar 0. 69 . Adicionar un poco de solución de etanol al 50 % para disolver.  NaOH 50% Pesar 50 g de Hidróxido de sodio (NaOH) y disolver en un vaso de precipitado con aproximadamente 100 ml de agua destilada. aforar con etanol al 50 % y homogeneizar.  Solución de Fenolftaleína Pesar 0. transferir a un matraz de aforo. Guardar la solución en un frasco gotero color ámbar.5 gr de fenolftaleína y transferirlos a un matraz volumétrico de 50 ml.5 gr de fenolftaleína y transferirlos a un matraz volumétrico de 50 ml. Una vez disuelto.06 = meq de Ácido Acético Azúcares Reductores Totales.X. CALCULOS: 𝑵𝒙𝑽𝒙𝟎.. Adicionar un poco de solución de etanol al 50 % para disolver. aforar con etanol al 50 % y homogeneizar. 𝟎𝟔 % 𝑨𝒄𝒊𝒅𝒆𝒛 = ( ) (𝟏𝟎𝟎) 𝒗 N = Normalidad de la solución de NaOH usado para titular V = Volumen de la solución de NaOH usado para titular v = Volumen de la muestra 0. Una vez disuelto. Guardar la solución en un frasco gotero color ámbar.

Guardar en un frasco ámbar y Conservar en lugar fresco. Dejar reposar por 24 hr y aforar nuevamente agitando la solución para homogeneizar. Completar el volumen con agua destilada hasta 500 ml. fuera del alcance de la luz. pesar 50 g de Hidróxido de sodio (NaOH) y disolver en un vaso de precipitado con aproximadamente 100 ml de agua destilada.  Solución B: Pesar 173 g de Tartrato de Sodio y Potasio tetrahidratado (KNC4 H4O6. Por otra parte.639 gr de Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4. con agitación. junto con la solución de Tartrato de sodio y potasio. Dejar en reposo hasta que clarifique y filtra a través de lana de vidrio o con un crisol gooch con capa de asbesto.5H2O) y transferir a un matraz volumétrico de 500 ml. Agregar agua destilada hasta la marca de 500 ml y homogenizar perfectamente la solución. Dejar en reposo hasta que clarifique y filtrar con papel filtro (Whatman No. Adicionar de 250 a 300 ml de agua destilada y agitar el matraz hasta disolver perfectamente el sulfato de cobre. Reactivo de Fehling:  Solución A Pesar 34. 4). 70 . Adicionar al matraz volumétrico de 500 ml. con agitación. guardar en botella de vidrio resistente a la alcalinidad.4H2O) disolver en un volumen de 250 a 300 ml de agua destilada y transferir a un matraz volumétrico de 500 ml. Homogenizar perfectamente la solución.

5 ml de la solución de ácido clorhídrico concentrado.1N. Solución de Azul de metileno Pesar 1. La hidrólisis puede acelerarse colocando la solución de sacarosa con el HCl en baño maría a una temperatura de 68 . Completar entonces el volumen del matraz hasta el aforo de 500 ml. Tapar el matraz y dejar en reposo a temperatura ambiente por 72h hasta completar la hidrólisis. Después de este tiempo. Agregar un poco de agua destilada para disolver. neutra. Una vez disuelto. Considerando que los 15min deben comenzar a contarse cuando la solución alcance la temperatura indicada. En cualquiera de estos dos casos.5). comenzando la neutralización con NaOH 2N y al final con NaOH 0. Adicionar lentamente y escurriendo por las paredes del matraz. Se afora con agua destilada y se homogeniza perfectamente.0 a 8. en refrigeración y utilizarla en un plazo no mayor a 2 días. para lo cual se utiliza fenolftaleína como indicador.0 g de azul de metileno y transferirlo a un matraz de 100 ml.70 °C por 15 min. agitar con movimiento rotatorio.7500 gr de sacarosa previamente secada en estufa a 60°C. o en desecador durante una semana. hasta obtener el color rosado débil en el vire de la fenolftaleína (que indica un pH final de 7. con agua destilada y homogeneizar perfectamente con agitación y finalmente guardar en frasco de vidrio. y se lleva a un matraz volumétrico de 250 ml. enfriar la solución hasta la temperatura ambiente. Añadir aproximadamente 50 ml de agua destilada para disolver los cristales. y se transfieren a un matraz volumétrico de 500 ml. completada la hidrólisis.  Estandarización de la Solución de Fehling Se toman 50 ml de la solución de azúcar invertido.  Solución patrón de azúcar invertida. Guardar la solución en un frasco gotero color ámbar. Pesar 4. ajustar a la marca con agua destilada y homogenizar. 2. es necesario neutralizar la solución. 71 . hasta peso constante.

para considerar esta solución estandarizada. deberá añadirse Sulfato de cobre disuelto. sin que se interrumpa la ebullición. Una vez iniciada la ebullición. El volumen de la solución de azúcar invertido utilizada para la titulación de la solución de Fehling debe ser de 20. adicionar de 5 a 6 perlas de vidrio para controlar la ebullición. 18 ó 19 ml de la solución de azúcar invertido y mezclar. (V) x 100 x F. Verter esta solución a una bureta de 50 ml. adicionar 5 ml de la solución de Fehling A. deberá realizarse nuevamente la titulación de esta solución para comprobar el gasto final.F.37 ± 0. 5 ml de la solución de Fehling B y 20 ml de agua destilada. En cualquiera de los casos anteriores. B (C) F.Esta dilución contiene 2 mg de azúcar invertido por ml (2 mg/ml). Anotar el volumen de azúcar invertido utilizado para la titulación.D. deberá diluirse la solución de Fehling con agua destilada. El tiempo. La titulación deberá realizarse por duplicado. Por otra parte. si se gasta más. desde que inicia la ebullición de la solución de Fehling. Agregar. Si se gasta menos.05 ml. hasta que termina la titulación debe ser de tres minutos. Calentar. en un matraz Erlenmeyer de 300 ml. CÁLCULOS % azúcares reductores = F.F. en una parrilla eléctrica o mechero. Agitar para mezclar. esperar por 2 minutos y agregar 3 gotas de la solución de azul de metileno y. de la bureta. hasta ebullición. En este momento termina la titulación.= factor de fehling 72 . agregar gota a gota la solución de azúcar invertido hasta que desaparezca completamente el color azul y se torne rojizo.

73 . Viabilidad  Colorante azul de Tripano 0.4 % Preparar 100 ml de colorante pesar 0.V = volumen del aforo de la primera dilución B = volumen de solución de la muestra hidrolizada utilizada en la titilación C = peso de la muestra en gramos F. Mezclar y almacenar en un frasco ámbar.D.4 g de azul de Tripano y agregar 100 ml de agua destilada. = factor de dilución de la muestra (alícuota/volumen total).