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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS

“Francisco García Salinas”
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOÓGICAS
“METODOLOGÍA PARA EL AÌSLAMÌENTO DE ADN Y EXTRACCÌÓN DE
PROTEÍNAS EN MAGUEY MEZCALERO (Agave salmiana)”
T E S I S
PARA OBTENER EL NÌVEL DE
ICENCIADO EN BIOOG!A
" R E S E N T A
S#r$io %#rr#ra Día&

Zaca'#cas( Zac) S#*'i#+,r# -#l ./01
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“Francisco García Salinas”
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOÓGICAS
“METODOLOGÍA PARA EL AÌSLAMÌENTO DE ADN Y EXTRACCÌÓN DE
PROTEÍNAS EN MAGUEY MEZCALERO (Agave salmiana)”
T E S I S
PARA OBTENER EL NÌVEL DE
ICENCIADO EN BIOOG!A
" R E S E N T A
S#r$io %#rr#ra Día&
DIRECTOR DE TESIS2 M) #n C) E-$ar #3n Es*ar&a I,arra
Dr) #n C) Francisco 4a5i#r Ca,ral Ar#llano
CO6DIRECTOR DE TESIS2 Dr) #n C) 4or$# 7is A8ala 79an

Zaca'#cas( Zac) S#*'i#+,r# -#l ./01
AGRADECIMIENTOS
La presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,
participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, teniéndome
paciencia, dando ánimo, acompañando en todo momento.
A la Universidad Autónoma de Zacatecas: en especial a
la Unidad Académica de Ciencias Biológicas por
darme la formación profesional de Licenciado en Biología.
A mis asesores: Al M. en C. Edgar León Esparza
Iarra y al !r. "rancisco #avier Caral Arellano por la
dirección de este trabajo, todo el apoyo brindado y las facilidades para trabajar en
el Laboratorio de Biotecnología.
A la Unidad Académica de Ciencias $uímicas en
especial al !r. #orge Luis A%ala Lu&an y a la M. en C.
Marisa 'ern(ndez Barrales integrantes del Laboratorio de
Patología y Diagnóstico Molecular.
A todos a)uellos que de alguna manera contribuyeron en la realización
de este trabajo, así como a la M. en C. Lucia !elgadillo *uiz y
a la $"B. +erla Ivonne ,allegos "lores por el apoyo
brindado.
DEDICATORIA
A mi padre:
Sergio Herrera Leos por el apoyo incondicional, por los valores que me
ha inculcado y que ha contribuido en mi formación como profesionista.
A mi madre:
Genoveva Díaz Zamora por darme la oportunidad de seguir adelante y
tener fe en mí en este trayecto.
A mi Hijo:
Khalid Alejandro Herrera Quiñones, por ser el motor en mi vida.
A mi hermana:
Yadira Gisela Herrera Díaz por darme apoyo a lo largo de la carrera.
A mis amigos:
Los que han pasado y los que han quedado. Gracias por su amistad, además de
todos aquellos momentos de debate o discusión que también contribuyeron a mi
formación.
INDICE DE FIGURAS
Página
1 Representación simplificada de las membranas celulares. 9
2 Solubilización de los lípidos. 10
3 Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico. 11
4 Corte transversal y toma de muestras para extracción de proteínas. 20
5 Material usado para extracción de ADN. 22
6 Espectrofotómetro UV (Q 5000 de Quawell®). 26
7 Cámara utilizada para electroforesis en geles de agarosa. 27
8 Cámara utilizada para Electroforesis en geles de poliacrilamida. 33
9 Gel de agarosa del ensayo con DNAzol. 34
10 Gel de agarosa con 2 µL de ADN total por muestra, usando CTAB-
STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent® mas RNasa.
36
11 Gel de agarosa con 2 µL de ADN total por muestra, usando Miniprep
CTAB. 38
12 Gel de agarosa con 2 µL de ADN total por muestra, usando
PlantDNAzolReagent® mas RNasa. 39
13 Gel de poliacrilamida 41
14 Curva patrón de albúmina sérica bovina y ecuación para la
cuantificación de muestras de proteína. 43
15 Gel de poliacrilamida con 15 µL de muestra preparada. 44
16 Gel de poliacrilamida con 20 µL de muestra preparada. 44
INDICE DE CUADROS
1 Valores para realizar la curva patrón de proteínas. 30
2 Cantidades de reactivo para preparar el gel concentrador y gel
separador.
32
3 Datos promedio del análisis con espectrofotómetro UV de ADN
aislado con el protocolo PlantDNAzolReagent®.
34
4 Datos del análisis con espectrofotómetro UV del protocolo CTAB-
STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent® mas RNasa
35
5 Descripción de la electroforesis usando CTAB-STE y segundo
ensayo con PlantDNAzolReagent® mas RNasa.
36
6
Datos del análisis con espectrofotómetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo mini-prep CTAB.
37
7 Datos del análisis con espectrofotómetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo PlantDNAzolReagent®.
37
8 Estimación del tiempo requerido para procesar las muestras para
aislamiento de ADN.
40
9 Lectura de absorbancia por espectrofotometría de las muestras de
proteína extraídas usando buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
40
10 Lectura de absorbancia por espectrofotometría de las muestras de
proteína en Agave salmiana de yema apical, piña y hoja, usado
para la extracción buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
42
11 Cuantificación de proteína, sustituyendo valores en la ecuación de
la curva patrón.
43
12 Cantidades necesarias, para realizar un gel separador a diferentes
concentraciones de poliacrilamida.
62
13 Lecturas del espectrofotómetro UV (Q 5000 de Quawell® por
ensayo.
65
RESUMEN
En este trabajo se determinó una metodología adecuada para el
aislamiento del ácido desoxiribonucleico (ADN) y la extracción de proteínas en
Agave salmiana, como apoyo a investigaciones proyectadas en la región
mezcalera del Altiplano Potosino - Zacatecano.
Para el aislamiento de ADN se realizó el ensayo y compararon tres
protocolos, el método mini-prep usando CTAB (Bromuro de cetiltrimetilamonio), el
método modificado CTAB-STE y el producto comercial PlantDNAzolReagent®.
Para la extracción de proteínas se compararon dos metodologías, la primera
mediante el buffer de extracción NET-2 y el método por precipitación salina
usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio.
El método que permitió mayor cantidad (hasta 660 ng a partir de 0.5 g de
tejido fresco) y calidad del ADN fue el de CTAB-STE, (aunque lleva mayor tiempo
en procesar las muestras) y le siguió el producto comercial PlantDNAzolReagent®
con RNasa, que reduce el tiempo de tratamiento de las muestras con resultados
cercanos al optimo en Absorbancia (A260/280) y ambos ADN con capacidad de
amplificación.

Para la extracción de proteínas se consideró adecuado el método adaptado
de Gorinstein et por precipitación salina usando buffer Tris-HCL y acetato de
amonio ya que permitió observar con buena resolución dos bandas de proteína de
entre 25 kDa y 40 kDa aproximadamente. La presencia dependió del tipo de tejido,
siendo la parte de la yema apical, el tejido que permitió mejor extracción.
ABSTRACT
Ìn this work was determined an appropriate methodology for the isolation of
deoxyribonucleic acid (DNA) and protein extraction in Agave salmiana, designed
as a support to research in the region mezcal Potosi-Zacatecas Altiplano.
For isolation of DNA testing was performed and compared three protocols, the
mini-prep method using CTAB (cetyltrimethylammonium bromide), modified
method CTAB-STE and PlantDNAzolReagent ® commercial product. For protein
extraction compared two methods, the first through the extraction buffer NET-2
(Nambara et al., 1992) and the method by salt precipitation (Gorinsteinet al. 1999;
Silos et al., 2003) using buffer Tris-HCL and ammonium acetate.
The method allowed a greater amount (up to 660 ng from 0.5 g of fresh tissue) and
DNA quality was that of CTAB-STE, (although it takes more time to process the
samples) and followed the commercial product PlantDNAzolReagent ® with RNase
, which reduces the processing time of the samples with near optimal performance
in absorbance (A260/280) and both DNA having amplification capability.
For protein extraction method was considered adequate adapted from
(Gorinsteinet al. 1999; Silos et al., 2003) by salting out using Tris-HCl buffer and
ammonium acetate since it possible to observe with good resolution two protein
bands between 25 kDa and 40 kDa. The presence depends on the type of tissue
being part of the heart, tissue allowing better extraction.
INDICE GENERA
Ì. Ìntroducción........................................1
1.1. Diversidad y problemáticas del género Agave...........1
1.2 El Agave en el Altiplano Potosino-Zacatecano ............. 4
1.2.1 El Agave salmiana........................4
1.2.2 Clasificación botánica ......................5
1.2.3 Distribución geográfica .....................6
1.2.4 Usos...............................7
ÌÌ. Revisión de literatura.............................8
2.1 Aislamiento de ADN .......................8
2.2 Métodos de aislamiento ..........................9
2.2.1 CTAB (Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio) ...............9
2.2.1.1 Principios de método CTAB .........................9
2.2.1.2 Lisis de la membrana celular....................9
2.2.1.3 Extracción ...........................12
2.2.1.4 Precipitación ......................... 12
2.2.2 PlantDNAzolReagent® ................... 12
2.2.2.1 Descripción general ..................... 12
2.2.2.2 Beneficios y características .................15
2.3 Cuantificación de ADN por espectrofotometría............. 13
2.4 Electroforesis en Gel de agarosa ................. 14
2.5 Extracción de proteínas por precipitación salina ..........15
2.6 Cuantificación de proteínas por el método Bradford ..........16
2.7 Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida ........16
ÌÌÌ. Justificación................................17
ÌÌÌ. Hipótesis ..............................18
ÌV. Objetivos ....................................19
3.1 Objetivo general..........................19
3.2 Objetivos específicos.......................19
V. Materiales y métodos ........................20
5.1 Colecta y conservación de muestras ................. 20
5.2 Aislamiento de ADN ......................20
5.2.1 Protocolo CTAB-STE ....................21
5.2.2 Protocolo Miniprep CTAB .............. ..... 23
5.2.3 Protocolo PlantDNAzolReagent® ................ 23
5.3 Cuantificación de la concentración de ADN ............25
5.4 Electroforesis en geles de agarosa .................26
5.5 Extracción de proteínas ..................... 28
5.5.1 Extracción con NET-2 ..................... 28
5.5.2 Extracción por precipitación con acetato de amonio ........ 28
5.6 Cuantificación de la concentración de proteína ........... 29
5.6.1 Curva patrón de proteína .....................29
5.6.2 Determinación por método Bradford ...............30
5.7 Electroforesis en geles de poliacrilamida .............31
5.7.1 Tinción de bandas de proteína .................. 32
VÌ. Resultados ...........................34
Aislamiento de ADN en Agave salmiana ............... 34
6.1.1 Ensayo usando PlantDNAzolReagent® ...............34
6.1.2 Ensayo con CTAB-STE y PlantDNAzolReagent® ...............35
6.1.3 Ensayo por Mini-prep CTAB ...... .......... 37
6.1.4 Ensayo con PlantDNAzolReagent® sobre diferentes tejidos ..... 38
6.2 Extracción de proteínas en Agave salmiana............. 40
VÌÌ. Discusión ............................46
7.1 Asilamiento de ADN de Agave salmiana.............. 46
7.2 Extracción de proteínas de Agave salmiana............. 46
VÌÌÌ. Conclusiones ..........................48
8.1 Recomendaciones ........................ 48
ÌX. Bibliografía ..........................50
X. Anexos ............................55
I) INTRODUCCIÓN
0)0 Di5#rsi-a- 8 *ro,l#+:'icas -#l $;n#ro Agave
En México se encuentran 150 de las 200 especies que pertenecen al
género Agave más 36 taxa infraespecíficos, siendo además endémico de América
(García, 2002). México no es solo su centro de mayor riqueza, con el 75% de las
especies del género sino también su centro de domesticación (Gentry 1982).Se
estima que la diversificación bajo cultivo y selección humana, comenzó hace 9 000
años por lo menos (Callen, 1965), este tiempo se a dividido en tres periodos, de
acuerdo a su utilización y que a determinado el criterio para seleccionar las
variedades en cada etapa: 1) alimento, 2) bebidas fermentadas y 3) bebidas
destiladas (mezcales) (Colunga y Zizumbo, 2006). Las variedades cultivadas de
forma tradicional o comercial durante los 9 000 años que lleva su aprovechamiento
en México no han sido descritas académica o legalmente, por lo que las unidades
taxonómicas más utilizadas para describir la diversidad de estos recursos
fitogenéticos en México han sido hasta ahora, especie, subespecie y variedad
botánica (CONABÌO, 2009).
Existen indicios de que se han generado gran cantidad de variantes durante
el tiempo de utilización de los agaves, aunque son pocos los estudios sobre la
diversidad agromorfológica a nivel infraespecífico. En un análisis sobre la
diversidad de agaves cultivados para producir bebidas destiladas (mezcales),
realizado al sur de Jalisco, se encontraron más de 20 cultivares tradicionales de
los cuales hay evidencia de su diferenciación agromorfológica y genética (Colunga
y Zizumbo 2006; Vargas et al. 2007, 2009).
-
Colunga et al., (2007) infiere que hay alrededor de 832 variedades
tradicionales de agaves usadas en México como alimento animal, alimento
humano, bebidas fermentadas, bebidas destiladas y fibra. Esta inferencia la
realizan a partir de los resultados obtenidos en la revisión de 180 fuentes
bibliográficas y ocho herbarios, en donde encontraron 832 nombres asignados
tradicionalmente a 98 taxa (Gentry, 1982). Entre estos hay 72 especies, 13
subespecies y 13 variedades que reciben estos usos. Es necesario confirmar esta
cifra ya que puede representar una estimación errónea de los datos. Seguramente
al realizar estudios regionales a profundidad se incrementaría el número de
variedades tradicionales en ciertas regiones. Su revisión taxonómica también
podría incrementar el número de taxa en ciertas áreas, y establecer sinonimias
que lo disminuirían en otras (CONABÌO, 2009).
Los estudios sobre su diversidad genética también son escasos. Los datos
disponibles indican que las variedades cultivadas tradicionalmente mantienen una
diversidad genética similar a la encontrada en poblaciones silvestres (Vargas et
al., 2009). En contraste, en las poblaciones manejadas en plantaciones
comerciales su diversidad ha disminuido cada vez más, hasta llegar prácticamente
a la homogeneidad genética. Esta tendencia ha sido favorecida por la posibilidad
de propagar vegetativamente las variedades seleccionadas y, más recientemente,
por la utilización de técnicas de propagación clonal (micropropagación). Tal es el
caso del henequén (Galindo et al., 2004) y el agave tequilero (Gil et al., 2006).
Las especies de agave en México se distribuyen de manera natural en
todos los estados con excepción de Tabasco. Desde el nivel del mar hasta los 3,
000 m, siendo más abundantes entre los 1, 000 y 2, 000 m. Crecen en dunas
costeras, matorrales xerófilos, selvas bajas caducifolias, bosques de pino-encino e
incluso en los bosques mesófilos de montaña. Las regiones de mayor riqueza de
especies son el Valle de Tehuacán-Cuicatlán, la Sierra Madre Occidental, la zona
árida entre Tamaulipas y San Luis Potosí, la zona árida hidalguense, el Eje
Neovolcánico en los límites de Michoacán y el Estado de México, el centro de
.
Jalisco, las montañas de Oaxaca y Chiapas, y los límites de la Altiplanicie y la
Sierra Madre Oriental (García, 1995).
La mayor parte de la diversidad de los recursos genéticos del género es
utilizada por los agricultores tradicionales, tanto para autoconsumo como para
comercialización. Solo pocos agricultores y compañías la utilizan con fines
comerciales sin hacer un consumo directo de ella. Los agricultores tradicionales
emplean una gran cantidad de variedades locales en forma habitual y mantienen
una amplia base genética de ellas. En contraste, las agroindustrias hacen un uso
muy restringido de la diversidad y mantienen una base genética muy estrecha.
Como ejemplo, se ha encontrado que un solo productor mantenía 11 variedades
mezcaleras dentro de su parcela, mientras que la agroindustria del tequila solo
utiliza la variedad azul de A. tequilana en la misma zona, y en toda su área de
distribución. Lo mismo ocurre en la agroindustria henequenera, que solo utiliza la
variedad tradicional sackide A. fourcroydes (Colunga y Zizumbo, 2006).
Dada la estrecha base genética de algunos cultivos, debido a su
propagación vegetativa, se está buscando incrementar su diversidad por medio de
técnicas biotecnológicas. Estos programas no contemplan la utilización de la
diversidad existente en los acervos genéticamente cercanos, como los parientes
silvestres y otros cultivares derivados del mismo acervo ancestral (CONABÌO,
2009).
Dado que muy poco del germoplasma disponible en el género Agave ha
pasado a un cultivo comercial, es de esperarse que sus niveles de diversidad se
hayan mantenido altos. Las acciones de generación y conservación de la
diversidad se han llevado a cabo, principalmente, por los agricultores tradicionales,
quienes mantienen en sus parcelas la selección continua de germoplasma
silvestre, el manejo de poblaciones del gradiente silvestre domesticado y la
conservación de cultivares antiguos, como ha sido documentado para el
germoplasma mezcalero en el sur de Jalisco (Colunga y Zizumbo, 2006).
/
La conservación y generación de nuevo germoplasma será relevante para
el futuro de las industrias que cobran cada vez más importancia, como la de los
mezcales y la del tequila, y que ya han enfrentado problemas fitosanitarios debido
a la homogeneidad genética de los cultivos. Se requiere, sin embargo, un cambio
en su enfoque productivo y legal, que busque la diversificación en lugar de la
homogenización (CONABÌO, 2009).
0). El Agave #n #l Al'i*lano "o'osino6Zaca'#cano
Los agaves se distribuyen en una amplia región del árido mexicano con
gran diversidad de especies. En los lugares donde se localiza se hace uso del
agave como alimento, forraje, fibras textiles o como materia para otro proceso,
según sus características y abundancia (Ramírez et al., 2000). En el Altiplano
Potosino-Zacatecano el maguey mezcalero (Agave salmiana) ocupa grandes
extensiones y es utilizado principalmente para su industrialización en la
elaboración de la bebida alcohólica conocida como “Mezcal¨ (Aguirre et al., 2001).
La elaboración de Mezcal entre los poblados de esta región es de gran
importancia social y económica como generadora de empleos directos o
indirectos, por lo que numerosas instituciones han dirigido esfuerzos para el
estudio de esta planta desde su diversidad, fisiología y componentes bioquímicos,
hasta los procesos actuales de cultivo e industrialización con el objeto de
mejorarlos o sustentarlos además de la comercialización y legalización.
0).)0 El Agave salmiana
El agave mezcalero potosino (Agave salmiana) forma parte de la familia
Agavaceae, es endémico de América y se distribuye desde el sur de Canadá
hasta el Caribe pasando por Estados Unidos, México, Centroamérica y norte de
Sudamérica; ha sido una de las especies más importantes en la historia del país,
0
debido particularmente al aprovechamiento de su sabia fresca (aguamiel) o
fermentada (pulque), lo que motivó su cultivo y dispersión (García, 1992).
El Agave salmiana es una planta robusta, monocotiledónea, de tamaño
mediano a grande, compuesta por hojas o pencas que se insertan en espiral,
dándole la forma de una roseta, posee una raíz fibrosa y revestida de escamas, en
general forma rosetas macizas de 1.5 a 2 m de alto e igual o el doble de ancho.
Sus hojas son carnosas y macizas; de jóvenes son rectas y ligeramente
separadas en su eje central, de adultas se curvan hacia el suelo y adquieren una
coloración verde grisácea, son profundamente convexas por el enves y cóncavas
por el haz; son largas, acanaladas, simples, enteras, más o menos lanceoladas,
con el ápice agudo de color verde oscuro, presentan una espina terminal pungente
de 5 a 8.5 cm de largo y con abundantes espinas laterales.
La inflorescencia es una panícula, robusta, de 6 a 8 m de altura, quiote con
15 a 24 pedúnculos o ramas laterales, el escapo floral presenta brácteas carnosas
y suculentas. Sus flores son hermafroditas, tienen ovario ínfero, perianto de 6
piezas, androceo de 6 estambres largos, gineceo constituido por un ovario
oblongo y cilíndrico, trilocular, multiovalado, estilo central y con los frutos
superpuestos. El fruto es una cápsula oblonga con 6 casillas longitudinales y 3
lóbulos. Las semillas son negras, triangulares, con el embrión recto y el
endospermo carnoso. Su periodo de floración ocurre entre los meses de mayo a
julio; por otro lado, se estima que el periodo de vida del agave mezcalero potosino
es de 16 años a partir de que emerge la plántula de semilla o del hijuelo, hasta su
recolección como cabeza de maguey (Aguirre et al., 2001)
0).). Clasi<icaci3n ,o':nica
Reino: Plantae
División: Magnolio!yta
Clase: "iliosida
1
Subclase: "iliidae
Orden: Asaragales
Familia: Agavaceae
Género: Agave
Especie: Agave #almiana $tto ".
0).)1 Dis'ri,7ci3n $#o$r:<ica
El Agave salmiana se puede encontrar en el área central de México,
principalmente en los estados de Durango, Zacatecas, San Luis Potosí, Morelos,
Michoacán, Guanajuato, Querétaro, Hidalgo, Puebla y Tlaxcala. En Zacatecas y
en San Luis Potosí constituye el maguey mezcalero más importante, mientras que
en Durango es el segundo o tercero en importancia para la elaboración de mezcal.
El Agave salmiana es el principal maguey pulquero del altiplano mexicano;
prospera con éxito entre los 1,000 a 2,250 msnm, en climas que van de semiseco
a seco y con una precipitación pluvial de 320 a 720 mm anuales; del 90 al 95%
incide en verano y el resto en invierno.
El régimen térmico puede ser de templado a semicálido extremoso y la
temperatura promedio anual puede ser de 16 a 22ºC, en primavera y verano tolera
temperaturas promedio de 26ºC o extremas diarias de hasta 35ºC. Pueden crecer
en pisos de valles rocosos laderas de cerro, bajadas o abanicos aluviales, excepto
en lugares propensos a inundaciones o con problemas de sales o sodio en el
suelo.
El agave mezcalero potosino en altitudes de 2,300 msnm se acompaña con
bosque de pinos y encinos con suelos derivados de yeso y carece de limitaciones
para establecerse casi en cualquier medio físico o biótico de los climas secos o
semisecos; no obstante la mayor productividad se logra en los suelos derivados de
rocas ígneas que comprenden las áreas óptimas para su desarrollo. Actualmente
este agave se distribuye en la región de Pinos-Zacatecas, en un área de
2
aproximadamente 60,000 ha y prácticamente en la totalidad del altiplano Potosino
(Aguirre et al., 2001).
0).)= Usos
A lo largo y ancho del territorio mexicano, la utilización que se le da a los
agaves es muy variada y depende tanto del lugar y la especie como de la estación
del año. Como su nombre lo indica, el uso principal del agave mezcalero potosino
(Agave salmiana) es la producción de mezcal que se elabora a partir de los
carbohidratos concentrados en la piña de la planta (actividad que constituye la
base económica de las localidades donde se explota). Otro uso importante del
agave es la producción de aguamiel, a partir de cuya fermentación se elabora el
pulque, que además de emplearse como bebida alcohólica, también se utiliza en
la elaboración del conocido pan de pulque. Las hojas o hojas que forman parte de
los residuos agrícolas del cultivo, así como todas aquellas piñas que no son
captadas por la industria mezcalera, son utilizadas como forraje para la
alimentación de animales de corral, principalmente vacunos, caprinos, ovinos y
equinos.
Tan solo en el estado de San Luís Potosí, se estima que entre 2 a 8 mil toneladas
de agave se utilizan anualmente como forraje (Martínez et al., 2005). Las hojas se
utilizan para obtener la fibra que se utiliza para fabricar cuerdas, telas, redes y
bolsas; anteriormente también se empleaban como relleno de colchones y sillones
para autos, etc.; el quiote ha sido usado como material de construcción (Gentry,
1982). Por otro lado, en el estado de Puebla se han utilizado los agaves como
barreras naturales inmensas alcanzando una altura de 1.8 a 2.1 m y 4.5 a 6 m de
ancho, filas de 2 a 3 agaves sirven como rompe vientos y barreras contra la arena
del desierto (Martínez et al., 2005).
3
II) REVISIÓN DE ITERATURA
.)0 Aisla+i#n'o -# ADN
Existe gran variedad de protocolos eficientes y convencionales para el
aislamiento de ADN, fáciles de usar y en poco tiempo (Brusés et al., 2000). Por
mencionar algunos métodos “clásicos¨, se encuentran los descritos por Doyle y
Doyle (1987) útiles en hojas maduras, independientemente de las condiciones de
crecimiento y edad (Weir et al., 1996).
Murray y Thopsom (1980); Wang et al., (1993); Henry (1997); Jewit et al.,
(1998); Lefort y Douglas (1999); Han usado al bromuro de hexadeciltrimetilamonio
(CTAB) para aislamiento de ADN de hojas maduras. Para estudios de
caracterización de especies con la técnica de RAPD (ADN Polimórfico Amplificado
Aleatoriamente). El CTAB, se pega fuertemente al ADN, desplaza las proteínas,
previene la degradación y solubiliza muchos polisacáridos. Además, funciona
como detergente que destruye las membranas al momento de moler el material
vegetal y se remueve mediante extracciones con cloroformo (Valadez y Kalh,
2000).
Weir et al., (1996) que también menciona a Edwards et al., (1991), utilizan
SDS (Dodecil sulfato de sódio) como detergente que disocia proteínas de ADN y lo
hace más accesible a la degradación por proteinasas usadas durante la técnica
del aislamiento (Valadez y Kahl, 2000). El ARN es un contaminante, por lo que es
necesaria la adición de RNasa e incubación al final de la extracción, a diferente
concentración y temperatura dependiendo del método a utilizar (Weir et al., 1996;
Csaikl et al., 1998; Stange et al., 1998).
4
.). M;'o-os -# aisla+i#n'o
.).)0 CTAB >Bro+7ro -# %#?a-#cil'ri+#'ila+onio@
.).)0)0 "rinci*ios -# +;'o-o CTAB
Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de
hexadeciltrimetilamonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos
nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos
fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden
eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la
concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol (Somma, 2007).
.).)0). isis -# la +#+,rana c#l7lar
La primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y
nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón
(buffer) de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las
membranas biológicas presentan la misma estructura general, integrada por
moléculas de lípidos y de proteínas, unidas por interacciones no covalentes.
Tal como muestra la Figura 1, las moléculas lipídicas están ordenadas en
una doble capa continua, en la que las moléculas proteínicas están disueltas. Las
moléculas lipídicas están formadas por extremos hidrófilos, denominados cabezas,
y extremos hidrófobos, denominados colas.
5
Figura 1. Representación simplificada de las membranas celulares
1
.
En este método, el detergente (CTAB) contenido en el tampón de
extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la composición de los lípidos
y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampón de extracción
captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear. La Figura 2 ilustra
el mecanismo de solubilización de los lípidos con un detergente.
Figura 2. Solubilización de los lípidos
1
.
La Figura 3 ilustra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente
captura los lípidos y las proteínas al entrar en contacto con la membrana celular y
el tampón de extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl)
determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos.
El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros
metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio
al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl
confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior
-
Las ilustraciones proceden de: %enetic #cience "earning &enter, Univ. de Utahhttp://gslc.genetics.utah.edu.
-6
daña el ADN). Es importante señalar que, como los ácidos nucleicos se degradan
fácilmente en esta fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo
transcurrido entre la homogeneización de la muestra y la adición de la solución
tampón con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la célula y de los
orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los
cloroplastos), se purifica el ADN (Somma, 2007).
Figura 3. Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico
1
.
.).)0)1 E?'racci3n
En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos nucleicos y el
CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y los demás
lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente importante
eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir
numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl< 0,5
M), los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y
pueden eliminarse extrayendo la solución acuosa con cloroformo. El cloroformo
desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica.
La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es
densa debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior. Además,
si el pH de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 ÷ 8,0), los
ácidos nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la
extracción con cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por
completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los
ácidos nucleicos, puede retro extraerse la fase orgánica con una solución acuosa,
--
que se añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los
complejos de ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa
del procedimiento (Somma, 2007).
-.
.).)0)= "r#ci*i'aci3n
En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente, para lo
cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación
compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl> 0,8
M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado
de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de
NaCl por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más
soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los
ácidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite
una mayor purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual
(Somma, 2007).
.).). PlantDNAzolReagentA
.).).)0 D#scri*ci3n $#n#ral
Ìnvitrogen Corporation (2004), describe que el protocolo
PlantDNAzolReagent® (ÌNVÌTROGEN) contiene una solución detergente llamado
“guanidina¨ la cual hidroliza el RNA y selecciona el ADN precipitado. El protocolo
es rápido y permite el aislamiento del ADN genómico para diferentes tejidos de la
planta. El procedimiento que utiliza PlantDNAzolReagent®, cuando se muele el
tejido con nitrógeno líquido y es homogenizado, realiza la extracción y con una
centrifugación se precipita el ADN y el sobrenadante es lavado con etanol. Dando
como resultado una pelotilla de ADN.
.).).). B#n#<icios 8 carac'#rís'icas
• El protocolo completo puede realizarse de 30 a 60 minutos.
• Con solo 0.3 ml PlantDNAzolReagent® se puede extraer ADN de 0.1 g de
tejido de plantas.
-/
• Este producto puede ser usado en clonación molecular, PCR, mapeos de
moléculas, y otras técnicas de biología y sus aplicaciones.
• PlantDNAzolReagent® se encuentra estable a temperatura ambiente
durante un año después de abierto.
• Con el reactivo PlantDNAzolReagent® se pueden extraer ADN hasta de 50
mg de tejido vegetal (Ìnvitrogen Corporation, 2004).
.)1 C7an'i<icaci3n -# ADN *or #s*#c'ro<o'o+#'ría
El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mono nucleótidos pueden
cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,
midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, D$) de luz ultravioleta (también
puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la
medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases
es sencillo y exacto. En este método, los tampones acuosos con escasa
concentración iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración
de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un
blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un
“cociente¨. Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente
A'()*A'+) para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes
respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de
carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente
A'()*A',) de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente (Somma, 2007).
Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede
emplearse el método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite
calcular la cantidad de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la
fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola
con unos patrones de concentración (Somma, 2007).
-0
.)= El#c'ro<or#sis #n G#l -# A$arosa
La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar
macromoléculas en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades
físicas. El término electroforesis describe la migración de las partículas cargadas
bajo la influencia de un campo eléctrico. “Electro¨ se refiere a la electricidad y
“foresis¨, del griego !oros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel
es una técnica consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que
atraviesen una placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión
eléctrica aplicada a los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de
una molécula determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede
desplazarla a través de un medio gelatinoso. Muchas macromoléculas biológicas
importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los
nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH
determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean
cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas
cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se
aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN
cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997).
La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza
para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica
sencilla y rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden
separarse adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede
localizarse en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que
es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante (Sambrook et
al., 1989; Somma y Querci, 2007).
-1
.)B E?'racci3n -# *ro'#ínas *or *r#ci*i'aci3n salina
Antes de iniciar el estudio de una proteína, es necesario que esta se
encuentre pura: sin contaminación con otras proteínas u otras sustancias
celulares; por esta razón, el primer paso es separar las proteínas de los demás
compuestos del extracto, ya sean de células vegetales, animales o humanas, y,
para lograrlo, se utilizan diversas técnicas. Una de las técnicas más antigua,
simple y muy eficaz, se basa en la baja solubilidad que tienen las proteínas en
diluciones salinas concentradas; la sal que más se ha utilizado con este propósito
es el sulfato de amonio, (NH4)2SO4. El hecho de que una proteína se disuelva en
un medio acuoso se debe a su capacidad de formar puentes de hidrogeno con el
agua: a mayor cantidad de puentes de hidrogeno, mayor solubilidad. La acción de
la sal es liberar el agua unida a la proteína por puentes de hidrogeno, lo cual
provoca su precipitación (Quesada, 2007).
La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la
de una fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio.
Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye
la interacción proteína-H2O porque elimina la capa de solvatación, predominando
la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas. La
concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las
proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de
proteínas particulares a partir de mezclas complejas. Comúnmente se usa sulfato
de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad (760 g de sulfato
de amonio/1000 ml. de agua a una temperatura de 20°C) y porque el ión sulfato
divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas.
-2
.)C C7an'i<icaci3n -# *ro'#ínas *or #l +;'o-o Bra-<or-
Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva
Blue) a las proteínas. El colorante, en solución acida, existe en dos formas una
azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo
proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre.
Este método es sensible (1-15µg), simple, rápido, barato y pocas sustancias
interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.
.)D El#c'ro<or#sis -# *ro'#ínas #n $#l#s -# *oliacrila+i-a
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados
para la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite
separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les
somete a la acción de un campo eléctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre
un soporte inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se
utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes
(p.e. SDS), caótropos (p.e. urea) y agentes reductores (2-mercaptoetanol, DTT).
Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción,
siendo el más habitual el azul de coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es
en función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso
molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf)
de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de
peso molecular conocido (Maldonado y Jorrin, 2008).
-3
III) 4USTIFICACIÓN
El presente trabajo surge ante la necesidad de identificar metodologías para
el aislamiento de ADN y la extracción de proteínas aplicables en específico sobre
muestras de Agave salmiana. Para obtener ADN de buena calidad en una especie
en particular, frecuentemente se requiere de ensayo de diferentes métodos de
aislamiento y aunque se cuenta con información sobre aislamiento de ADN en
Agave, la composición química entre especies del mismo género suele ser muy
diversa, por lo que es necesario probar algunas metodologías en Agave salmiana
para garantizar aislar ADN de capacidad amplificable.
De igual forma es necesario definir un método para la extracción de
proteínas en Agave salmiana al haber pocos estudios que informen sobre perfiles
de proteínas de las especies de Agave. Para lo cual se requiere adaptar
metodologías aplicadas en otros géneros, como las efectuadas en el género
$untia.
Este trabajo servirá como base para realizar estudios sobre la morfología y
diversidad genética en las poblaciones de Agave salmiana del Altiplano Potosino-
Zacatecano que al ser un importante recurso en esta región, su demanda lo podría
poner en riesgo si no se cuenta con información que demuestre la necesidad de
un adecuado aprovechamiento y conservación.
-4
IV) %I"ÓTESIS
A partir de métodos establecidos para el aislamiento de ADN y extracción
de proteínas, se establece una metodología específica para el aislamiento y
extracción de ADN de calidad y proteínas del Agave salmiana, reflejando su
concentración, pureza y comportamiento electroforètico.
-5
V) OB4ETIVOS
B)0 O,9#'i5o $#n#ral
- Obtener una metodología adecuada para el aislamiento de ADN y la
extracción de proteínas en Agave salmiana, mediante el ensayo y
comparación de métodos establecidos.
B). O,9#'i5os #s*#cí<icos
- Comparar dos métodos para el aislamiento de ADN en Agave salmiana en
términos de su concentración, pureza y comportamiento electroforético.
- Comparar dos métodos para la extracción de proteínas en Agave
salmiana en términos de su concentración y comportamiento electroforético.
- Proporcionar herramientas e información útil para las investigaciones en la
región mezcalera del Altiplano Potosino - Zacatecano.
.6
VI) MATERIAES E MÉTODOS
C)0 Col#c'a 8 cons#r5aci3n -# +7#s'ras
El muestreo se realizó mediante un corte transversal del agave adulto
(Figura 4) y tomando una porción de aproximadamente 100 gramos en cada parte
de tejido de tallo, yema apical y hoja para la extracción de proteína. Para el
ensayo de los métodos de aislamiento de ADN además se tomaron hijuelos
radiculares. Las muestras se conservaron de bolsas de plástico -imloc. dentro
de una nevera con hielo hasta ser almacenadas en el laboratorio. En laboratorio
las muestras que serían usadas en tejido fresco se almacenaron en refrigeración a
4º C y las que requirieron más tiempo para su uso se almacenaron en congelador
a -20º C, como fue el caso del ensayo con proteínas.
Figura 4. Corte transversal y toma de
muestras para extracción de proteínas.
C). Aisla+i#n'o -# ADN
Para los ensayos de aislamiento de ADN, generalmente se tomaron
muestras de tejido fresco de hijuelos de Agave salmiana, en algunos se usó tejido
refrigerado, para el último ensayo se agregaron muestras de A. tequilana y A.
.-
americana. Lo anterior de acuerdo a los siguientes protocolos, con pequeñas
modificaciones para plantas suculentas.
C).)0 "ro'ocolo CTAB6STE >Falc3n 8 Val#ra( .//D@
Se molieron 0.5 g de tejido fresco con nitrógeno líquido hasta obtener un polvo
fino. Se trituro en un solo evento para no remoler la muestra excesivamente (esto
provoca que el ADN se fraccione).
Después se agregaron 260 µl de CTAB y 975µL de STE (Sodio-Tris-EDTA),
agitando hasta obtener un jarabe. (La mezcla se pasó a un tubo nuevo de 1.5 ml).
Posteriormente se le agrego 65 µl de SDS al 20 % agitando vigorosamente por 5
min e incubo a 65 ºC por 10 minutos. Después se le añadió 325µl de acetato de
potasio 5M frío e incubo a -20 ºC por 40 min. Se centrifugaron los tubos a 12 000
xg por 30 min., y se filtraron las fases acuosas con un trozo de algodón (o gasa)
estéril insertado en la boca del tubo y sobre éste recupero el sobrenadante en un
tubo nuevo.
Después se le agregaron 2/3 del volumen de sobrenadante obtenido con
isopropanol frío (-20 ºC), se mezcla suavemente e incubo a -20 ºC por 1 h.
Posteriormente se mezcló suavemente y se centrifugaron los tubos a 12 000 xg a
6C por 10 min. Se descartó el sobrenadante para dejar secar el botón de ADN y re
suspender en 500µl de buffer TE. Se incubo a 65 ºC por 10 min.
Se centrifugo a 12 000 xg por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un tubo
nuevo en el que se le agregaron 30µl de acetato de sodio 3 M y 300µl de
isopropanol frío (-20 ºC), mezclándolo suavemente. Se incubo a -20 ºC por 30 min.

Luego se mezcló suavemente y se centrifugo a 6 ºC por 10 min., (hasta formar un
botón pequeño traslúcido), el cual es limpiado con etanol frío (-20 ºC) al 70 %,
mezclando con agitación manual hasta soltar el botón. En algunos casos se
..
consideró necesario repetir el lavado con alcohol al 70 %. Limpio el botón se
centrifugo a 1000 x g durante 10 min y se deshecha el sobrenadante. Se rehidrato
el ADN con buffer TE, el volumen de agua puede ir de 15µl a 150µL. (Las
extracciones realizadas se suspendieron en 70 µl de buffer TE).
Notas:
• Se recomendó hacer ensayos previos para ajustar adecuadamente el
algodón o gasa, es importante para recuperar correctamente la mayor
cantidad de sobrenadante.
• Ver soluciones para método CTAB-STE en los anexos.
• Material esterilizado para evitar degradación del ADN (Figura 5).
Figura 5. Material usado para extracción de ADN.
./
C).). "ro'ocolo Mini*r#* CTAB >E-Far-s( .//0G A,raHa+( .//I@
En un tubo frio de 1.5 ml se pesaron 0.05g de tejido pulverizado con nitrógeno
líquido y se le añadieron 500µl de buffer de extracción CTAB e incubaron por 15
min., en agua previamente calentada a 60ºC, con mezcla ocasional por inversión
para dispersar los grumos.
Después se le añadieron 500µl de cloroformo y se mezclaron por inversión hasta
formar una emulsión (20 veces).
Centrifugaron a 12000 /g durante 10 minutos a temperatura ambiente y se colocó
la fase acuosa en un tubo de 1.5ml para mezclar 2.5µl de RNasa suavemente e
incubar a 37ºC durante 30 min., (dos veces).
Posteriormente se transfiere la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo y se le
añadieron 0.6 volúmenes de isopropanol y se mezclaron por inversión para
precipitar el ADN.
Después se colocó la muestra a -20 ºC durante 10 min. Centrifugada a 12000 /g
por 5 min. Se decantó el sobrenadante.
Se lavo la pastilla con 500 µl de etanol 70% frío. Agitando hasta despegar la
pastilla. Se centrifugo a 12 /g por 5 min. Para decantar el sobrenadante.
Se invirtio el tubo sobre papel absorbente y se dejo secar la pastilla a temperatura
ambiente entre 5-10 min. Para posteriormente re suspender en 30µl de buffer TE
1X y almacenar a -20ºC.
C).)1 "ro'ocolo PlantDNAzolReagentA
Para la Extracción se pulverizo el tejido con nitrógeno líquido en mortero, tratando
de moler en un solo evento y con una espátula se pesaron 0.3g pasando el
.0
pulverizado a un tubo de 1.5 ml que esté sobre una balanza previamente tarada.
Luego se le agrego PlantDNA-$". en la siguiente proporción: 300µl de
PlantDNA-$". por cada 0.1 g de muestra de tejido. Se agita por inversión tres
veces y se puso a incubar durante 5 min a 25 °C con agitación manual moderada.
Se agregaron 300 µl de Cloroformo y se agitaron manualmente para incubar
durante 5 min a 25 °C.
Para la Precipitación del ADN se centrifuga a 12000 xg durante 10 min., se recoge
la fase acuosa y se agregan 225 µl de etanol absoluto, se agito por inversión en 6
u 8 ocasiones y se dejaron reposar 5 min a 25 °C.
Posteriormente se centrifugo a 5000 g durante 4 min., y se retiró del
sobrenadante. (En algunos casos en ADN precipitado no es visible después de la
centrifugación).
Para el Lavado del ADN se preparó la soluci0n de lavado PlantDNA-$"12tanol:
Mezclando 1vol de etanol por 0.75vol de etanol absoluto.
Se mezclaron 300µl de la soluci0n de lavado PlantDNA-$"12tanol con el ADN
precipitado y se agitaron con vortex para dejar reposar 5 min a 25 °C.
Después se centrifugo a 5000 xg durante 4 min. Y se eliminó la solución de lavado
PlantDNA-$"12tanol y la pastilla se lavó con 300 µl de etanol al 70% mezclando
vigorosamente.
Continuando se centrifugo a 5000 xg durante 4 min.
Luego se desechó la solución de etanol por decantación para dejar secar la
pastilla. Después se re suspendió la pastilla agregando 70 µl de Buffer TE
Notas:
.1
• Se mantuvo la proporción en todas las soluciones respecto a la cantidad de
tejido usado.
• En el segundo ensayo se agregaron 3µl de RNasa (10 mg/ml).
• Protocolo original (en inglés) en los anexos.
.2
C)1 C7an'i<icaci3n -# la conc#n'raci3n -# ADN
Se utilizó un espectrofotómetro (Figura 6) UV (Q 5000 de Quawell®), posee
la ventaja de poder realizar lecturas con 2 µl de muestra que se van archivando en
el software que incluye el equipo.
Al encender el equipo se limpió el punto de lectura con agua estéril y papel, se
cargó la muestra blanco (2µl) y se cerró el brazo.
En la aplicación (software) se identifica el nombre de la muestra (ÌD sample) y se
da clic en blanco (Blank).
El brazo hace un movimiento de abertura y ajusta su posición, en este momento
es. Se verifica la lectura en el software y se limpia el punto de lectura.
Después se carga la muestra a medir. Nuevamente se identifica la muestra con un
nombre (ÌD sample), ahora se da clic en medir (measure).
Corroborar que se forme la película con la muestra a medir y limpiarla con papel
una vez registrada la lectura en el software.
Al terminar la medición de muestras se hace clic en (Report to Exel) para obtener
un reporte en Exel y archivarlo para posterior análisis.
Notas:
• Se realizaron tres lecturas (repeticiones) por muestra y al final se
promediaron para tener menor margen de error.
• Entre cada muestra, se hizo una lectura del blanco, para corroborar si se
presentan anomalías. Si cambiaba la curva que presenta el software entre
cada lectura de la muestra blanco se tenía que volver a calibrar en (Blank).
.3
• Tiene un puerto de conexión USB que debe estar bien ajustado para evitar
problemas de conexión.
Figura 6. Espectrofotómetro UV (Q 5000 de
Quawell®).
C)= El#c'ro<or#sis #n $#l#s -# a$arosa
Se pesaron 0.8g de agarosa y se vacíaron en un matraz Erlenmeyer disolviendo
en 100 ml de buffer TAE 1 X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) para obtener una
concentración de 0.8%.
La solución se caliento en el horno de microondas hasta que desaparecian los
grumos formados; observando continuamente el matraz y agitando hasta disolver
la agarosa.
Se dejó enfriar hasta una temperatura cercana a los 60 °C, y se adicionaron 4.5µl
de bromuro de etidio (10 mg/ml).
Se mezclaron bien y se vacío el contenido a una cámara de electroforesis
sumergida (Figura 7), previamente armada con su peine y deja gelificar.
Cada muestra de ADN (∼100 µg) se preparó con 10 µl de la muestra más 2µl de
.4
buffer de carga para ácidos nucleicos.
Después se retira el peine del gel y se carga cada pozo o carril, con la muestra.
Se vierte con cuidado el buffer TAE 1X para el corrimiento y se aplica una
corriente constante de 80 Volts por 45 minutos.
Junto con las muestras se corrió un marcador de longitud nucleotídica (λ)
poniendo 4µl equivalentes a 25µg de ADN, dando un total de 100 µg.
Concluida la electroforesis, se llevó el gel al trans iluminador y se encendió la
lámpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas teñidas con el bromuro de
etidio.
Después se realizó la captura de imagen en un foto documentador y se verifico la
integridad del ADN genómico.
.5
/6
Figura 7. Cámara utilizada para electroforesis en
geles de agarosa.
/-
C)B E?'racci3n -# *ro'#ínas
Para la extracción de proteínas se realizaron ensayos con especies de
Agave americana y Agave tequilana en yema apical, tallo y hoja. Una vez definida
la metodología se realizó la extracción de proteínas de las muestras colectadas de
Agave salmiana.
C)B)0 E?'racci3n con NET6.
Se realizó la extracción con buffer NET-2 (ver ane/os) adaptando la
metodología original de acuerdo a la disposición de equipo en laboratorio,
desarrollándola como sigue:
Se agregó 1gr de tejido fresco en un tubo de 15 ml y vertió buffer NET-2 hasta 14
ml.
Se pasaron por vortex hasta homogenizar la muestra e incubo tres min., en baño
María.
Se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y se recuperó el sobrenadante.
Del sobrenadante recuperado se hicieron las pruebas de cuantificación.
C)B). E?'racci3n *or *r#ci*i'aci3n con ac#'a'o -# a+onio
Se realizó el método de extracción usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio de
acuerdo a (Gorinstein et al., 1999; Silos et al., 2003), haciendo algunas
modificaciones de acuerdo a la disposición de material y equipo en laboratorio,
desarrollando como sigue:
Se tomaron 75 gr de tejido fresco en trozos para licuar hasta homogenizar con
37.5 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 a 4°C.
La suspensión se filtró con una gasa estéril, el filtrado se centrifuga a 6000 rpm
/.
durante 10 min.
El sobrenadante se pasó por papel filtro Whatman Nº 2 y se centrifugó
nuevamente a 6000 rpm durante 10 min.
Se recogió el sobrenadante calculando el volumen y se adicionó 80% de solución
saturada de Sulfato de Amonio, se dejó en reposo a 4 °C durante 48 h.
El precipitado formado se recogió por centrifugación a 6000 rpm durante 10
minutos y eliminando el sobrenadante.
Los gránulos o sedimento se re suspendieron en 5 ml de 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 a
4°C.
La suspensión se dializó en un tubo de diálisis de celulosa (#ectra*Por®) con un
punto de corte MW 6-8000 contra agua destilada durante 16 hrs a 25 °C.
Se calculó el volumen de la suspensión y se prepararon alícuotas para concentrar
en Rota-evaporador a 45 °C hasta reducir aprox. un 50% del volumen inicial.
Las alícuotas concentradas se almacenan a -20 °C hasta su uso.
C)C C7an'i<icaci3n -# la conc#n'raci3n -# *ro'#ína
C)C)0 C7r5a *a'r3n -# *ro'#ína
Se preparó una solución estándar de albúmina sérica bovina a una concentración
de 1 mg por ml, para esto se pesó 0.01g (10mg) de ésta proteína y se disolvió en
10ml de NaCl 150 mM; para hacer alícuotas de 1 ml y almacenarlas a -20 °C, para
su posterior uso.
//
Se colocó en una serie de tubos de 1.5 ml diferentes concentraciones de la
solución estándar de proteína, adicionando el NaCl 150 mM (0.15 M) necesario
para tener un volumen de 800 µl, como se muestra en la tabla. (Se realizaron por
triplicado).
Después se midio la absorbancia de cada repetición respecto al blanco y se
elaboró la curva incluyendo la ecuación de la línea de tendencia.
Cuadro 1. Valores para realizar la curva patrón de proteínas.
No) -# '7,o Clor7ro -# so-io
/)0B M
S'ocJ -# al,K+ina
>0+$L+l@
Conc#n'raci3n <inal
-# *ro'#ína
0 (blanco) 800 µl 0 µl 0 µg
1 799 µl 1 µl 1 µg
2 795 µl 5 µl 5 µg
3 790 µl 10 µl 10 µg
4 785 µl 15 µl 15 µg
5 780 µl 20 µl 20 µg
6 775 µl 25 µl 25 µg
7 770 µl 30 µl 30 µg
8 765 µl 35 µl 35 µg
9 760 µl 40 µl 40 µg
10 755 µl 45 µl 45 µg
C)C). D#'#r+inaci3n *or +;'o-o Bra-<or-
Se adiciono en varios tubos de 1.5ml la cantidades de 1.5 y 10µl de muestra
ajustando a un volumen de 800 µl con solución de NaCl 150 mM (ver ane/os).
Se añadieron 200µl de solución de trabajo Bradford (Bradford, 1976) y se
mezclaron los tubos en vortex sobre la gradilla y se dejaron reposar por 3 min., a
temperatura ambiente.
Después se transfirio la muestra a una cubeta de plástico y se leyo la absorbancia
/0
a una densidad óptica de 595 nm en la región visible.
Se calculó la cantidad de proteína, interpolando la densidad óptica obtenida en
una curva patrón de proteína o sacando la regresión lineal y sustituyendo el valor
en la ecuación de una recta (ver ane/os). Cada determinación se realizó por
triplicado.
C)D El#c'ro<or#sis #n $#l#s -# *oliacrila+i-a
Se armó la mini cámara (Figura 8) y se preparó el gel separador (&uadro ' y
ane/os ara soluciones).
Después se colocó la mezcla poco a poco en la cámara, dejando espacio para
poner el gel concentrador e inmediatamente se adiciona isopropanol 1:1 en agua
(v/v), para alinear el gel y para que gelifique más rápido al estar en un ambiente de
anaerobiosis.
Se dejó polimerizar por aproximadamente 20 min., y luego se decantó el
isopropanol, posteriormente se seca con papel absorbente.
Luego se preparó y adiciono el gel concentrador (ver ta3la) colocando previamente
el peine con el número de pozos deseado en la cámara de electroforesis.
Una vez gelificado, se remueve el peine despacio y con cuidado.
Se añadió el buffer de corrida 1X (ver ane/os) y se cargaron los pozos con la
muestra de interés.
Se corrió el gel en dos etapas, la 1ª a 80 volts durante 15 min., para alinear las
muestras en su trayectoria y la 2ª a 100 volts constantes por 140 min., usando una
fuente de poder PowerPac de Bio-Rad.
/1
Para finalizar la electroforesis, se tiño el gel para visualizar las bandas de proteína.
El gel se cargó con 60 µg de proteína por carril (15 µl de muestra), esta se
preparó calculando la cantidad de muestra necesaria para 10 corrimientos y se
diluyo en un volumen de 150µl de buffer de muestra para proteínas, luego se puso
a hervir la muestra contenida en un tubo de 1.5ml por 5min., en un baño con agua.
Después se centrifugo a máxima velocidad (14,000 rpm) por 10 segundos. Se
cargó también 10µl en un carril de un marcador de peso molecular.
/2
Cuadro 2. Cantidades de reactivo para preparar el gel concentrador y gel
separador.
Soluciones Gel separador
al 12 %
Gel concentrador
al 4.5 %
Acrilamida-bisacrilamida (30:0.8
%)
Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8
Tris-Cl 0.5 M, pH 6.8
H2O bidest. o tridestilada
SDS al 10 %
PSA al 10 %
Temed
4 ml
2.5 ml
0 ml
3.5 ml
200 µl
70 µl
10 µl
0.6 ml
--
1 ml
2.32 ml
80 µl
25 µl
5 µl
Modificado de Laemmli U. K. 1970.
C)D)0 Tinci3n -# ,an-as -# *ro'#ína
Para realizar esta tinción, primero se coloca el gel de poliacrilamida en un
recipiente de plástico, al cual se le adiciona solución fijadora para tinción de
Coomassie (ver ane/os) hasta cubrir totalmente el gel y se agita suavemente por
15 min., en un orbital rocket o shaker. Luego se decanta la solución fijadora y se
cubre el gel con solución de tinción rápida de Coomassie (ver ane/os) y se agita
suavemente por 2 hrs o hasta observar las bandas teñidas. Después se desecha
la solución de tinción y se le coloca al gel en la solución desteñidora de ácido
acético al 10 % (ver ane/os). Se agita suavemente, hasta que de un fondo claro y
se visualizaran las bandas de proteína para posteriormente poder analizar el gel.
Figura 8. Cámara utilizada
Electroforesis en geles de
poliacrilamida.
/3
VII) RESUTADOS
D)0 Aisla+i#n'o -# ADN #n Agave salmiana
D)0)0 Ensa8o 7san-o PlantDNAzolReagentA)
Cuadro 3. Datos promedio del análisis con espectrofotómetro UV de ADN
aislado con el protocolo PlantDNAzolReagent®
Muestra A260/280 A260/230 Conc. ng/µL Conc. µg/µL
S1 Dnazol 1.66 0.11 22.83 0.02
Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% con bromuro de etidio, de la
muestra de ADN S1(A. salmiana 1) aislado con el protocolo
PlantDNAzolReagent® (Figura 9).
Figura 9. Gel de agarosa del
ensayo con DNAzol. (M) 4 µl
Marcador Lambda DNA/HindÌÌÌ) (1)
2 µl de ADN, (2) 4 µl de ADN, (3) 6
µl de ADN.
D)0). Ensa8o con CTAB6STE 8 PlantDNAzolReagentA
/4
Promedio de los datos del análisis con espectrofotómetro UV de ADN
aislado con el protocolo CTAB-STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent®
agregando RNasa (Cuadro 4). En negritas los valores más acercados al cociente
óptimo.
Cuadro 4. Datos del análisis con espectrofotómetro UV del protocolo CTAB-STE y
segundo ensayo con PlantDNAzolReagent® mas RNasa.
Muestra Descripción A260/280 A260/230 Conc. ng/µl Conc.µg/µl
1 S1 CTAB-STE 0)D1 .).C 513.55 0.51
2 S2 CTAB-STE 0)M. .).1 661.07 0.66
3 S1 DNAzol 1.52 0.13 72.80 0.07
4 S2 DNAzol 0)DM 0.05 23.54 0.02
5 S3 DNAzol 0)M/ 0.05 30.55 0.03
6 S3 DNAzol 0)MB 0.07 33.52 0.03
7 Ctrl DNAzol 1.25 0.01 4.37 0.00
Se corrió un gel (Figura 10) cargando cada pozo con 2 µl de muestra
después de resuspender el ADN en 70µl de buffer TE al concluir el aislamiento,
usando el protocolo CTAB-STE y segundo ensayo con PlantDNAzolReagent®
agregando RNasa (Cuadro 5).
Figura 10. Gel de agarosa con2 µl de ADN total por
muestra, usando CTAB-STE y segundo ensayo con
PlantDNAzolReagent® mas RNasa.
/5
Cuadro 5. Descripción de la electroforesis usando CTAB-STE y segundo
ensayo con PlantDNAzolReagent® mas RNasa.
Carril Descripción
Días de refrigeración (4ºC) de la
muestra al momento de extracción
M Marcador Lambda
DNA/HindÌÌÌ(4 µl)
--
1 S1 por CTAB-STE 3 días
2 S2 por CTAB-STE 0 días
3 S1 por DNAzol+RNAasa 4 días
4 S2 por DNAzol+RNAasa 1 día
5 S3 por DNAzol+RNAasa 0 días
6 S3 por DNAzol (sin RNasa) 0 días
7 Control (Proced. DNAzol sin
muestra)
--
S1= Muestra 1 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
S2= Muestra 2 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
S3= Muestra 3 de Agave salmiana, cogollo de hijuelo.
Notas:
• El aislamiento por CTAB-STE fue a partir de 0.5 g de tejido.
• El aislamiento por PlantDNAzolReagent® fue a partir de 0.3 g de tejido.
D)0)1 Ensa8o *or Mini *r#* CTAB >E-Far-s( .//0@)
Los datos obtenidos con este método se indican en el Cuadro 6 y Figura 11,
donde se puede observar buena concentración de ADN y de buena calidad.
Cuadro 6. Datos del análisis con espectrofotómetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo mini-prep CTAB.
Muestra Descripción A260/280 A260/230 Conc. ng/µl Conc. µg/µl
1 S4A 1.66 1.99 351.87 0.35
2 S4B 1.58 1.42 310.41 0.31
06
3 S4C 1.69 2.02 601.41 0.60
S4= Muestra 4 de Agave salmiana, yema apical de hijuelo.
Figura 11. Gel de agarosa con 2 µl de ADN
total por muestra, usando mini-prep CTAB.
(M) Marcador (Lambda DNA/HindÌÌÌ
Marker), (1) S4A a partir de 0.1 g, (2) S4B a
partir de 0.3 g, (3) S4C a partir de 0.05g,
(4) S2 CTAB-STE.
D)0)= Ensa8o con PlantDNAzolReagentA so,r# -i<#r#n'#s '#9i-os)
El último ensayo se realizó usando PlantDNAzolReagent®, aislando ADN
de diferentes tejidos (yema apical, tallo, raíz y hoja) de A. salmiana, se incluyeron
muestras de A. tequilana y A. americana para observas diferencias (Cuadro 7,
Figura 12).
Cuadro 7. Datos del análisis con espectrofotómetro UV de muestras de ADN
usando el protocolo PlantDNAzolReagent®.
Muestra Descripción A260/280 A260/230 Conc. ng/µL Conc.µg/µl
1 Cogollo S5 1.69 0.25 102.82 0.10
2 Piña S5 1.39 0.05 35.93 0.03
3 Raíz S5 1.63 0.05 34.35 0.03
4 Penca proximal S5 1.66 0.04 15.47 0.01
5 Penca distal S5 1.67 0.02 8.62 0.00
0-
6 Cogollo T1 1.67 0.34 269.78 0.26
7 Piña T1 1.57 0.31 222.53 0.22
8 Penca proximal T1 1.75 0.10 40.87 0.04
9 Cogollo A1 1.67 0.24 182.92 0.18
10 Piña A1 1.64 0.07 51.35 0.05
11 Raíz A1 1.63 0.03 16.47 0.01
12 Penca proximal A1 1.62 0.08 55.15 0.05
13 Control 2.81 0.01 4.14 0.00
SB= Muestra 5 de Agave salmiana, hijuelo de edad media.
T0= Muestra 1 de Agave tequilana, hijuelo de edad media.
A0= Muestra 1 de Agave americana, hijuelo de edad media.
Figura 12. Gel de agarosa con 2 µl de ADN total por muestra, usando
PlantDNAzolReagent® más RNasa.(M) Marcador (Lambda DNA/HindÌÌÌ Marker),
(1) Yema apical A. salmiana, (2) Hoja A. salmiana, (3) Raíz A. salmiana, (4) Hoja
proximal A. salmiana, (5) Hoja distal A. salmiana, (6) Yema apical A. tequilana,
(7) Tallo A. tequilana, (8) Hoja A. tequilana, (9) Yema apical A. americana, (10)
Yema apical A. americana, (11) Raíz A. americana, (12) Hoja proximal A.
americana, (C) Control negativo.
De acuerdo a los ensayos realizados se estimaron los siguientes tiempos
(Cuadro 8) para procesar las muestras para aislamiento de ADN, según cada
protocolo, en base a los registros de la bitácora de trabajo en laboratorio.
Cuadro 8. Estimación del tiempo requerido para procesar las muestras para
aislamiento de ADN.
"ro'ocolo Ti#+*o #s'i+a-o *ara *roc#sar 0/
0.
+7#s'ras
PlantDNAzolReagent®+RNasa 1 hora 40 min
CTAB-STE 4 horas 30 min
Miniprep CTAB 2 horas 15 min
D). E?'racci3n -# *ro'#ínas #n Agave salmiana
El primer ensayo se realizó con el buffer de extracción NET-2 sobre
muestras de A. americana y A. tequilana, los resultados de las lecturas de
espectrofotómetro fueron negativas y por lo tanto se determinó que no hubo
extracción de proteínas. Al hacer el primer ensayo por precipitación salina usando
buffer Tris-HCl y acetato de amonio (Gorinstein et al., 1999; Silos et al., 2003), las
determinaciones de cuantificación fueron similares al buffer de extracción NET-2
(Cuadro 9), por lo que se decidió preparar una electroforesis SDS-PAGE para
corroborar que no había proteína en las muestras. Se cargó el gel con 300 µl de
muestra y al concluir la electroforesis y una vez teñido del gel, se logró observar
bandas en las muestras 3, 4 y 5 (Figura 13). Esto nos confirmó la presencia de
proteína en la muestra, aunque a muy baja concentración.
Cuadro 9. Lectura de absorbancia por espectrofotometría de las
muestras de proteína extraídas usando buffer Tris-HCl y acetato
de amonio.
Vol. de muestra >.@ >1@ >=@ >B@
1 µl 0 0 0 0
5 µl 0 0 0.002 0
10 µl 0 0 0.007 0
0/
Figura 13. Gel de poliacrilamida. (M) 5 µl de
marcador, (1) 10 µl de albúmina, (2) 300 µl Hoja
A. americana, (3) 300 µl Yema apical A.
americana, (4) 300 µl Quiote A. americana, (5)
300 µl Hoja A. tequilana.
Nota:
Preparación de muestras y relación de carga para la electroforesis SDS-PAGE.
(1) 30 µl de Albumina (1mg/ml) + 50 µl de Buffer de proteína
(2) 300 µl de Hoja Agave americana4 + 200 µl de Buffer de proteína
(3) 300 µl de Yema apical Agave americana44 + 200 µl de Buffer de proteína
(4) 300 µl de Quiote Agave americana4*+ 200 µl de Buffer de proteína
(5) 300 µl de Hoja Agave tequilana44 + 200 µl de Buffer de proteína
* Agave adulto
** Agave de edad media
Al corroborar el método de extracción de proteínas de las muestras, se
00
realizó un segundo ensayo usando por precipitación salina. En el Cuadro 10 y
Figura 14 se muestran los resultados de absorbancia por espectrofotometría de
las muestras de proteína en Agave salmiana de yema apical, tallo y hoja extraídas
usando buffer Tris-HCl y acetato de amonio de acuerdo a (Gorinsteinet al., 1999;
Silos et al., 2003). En la Figura 15 y 16 se observan los patrones de proteínas
obtenidos a partir de diferente tejido del maguey, resultando la yema apical el
mejor tejido para el aislamiento de proteínas.
Cuadro 10. Lectura de absorbancia por espectrofotometría de las
muestras de proteína en Agave salmiana de yema apical, tallo y hoja,
usando para la extracción buffer Tris-HCl y acetato de amonio.
Muestra
Descripció
n
Absorbancia 5 µl Absorbancia 10 µl
1 Hoja P1 0.032 0.054
2 Tallo P1 0.052 0.065
3 Hoja S2 0.069 0.081
4 Tallo P2 0.053 0.096
5 Hoja P2 0.074 0.099
6 Tallo S1 0.023 0.049
7 Tallo S2 0.051 0.074
8 Hoja S3 0.011 0.036
9 Tallo S3 0.067 0.097
10 Yema S3 0.062 0.112
Las muestras 11,12,13,14,15 y 16 no se determinaron.
01

Figura 14. Curva patrón de albúmina sérica bovina y
ecuación para la cuantificación de muestras de
proteína.
Cuadro 11. Cuantificación de proteína, sustituyendo valores en la ecuación
de la curva patrón.
Muestr
a
[Proteína
A] 5 µl
[Proteína B]
10 µl
[Proteína
A] µg/µl
[Proteína B]
µg/µl
[Promedio
proteína] (µg/µl) ó
(mg/ml)
1 1.241 5.315 0.248 0.531 /)1I
2 4.944 7.352 0.989 0.735 /)MC
3 8.093 10.315 1.619 1.031 0)11
4 5.130 13.093 1.026 1.309 0)0D
5 9.019 13.648 1.804 1.365 0)BM
6 -0.426 4.389 -0.085 0.439 /)0M
7 4.759 9.019 0.952 0.902 /)I1
8 -2.648 1.981 -0.530 0.198 6/)0D
9 7.722 13.278 1.544 1.328 0)==
10 6.796 16.056 1.359 1.606 0)=M
02
!
e
n
s
i
d
a
d

7
p
t
i
c
a

8
1
5
1

n
m
9
+roteína 8ul9
Figura 15. Gel de poliacrilamida con 15µl de muestra preparada. (m) 5µl
Marcador de bajo peso molecular, (1) Hoja P1, (2) Tallo P1, (3) Hoja S2, (4)
Tallo P2, (5) Hoja P2, (6) Tallo S1, (7) Tallo S2, (8) Hoja S3, (M) 5 µl
Marcador de peso molecular.
Figura 16. Gel de poliacrilamida con 20µl de muestra preparada. (M) 5µl
Marcador de peso molecular,(9) Tallo S3, (10) Yema apical S3, (11) Yema
apical P1, (12a, 12b) Tallo L, (13) Yema apical P2, (14) Yema apical S2,
(15) Yema apical L, (16) Hoja L.
Muestras de Agave salmiana
03
S1= Muestra 1 Ejido Saldaña
S2= Muestra 1 Ejido Saldaña
S3= Muestra 1 Ejido Saldaña
P1= Muestra 1 Ejido Pendencia
P2= Muestra 1 Ejido Pendencia
L= Muestra Agave lec!uguilla
Marcador de peso molecular
>M@ Unstained Protein Molecular Weight Marker (ver Ane/os).
04
VIII) DISCUSIÓN
M)0 Aisla+i#n'o -# ADN -# Agave salmiana
De la relación entre la Absorbancia a 260 nm y la Absorbancia a 280 nm, se
obtiene un cociente que refleja el estado de pureza del ADN. El valor optimo en el
cociente de A260/280 es de 1.8 aunque se considera libre de contaminantes
celulares si el valor se encuentra entre 1.7 a 2.0. Valores por debajo de 1.7,
indican contaminación con proteínas, fracciones de membranas o fenol y valores
por arriba de 2 significa que hay ARN disperso (Müller y Schweizer, 1994). Una
absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de
carbono, péptidos, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente (Somma, 2007). Los
métodos CTAB-STE y PlantDNAzolReagent®+RNasa fueron quienes
representaron un aislamiento de mayor calidad de acuerdo a los cocientes de
pureza de mayor importancia, que son los de absorbancia A260/280. Cabe
mencionar que en el cociente de absorbancia A260/A230 solo el método CTAB-
STE obtuvo valores óptimos. El método mini-prep CTAB ha sido usado para aislar
y posteriormente amplificar ADN en Agave tequilana por (Abraham, 2009) pero los
resultados obtenidos en Agave salmiana no fueron favorables para garantizar la
amplificación del material, estuvo próximo pero por debajo del valor mínimo (1.7)
en cociente A260/280, por lo que se requiere hacer algunas modificaciones al
protocolo, para evitar la presencia de proteínas en la muestra.
La cantidad de ADN necesaria para una reacción de amplificación depende
de la complejidad y del tipo de secuencia a amplificar. Normalmente en plantas se
utilizan desde 10 ng hasta 200 ng dependiendo del rendimiento del ADN propio de
la técnica de aislamiento y de la especie. En concentración de ADN aislado, con
CTAB-STE se llegó a obtener hasta 660 ng a partir de 0.5 g de tejido fresco,
mientras en el método mini-prep CTAB las concentración fue muy semejante (600
05
ng) a partir de 0.05 g de tejido fresco, lo que sugiere que a partir de cantidades
menores a 0.1 g se obtienen mayores concentraciones.
En el último ensayo con PlantDNAzolReagent®+RNasa se realizó el
aislamiento sobre diferentes tipos de tejido a partir de 0.3 g y se observa que las
mayores concentraciones se obtienen usando la yema apical, aun en otras
especies de agave.
En el gel ensayo con CTAB-STE y PlantDNAzolReagent®+RNasa se
comprobó que el uso de material refrigerado (4ºC) no garantiza la integridad y
cantidad del ADN por aislar, por lo que se recomienda usar tejido fresco o
almacenando muestras en nitrógeno líquido.
M). E?'racci3n -# *ro'#ínas -# Agave salmiana
Con el método por precipitación salina usando buffer Tris-HCL y acetato de
amonio, adaptando la metodología en base a (Gorinstein et al., 1999; Silos et al.,
2003) logró la extracción de proteínas, comprobadas con la cuantificación y
comportamiento electroforético. Bajo el mismo tratamiento de las muestras, es
evidente que la mayor concentración y posible diversidad de proteínas del agave
se encontraron en la yema apical, que es el punto de crecimiento, en menor
cantidad en el tejido del tallo y fueron poco visibles en penca en la mayoría de las
muestras al realizar la electroforesis, aunque si hubo medición de concentración.
En el gel de poliacrilamida, se observa que predominan dos bandas de
proteína, entre los 25 kDa y otra aproximadamente los 40 kDa, siendo visibles en
los tres tipos de tejido muestreado. Esta observación puede indicar que se tratan
de proteínas de función estructural.
16
IN) CONCUSIONES
- El método de elección para el aislamiento de ADN es el de CTAB-STE, que a
pesar de ser el que consume mayor tiempo en procesar las muestras, garantiza
una buena amplificación, además de que se obtienen mayores concentraciones de
ADN. Seguido del producto comercial PlantDNAzolReagent® agregando RNasa,
que reduce el tiempo de tratamiento de las muestras con resultados cercanos al
optimo en A260/280 que es la de mayor relevancia.
- Se considera adecuado extraer proteínas en Agave salmiana por el método
adaptado de (Gorinsteinet al., 1999; Silos et al., 2003) por precipitación salina
usando buffer Tris-HCL y acetato de amonio, al observar favorables los resultados
obtenidos.
I)0 R#co+#n-acion#s
- La yema apical es el tejido recomendado para tomar la muestra para realizar el
aislamiento de ADN, seguido la hoja donde se llegó a obtener de calidad solo que
a menores concentraciones.
- El tejido refrigerado no garantiza ADN de calidad. Es preferible siempre usar
tejido fresco para iniciar un aislamiento de ADN, o tomar pequeñas muestras de
tejido fresco contenidas en papel aluminio marcado y consérvalas en nitrógeno
líquido.
- Es importante tomar en cuenta que con mayor cantidad de tejido al iniciar el
aislamiento no precisamente se obtendrá mayor concentración de ADN. Por lo que
recomiendo realizar el aislamiento partir de muestras próximas a 0.1 g de tejido.
- En la metodología para extraer proteínas por precipitación salina, se debe
reconsiderar el paso anterior al almacenamiento de las muestras, en el que se uso
1-
un Rota-evaporador a 45 °C para concentrar. Debido a la posible presencia de
proteasas que a esta temperatura pudiesen ser activas y degradar algunas
proteínas. Recomiendo liofilizar como lo indica (Gorinstein et al., 1999; Silos et al.,
2003) probar el uso de dispositivos de filtración por centrifugación con membranas
de celulosa o algún otro en el que se reduzca esta actividad enzimática.
- Por la baja cantidad de proteínas observadas en muestras de la hoja, se
recomienda concentrar más las muestras en posteriores trabajos y visualizarlas
mejor en el gel.
1.
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13
NI) ANENOS
Reactivos para protocolo de aislamiento de ADN con CTAB-STE
(Esterilizar todas las soluciones)
Buffer de extracción CTAB
Tris-HCl 100 mM pH8
NaCl 1.5 M
EDTA 20 mM pH8
CTAB 4%
PVP40 4%
Ac. Ascórbico 0.1%
DÌECA 0.1%
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento
de usar el buffer)
Buffer de extracción ST
Tris-HCl 100 mM pH8
EDTA 50 mM pH8
NaCl 100mM
b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de
usar el buffer)
SDS 20%
Acetato de potasio 5 M
Acetato de sodio 3 M
Tam!ón T
10mL 1M Tris HCl pH 8.02 mL de EDTA 0,5 M Aumentar el volumen total de 1 L
con agua bidestilada
14
" # Tris $Cl !$ M)/
121,1 g de Tris Disolver en 700 mL de H2O. Llevar el pH hasta 8.0 mediante la
adición de HCl concentrado (necesitará alrededor de 50 ml). Aumentar el volumen
total de 1 L con agua bidestilada
DTA %,& #
186,12g de EDTA Añadir 700 mL de H2O 16-18 g de perlitas de NaOH Ajustar el
pH a 8.0 agregando perlitas de NaOH, el EDTA no se disolverá hasta que el pH
está cerca de 8.0 Aumentar el volumen total de 1 L con agua bidestilada
& # NaCl
292,2g de NaCl 700 mL de H2O Añadir NaCl poco a poco o nunca entrará en
solución y llevar a 1 L agua bidestilada Protocolo original de método con
PlantDNAzolReagent®
15
FicHa T;cnica -#l R#ac'i5o "lan'DNA&olR#a$#n' >INVITROGEN( USA@
26
2-
Buffer TA &%'( Disolver 242 g de Tris base (40 mM) y 37.2 g de EDTA-Na2·H2O
(2mM) en 900 ml de agua destilada. Adicionar 57.1 ml de acido acético glacial y
ajustar el volumen final con agua a 1 litro. Tomar 2 mL de este buffer 50X y aforar
en 100ml de agua para hacer TAE 1X. Almacenar a temperatura ambiente o a
4ºC.
Buffer de carga DNA
Buffer de carga 6X (Azul de bromofenol-Xilen-cianol)
0.05% (w/v) Azul de bromofenol
0.05% (w/v) Xilencianol
50% (v/v) Glicerol
Buffer de xtracción NT)*
Mesclar 0.87 g de NaCl (150mM), 10 ml de Tris-HCl 500 mM pH 7.4 y 500 µL de
Nonidet NP-40 ó Ìgepal (0.5%). Aforar a 100 ml con agua destilada y esterilizar.
Almacenar a 4ºC.
Sol7ci3n -# Tris6Cl B// +M( *% D)=
Pesar 6.05 g de Tris base (0.5 M) y disolver en 50 ml de agua, luego ajustar a pH
de 7.4 con ácido clorhídrico concentrado y aforar a 100 ml con agua destilada.
Almacenar a 4 °C.
Solución stoc+ Bradford,
Mezclar 10 ml de etanol al 95 %, 20 ml de ácido fosfórico al 88 % y 35 mg (.035 g)
de azul brillante de Coomassie G-250. Almacenar en frasco ámbar. Esta solución
es estable indefinidamente a temperatura ambiente.
Solución de tra-a.o Bradford
Mezclar 42.5 ml de agua destilada, 1.5 ml de etanol al 95 %, 3.0 ml de ácido
fosfórico al 88 % y 3.0 ml de la solución stock Bradford. Después filtrar en papel
filtro (Whatman No.1) y almacenar a 4 °C en un frasco ámbar. Estable por un par
2.
de meses, luego debe se filtrada nuevamente, para su uso.
C/lculos !ara determinar concentración de !rote0nas res!ecto a la curva
!atrón,
Hacer los siguientes cálculos utilizando la ecuación de una recta. Por ejemplo, si la
densidad óptica fue de 0.209, este valor hay que sustituirlo en la siguiente formula:
Y= a+bx; despejando nos quedaría que x= y-a/b; luego sustituyendo los valores
obtenidos a partir de una regresión lineal de los valores de la curva patrón por el
método de mínimos cuadrados, tendríamos 0.209-0.1692/0.01474 = 2.7, luego
dividir este resultado entre la dilución si es que la hay. Ej: 2.7/5 que son los
microlitros de la muestra problema, nos daría 0.54 µg de proteína por microlitro, y
por último se calcula la concentración total de proteína por mililitro de muestra, la
cual para este caso sería de 540 µg/ml = 0.54 mg/ml.
2/
Soluciones de electroforesis !ara se!aración de !rote0nas
Cuadro 12. Cantidades necesarias, para realizar un gel separador a diferentes
concentraciones de poliacrilamida.
"orci#n'o -#l $#l

=)B O C O D O M O I O 0/ O 00 O 0. O
Acrila+i-a
(X/3=ml)
1.50 ml 2.00
ml
2.35 ml 2.70 ml 3.00 ml 3.35
ml
3.70
ml
4.00
ml
Tris6Cl 0)B M *%
M)M
2.50 ml 2.50
ml
2.50 ml 2.50 ml 2.50 ml 2.50
ml
2.50
ml
2.50
ml
A$7a (7.5-x/3=ml) 5.80 ml 5.50
ml
5.15 ml 4.80 ml 4.50 ml 4.15
ml
3.80
ml
3.50
ml
SDS al 0/ O 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl
"SA al 0/ O 50 µl 50 µl 60 µl 60 µl 65 µl 65 µl 70 µl 70 µl
T#+#- 6 µl 7 µl 8 µl 8 µl 9 µl 9 µl 10 µl 10 µl
Modificado de Laemmli U. K., 1970.
Sol7ci3n -# acrila+i-a >1/2/)M O@
Disolver 30 g de acrilamida, más 0.8 g de bis-acrilamida y aforar a 100 ml con
agua destilada. Almacenar a 4 °C en frasco ámbar. Usar guantes y cubrebocas, ya
que la acrilamida es neurotóxica en polvo ó solución.
Sol7ci3n -# Tris6Cl 0)B M( *% M)M
Pesar 18.2 g de Tris base y disolver en 60 ml de agua. Ajustar a pH 8.8 con HCl
concentrado. Aforar a 100 ml con agua destilada y almacenar a 4 °C.
Sol7ci3n -# Tris6Cl /)B M( *% C)M
Pesar 6.05 g de Tris base y disolver en 40 ml de agua. Ajustar a pH 6.8 con ácido
clorhídrico concentrado. Aforar a 100 ml con agua y almacenar a 4 °C.
SDS al 0/ O
Disolver 10 g del detergente duodecil sulfato de sodio en 90 ml de agua destilada.
Calentar a 68°C para disolver bien y ajustar el pH a 7.2 con HCl. Aforar a 100 ml
con agua destilada y almacenar a temperatura ambiente.
"SA al 0/ O
Pesar 0.5 g de persulfato de amonio y disolver en 5 ml de agua. Almacenar
20
alicuotas de 500 microlitros en tubos de 1.5 mL cubiertos con papel aluminio para
proteger de la luz y almacenar a -20 °C. Dejar un vial a 4 °C para su uso.
Buffer de corrida ó electroforesis "% '
Disolver 30 g de tris base, más 144 g de glicina en una cantidad de agua
destilada. Aforar a 1 litro y almacenar a temperatura ambiente.
B7<<#r -# corri-a 3 #l#c'ro<or#sis 0 N
Mezclar 100 ml de buffer de corrida 10 X, más 900 ml de agua destilada y más 1 g
de SDS. Almacenar a temperatura ambiente. Este buffer se puede reutilizar hasta
5 veces.
Buffer de muestra !ara !rote0nas
Para preparar 20 ml de buffer adicionar 2.5 ml de solución de Tris-Cl 0.5 M, pH 6.8
(0.0625 M), 4.0 ml de SDS al 10 % (2 %), 1.0 ml de Bis-mercaptoetanol (5 %), 8.0
ml de glicerol (10 %), 20 µl de azul de bromofenol al 1 % (0.001 %) y 4.5 ml de
agua destilada. Mezclar bien y hacer alicuotas de 1 ml. Almacenar a -20°C.
Solución fi.adora !ara tinción de Coomassie
Mezclar 125 ml de metanol ó isopropanol (25 %), con 50 ml de ácido acético
glacial (10 %) y aforar a 500 ml con agua destilada. Almacenar indefinidamente a
temperatura ambiente.
Solución de tinción r/!ida de azul de Coomassie
Mezclar 0.06 g de azul brillante de Coomassie G ó G-250 (0.006 %) con 100 ml de
ácido acético glacial (10 %) y aforar a 1 litro con agua destilada. Almacenar
indefinidamente a temperatura ambiente en frasco ámbar.
Solución deste1idora de /cido ac2tico al "% 3
Mezclar 50 ml de ácido acético (10 %) con 450 ml de agua destilada. Almacenar
21
indefinidamente a temperatura ambiente.
Pre!aración de muestras de !rote0na(
Se tomaron 120 uL de muestra en tubos de 1.5 mL y se agregaron 24 uL de Buffer
de carga PAGE-SDS 6X, se pusieron en un baño de agua hirviendo durante 5
min.
Buffer de carga PA4)SDS 5'
2 mL Glicerol
2 mL SDS 10%
0.25 mg Azul de Bromofenol
2.5 mL Buffer 4X del gel concentrador
0.5 mL b-mercaptoetanol
Aforar con agua destilada a 10 mL.
22
Marca-or#s
Para proteínas
Para ADN
23
Cuadro 13. Lecturas del espectrofotómetro UV (Q 5000 de Quawell® por ensayo.
PlantDNAzolReagent!
*eport
!ate: 6-;-.;.6-6 -6:15:16 a.m.
<o. =ample I!
I!>
?
=ampl
e @%pe EC =A
=A
As
.26
As
.46
As
.26;.4
6
.26;./
6
Concentrati
on
- Agua - ds!<A16 ./6
6.63
4
6.6.
-
6.6.
3 6.333 6..25 -.61
. BuBBer @E - ds!<A 16 ./6
6.61
1
6.6-
0
6.6.
1 6.115 6..10 6.3
/ =- !nazol - ds!<A 16 ./6
0.-.
0
6.0/
0
6..0
5 -.30. 6.-61 .-.255
0 =- !nazol . ds!<A 16 ./6
0.-/
3
6.00
2
6..3
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3 6.05
6./6
3 -.152 6.--1 .0.055
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PlantDNAzolReagent!()*a
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on
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6.6-
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. BuBBer @E - ds!<A 16 ./6
>
6.65
-
>
6.60
5
>
6.6/
4 -..45 6.1/4 >..01-
/ =- C@AB - ds!<A 16 ./6
0./.
0
5.55
3 1.21 -.325 ../-- 055.405
0 =- C@AB . ds!<A 16 ./6
0.21
2
-6.-
5.
1.40
2 -.30/ ..-45 165.2
1 =- C@AB / ds!<A 16 ./6
0.0/
2
-6./
1 2.6- -.3.. ../// 1-3.055
2 =- C@AB 0 ds!<A 16 ./6
0.01
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-6.0
-.
2.60
3 -.3.- ..//3 1.6.2
3 =- C@AB 1 ds!<A 16 ./6
0.10
-
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4 BuBBer @E - ds!<A 16 ./6
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0
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5 =. C@AB - ds!<A 16 ./6 2..2
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24
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1.33
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6.50
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6.3.
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* Lecturas nulas
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