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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“FRANCISCO GARCÍA SALINAS”

UNIDAD ACADÉMICA DE AGRONOMÍA

“EFECTO DE TEMPERATURAS ALTAS EN LA EXPRESIÓN DE Hsp70 DE EMBRIONES DE FRIJOL”

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

INGENIERO AGRÓNOMO
PRESENTA:

GRACIELA GONZÁLEZ BÁEZ

ZACATECAS, ZAC., NOVIEMBRE 2006.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
“FRANCISCO GARCÍA SALINAS”

UNIDAD ACADÉMICA DE AGRONOMÍA “EFECTO DE TEMPERATURAS ALTAS EN LA EXPRESIÓN DE Hsp70 DE EMBRIONES DE FRIJOL”

TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

INGENIERO AGRÓNOMO
PRESENTA:

GRACIELA GONZÁLEZ BÁEZ
ASESORES:

M. en C. EDGAR LEÓN ESPARZA IBARRA Dr. en C. MIGUEL ANGEL SALAS LUÉVANO Dr. en C. FRANCISCO AVIER CABRAL ARELLANO
ZACATECAS, ZAC., NOVIEMBRE 2006.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Franc !c" #a$ %r Ca&ral Ar%llan", '"r la ( r%cc )n * a'"*" +,% -% &r n() (,ran.% la r%al /ac )n (% %!.% .ra&a0". Al M. %n C. E(1ar L%)n E!'ar/a I&arra, '"r !, 1ran a*,(a, a!%!"r2a * c"la&"rac )n a'"r.a("! (,ran.% %l (%!arr"ll" (% %!.% .ra&a0". Al Dr. M 1,%l An1%l Sala! L,3$an", '"r %l a'"*" &r n(a(", '"r !,! $al "!"! c"-%n.ar "! * '"r !, c""'%rac )n %n la r%$ ! )n (%l 'r%!%n.% .ra&a0". A la M. %n C. Mar an(r%a Ca&ral Enc !", '"r !, a'"*" 'r%!.a(" %n la r%$ ! )n (% %!.% .ra&a0". Al M. %n C. #"!3 4a.r"c n " G)-%/ D%l1a(", '"r la r%$ ! )n * a'"*" %n la 'r%!%n.% .%! !. A M. %n C. Man,%la C56$%/ C5a2r%/, '"r la a*,(a 'r%!.a(a %n %l la&"ra."r ". A la 7n (a( Aca(3- ca (% B "l"12a E8'%r -%n.al, a!2 c"-" a la 7n (a( Aca(3- ca (% A1r"n"-2a (% la 7n $%r! (a( A,.)n"-a (% Zaca.%ca! '"r !, a'"*" n!. .,c "nal.

A la -%-"r a (% ."r%! * 'r":%!"r%!. 1ran a'"*".a(."(" .! c"-'a?%r"!.% %n :"r-ac )n aca(3. A . '"r !. Grac a!."(" -"-%n."("! .al%/a * %!. A .an.al%! :..la(" %n .% !"n .! !acr : c "! * %!:.a-"r. 'ac %nc a * -"."("! .% -'"r. c"n . A . -". l"! c.! 4a(r%!9 A'"l"n " * #. $ac )n nc"n( c "nal %n .%r-an"!9 @. c"-'r%n! )n.DEDICATORIAS A D "!9 4"r c"nc%(%r-% %l ("n (% la $ (a.! . 0"!9 C3!ar A(r 6n.a =†> En r%c.an a . '"r !."(" l" +. '"r+.! ..1".ca.E!'"!"9 #"!3 Al:r%(". $ac )n.%r(" c"n a-"r * car ?".!.an .% 5% %-'r%n( (". a. A .". A . . '"r !.! .% ! %-'r% 5an %!. '"r !. #a$ %r Al%0an(r" * Er c<.a(" c"n.%r"n 'ar.%r/"!.:"r.

!00" ) &'%%$ . 070/FP /!00"# UA $ 0%0&&"' ( DGIP $ UA No.FINANCIAMIENTO El presente trabajo de tesis se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular de Plantas de la Unidad Académica de Biología Experimental de la Universidad Autónoma de "inanciamiento del pro#ecto de FUNDACIÓN acatecas! bajo el PRODUCE No.

toneladas 1?@EA?! )//)3$ acatecas es el principal productor 1con */B de la producción nacional3 en di"erentes variedades adaptadas a la región # de consumo nacional como el= @egro acatecas! Ba#o acatecas # Clor de Ma#o entre otros 1>AAAD! %22..$.$/ millones reciben una precipitación menor a los .%! 7'i'ua'ua con -*! .// mm anuales. >ECEA! %22.)! 2&* toneladas en el a6o agrícola )///<)//%$ En general! la ma#oría de los estados siembran "rijol! # las principales zonas productoras son= acatecas con */. # de éstas! %/$& millones son tierras laborables! de las cuales unos . &$0 millones de 'ect(reas son tierras improductivas! principalmente por su aridez 1López! %22%3$ +ada la importancia 4ue tiene el país con respecto a una gran cantidad de suelos 4ue son de temporal! es indispensable contar con cultivos 4ue sean tolerantes a estas condiciones clim(ticas predominantes$ +e esta manera! se tendría una ma#or producción en el campo! mejorando las posibilidades del agricultor # su "amilia de sobrevivir en sus lugares de origen$ En este sentido! la investigación biotecnológica de plantas! o"rece la oportunidad de encontrar mejoras en los cultivos a "avor del campesino 1Lindse# # 5ones! %2-23$ El "rijol es considerado junto con el maíz! como uno de los elementos m(s importantes en la dieta de la ma#oría de los mexicanos! su cultivo data desde 'ace 0!/// a6os a$ 7$ 18idalgo # +ebouc9! %2-03$ México es uno de los países con ma#or consumo! #a 4ue cultiva una super"icie de ) millones de 'ect(reas principalmente en el ciclo primavera:verano. INTRODUCCIÓN En México! existen %%& millones de 'ect(reas potencialmente agrícolas # de las cuales )* millones son laborables$ +e esta super"icie! sólo .I. # Ertiz! %22-3$ Estas cantidades de producción! representan la demanda de A .2)! >inaloa con -0! 0. obteniendo una producción nacional de %! /.millones de 'ect(reas son de riego # %-$) millones son de temporal.! /-%! +urango con %%%! .-.# 7'iapas con &%! )2.

)3 a 4ue no se usan variedades mejoradas! *3 al uso incorrecto de "ertilizantes.un alto consumo generalizado entre la población! producción 4ue se ve a"ectada por la carencia de recursos económicos disponibles por parte de los ejidatarios. 03 a "actores ambientales importantes como la temperatura! #a 4ue puede causar estrés en pocos minutos a di"erencia de la "alta de agua del suelo! 4ue toma días o semanas en actuar como estresor # a los nutrientes minerales! 4ue tardan 'asta meses en ser estresantes 17sermel# # La9'otia! %22-3$ El estrés ambiental! implica la respuesta de un sistema biológico "rente a la exposición a condiciones "ísicas # 4uímicas extremas en el medio ambiente! ante la cual! dic'o sistema debe ajustarse para llevar a cabo sus "unciones de manera normal$ La temperatura del aire! la radiación solar indirecta # una pobre nutrición! son los principales "actores 4ue a"ectan el balance energético de los sistemas biológicos en las zonas (ridas 1>ilani9ove! %2-&3$ La radiación solar es el e"ecto de la energía radiante del sol # la radiación térmica del medio ambiente circundante 17#mbalu9 # 7'ristison! %22/3! # es el principal "actor 4ue causa estrés calórico e incrementa la ganancia de calor! tanto directo como indirecto 1>'earer et al$! %22%3$ +urante las 'oras de luz del día! casi todo el calor obtenido del medio directo o indirectamente del sol! puede reducir la e"iciencia reproductiva en un nic'o! # esto se debe probablemente a la energía gastada en liberar al organismo del exceso de la carga calórica! mediante un incremento en la respiración # otras actividades relacionadas 4ue alteran el metabolismo de un ser vivo 1Cu4ua#! %2-%3$ El estrés calórico se de"ine como cual4uier combinación de condiciones ambientales! 4ue causan 4ue la temperatura de la zona termoneutral de los organismos sea superior$ >in embargo! es di"ícil especi"icar cu(l es la exacta combinación de condiciones ambientales para 4ue se origine el estrés calórico para 2 . .3 a la presencia de plagas # en"ermedades # al inadecuado control de éstas. así como también de los apo#os "inancieros por parte del gobierno$ Adem(s intervienen otros "actores 4ue in"lu#en en 4ue la producción promedio sea baja! # esto es debido= %3 a 4ue se cultiva principalmente en terrenos de temporal.

# >ilani9ove! %2-&3$ Por otra parte! las zonas semi(ridas! se caracterizan por condiciones estacionales extremas! con lluvias relativamente escasas # períodos mu# prolongados de se4uía$ Las "luctuaciones diarias # estacionales con respecto a la temperatura son mu# amplias casi todo el a6o! con una intensa radiación solar por la atmós"era seca # los cielos despejados 1>'arma! %22%3$ 7on respecto a la respuesta celular generada por las agresiones ambientales! éstas propician el replegado inapropiado de las proteínas! lo cual es mu# peligroso para la célula$ Por m(s de */ a6os 'a sido reconocido 4ue la lenta elevación de la temperatura! puede inducir la respuesta llamada de c'o4ue calórico en todas las células 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ Esta respuesta de estrés! se caracteriza por un r(pido aumento en la síntesis de un grupo de polipéptidos llamados proteínas de c'o4ue térmico ó calórico 8sp 18eat s'oc9 proteins3$ Mismas 4ue se clasi"ican en cinco "amilias con"orme al peso molecular aproximado con respecto a sus di"erentes miembros= 8sp%//! 8sp2/! 8sp&/! 8sp./3! existiendo escasa in"ormación sobre la carga calórica extra de la radiación solar sobre el balance energético! el consumo de nutrientes # el metabolismo 'ídrico de un organismo 1Mac"arlane et al$!%2. donde se expresan genes para las "amilias de las 8sp con distintos grados de variación respecto a la secuencia # a sus patrones de expresión$ Adem(s! participan en la síntesis de proteínas! en la traducción e interacción proteína< proteína! en la degradación de proteínas! en el transporte # en la termotolerancia$ B .3$ Muc'as de las 8sp est(n asociadas a c'aperonas! las cuales son expresadas constitutivamente en todas las células../! 8spGs pe4ue6as de %0 a .cual4uier tipo de organismos! #a 4ue existen varias di"erencias entre los mismos 1Bu""ington et al$! %2-%3$ Fambién se 'a se6alado 4ue la importancia de la variación en la radiación solar para producir respuestas "isiológicas! es comparable bajo condiciones de campo con las variaciones en la temperatura del aire! # considerablemente ma#or 4ue la de presión de vapor # la velocidad de los vientos 18arris et al$! %2./ 9ilodaltones$ Por a6os! las "unciones de éstas proteínas "ueron desconocidas! pero estudios recientes las 'an de"inido como los compuestos moleculares centrales en la ma4uinaria del plegado de las proteínas 18artl! %22.

3$ >e tienen antecedentes en el laboratorio! de 4ue existe 'omología entre las 8sp expresadas en mamí"eros # las de "rijol! #a 4ue al utilizar anticuerpos de ratón cu#o blanco son las 8sp! se pueden localizar # puri"icar los componentes proteícos de las 8sp de "rijol$ 7abe mencionar 4ue no se encuentra estudio alguno reportado sobre estas proteínas en embriones de "rijol$ Para la realización de este trabajo! se consideró relevante estudiar la proteína de c'o4ue térmico 8sp&/.Así! la respuesta al estrés es la adaptación evolutiva para corregir r(pidamente el replegado e4uivocado de las proteínas # restaurar el plegado ambiental normal de la célula 1Pa'l et al$! %22&3$ En términos generales! las 8sp "uncionan previniendo la acumulación de proteínas da6adas por el estrés en dos "ormas= %3 algunas participan como c'aperonas moleculares! promoviendo el adecuado redoblamiento de las proteínas # evitando su desnaturalización. # )3 es 4ue "acilitan la degradación de proteínas anormales$ Esto conlleva a detallar el conocimiento bio4uímico # molecular de la "unción de las 8sp necesario para integrarse con un entendimiento "isiológico Hnico de cual4uier organismo en particular! #a 4ue estos responden a di"erentes niveles # tipos de estrés empleando di"erentes 8sp 1Parsell # Lind4uist! %22. en virtud de su disponibilidad a interactuar con polipéptidos 4ue no se encuentran plegados en su estado natural! # 4ue desempe6an una "unción vital plegando proteínas tanto en el estado normal! como en el de estrés calórico dentro una célula. siendo la "amilia m(s conservada de las 8sp entre los organismos 1Cr#dman! )//%3$ Por otro lado! la caracterización de las variedades de "rijol se 'ace de manera tradicional! a través de una descripción mor"ológica # agronómica 1"enotípica3 de las plantas cultivadas$ >in embargo! desde el punto de vista bio4uímico<molecular! es interesante explorar metodologías 4ue permitan obtener in"ormación b(sica! 4ue pueda ser utilizada para entender los mecanismos de adaptación e inadaptación de las variedades cultivadas en la región! a las cuales se les re4uiera incorporar alguna característica especial para alterar su capacidad productiva! así como C .

seleccionar las variedades de "rijol! 4ue mejor se adapten a las condiciones ambientales de la región$ El modelo universal para el estudio molecular de plantas es la Arabidopsis taliana 1considerada maleza en Europa3! cu#o punto de atracción 'a sido su pe4ue6o genoma 1%0 cromosomas3 # su ciclo biológico de corta duración$ >in embargo! existen otras especies de alto interés económico como el maíz! trigo # cebada! donde se aplican grandes cantidades de dinero para su investigación a nivel mundial en mejoramiento genético$ 7abe mencionar! 4ue no todos los estudios de modi"icación genética basados en modelos se6alados para la caracterización de genes # de su control! se pueden extrapolar a otras especies! ni en el caso de Arabidopsis! aun cuando ésta es una planta dicotiledónea al igual 4ue el "rijol 1CujiIara et al$! )//)3$ Las 8sp se expresan! precediendo las posibilidades de aclimatación! protección # supervivencia$ +e a'í la relevancia de estudiar el comportamiento de las mismas en la germinación! el cual es un evento crítico en la agricultura! siendo Htil desde el punto de vista de la producción # del cultivo del "rijol # al mismo tiempo para obtener in"ormación b(sica de su "isiología celular # molecular$ El conocer algunos aspectos moleculares de los eventos bio4uímicos involucrados en el proceso de germinación! permitiría contar con la in"ormación b(sica sobre los mecanismos de adaptación de la planta a las condiciones climatológicas de la región "rijolera del Estado$ >i bien este conocimiento de momento no impacta directamente sobre los procesos productivos! si genera in"ormación b(sica del comportamiento molecular de las proteínas inducibles por estrés ambiental e in"ormación 4ue expli4ue algunos aspectos "isiólogicos del ciclo de vida del "rijol$ 7onocer la din(mica de la expresión de las 8sp inducibles por calor! podría ser también de gran utilidad en un "uturo! #a 4ue se podría utilizar como un indicador de adaptación al estrés ambiental$ Adem(s! permitir( extrapolar detalles del comportamiento molecular del "rijol sobre la "unción especí"ica de estas proteínas! comparando con las #a D .

"ueron los siguientes= 6 .existentes en otras especies productoras de grano #Jo modelos biológicos 1Miern#9! %2223$ La propuesta de un modelo alternativo basado en algunas de las características relevantes del "rijol como= variedades de amplia utilización en la región! semillas relativamente grandes! gran disponibilidad de material genético! conservación de las características de la especie! embriones con alto porcentaje de germinación! es en sí! una propuesta original$ Los embriones de "rijol permiten contar con un sistema estable de moléculas! las cuales pueden ser puri"icadas para su estudio # utilización! #a 4ue podrían ser monitoreadas in vivo e in vitro a través del proceso de germinación o durante el ciclo biológico de la planta$ Ensa#os preliminares 'an demostrado 4ue es viable la utilización de este modelo biológico! puesto 4ue permite la manipulación molecular a un bajo costo si se compara! por ejemplo! con el costo del cultivo de células animales o vegetales! el cultivo de protoplastos o el del cultivo de tejidos vegetales$ Adem(s! existe una gran cantidad disponible de este material biológico para su caracterización bio4uímico:molecular! con lo cual se estudiarían los productos de los genes expresados en el ambiente natural de las plantas # se aportarían elementos novedosos al conocimiento de la din(mica molecular de los genes 1genómica3 # sus productos 1proteómica3 para su mejor entendimiento$ 7on base a lo anterior # ante los escasos estudios sobre las proteínas de c'o4ue calórico 18sp&/3 en "rijol 1Phaseolus vulgaris L3! el objetivo general! objetivos particulares e 'ipótesis.

/K7! con la expresión del AD@m # de la proteína de c'o4ue térmico 8sp&/! en embriones de Phaseolus vulgaris en el proceso inicial de la germinación$ )$ 7uanti"icar los niveles de la expresión in vitro! del AD@m # de la proteína de c'o4ue térmico en embriones germinados de Phaseolus vulgaris! sometidos a estrés calórico$ H.s.234 +eterminar la expresión del AD@m # de la proteína 8sp&/ en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrés calórico$ O*+.-.O*+./o 0.1.s %$ 7onocer la relación de un rango de temperatura de )0K7 a .s El AD@m # la proteína 8sp&/! muestran un patrón de expresión di"erencial en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrés térmico$ E .p7-.56432./os p32-.-.

II. ) de Australia # tan sólo % de Europa$ En México! se 'an identi"icado m(s de ..2:s-. del sur de Asia # oriente de A"rica.& especies del género Phaseolus! de éstas sólo cuatro se cultivan con el propósito de usarse en la alimentación 'umana= P. son originarias del continente Americano.+o4 =Phaseolus vulgaris L. como por el consumo generalizado del mismo entre la población$ Es una planta anual! 'erb(cea intensamente cultivada desde las zonas tropicales 'asta las templadas$ >e le conoce con di"erentes nombres= poroto! 'aricot! caraota! judía! alubia # 'abic'uela$ El "rijol pertenece a la "amilia Leguminoceae # es una semilla "ormada por una cubierta! dos cotiledones # un embrión 1Cigura %3! el cual esta "ormado por las estructuras de la radícula! epicótilo! plHmula e 'ipocótilo 18idalgo # +ebouc9! %2-03$ Cigura %$ 7orte transversal de una semilla de "rijol$ 8idalgo # +ebouc9! %2-0 A nivel mundial se conocen %-/ especies del género Phaseolus! de las cuales aproximadamente %).s .4 <2. 0.234.1. RE8ISIÓN DE LITERATURA !.> El "rijol es un cultivo de gran importancia tanto por la producción nacional # regional.9 C3235-. coccineus! P$ F .53s 0.

3 Las semillas son un componente vital de la dieta en el mundo! siendo los granos de cereales los 4ue comprenden aproximadamente el 2/B de todas la semillas cultivadas.! E4 p2o5.135. por lo 4ue una dieta adecuada en amino(cidos esenciales se logra al combinar "rijol con cereales como maíz! arroz # otros 1Ertiz! %22-3$ !.o2?315.71). 4ue contribu#en con la mitad de la ingesta de energía per capita$ L no es de sorprenderse! de 4ue la biología de las semillas es una de las (reas de la "isiología de las plantas con ma#or investigación$ Pero! a pesar de la gran cantidad de publicaciones sobre germinación # dormancia! aHn no se pueden responder dos cuestiones "undamentales= %3 M7ómo emerge el embrión de la semilla para una completa germinaciónN # )3 M7ómo la emergencia del embrión es blo4ueda! de tal manera 4ue las semillas pueden mantenerse en estado de dormanciaN 1BeIle#! %22&3$ Una semilla viable de "rijol! germina a los pocos minutos de 'aber embebido agua! siempre # cuando la temperatura sea la apropiada # exista adem(s un suministro adecuado de oxígeno$ La germinación del "rijol es epígea 1Cigura )3! donde los cotiledones salen a la super"icie sostenidos por el 'ipocótilo 4ue se alarga # se endereza por encima del suelo durante el desarrollo de la planta$ G .so . 0..lunatus! P$ acutifolius # P$ vulgaris$ >iendo ésta Hltima la m(s utilizada! es originaria del (rea comprendida por México<Auatemala 1López! %22%3$ El "rijol es cultivado con el "in de cosec'ar grano seco 1contiene alrededor de )0B de proteína3 # en menor proporción para la producción de vaina! es decir! "rijol ejotero! el cual puede consumirse "resco! enlatado o congelado$ La semilla # vainas se usan como alimento! en la producción de "orraje para el ganado # en el mejoramiento de suelos como abono$ Adem(s! es rico en lisina pero de"iciente en los amino(cidos azu"rados= metionina! cistina # triptó"ano.2?.

Cigura )$ Aerminación epígea de una semilla de "rijol$ BeIle# # Blac9! %22.$ A0 .$ La planta de "rijol 1Cigura *3! "lorece cuando cambia de la "ase vegetativa a la "ase reproductiva! donde aparecen in"lorescencias 4ue al madurar en vainas! éstas se abren # dejan escapar las semillas propag(ndose así por de'iscencia$ Cigura *$ Planta de "rijol$ Cuente= BeIle# # Blac9! %22.

s?o ..71 ( 2.*.& I?*.2?.En cuanto a lo 4ue respecta a la germinación! se sabe 4ue ésta incorpora varios eventos 4ue comienzan con la imbibición de agua por una semilla seca # 4uiescente! # termina con la elongación de los ejes embrionarios 1BeIle# # Blac9! %22.o .1 43 0.4 ?..1.-3*o4.135. en tanto 4ue el incremento posterior 1"ase ???3 sólo ocurre después de 4ue la germinación se 'a completado$ La toma de agua durante el inicio de la "ase ?! resulta en perturbaciones estructurales particularmente de membranas! 4ue permiten la salida de solutos # metabolitos de bajo peso molecular$ Esto es sintom(tico de las membranas bilipídicas en "ase de gel en la maduración # des'idratación! a la "ase normal de 'idratación # "ase lí4uida cristalina 17roIe # 7roIe! %22)3$ +entro de un tiempo corto de re'idratación las membranas cortan la "uga de solutos$ 7abe mencionar 4ue a nivel molecular aun no se conoce como se reparan las membranas plasm(ticas # las de organelos 1>andoval et al$! %2203$ Bajo la imbibición! las semillas secas # 4uiescentes rapidamente reinician la actividad metabólica$ Las estructuras # enzimas necesarias para reiniciar tal AA .5.3$ El signo visible de 4ue la germinación se llevó a cabo! es la penetración de las estructuras 4ue rodean el embrión por la radícula$ Los eventos subsecuentes inclu#endo la movilización de las reservas almacenadas! se asocia con el crecimiento # desarrollo de la pl(ntula$ Fodos los eventos metabólicos # celulares 4ue ocurren 'asta antes de la germinación en semillas no dormantes! ocurren en las semillas en dormancia inclu#endo la imbibición! pero éstas Hltimas "allan en la elongación de los ejes embrionarios$ Por otro lado! el "enómeno de dormancia sucede en la Hltima etapa de la embriogénesis! cuando la semilla est( totalmente "ormada # madura! es decir! des'idratada # con capacidad para sobrevivir de manera independiente de la planta 1Bentsin9 # Ooornnee"! )//)3$ !.71 La toma de agua por la semilla madura 1seca3! tiene tres "ases= la "ase ? en la cual 'a# un ingreso inicial r(pido del agua! seguido de una "ase de meseta 1"ase ??3.5.

actividad! se encuentran en la semilla seca! las cuales sobreviven por lo menos parcialmente intactas al proceso de desecación 4ue termina en la semilla madura$ La introducción de agua permite la actividad metabólica sin síntesis de nuevas enzimas! 4ue en pocas 'oras son remplazadas por el metabolismo completo$ Uno de los primeros cambios con la imbibición! es el reinicio de la actividad respiratoria! la cual es detectada en minutos después del incremento inicial en el consumo de oxígeno$ La tasa respiratoria se reduce 'asta 4ue la radícula penetra las estructuras 4ue la rodean! gener(ndose un nuevo incremento de la actividad respiratoria 1BeIle# # Blac9! %22.s .6231-.s. p2o-.3$ La vía glicolítica # la ruta de las pentosas "os"ato se reinician en "ase ?! así como también se activan las enzimas del ciclo de Orebs$ >e conoce también de la existencia de mitocondrias en los tejidos embrionarios! pero con poca di"erenciación los cuales en unas cuantas 'oras se redi"erencian # permiten la generación de nuevas mitocondrias! en donde se expresan los primeros genes nucleares 1E'rens'a"t # Brambl! %22/3$ !. 43 0..135.3. por ejemplo! los 4ue codi"ican para las proteínas ribosomales después de su traducción son remplazados por nuevos AD@Gs mensajeros 1Beltr(n et al$! %2203$ El almacenamiento de los mensajeros en las semillas! apunta a 4ue se almacenan asociados con proteínas en "orma de ribonucleoproteínas mensajeras 1D@Pm3 en el citoplasma! o bien almacenados en el nHcleo 1Peumans et al$! %2&23$ A2 .2?." S:1-.:13s .71 Foda la ma4uinaria para el reinicio de la síntesis de proteínas durante la imbibición! est( presente en las células de los embriones maduros! donde no se detecta la presencia de polirribosomas$ >in embargo! en los primeros minutos de la re'idratación se disminu#e la presencia de ribosomas simples # se detectan complejos de síntesis de proteínas en polirribosomas$ La síntesis inicial depende de ribosomas existentes! pero! se sintetizan nuevos ribosomas en unas 'oras después de 4ue se detecta la asociación en polisomas$ Los AD@m 4ue son traducidos inicialmente! existen en el embrión seco # maduro 1Cigura .

Cigura .' E4 .$ Cormación de AD@Gs mensajeros durante el desarrollo completo de la semilla$ Peumans et al$! %2&2$ !.s-2@s El estrés es todo a4uello 4ue no causa bienestar al organismo # es provocado por diversos "actores! 4ue implica la respuesta de éste "rente a una amenaza ante la cual necesita ajustarse 1Pon! %2203$ En plantas! usualmente es de"inido como el "actor 4ue ejerce una in"luencia de desventaja en éstas$ El estrés puede ser biótico! impuesto por otros organismos! o abiótico despertado por un exceso o de"iciencia en el ambiente "ísico o 4uímico 17uadro %3$ AB .

7-.5oA Las plantas "recuentemente se en"rentan al estrés 1condiciones externas 4ue a"ectan adversamente el crecimiento! el desarrollo o la productividad3$ Qste despierta un amplio rango de respuestas en la planta! desde una alteración en la expresión de genes # del metabolismo celular! 'asta cambios en las tasas de crecimiento # rendimiento de las cosec'as$ La duración! severidad # el rango al cual el estrés es impuesto in"lu#en en la respuesta de la planta$ Algunas condiciones adversas en combinación! pueden inducir una respuesta di"erente de a4uella proveniente de un solo tipo de estrés$ 7aracterísticas de la planta inclu#endo identidad de los órganos # tejidos! la edad del desarrollo # el genotipo también in"lu#en en la respuesta al estrés$ Algunas respuestas claramente "avorecen la aclimatación al estrés! mientras el papel "uncional de otras no es claro$ +e tal manera! 4ue identi"icar cu(les respuestas promueven o mantienen el crecimiento # desarrollo de las plantas durante este proceso! es de suma importancia para entender el proceso de respuesta al estrés$ >i se compara el rendimiento m(s alto con el rendimiento promedio! el impacto del medio ambiente sobre la productividad 4ueda de mani"iesto$ >i este crecimiento m(ximo se asume como el 4ue representa el desarrollo de las plantas bajo condiciones ideales! entonces! las pérdidas asociadas con el estrés biótico # abiótico! reducen la productividad media en .5oA 7alor Crío >e4uía >al Aire Exidativo Anaeróbico Metales pesados Lesiones Calta de nutrientes Exceso de luz Patógenos 8erbívoros B.7-. AC .7uadro %$ Cactores 4ue causan estrés$ Cuente= Pon! %220$ A*.0 a -&B dependiendo del tipo de cultivo 1Polla et al$! %22-3.

estas proteínas "ueron descubiertas primero en Drosophila # 'an AD .:13s . 5CoD6. por lo 4ue ésta tiene ma#or tolerancia al estrés por calor$ >i la tolerancia se incrementa como resultado de la exposición previa a un estrés! se dice 4ue la planta est( aclimatada$ La aclimatación se debe di"erenciar de la adaptación! donde ésta se re"iere a un nivel de resistencia determinado genéticamente # ad4uirido por un proceso de selección en varias generaciones 18o""mann # Parsons! %22%3$ Bajo condiciones naturales # de agricultura! las plantas son "recuentemente expuestas a estrés$ Algunos "actores ambientales! como la temperarura del aire pueden ser estresantes en pocos minutos! otros como el agua del suelo toman días o semanas # otros como los nutrientes minerales toman meses en ser estresantes 17urrie! %22&3$ !..Entre las condiciones ambientales 4ue causan el estrés! se encuentran el exceso de agua! se4uía! altas # bajas temperaturas! excesiva salinidad en el suelo! nutrientes minerales inadecuados en el suelo # exceso o de"iciencia de luz$ Fambién compuestos "itotóxicos como el ozono! pueden ser da6inos a los tejidos de la planta$ En ese sentido la resistencia o sensibilidad al estrés depende de la especie! el genotipo! el desarrollo # la edad de la planta 17urrie! %22&3$ En la ma#oría de los casos el estrés es medido en relación con la sobreviviencia! rendimiento # crecimiento de la planta! así como en la expresión de sus genes$ +ebido a 4ue el estrés es de"inido en términos de la respuesta de la planta! se asocia íntimamente con la tolerancia al estrés! el cual consiste en la adecuación de la planta a un ambiente des"avorable$ Un ambiente o "actor estresante para una planta puede no serlo para otra! por ejemplo= Pisum sativum crece bien a )/K7 # Glycine max a */K7$ Al incrementar la temperatura P. sativum presenta síntomas de estrés calórico m(s pronto 4ue la otra planta.B L3s p2o-. 53472.5o =Hsp> En respuesta a temperaturas elevadas! las plantas sintetizan proteínas de c'o4ue calórico 18sp3.

/K7 1justo debajo de la temperatura letal3! la síntesis de AD@m # proteínas! es suspendida mientras se estimula la transcripción # traducción del grupo de proteínas 8sp$ Los transcritos nuevos de AD@m 'an sido detectados de * a 0 minutos después del c'o4ue calórico 1>ac's # 8o! %2-.3$ Los rangos de los pesos moleculares de las 8sp se encuentran entre los %0 a %%/ 9ilodaltones 19+a3! las proteínas de bajo peso molecular 18sp de %0<./ 9+a3 son abundantes en plantas superiores m(s 4ue en otros organismos # presentan baja 'omología con otras 8sp de bajo peso molecular de animales # microorganismos$ >in embargo! algunas otras 8sp son mu# similares en plantas # animales! por ejemplo! los genes estructurales 4ue codi"ican para 8sp&/ en Maíz! Drosophila # 'umanos muestran un &0B de 'omología$ >i bien las 8sp de plantas "ueron identi"icadas por cambios r(pidos de )0 a ./K7! 4ue raramente ocurren en la naturaleza! también son inducidas por cambios graduales de incremento de temperatura 4ue representan el ambiente natural # ocurren en plantas bajo condiciones de campo$ Algunas 8sp se encuentran en células normales 1constitutivamente3 sin estrés! # algunas proteínas celulares esenciales son 'omólogas a las 8sp! pero no se incrementan en respuesta al estrés por temperatura$ Muc'as 8sp son codi"icadas por miembros de "amilias multigénicas! de las cuales solo algunas son inducidas por calor$ +istintas 8sp son localizadas en el nHcleo! mitocondria! cloroplasto! retículo endopl(smico # citoplasma$ Las 8sp no sólo son inducidas por calor! sino 4ue también por estrés ambiental como dé"icit 'ídrico! tratamiento con (cido abcísico 1ABA3! da6o "ísico! baja temperatura # salinidad 1Ruarrie! %22*.sido identi"icadas también en 'umanos! plantas # microorganismos$ 7uando las células o pl(ntulas de "rijol de so#a son sometidas de )0K7 a . Dobertson et al$! %22*3$ El c'o4ue por calor se puede despertar bajo numerosas circunstancias con resultados 4ue se ubican entre crecimiento retardado! a da6o de órganos # la muerte de la planta$ En el campo! el c'o4ue calórico puede encenderse cuando la transpiración es insu"iciente 1limitación de agua o temperatura alta3 o cuando los A6 .

Parson! %2-%3$ >i bien muc'as semillas germinan en un amplio rango de temperaturas! usualmente no germinan por arriba o por debajo de sus rangos especí"icos de especie$ La temperatura mínima de muc'as especies es de / a 0K7! la m(xima es de .0 K7 1Faiz # eiger! %22-3$ Las plantas expuestas a calor excesivo ex'iben un grupo de características de respuesta celular # metabólica! de las cuales muc'as est(n conservadas en todos los organismos$ La característica de la respuesta a calor es un decremento en la síntesis de proteínas normales! acompa6ada por una transcripción # traducción acelerada de las proteínas de c'o4ue calórico 1conocidas como 8sp3! esta respuesta se observa cuando las plantas son expuestas a por lo menos 0K7 por encima de las condiciones óptimas de crecimiento$ En adición a la alteración de los patrones de expresión genética! el calor también a"ecta la estabilidad de las membranas! aumentando la "luidez de los lípidos de la membrana! lo cual se correlaciona con la pérdida de la "unciones biológicas cuando se presenta cierta AE . a .-K7! # la óptima! es de )0 a */K7 1Daven et al$! %2223$ Los tejidos 'idratados con crecimiento activo di"ícilmente sobreviven a . en órganos con capacidad reducida para la transpiración$ Las plantas pueden ser aclimatadas al estrés por calor! o ad4uirir termotolerancia si son sujetas a temperaturas altas no letales 1permisivas3 por unas pocas 'oras antes de encontrar las condiciones de c'o4ue calórico$ El proceso de aclimatación se creé involucra nuevas proteínas sintetizadas en respuesta a temperaturas altas permisivas! las cuales con"ieren termotolerancia al organismo$ Una planta aclimatada puede sobrevivir a temperaturas 4ue podrían ser de otra "orma letales$ A pesar de esa capacidad 'a# por supuesto límites de la cantidad de calor 4ue debe recibir la planta 1Bra# et al$! )///3$ La germinación después de la siembra a temperaturas entre )/ # )0K7 es de . en la germinación! cuando el suelo es calentado por el sol. +u""us # >laugt'er! %2-/.%.0 a .estomas est(n parcial o totalmente cerrados # la irradiación es alta. días 17olbr# et al$! %2. días 1con crecimiento de por lo menos 0 cm para poder emerger a la super"icie3! en tanto 4ue al incrementar el rango 'asta */K7! germinan de ) a .

# al mismo tiempo evento "isiológico! celular # molecular! 4ue merece ser estudiado para la obtención de conocimientos b(sicos! para su entendimiento # posterior manipulación 1Bra# et al$! )///3$ La "unción especí"ica de las di"erentes 8sp aun no se conoce! pero las 8sp # algunas otras proteínas actuan como c'aperonas! involucrando estabilización # doblado de proteínas dependientes de AFP # ensamble de proteínas oligoméricas 1Cigura 03$ Fambién! est(n involucradas en el transporte de polipéptidos a través de las membranas a compartimentos celulares 1Telc' # BroIn! %22.3$ Algunas de las principales 8sp est(n conservadas entre todos los organismos vivos= eucariotes # procariotes! muc'as de esas proteínas "uncionan como c'aperonas # est(n involucradas en el re<doblamiento de proteínas desnaturalizadas por el c'o4ue calórico$ Algunas de las 8sp son expresadas al inicio del desarrollo del organismo! por lo tanto! no son inducidas por calor! pero son de"inidas como 8sp debido a su 'omología de secuencias # posible similitud en la "unción$ La ma#oría de las "unciones de las 8sp de plantas no 'a sido demostrada in vivo 1Bra# et al$! )///3$ Es decir! la ma#or parte de la investigación de las "unciones de las 8sp 'a sido completada en Drosophila! donde se 'an obtenido mutantes! por lo 4ue el papel de AF .adaptación "isiológica al incremento de la temperatura$ +e igual manera se a"ecta la "uerza de las interacciones electrost(ticas de las proteínas con otros componentes solubles # con los lípidos 1Daison et al$! %2-)3$ El incremento de la temperatura a"ecta la "otosíntesis! por4ue se ven a"ectados los "otosistemas ? # ?? de las membranas de los cloroplastos$ Existen plantas 4ue se 'an adaptado a las condiciones ambientales de una radiación solar intensa # 'an desarrollado algunas estructuras mor"ológicas # "uncionales 4ue les permiten protección contra un calor excesivo 1BSjorman et al$! %2-/3$ En ese contexto de adversidades es 4ue las proteínas 8sp se expresan! precediendo las posibilidades de aclimatación! protección # sobrevivencia$ +e a'í la relevancia de estudiar el comportamiento de las mismas en uno de los eventos críticos de la agricultura= la germinación! asunto Htil desde el punto de vista de la producción # del cultivo del "rijol.

$ Los residuos 'idro"óbicos de las cadenas de los polipéptidos no doblados son protegidos por las 8sp del ambiente acuoso! de tal manera 4ue evitan interacciones 'idro"óbicas # "ormaciones agregativas no nativas de los polipéptidos$ Estudios in vitro de "racciones proteícas enri4uecidas con 8sp%0 muestran 4ue se comportan como proteínas estabilizadoras no especí"icas! 4ue estabilizan otros polipéptidos 4ue se degradan "(cilmente con el incremento de calor$ In vivo la unión de 8sp a péptidos particulares dentro de compartimentos subcelulares se creé es muc'o m(s especí"ica! tales uniones de 8sp<polipéptidos son críticas dado la tendencia de muc'as proteínas a desnaturalizarse en altas temperaturas 18ig'toIer # 8enders'ot! %22&3$ AG .8sp en plantas! 'a sido in"erido por estudios de complementación en levaduras de Saccharomyces cerevisiae 1@over et al$! %22.3$ Cigura 0$ Cunciones de c'aperonas moleculares$ Cuente= Telc' # BroIn! %22.

3 .4. 43s Hsp70 =BB)7F ED3> $ >on esenciales para la "unción celular normal! algunos miembros de esta "amilia son expresados constitutivamente! otros 20 .3$ *3 F3?.Las condiciones 4ue inducen la tolerancia térmica en plantas correlacionan estrec'amente con las 4ue inducen la acumulación de 8sp! pero tal correlación no proveé evidencia de 4ue las 8sp jueguen un papel esencial en la aclimatación al estrés calórico$ La expresión del "actor activador 18s"3 de la transcripción de las 8sp! induce la síntesis constitutiva de las 8sp e incrementa la termotolerancia en Arabidopsis 1Lee et al$! %2203$ Estudios en plantas de Arabidopsis 4ue contenian secuencias antisentido de A+@! redujeron la síntesis de 8sp&/! mostrando 4ue las altas temperaturas extremas a las cuales las plantas podían sobrevivir! se redujeron en )K7 comparados con el control$ Mutantes crecieron a la temperatura óptima 1Lee # >c'oe""l! %22.3 .3$ %3 F3?. 43s Hsp%0 =F&)%0 ED3> $ Las 8sp2/ se asocian con receptores de 'ormonas en células animales # podrían estar involucradas en su activación! pero! no 'a# in"ormación e4uivalente en plantas$ >e encuentran en bacterias! compartimentos citopl(smicos! nucleares # de retículo endopl(smico de eucariotes! donde "uncionan como c'aperonas moleculares de larga vida de interacción$ En levaduras son esenciales para la sobrevivencia a las temperaturas altas 1Laevis et al$! %22..3 .3$ Las proteínas de c'o4ue calórico 18sp3 se 'an denominado # agrupado en cinco distintas "amilias! con base a sus pesos moleculares 1Ellis! %22.4. 43s Hsp900 =900)990 ED3>$ ?nclu#en proteínas de bacterias! levaduras! tripanosomas! mamí"eros # plantas! contienen dos dominios conservados de unión a AFP$ >e pueden distinguir * sub"amilias con base a la 'omología de los dominios 4ue "lan4uean los dominios de unión a AFP$ Una de las sub"amilias es inducible por calor # estan involucradas en la termotolerancia$ Estas c'aperonas "uncionan en la desagregación! m(s 4ue en prevenir la agregación # doblados erróneos durante la exposición a altas temperaturas 1Easton et al$! )///3$ )3 F3?..4..

. 43s HspB0 ='0$B0 ED3>$ Fambién se creé 4ue "uncionan como c'aperonas moleculares! se presentan en el citoplasma bacteriano! matriz mitocondrial # en el estroma de cloroplastos$ >on abundantes aun en temperaturas normales! su "unción principal est( asociada al ensamble de proteínas$ Presentan una estructura oligomérica! ) 'ept(meros en "orma de anillo 4ue re4uieren de AFP$ En plantas! la m(s estudiada es la c'aperonina .G3s s?Hsp =9'$"0 ED3> $ Un aspecto Hnico de las plantas! es la presencia de sm8>Ps 1small 'eat s'oc9 proteins3 contienen por lo menos 0 clases de estas proteínas! mientras otros organismos tienen sólo una clase de sm8>P! las distintas clases se distribu#en dos en citoplasma! una en cloroplasto! una en retículo endopl(smico! una en mitocondria$ El extremo amino de ellas comparte 'omología con las proteínas α<cristalinas! proteínas del cristalino de los ojos de vertebrados$ Corman complejos de )//<-// 9+a. en plantas no se 'a demostrado su "unción! pero en mamí"ieros # Drosophila indican 4ue éstas participan en el establecimiento de la termotolerancia! no 'a# evidencia de 4ue se re4uieran para la "unción celular normal$ @o re4uieren de AFP$ En c'íc'aro se 'a demostrado 4ue previenen la agregación de proteínas in vitro! en respuesta a temperaturas altas 1Bra# et al$! )///3$ Algunas 8sp se unen temporalmente a una 2A .4.son iducibles por "río o calor! se localizan en muc'os compartimentos celulares! son c'aperonas dependientes de AFP involucradas en el doblado! ensamble # desensamble$ La localización nuclear de las 8sp&/ es redistribuída al citoplasma durante la recuperación por estrés$ La característica m(s conservada entre organismos es el dominio amino terminal de unión a AFP! la expresión de 8sp&/ en plantas generalmente no es tan "uerte como en otros organismos$ +os miembros distintos pero mu# 'omólogos por su igualdad en composición de amino(cidos son= la 8sp&/ # la 8sc&/! 4ue residen respectivamente en el citoplasma # nHcleo de las células de mamí"eros 1Marimoto # Milas9i! %22/.3 ./ de cloroplasto codi"icada en nHcleo! involucrada en el ensamble de la enzima Dubisco! pero! no se incrementa en respuesta al estrés por calor 1Lo9ota et al$! )///3$ 03 F3?. 7raven et al$!%22&3$ .D6.3 F3?. 43s p..4.3 .

1/o465231 3 43 Hsp70 >e 'a reportado 4ue la proteína del gene de c'o4ue calórico 18sp&/3 est( involucrada en la determinación de susceptibilidad a desarrollar lupus eritematoso sistémico en la población mestiza mexicana$ Esto est( soportado! a 4ue este gene se encuentra cercano a los alelos del complejo de 'istocompatibilidad! 4ue son reconocidos como "actores genéticos para desarrollar lupus 1Pargas et al$! )///3$ Por otro lado! el "actor de necrosis tumoral al"a 1F@C< α3 est( en aumento en tejido adiposo! tanto en modelos de roedores como en 'umanos! por lo 4ue se 'a! considerado un gene candidato para la obesidad$ 8a# evidencia de 4ue el gene cercano de 8sp&/ est( involucrado también en la ganancia de peso 17'ouc'ane et al.enzima estabilizada en un estado particular del desarrollo celular! posteriormente! se liberan para dejar activa la enzima! por ejemplo la 8sp&/ de plastidios en el cromoplasto de las "lores de Narcissus pseudonarcissus! la cual protege la enzima "itoene desaturasa! 4ue se asocia con la biosíntesis de los carotenoides$ Esta enzima se codi"ica en el nHcleo # es importada al cromoplasto temprano en el desarrollo! permanece unida # es estabilizada por la 8sp&/ 'asta 4ue es liberada m(s tarde para 4ue sea activa 1Bon9 et al$! %22.7 O-2os p2o5.sos D6. .3$ !.! )//%3$ Por otra parte! se 'a estudiado la expresión de la "orma constitutiva # de la inducible por estrés de 8sp&/! respecto a la calidad del semen en c'ivos de carne al realizar an(lisis de Testern blot! # se observó 4ue la calidad disminu#e signi"icativamente en muestras con un bajo nivel de 8sp&/ durante la estación de calor 18uang et al$! )///3$ >e 'a reportado 4ue la proteína 8sp&/ participa en el proceso de muerte celular programado 1apoptosis3! uniéndose al "actor Apa"<% evitando 4ue se "orme el apoptosoma # se lleve a cabo este evento 1Davagnan et al$! )//%3$ 22 .

& Ap4.o470..0 segundos con el mismo 2B . .o El presente trabajo se realizó en el +epartamento de Biología Molecular de Plantas de la Unidad Académica de Biología Experimental de la Universidad Autónoma de acatecas! ubicada en el 9ilómetro 0 de la 7alzada de la Devolución Mexicana en la 7olonia Fierra # Libertad del municipio de Auadalupe< acatecas.s-6.J35.III.$ >emillas # plantas de "rijol! variedad @egro acatecas &.5o 3 43s s. .2.34 *.3 .535.71 >e pesaron )/ gramos de semillas de "rijol! en cajas Petri # se pusieron a germinar en papel absorbente 19im Iipe3 con 0 mL de agua destilada estéril a una temperatura de )0K7! en una incubadora simple durante %) 'oras. previamente las semillas "ueron lavadas * veces en agitación por .443s .1 0.s-2@s 53472. con una temperatura promedio de %-K7 # una altura de ).4 K2.71 . metros sobre el nivel del mar$ &..! M3-..3$ Los anticuerpos 1anti<8sp&/ # anti<?gA asociado a peroxidasa3! "ueron de 7albioc'em$ Cigura .135. MATERIALES H MITODOS &.2.2?.9 Lo534.71 .5o En este estudio se utilizó la variedad de "rijol @egro acatecas 1Cigura .?..

K7 en el re"rigerador! para luego centri"ugar a %*!/// rpm por %/ minutos$ Posteriormente! se decantó el sobrenadante # se lavó el pellet de AD@ 1gel translHcido3! adicionando % mL 1por 2C . todo el ensa#o se realizó por triplicado! para veri"icar su reproducibilidad en el resultado$ &./K7! es decir! 4ue el segundo tratamiento "ué sometido 0 grados sobre los )0K7 iniciales por una 'ora! en tanto 4ue el Hltimo tratamiento "ue sometido %0 grados sobre los )0K7 durante una 'ora$ 7omo control! se utilizaron semillas de "rijol de la misma variedad en estado de dormancia! las cuales solo "ueron tratadas con agua # sin aplicar estrés calórico$ A todas las semillas se les extrajeron los embriones! )/ gramos rinden aproximadamente -// miligramos de embriones en seco$ +espués se les 'izo extracción # cuanti"icación de AD@ # proteínas solubles 1Brad"ord! %2&.volumen de agua destilada$ >e 'izo un lavado "inal con agua destilada estéril$ Franscurridas las %) 'oras del proceso de germinación en condiciones de 'umedad! oscuridad # de temperatura constante! las semillas se sometieron a un incremento de temperatura de 0K7 por una 'ora! de tal manera 4ue el primer tratamiento sólo contaba con %) 'oras a )0K7$ El segundo tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a */K7$ El tercer tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a *0K7$ #! el Hltimo tratamiento contaba con las %) 'oras a )0 grados m(s % 'ora a .3.71 .Jo4 >e tomaron en un tubo eppendor" de %$0 mL 0/ miligramos de embriones de "rijol! # se les adicionó % mL de reactivo de Frizol 1Aibco BDL3! se mezcló # se incubó por %/ minutos$ Luego se puso la mitad del 'omogeneizado en otro tubo eppendor" estéril$ +espués se le adicionó a cada tubo )// µL de cloro"ormo 1>igma3 "río! se taparon bien # se agitaron vigorosamente con la mano por %0 segundos # se dejaron reposar durante * minutos para posteriormente centri"ugar a %*!/// rpm por %0 minutos$ La "ase acuosa e incolora 1parte de arriba3! se tomó cuidadosamente # se trans"irió a otro tubo eppendor" estéril # se le adicionó a cada tubo 0// µL de alco'ol isopropílico 1>igma3 "río! se mezclaron ligeramente con la mano # se dejaron reposar por )/ minutos a ." EL-2355. ARN -o-34 5o1 T2..

.. p2o-..71 .+o4 Los embriones se sumergieron en nitrógeno lí4uido # una vez congelados! se molieron con el pistilo en un mortero de porcelana 'asta obtener un polvo "ino$ +espués! al polvo se le adicionó bu""er de extracción @EF<) 1@ambara et al$! %22)3! poniendo )/ microlitros de bu""er por cada % miligramo de embrión molido$ Para este caso se emplearon aproximadamente ..71 ..s . 43 5o15.cada tubo3 de etanol al &0 B en agua<+EP7 1Apéndice3$ >e mezcló un poco # nuevamente se centri"ugó a %*!/// rpm por %/ minutos$ Por Hltimo! se decantó el sobrenadante # el remanente acuoso se retiró con papel absorbente! luego se dejó el tubo abierto para secar un poco al aire durante 0 minutos # después se resuspendió el AD@ de cada! tubo en 0/ µL de agua tratada con +EP7 1Apéndice3$ >e cuanti"icó el AD@ en el espectro"otómetro # después se mantuvo a <)/K7 en el re"rigerador por tiempo inde"inido 'asta su uso$ Fodo el procedimiento se realizó a temperatura ambiente # usando guantes desec'ables! para evitar su degradación por la contaminación de D@Asas! empleando la técnica suministrada con el reactivo de Frizol de la empresa ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %002..! %22&3$ &.:13s so46*4.5os ( p2o-. mL de bu""er @EF<) 1Apéndice3! luego! el extracto de embriones se pasó a un tubo estéril # se disolvió bien en vortex! posteriormente! se puso a ebullición por * minutos # después se centri"ugó a -/// rpm durante %/ minutos para recuperar la "racción soluble 1sobrenadante3 # determinar así! la concentración de proteínas$ &.. K5.o1./ nanómetros en la región ultravioleta$ La concentración de AD@ total se calculó 2D .5.. <2.. 4os .B M.' EL-2355.1-235.s .os 1654.?*2.71 .:13s Para la determinación de (cidos nucleicos! se tomaron 0 µL de la muestra # se le adicionaron 220 µL de agua destilada! luego se mezclaron # se trans"irieron a una cubeta de cuarzo$ Para ajustar el espectro"otómetro a ceros! se trans"irieron %/// µL de agua destilada a la cubeta$ >e le#ó la absorbancia a una densidad óptica de ).

3! donde se adicionaron en varios tubos eppendor" cantidades de % a 0 microlitros de muestra ajustando a un volumen de -// µL con solución de @a7l %0/ mM 1Apéndice3! después se a6adieron )// µL de solución de trabajo Brad"ord 1Apéndice3$ >e mezclaron los tubos en el vortex # se dejaron reposar por * minutos a temperatura ambiente$ +espués se trans"irió a una cubeta de pl(stico # se le#ó la absorbancia a una densidad óptica de 020 nanómetros en la región visible$ El blanco para ajustar el espectro"otómetro a cero! contenía -// µL de @a7l %0/ mM U )// µL de solución de trabajo Brad"ord$ La cantidad de proteína se calcula! interpolando la densidad óptica obtenida en una curva patrón de proteína o sacando la regresión lineal # sustitu#endo el valor en la ecuación de una recta 1Apéndice3$ 7ada determinación se 'izo por triplicado$ &.a partir de 4ue una densidad óptica de %$/ es igual a .o >e pusieron /$&0 gramos de agarosa 1%$0 B3 en un matraz erlenme#er de %)0 mL # se disolvieron en .s . 3032os3 <o2?34.5-2o<o2.C:.s ../ µg de AD@ por mililitro 1/$%% mM3$ Por ejemplo! si la densidad óptica "ue de /$)0! 'aciendo una regla de tres daría igual a %/ µg por los 0 µL 4ue se aplicaron de AD@! 'abiendo así una concentración "inal de ) µg de AD@ por % microlitro de muestra$ 7ada determinación se 'izo por triplicado$ Para la concentración de A+@c # oligos! ésta se calculó a partir de 4ue una densidad óptica de %$/ es igual a 0/ µg de A+@ por mililitro 1/$%0 mM3 # de ** µg de oligos por mililitro 1/$%/ mM3 respectivamente 1+avis et al$! %2-.. ARN -o-34 .3$ Por otra parte! la cantidad de proteínas se midió de manera colorimétrica en el espectro 1Brad"ord! %2&.4./K7! se le 26 .1 0.0 mL de agua destilada m(s 0 mL de bu""er MEP> %/ V 1Apéndice3$ >e puso la solución a calentar en el 'orno de microondas # se dejó a'í! 'asta 4ue desaparecieron los grumos "ormados.s.7 E4. de vez en cuando se sacó el matraz # se agitó para luego observar si #a se 'abía disuelto completamente la agarosa$ +espués! se dejó en"riar # cuando llegó a una temperatura de ..

)! )//)3$ 2E .-n .23s. CC3. (" =A0 µM3 M%/cla (% RTKTa+ 'la.adicionó 1en una campana de extracción3 )$& mL de "ormalde'ido al *& B # 0 µl de bromuro de etidio %/ mgJmL 1apéndice3$ >e mezcló # se vació el contenido a una c(mara de electro"oresis sumergida previamente armada con su peine! # se dejó geli"icar la solución de agarosa$ 7ada muestra se preparó con ) microgramos de la muestra! e4uivalentes a 0 µl de AD@ total diluído! m(s %0 µl de bu""er de muestra para AD@ 1Apéndice3! se calentaron a 20K7 por * minutos$ +espués de 4ue se retiró el peine del gel! se cargó cada pozo con la muestra # se puso bu""er de corrida MEP> %V para la electro"oresis! luego se le aplicó una corriente constante de %// Polts por */ minutos$ Una vez terminada la electro"oresis! se puso el gel en el transiluminador # se encendió la l(mpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas 1+avis et al$! %2-.35-.2s.F RT)PCR =R.3r l V!&'"en ( )0 µ l 2D µL H µL A µL A µL A µL A:"rar a D0 µL C!n*en$r+*. ("=A0 µM3 4r -%r an.o1> 7on el AD@ obtenido! se realizó DF<P7D segHn lo descrito en el protocolo proporcionado por el producto >uper>criptFM Ene<>tep DF<P7D Iit' PlatinumD Fa4 de ?nvitrogen 17at$ @o$= %/2)-</.2 µM I I ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/2)-</.)! )//)3 con oligonucleótidos especí"icos para el AD@m de 8sp&/ caprino 1secuencia no mostrada3$ Esta reacción 17uadro )3! consistió en usar una mezcla de las enzimas reverso transcriptasa 1DF3 # Fa4 A+@ polimerasa 1Fa4 platinum3! donde primero se llevó a cabo la síntesis de A+@ complementario a partir del AD@m! # luego se ampli"icó el "ragmento resultante por P7D en un termociclador Fec'ne marca Aenius aplicando di"erentes ciclos de temperatura # tiempo 17uadro *3= 7uadro )$ 7antidades de la mezcla de reacción para la DF<P7D C!"#!nen$e% M%/cla (% r%acc )n 2H T%-'la(" (% ARN 4r -%r !%n.n+& I A0 '1 J A µ1 0. T231s52.A1.1 R./.$Po4(?.2 µM 0.3$ &.aIDE4C %!.p-3s.. I!%n. n.

% E4.n+& . 5.*+*.5-2o<o2.s .s..n. E7$en%. 3032os3 >e pusieron /$0 gramos de agarosa 1% B3 en un matraz Erlenme#er de %)0 mL # se disolvieron en 0/ ml de bu""er FAE %V 1Apéndice3$ >e calentó la solución en el 'orno de microondas con el propósito de 4ue desaparecieron los grumos "ormados.4+*.ac%r A c cl" (%9 E2LC '"r A0 . GCLC '"r 2 . A"#&.n.o .-n .1 0./K7! se le adicionó 0 µl de bromuro de etidio %/ mgJmL 1Apéndice3$ >e mezcló bien # se vació el contenido a una c(mara de electro"oresis sumergida previamente armada con su peine! # se dejó geli"icar la solución de agarosa$ 7ada muestra se preparó con ) microgramos de la muestra! e4uivalente a %/ µL del A+@c diluido! m(s %<) µl de bu""er de muestra para (cidos nucleicos 1apéndice3$ +espués se retiró el peine del gel # se cargó cada pozo con la muestra$ >e puso con cuidado! el bu""er FAE %V 1o el FBE %V3 para el corrimiento! # se le aplicó una corriente constante de %// Polts por */ minutos 1+avis et al$! %2-. GCLC '"r D ! Al n%ar.%n(%r. &.ac%r A c cl" (%9 CDLC '"r AD .4...ac%r C0 c cl"! (%9 D%!na.3$ Fambién se aplicaron ) µL de marcadores 1/$& µgJµL3 #a preparados de peso molecular para A+@ % Ob plus 1de %// pb a %) Ob3 marca ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/&-&</%-! )//)3$ Una vez terminada la electro"oresis! se puso el gel en el transiluminador # se encendió la l(mpara de luz ultravioleta para visualizar las bandas te6idas con el bromuro de etidio$ Posteriormente! se capturó la imagen # el an(lisis densitométrico de las bandas se 'izo empleando un "otodocumentador modelo 7'emi<+oc marca Bio<Dad$ 2F . de vez en cuando se sacó el matraz # se agitó para luego observar si #a se 'abía disuelto la agarosa$ +espués! se dejó en"riar # cuando llegó a una temperatura cercana a los .ral /ar.% 1e ADN* 2 #re3 1e%n+$'r+&.n.s .nK<& ?nvitrogen Li"e Fec'nologies 17at$ @o$= %/2)-</.?..7uadro *$ 7iclos de temperatura # tiempo para la DF<P7D /. S0n$e%.-n PCR . ADN 5o?p4..)! )//)3$ 6. 6FLC '"r A . DDLC '"r B0 ! E8.1-32.-n F.

.:13s .%</*/23$ 2G .s ..352.& 1ovoalbHmina3 9ilodaltones 1Bio<Dad 7at$ @o$= %. p2o-.43?.!/// rpm3 por %/ segundos$ >e pusieron también! %/ µL por carril de marcadores de peso molecular prete6idos de amplio rango! 4ue contenía las proteínas de= )/1miosina3! %%. # Apéndice3! luego se colocó la mezcla poco a poco en la c(mara! dejando espacio para poner el gel concentrador e inmediatamente se adicionó isopropanol %=% en agua 1vJv3! para linealizar el gel # para 4ue geli"i4ue m(s r(pido al estar en un ambiente de anaerobiosis$ >e dejó polimerizar por aproximadamente )/ minutos # luego se decantó el isopropanol! posteriormente se secó con papel absorbente$ +espués se preparó # adicionó el gel concentrador 17uadro .4..s.s .&. po4.1 0. 1albHmina sérica bovina3 # .3 >e 'icieron electro"oresis para la separación de proteínas bas(ndose en su peso molecular! en condiciones desnaturalizantes # reductoras 1Laemmli! %2&/3$ >e utilizó una minic(mara de electro"oresis dual Mini protean ?? de Bio<Dad$ Para ello! primero se armó la minic(mara # se preparó el gel separador 17uadro .90 E4.3 colocando previamente el peine con el nHmero de pozos deseado en la c(mara de electro"oresis$ Una vez geli"icado! se removió el peine despacio # con cuidado se a6adió bu""er de corrida %V 1Apéndice3 # después se secaron los pozos con tiras cortadas de papel "iltro$ >e cargaron los pozos con la muestra de interés! preparada en bu""er de muestra para proteína 1Apéndice3 # luego se a6adió lentamente bu""er de corrida %V sobre los pozos cargados con la muestra! # se corrió el gel a %// Polts constantes por aproximadamente ) 'oras usando una "uente de poder PoIer Pac de Bio<Dad$ Al "inal de la electro"oresis! se ti6ó el gel para visualizar las bandas de proteína! o se trans"irieron a membranas de nitrocelulosa para realizar ensa#os de Testern blot$ El gel se cargó con . 1β<galactosidasa3! -.5-2o<o2./ microgramos de proteína por carril 1%0 microlitros de muestra3! ésta se preparó calculando la cantidad de muestra necesaria para %/ corrimientos # se dilu#eron en un volumen de %0/ microlitros de bu""er de muestra para proteínas 17uadro 03! luego se puso a 'ervir la muestra contenida en un tubo eppendor" por 0 minutos en un ba6o con agua$ +espués se centri"ugaron a m(xima velocidad 1%)!/// a %.

15.3s .71 .$ 7antidades para preparar ) minigeles de poliacrilamida S!&'*..B2 -L F0 µL 2D µL D µL C..D0 -L 0 -L B. p2o-.00 -L 2.7uadro .D M.!ne% Ge& %e#+r+1!r +& /5 8 Acr la.2O & (%!..F M> Tr !ICl A.. la(a SDS al A0 M 4SA al A0 M T%-%( Laemmli U$ O$ %2&/$ Ge& *!n*en$r+1!r +& 9. Esta técnica se utilizó para visualizar las proteínas separadas después de la electro"oresis! donde el azul de 7oomassie se une a las proteínas de manera no especí"ica # el límite de detección es de /$* µg a % µg por banda de proteína$ Para realizar esta tinción! primero se colocó el gel de poliacrilamida en un recipiente de pl(stico! al cual se le adicionó solución "ijadora para tinción de 7oomassie 1Apéndice3 'asta cubrir totalmente el gel # se agitó suavemente por %0 minutos en un orbital s'a9er$ Luego se decantó la solución "ijadora # se cubrió el gel con solución de tinción r(pida de 7oomassie 1Apéndice3 # se agitó suavemente por ) 'oras o 'asta observar las bandas te6idas en el s'a9er$ +espués se tiró la solución de tinción # se cubrió el gel con solución deste6idora de (cido acético al %/ B 1Apéndice3$ >e Agitó suavemente! 'asta 4ue dio un "ondo claro$ +espués se analizó el gel en un "otodocumentador! para realizar densitometría o c(lculo de pesos moleculares de las bandas de interés o simplemente escanear el gel puesto entre dos acetatos para obtener la imagen # así analizarla con un so"tIare apropiado$ Para almacenar el gel! éste se secó en papel celo"(n a temperatura ambiente 1Bollag # Edelstein! %22%3$ B0 .r (%!.D M.99 T.60 -L 0 -L A.F Tr !ICl 0.(aI& !acr la.) 8 0. '. F. 6. " .F . '. Coo?3ss.:13s 5o1 5o4o231-. 3J64 .00 -L 2. *31.(a =B090..D0 -L 200 µL E0 µL A0 µL &.

43?.3 Para secar los geles para su conservación prolongada! se llevaron a cabo los siguientes pasos= primero! el gel # el papel de celo"(n dulce se embebieron por */ minutos! en un recipiente de vidrio 4ue contenía solución de secado para geles 1Apéndice3$ Luego se colocó el gel en medio de dos trozos de papel celo"(n "ormando un emparedado$ Posteriormente! ésto se puso sobre una placa de vidrio! # se estiró.352..s .15.53. 0. mm semidr#3 en la misma solución para 'umedecerlo$ >e utilizó un aparato trans blot para realizar la trans"erencia en semiseco 1modelo Frans Blot >em# +r# marca Bio<Dad3$ Posteriormente! se 'izo un emparedado sobre la placa positiva 1parte in"erior3 del trans blot! colocando primero el papel extra grueso! luego la membrana de nitrocelulosa! después el gel de poliacrilamida # por Hltimo! otro papel extra grueso$ >e a6adió m(s solución de FoIbin por encima del emparedado # se pasó rodando un tubo de ensa#o por encima del s(ndIic'! para evitar 4ue se "ormaran burbujas de aire$ Luego se colocó la placa negativa 1parte superior3 # la tapa del trans blot! # se conectó a una "uente de poder modelo poIer pac)// marca Bio<Dad! aplicando una corriente de %0 Polts por )/ minutos$ Una vez terminada la trans"erencia de las proteínas del gel al papel de nitrocelulosa! se ti6ó en solución de verde r(pido BA .-2o5.. luego se colocó encima un marco de pl(stico # se sujetó éste con pinzas de clip! evitando la "ormación de burbujas$ El gel se dejó secar a temperatura ambiente por * días 1Bollag # Edelstein! %22%3$ &.5-2o-231s<.:13s 3 p3p. p2o-.. 1..o .464os3 Una vez 4ue se realizó la electro"oresis! se realizó la electrotrans"erencia 1FoIbin et al$! %2&23! 4ue consistió en trans"erir las bandas de proteína separadas en el gel de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa 18#bond<7 de Amers'an3$ Estas membranas se marcaron con un corte diagonal con tijeras en un extremo! para saber cual era el inicio del corrimiento # se les puso también con l(piz un nHmero para identi"icar las membranas$ En un recipiente de vidrio! el gel # el papel de nitrocelulosa se cubrieron con solución de FoIbin 1Apéndice3 de %0 a */ minutos! después se colocó papel extra grueso 1F'ic9 Paper Bio<Dad .4..4 .9! S.9& E4.&. po4.2.3 .

1Apéndice3 todo el papel o una sola tira 4ue correspondió a un solo carril$ Para ello! se aplica en un recipiente de pl(stico un poco de esta solución al papel # se agita con la mano 'asta visualizar las bandas de proteína$ Para remover el colorante! sólo 'a# 4ue adicionar agua destilada # poner en agitación$ +espués se determinó la presencia de la proteína 8sp&/ mediante la reactividad del anticuerpo monoclonal anti<8sp&/ isotipo ?gA% de 7albioc'em 1Alan W F'orpe! %2--3! revelando con un segundo anticuerpo anti<?gA de ratón conjugado con peroxidasa 15o'nson et al$ %2&23. cu#o sustrato "ue un reactivo 4uimioluminiscente 1Doc'e3! en el cual se visualizaron # analizaron las bandas en un "otodocumentador 7'emi<+oc marca Bio<Dad$

&.9" M,s-,21 *4o+espués de la electrotrans"erencia de las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa! se le puso a blo4uear por toda la noc'e a ,K7 en solución de PB> % V : lec'e * B 1Apéndice3$ +espués! se decantó la solución # se lavó la membrana cuatro veces por 0 minutos en el siguiente orden= a3 lavado con PB><FIeen 1apéndice3! b3 lavado con PB> %V 1Apéndice3! c3 lavado con PB><FIeen # d3 lavado con PB> %V$ +espués de terminar los lavados! la membrana se incubó con el primer anticuerpo anti<8sp&/ de bovino 1dilución %=%/// en PB> % V : lec'e * B3 durante ) 'oras o toda la noc'e a ,K7! para una mejor reactividad del anticuerpo$ Luego se volvieron 'acer los , lavados # después se incubó % 'ora la trans"erencia con el segundo anticuerpo asociado a la enzima peroxidasa de r(bano 1dilución %=%/// en PB><lec'e3$ >e volvió a lavar , veces siguiendo la secuencia anterior # luego se dejó secar el papel de nitrocelulosa sobre una 'oja de papel en blanco # se reveló con un 9it de 4uimioluminiscencia E7LUPlus de la marca Amers'an! 4ue permite localizar la enzima peroxidasa por la emisión de luz$ Para ello! se ba6ó la membrana con % mL de la solución del 9it! # luego se puso a secar a temperatura ambiente # posteriormente se visualizó la aparición de bandas reactivas en el "otodocumentador 7'emi<+oc marca Bio<Dad$ Fodos los pasos de lavado e incubación con los anticuerpos # el sustrato! se 'icieron a temperatura

B2

ambiente # en agitación constante # suave! en un orbital roc9et o s'a9er 1Bollag # Edelstein! %22%3$

&.9' D,1s.-o?,-2:3 Las im(genes de las bandas de proteína! Testern blot # A+@c! "ueron capturadas con un "otodocumentador 7'emi+oc marca Bio<Dad$ Luego se sometieron a un an(lisis densitométrico semi<cuantitativo! con el so"tIare Ruantit# Ene de marca Bio<Dad! con el "in de calcular el tama6o en base a est(ndares de peso. así como también cuanti"icar la cantidad de AD@ mensajero # de la proteína 8sp&/ expresada en embriones de "rijol sometidos a di"erentes temperaturas$

BB

IV. RESULTADOS

Una vez extraídas las proteínas de los embriones en dormancia # de los sometidos a estrés calórico 1cuadro 03! se separaron por electro"oresis las bandas de proteína 1"igura &3 se les determinó el peso molecular 1"igura -3. # se analizaron por densitometría para su cuanti"icación 1"igura 23$ Feniendo el antecedente de 'aber identi"icado a la proteína 8sp;/ en embriones de "rijol sometidos a varias temperaturas 1"igura %/3$ Las bandas resueltas por electro"oresis! se electrotrans"irieron a membranas de nitrocelulosa 1"igura %%3! para identi"icar la banda de proteína 8sp&/ por Testern blot 1"igura %)3! a la cual se le 'izo an(lisis densitométrico 1"igura %*3$ Fambién se extrajo # veri"icó por electro"oresis! la integridad del AD@ total de los embriones en dormancia # de los germinados sometidos a estrés calórico 1"igura %,3$ 7on el AD@ obtenido se realizó DF<P7D con primerGs especí"icos para el gene de la proteína U%&/! la cual participa en el procesamiento del AD@m en eucariotes # el cual sirvió de re"erencia para ver si 'abía o no ampli"icado 1"igura %03$ Fodos los AD@ mensajeros de los embriones en dormancia # de los germinados a varias temperaturas! se ampli"icaron con oligoprimerGs especí"icos para 8sp&/ 1"igura %;3 # se les 'izo densitometría para comparar con un gene conservado AA+P8 # cuanti"icar su expresión 1imagen no mostrada3$ Así mismo! se determinó su tama6o en pares de bases empleando marcadores de peso nucleotídico conocido 1"igura %-3$ Por otro lado! se observó la relación de la temperatura con la expresión del AD@m # de la proteína 8sp&/ 1"iguras %)! %*! %; # %&3$

BC

C.$-& µL 0$%& µL *$&) µL 0$-.a(r" D.µL 0$.% /$. C"nc%n. O.rac )n (% 'r".".µL U 2%$) µL 0.3 !' NC &0 NC &' NC "0 NC /$.%2na! . µL U 2*$..µL 0-$. .).n+& 1e /)0 µ L 1e A'. µL S$!*> /0 *!rr.r":"r%! ! M'e%$r+ D.-2 /$.er 1e "'e%$r+ Do2?315. µgJµL . P+r+ :<0 µ =.-$& µL U %/%$* µL 0%$& µL U 2-$* µL *&$) µL U %%)$. .1+%? en @!&. 'ara r%!"l$%r '"r %l%c..! :Pr!$e0n+.$.. µgJµL %. %)$* µgJµL %%$.. µL BD .$% µgJµL %/$) µgJµL %/$. Pr!"e1.al%!.// /$*&* /$.

ra E. B6 .r":"r%! ! (% 'r".%2na! %n 1%l (% '"l acr la. c"n.r"l =carr l 2>. %-&r "n%! !"-%.&: / 5 6 9 ) < B PM >D+.%? ("! (% '%!" -"l%c. ("! a9 2D LC =carr l B>.C+rr.lar =carr l A * E>. B0 LC =carr l C>.(a al A2 M Marca("r%! 'r%. 50C //< C9 9B F 1. El%c. BD LC =carr l D> * C0 LC =carr l 6>.

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r"l =carr l 2>."-3. ("! a9 2D LC =carr l B>.C+rr. c"n.r c" (% la! &an(a! (% 'r". BD LC =carr l D> * C0 LC =carr l 6>. BF . An6l ! ! (%n! . 50C //< C9 9B F 1. %-&r "n%! !"-%.ra G.lar =carr l A * E>.&: / 5 6 9 ) < B PM >D+. B0 LC =carr lC>.%? ("! (% '%!" -"l%c.%2na Marca("r%! 'r%.

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&: / 5 6 9 ) ⇐ /B60 #A ⇐ 660 #A F 1.!'E0 (%9 ca&ra =carr l 2>. n"'al =carr l C> * :r 0"l =carr l D>.2( c" 'ara ADN =carr l A>. c%&a(a =carr l B>. D%.lar %n 'ar%! (% &a!%! (%l ADNc (% .C+rr.%r.ra AF.cl%".!'E0 Marca("r%! (% '%!" n. ADNc (% .nac )n (%l '%!" -"l%c. DISCUSIÓN CE . V.

El objetivo de este trabajo "ue determinar la expresión del AD@ mensajero # de la proteína 8sp&/ en embriones germinados de Phaseolus vulgaris sometidos a estrés calórico! así como generar datos de las proteínas 8sp&/ # del AD@ mensajero de "rijol bajo condiciones de semillas en latencia # germinación! para conocer sus características moleculares # poder asociar sus "unciones b(sicas en las células vegetales u otros modelos biológicos$ El en"o4ue se centró en las etapas iniciales de la germinación en "rijol! en esta "ase del ciclo biológico no se encontraron reportes de estudios de proteínas de estrés calórico! en tanto 4ue en otros modelos! sobre todo de microorganismos # animales sí abundan 1Lu"t # +ix! %2223$ Al momento de comenzar la germinación se inicio el "enómeno de 'idratación # vacuolización celular! lo cual "ue in"luido por acción de la temperatura! #a 4ue se observó 4ue 'ubo una disminución de la concentración de proteínas a los )0 K7! en tanto 4ue a los */ K7 se presento el valor m(s alto en condiciones de germinación! a partir de esa temperatura disminu#ó el rendimiento en cuanto a concentración de proteinas a los *0 K7 # aumento nuevamente a los ./ K7 1cuadro 03$ Las concentraciones de los extractos de proteinas de embriones permitieron comparar los rendimientos # de"inir el e"ecto del estrés calórico de cada una de las temperaturas aplicadas$ Los resultados permitieron comprobar 4ue la síntesis de proteínas totales se incrementa por el estrés de acuerdo con lo propuesto por Lind4uist # 7raig %2--! sin embargo un dato importante es el rendimiento de proteínas totales en los embriones en dormancia! 4ue se 'a reportando como el valor m(s alto! ello es importante en términos de 4ue en latencia se tiene toda la ma4uinaria protéica para iniciar el proceso de germinación # generación de la nueva planta 1Beltr(n et al$! %2203$ La importancia de la concentración de los extractos de proteínas explican la síntesis de las mismas en los tratamientos del presente trabajo$ Es importante comentar 4ue el rendimiento de proteínas es alto! si se considera el rendimiento 4ue produce un cultivo de células animales! por ejemplo= 8eLa$ La cantidad de CF .

.$&& unidades a los ./ K7! sobre todo las proteínas entre los pesos de 0/ # 2/ 9+a! 4ue se pueden apreciar de manera visible en el gel te6ido con azul de 7oomassie$ +atos 4ue corresponden con lo propuesto en >o#a por! >ac's # 8o! %2-.$ +espués de te6ido el gel con las proteínas separadas por peso molecular se calculó el peso molecular aproximado de las mismas! los datos permitieron concluir 4ue la concentración de poliacrilamida al %)B "ue su"iciente para separar proteínas entre los )/ # %// 9+a sin perder resolución! # 4ue los marcadores estandarizados de peso molecular sirvieron adecuadamente para calcular el peso de las proteínas de peso desconocido! mediante una regresion lineal 4ue procesa autom(ticamente el so"Iare Ruantit# Ene empleado 1"igura -3$ El an(lisis densitométrico de las bandas de proteína observados en la "igura 2! demuestraron 4ue al incrementar la temperatura de las muestras 1carriles * a .proteínas permitió estandarizar las cantidades aplicadas para separar por electro"oresis # monitorear 8sp&/ por Testern blot$ Al separar las proteínas por electro"oresis se observó un correspondencia con los rendimientos de los extractos! es decir! 4ue se corrió la misma cantidad de proteína para cada muestra en cada carril 1"igura &3! sin embargo se observó un incremento en la concentración de alguna bandas! indicando el incremento a los */ K7! con un descenso a los *0 K7 # nuevamente se incrementaron a los . "igura 23$ Por ejemplo! en la banda de peso aproximado a los &/ 9+a! se observó una densidad promedio en embriones en dormancia de %%$)% unidades! alcanzando un valor de )./ K7! es decir! un incremento de m(s del doble! en donde evidentemente! se demuestró el impacto del "actor calor sobre la síntesis de proteínas # por tanto sirvio para validar el modelo biológico de embriones$ Al nivel de proteínas cercanas a los 2/ 9+a en CG . "igura 23! se incrementó la densidad de las bandas de proteína # por tanto de su concentración individual en el gel 4ue las separó! demostrando de manera clara el e"ecto del estrés en los embriones germinados sobre la expresión de proteínas asociadas a la germinación! #a 4ue 'a# ma#or síntesis de algunas proteínas con respecto al control 1carril ).

& unidades 1carril )./ K7 1carril . "igura -3$ Por otro lado! en bandas cercanas a los .$.. la cual dio reactividad cruzada con el anticuerpo empleado$ Fal reconocimiento de ambas proteínas se presentó en los embriones en dormancia! como en todos los tratamientos./ K7 1carril .embriones en dormancia la densidad "ue de %0$%& unidades contra )2$%) de embriones a . lo cual probablemente indica 4ue el anticuerpo reconoce estructuras o epitopes conservados de 8sp&/ 18uang et al$! )///3$ 7abe mencionar 4ue no existen anticuerpos monoclonales especí"icos para esta proteína en plantas de manera comercial # muc'o menos para "rijol! por ello el antecedente m(s directo es 4ue la proteína 8sp&/ es una de las m(s conservada entre los organismos 1Lind4uist # 7raig! %2--3$ >in embargo! es interesante el D0 ../ 9+a$ presentaron valores de %.$. "igura -3 en embriones en dormancia! contra *%$** a los . "igura 23 a los . siendo probable 4ue también sean las mismas$ Por otro lado! se observó un incremento de embriones en dormancia a )0 # */ K7! con un decremento a los *0 K7 # una recuperación del incremento de las densidades a ./ 9+a$ el valor "ue de %. "igura 23 4ue aumentaron 'asta ./ K7! lo cual conserva el mismo nivel de comportamiento para todas las proteínas asociadas con las "amilias de 8sp 1Los'ida et al$! %2223$ El an(lisis de los geles de poliacrilamida a nivel de bandas te6idas! peso molecular # densitometría permitió realizar la siguiente etapa! en la cual se se exploró la expresión de la proteína 8sp&/ por Testern blot con el antecedente de 4ue previamente se realizaron experimentos para monitorear la proteína 8sp.../ K7$ Esto es interesante! #a 4ue todas estas bandas coinciden con las principales "amilias de proteínas de c'o4ue calórico 1Los'ida et al$! %2223.$2/ unidades de densidad en los embriones en dormancia 1carril )./ 1"igura %/3$ La e"iciencia del procedimiento de electrotrans"erencia de las proteínas del gel a la membrana de nitrocelulosa! "ue evidente al ser te6ido con verde r(pido el papel 1"igura %%3$ La detección de 8sp&/ como muestra la "igura %) de"inió la expresión de la 8sp&/ 1Telc'! %22)3 # otra proteína 4ue puede ser una iso"orma de 8sp&/ o la "orma constitutiva de ésta! así como también una proteína no relacionada con 8sp&/. "igura -3$ Así mismo bandas cercanas a los . 1carril ..

3! donde sí se observaron todas las clases de AD@$ >e realizó DF<P7D con oligoprimerXs especí"icos de 8sp&/! a partir de los AD@ mensajeros 1Tang et al$! %2223! las reacciones de control positivo se 'icieron con DA .3$ 7on el propósito de analizar la expresión de los genes de 8sp&/! se extrajo AD@ de los embriones! obteniendo AD@ total de buena integridad 1"igura %. "igura %*3 # en embriones en dormancia 1carril %. aun4ue conviene 'acer m(s estudios sobre esta "orma para corroborar 4ue pertenece a la "amilia de las 8sp$ Posteriormente! al asociar estos resultados con los resultados del an(lisis de los AD@ mensajeros de la proteína! se observó una coincidencia en cuanto a 4ue la ma#or inducción del mismo! "ue a la misma temperatura de */ K7 1"igura %. "igura %*3 con respecto a )0 K7 1carril ). "igura %*3$ Mientras 4ue para la "orma 4ue probablemente sea una proteína de las 8sp! la ma#or expresión "ue en los embriones en dormancia! lo cual indica la posibilidad de 4ue dic'a proteína esté disponible para ser utilizada como c'aperona en los eventos tempranos del proceso de germinación! particularmente después de la imbibición! en tanto 4ue tiende a disminuir con"orme aumenta la "orma inducible de 8sp&/ 1"igura %&3.3$ Fambién se corrió AD@ total de células eucariotes como control 1carriles % # ).. "igura %. K7! ello probablemente debido a la naturaleza de la "uente antigénica de la cual derivaron el monoclonal utilizado # la concentración a la cual se expuso la electrotrans"erencia$ El an(lisis densitométrico del Testern blot 1"igura %*3! detectó 4ue 'ubo una ma#or densidad de 8sp&/ inducible a los */ # *0 K7 1carriles * # .3$ Es necesario mencionar 4ue el patrón de bandeo en células de mamí"eros es di"erente al de plantas$ >in embargo! no se detectó el AD@ de trans"erencia ni los AD@ ribosomales! posiblemente por4ue est(n en mu# baja cantidad en el embrión o 4uiz(s por4ue éstos se degradaron 1carril *.'ec'o de 4ue no 'ubo reactividad cruzada con otros antígenos de la muestra! #a 4ue "ueron las Hnicas bandas detectadas$ Un aspecto importante es 4ue la detección de las bandas de 8sp&/ en el Testern blot re4uirió de tiempos largos de exposición del extracto proteíco con el anticuerpo anti<8sp&/! con tiempos de %0 'oras a . "igura %.

un control de embriones! en el cual se ampli"icó con primerGs especí"icos! el AD@m de una de las proteínas >m 4ue participan en el procesamiento del AD@ 1U% &/ 9+a$3 4ue es conservado entre los genomas eucariotes 1"igura %0 iz4uierda3$ En el cual se obtuvo el A+@ complementario a partir de AD@ resuspendido en agua tratada con dietil pirocarbonato 1carriles ) # .3. "igura %-3$ >e tuvo como control! un producto ampli"icado con los D2 . "igura %. "igura %03$ >e observo 4ue se obtuvo mejor A+@c a partir de AD@ en agua<+EP7 al correr éste en una electro"oresis en gel de agarosa$ Fambién para el an(lisis densitométrico de la imagen obtenida directamente con luz del transiluminador 1iz4uierda3! se invirtió con el so"tIare del "otodocumentador 1derec'a3$ Esto para "ines de 'acer un mejor an(lisis densitométrico # para visualizar las bandas con una ma#or resolución! en las siguientes electro"oresis 1"igura %0 derec'a3$ La ampli"icación de los AD@ mensajeros de 8sp&/! producto de los genes expresados se sometió a electro"oresis en gel de agarosa # a un an(lisis densitométrico invertido de las bandas obtenidas de A+@c 1"igura %. lo 4ue indica la pureza del sistema! #a 4ue no se observa otra banda! ni degradación alguna del ampli"icado.3 se obtuvo la ma#or densidad! lo cual corresponde con los resultados obtenidos en el Testern blot! correlacionando las temperaturas tanto en la expresión del gene como del producto 1"igura %*3$ Se realizó una electro"oresis para calcular el tama6o del "ragmento ampli"icado 1"igura %-3$ >e calculó el peso molecular del "ragmento obtenido en base a marcadores moleculares de peso nucleotídico conocido 1carril %.. "igura %03 # en "ormamida 1carril 0. #a 4ue esta reportado 4ue 'a# polimor"ismo del gene de 8sp&/ en otras especies 1Cavatier et al$! %22&3$ Adem(s 'ubo di"erencias visibles en sus concentraciones #a 4ue también se observó 4ue a temperaturas de */ # *0 K7 1carriles * # .3 # en las dem(s temperaturas 1carriles ) a 03! se obtuvo una sola banda de A+@c de 8sp&/. en el cual adem(s! se comparó con un gene control 1'ouse<9eeping3 de la enzima gliceralde'ido "os"ato des'idrogenesa AA+P8 para su cuanti"icación 1dato no mostrado3$ >e observa 4ue en el control 1carril %.. "igura %. "igura %-3 # se observó 4ue en todos los A+@c de 8sp&/ de "rijol! tenia un peso aproximado de **/ pb 1carril 0.

/ Y7$ Fambién 'a# datos en la literatura! de 4ue en los blot de proteínas en tejidos de 'ojas de espinaca mostraban niveles de proteínas 8sp&/ relativamente constantes con respecto a la actividad metabólica durante el día 1Li et al.Y7 la inducción aumentaba con"orme se acrecentaba el tiempo de exposición en una! dos # tres 'oras! cesando cuando se elevaba la temperatura a . donde se encontró 4ue en líneas celulares de zana'oria la 8sp2/ se expresaba constitutivamente a )0 Y7 # 4ue a *. # el cual presentó un tama6o aproximado de %&*/ pb 1carril ). )///3$ Por otro lado! se encontró 4ue una línea de maíz resistente! PBL %*/.. )//%3. "igura %-3 # nopal 1carril .0 9+a$ 1B'adula et al$! %22&3$ 8a# antecedentes 4ue para para inducir embriogénesis en polen de !rassica napus es necesario aplicar estrés calórico severo # corto para iniciar la síntesis de +@A en células vegetales para complementar su ciclo celular # posterior división 1Binarova et al$! %22&3$ L se 'a demostrado previamente 4ue en 'ojas de "rijol con di"erentes grados de maduración! la 8sp&/ localizada en la matriz mitocondrial declinaba sus niveles de 8sp! sugiriendo 4ue esta reducción de niveles de 8sp&/ limitaba la importación de proteínas mitocondriales en tejidos vegetales maduros 1Moore et al$!%22&3$ +e estas revisiones e"ectuadas # de otras mencionadas anteriormente! se puede decir 4ue es necesario analizar # pro"undizar en los estudios de 8spXs para un mejor entendimiento de cómo las proteínas de c'o4ue calórico actuarían no DB .mismos primerGs utilizados de 8sp&/! de A+@c proveniente de células de ovario de cabra. "igura %-3$ Fambién se puso un ampli"icado de 8sp&/ de cebada 1carril *.! puede estar involucrada en el desarrollo de resistencia bajo condiciones de campo a la se4uía # al calor observadas en 8sp de . "igura %-3$ Esto es interesante! #a 4ue los primerGs ampli"icaron AD@ mensajeros para 8sp&/ de varias "uentes! lo cual indica 4ue es un gene mu# conservado en la escala "ilogenética$ Aun4ue en revisiones e"ectuadas 'asta la "ec'a! no se 'a reportado estudios similares! autores mencionan la expresión de proteínas 8sp 4ue se expusieron a di"erentes tipos de estrés 1Milioni et al.

solamente por la exposición de estrés calórico aplicado! sino también cómo a"ectaría la exposición prolongada de calor en di"erentes etapas del desarrollo vegetativo en el cultivo de "rijol$ Estos datos son el comienzo de una serie de estudios! para determinar si la expresión del AD@m # de la proteína 8sp&/! es una medida con"iable para estimar el nivel de adaptación del "rijol al estrés térmico$ L para explorar si existe 'omología a nivel de "unción entre las 8sp&/ expresadas en mamí"eros # las de "rijol$ VI. CONCLUSIONES DC .

9. >e ampli"icó di"erencialmente el AD@ mensajero de 8sp&/! en los embriones sometidos a estrés calórico # en los embriones en dormancia$ LITERATURA CITADA DD . Por Testern blot se detectó di"erencialmente la proteína 8sp&/ en los embriones sometidos a estrés calórico # en los embriones en dormancia$ &. La temperatura a"ecta la expresión di"erencial de proteínas 8sp&/ # de otras proteínas de pesos moleculares similares al de las "amilias de 8sp! en embriones germinados sometidos a di"erentes temperaturas$ !.

2$ Bo1E M.41(E# E. =9%%B> Puri"ication and c'aracterization o" c'aperonin .-<-0! %%*<%*/! )/&<).A431 J..1-s.s# J.J E. D. O B435E M.( J.# 831. 31. =9%%">.-.-<)00$ B23(# E. =9%%7>. H./$ A4/323.# 8. >eeds= P'#siolog# o" +evelopment and Aermination$ 1@eI Lor9= Plenum Press3$ B. O TCo2p.0$ >$ name= Enviromental Desponse and Adaptation$ Aspb$ Abstract number %/)%$ B. =9%F0>. =9%%7>. 31. R..# S-. =!00!>. >#nt'esis o" ribosomal proteins "rom stored mD@As earl# in seed germination$ Plant Molecular Biolog#$! vol$ )-= *)&< **.J A.1 S. A rapid and sensitive met'od "or t'e 4uantitation o" microgram 4uantities o" protein$ Anal#tical Bioc'emistr#$! vol$ &)= ). Production o" Antibodies$ Production o" antibodies$ Dadiolabelling Fec'ni4ues$ Pol#acr#lamide gel tec'ni4ues! A""init# 7'romatograp'# and immunoprecipitation! ?mmunoc#toc'emistr#$ ?n ?mmunoc#toc'emistr# in practice$ 7'ap$ )!0!&!%/!%)$ Ed Bla9Iell >cienti"ic Publication $ Ex"or UO$ pp$ */< .2os M. >eed germination and dormanc#$ F'e Plant 7ell! vol$ 2= %/00< %/.2J.# O2-. J.1 C. J31 H. =9%7B>.A.# 31. =9%%7>. FIo<+ gel anal#siso" .# T3.4.Q4.&! .E.# B3. Protein Met'ods$ A 5'on Tile# W >ons! ?nc$! @eI #or9$ BR+o2?31 O.2.2 A.4.# H310 G.%! ).$ B.o# A.(.132o/3 P.s-.()S.0 9+a$ 'eat s'oc9 proteins in a droug't and 'eat resistant maize line$ >ession number .4-2K1 E..# P.( J.0.Q4. A2?o1. Desponse to abiotic stress in= Bioc'emistr# W Molecular Biolog# o" Plants! B$ Buc'anan! T$ Aruissem! D$ 5ones! Eds$ A>PP$ Mar#land U>A$ 7'apter ))= %%0-<%)/*$ D6 . O E.1E L. R.# 31.<o2.# B3.4s-.23 C. =9%%9>..643 S.< N. 31. =!000>. @egro acatecas= Pariedad de "rijol para siembras de riego en el altiplano de acatecas$ Dev$ Citotecnia Mex$ %%=--$ BC3. =9%%'>. S. LooE.2.# A4)B3*.2 M..10.# 31.22. A s'ort severe 'eat s'oc9 is re4uired to induce embr#ogenesis in late bicellular pollen o" !rassica napus L$ >exual Plant Deproduction$ %/1.2./ and 'eat<s'oc9 protein &/ "rom c'romoplast o" Narcissus pseudonarcissus$ ?nvolvement o" 'eat s'oc9 protein &/ in a soluble protein complex containing "itoene desaturasa! Plant P'#siolog#! Pol$ %%%= 2*%<2*2$ B23./! ). SK15C. >eed dormanc# and germination$ F'e Arabidopsis boo9$ American societ# o" Plants Biologists$ pp$ %<%&$ B. M.2 P. B. Desponse and adaptation o" p'otosint'esis to 'ig' temperatures$ ?n= Adaptations o" Plants to Tater and 8ig' Femperature >tress$! @$ 7$ Furner and P$ 5$ Oramer! eds$! Tile#! @eI Lor9! pp$ )**<). M. O Poo211. =9%FF>.$ B.5 .25ECo/. 9%FF.# G.3= )//<)/-$ Bo4430 M.

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B # *0 mg 1$/*0 g3 de azul brillante de 7oomassie A<)0/$ Almacenar en "rasco (mbar$ Esta solución es estable inde"inidamente a temperatura ambiente$ 62 . so.1 3063 DEPC Mezclar en un tubo estéril &$0 mL de etanol 1&0 B3 # )$0 mL de agua +EP7$ Fapar # almacenar a .2o532*o13-o =DEPC> 4.-.K7$ A063 D.K7$ So465.71 .2 .$/0 g de Fris base 1/$0 M3 # disolver en 0/ mL de agua! luego ajustar a p8 de &$. EL-2355." Pesar .o 9'0 ?M +isolver /$-& g de cloruro de sodio 1/$%0 M3 en %// mL de agua destilada$ Almacenar a ./ ó ?gepal 1/$0 B3$ A"orar a %// mL con agua destilada # esterilizar en autoclave a %)%K7 por %0 minutos$ Almacenar a .K7$ B6<<. RNAs3s Adicionar en % litro de agua destilada %// µL de dietilpirocarbonato 1/$/% B3 # dejar en agitación toda la noc'e! después esterilizar en autoclave a %)%K7 por %0 minutos # luego almacenar a .APINDICE So465.4p.K7$ So465. 54o262o .... T2.71 . con (cido clor'ídrico concentrado # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a ... 10/ mM3 # 0// µL de @onidet @P<.<o2.*2.. . Mezclar %/ mL de etanol al 20 B! )/ mL de (cido "os"órico al -.71 NET)! Mezclar /$-& g de cloruro de sodio 1%0/ mM3! %/ ml de Fris<7l 0// mM p8 &$..-31o4 34 7' V .71 s-o5E B23.. .71 .s)C4 '00 ?M# pH 7.K7$ So465.

K7 en un "rasco (mbar$ Estable por un par de meses! luego debe se "iltrada nuevamente! para su uso$ C62/3 p3-271 .?.J32 43 562/3 p3-271 .:13 P2o5..:13s. p2o-.B # *$/ mL de la solución stoc9 Brad"ord$ +espués "iltrar en papel "iltro 1T'atman @o$%3 # almacenar a . 'acer alicuotas de % mL # almacenar a <)/ K7! para su posterior uso$ )3 7olocar en una serie de tubos eppendor"! di"erentes concentraciones de la solución est(ndar de proteína! adicionando el @a7l %0/ mM 1/$%0 M3 necesario para tener un volumen de -// µL! como se muestra en la tabla 1'acer por triplicado3$ D. /34o2.-344.)$0 mL de agua destilada! %$0 mL de etanol al 20 B! *$/ mL de (cido "os"órico al -.. -23*3+o B23.<o2... Mezclar .So465./) M S$!*> 1e +&AG"..1-oA %3 Preparar una solución est(ndar de albHmina sérica bovina a una concentración de % mg por mililitro! pesar $/% g 1%/ mg3 de ésta proteína # disolver en %/ mL de @a7l %0/ mM. 1e $'A! 0 =&lanc"> A 2 B C D 6 E F G A0 C&!r'r! 1e %!1..n+& 1e #r!$e0n+ F00 µL EGG µL EGD µL EG0 µL EFD µL EF0 µL EED µL EE0 µL E6D µL E60 µL EDD µL 0 µL A µL D µL A0 µL AD µL 20 µL 2D µL B0 µL BD µL C0 µL CD µL 0 µ1 A µ1 D µ1 A0 µ1 AD µ1 20 µ1 2D µ1 B0 µ1 BD µ1 C0 µ1 CD µ1 6B ..n+ H/"=("LI C!n*en$r+*..71 . N!. .! 0. p2o-.34.s p323 2.-n .

Z )$&! luego dividir este resultado entre la dilución si es 4ue la 'a#$ Ej= )$&J0 4ue son los microlitros de la muestra problema! nos daría /$0. Den%. /$* /$) /$) /$% /$% /$/ /$/ / 0/ %// %0/ )// )0/ Pr!$e0n+ HJ= "& 3/I *3 Adicionar a cada tubo )// µL de la solución de trabajo Brad"ord para tener un volumen "inal de % mL! luego vortexear$ .&.&. despejando nos 4uedaría 4ue xZ #<aJb. µg de proteína por microlitro! # 6C .2) /$//0*) B /$/%. /$//-% D Z /$222) \///% )$))-%)E<.2)J/$/%.1+1 O#$.*+ H)D)n"I /$* LZAUB[V Param Palor sd A /$%. luego sustitu#endo los valores obtenidos a partir de una regresión lineal de los valores de la curva patrón por el método de mínimos cuadrados! tendríamos /$)/2</$%. /$.C7RVA 4ATRON DE ALB7MINA SERICA BOVINA / 0/ %// %0/ )// )0/ /$.3 +ejar reposar durante * minutos$ 03 +espués ajustar a cero con el blanco # leer la absorbancia en luz visible a una longitud de onda de 020 nm$ Ara"icar la densidad óptica versus la concentración de proteína$ +espués interpolar la densidad óptica obtenida de la muestra problema en la gr("ica ó 'acer los siguientes c(lculos utilizando la ecuación de una recta$ Por ejemplo! si la densidad óptica "ue de /$)/2! este valor 'a# 4ue sustituirlo en la sig$ "ormula= LZ aUbx.

2 .J3.mL de azul de bromo"enol al % B$ 8acer alícuotas de 0// µL # almacenar a <)/K7$ B6<<.) g de Fris base 1.> 90 X +isolver en %// mL de agua destilada ... mL de bu""er MEP> %/ V! )$.$%.g de MEP> 1/$) M3! /$.3 o .por Hltimo se calcula la concentración total de proteína por mililitro de muestra! la cual para este caso sería de 0.s64<o1.o> Mezclar en un tubo estéril &$0 mL de "ormamida! %$.K7$ 6D .4.5-2o<o2@s.K7$ B6<<.K7$ B6<<./ µgJmL Z /$0.s MOPS 9 X Mezclar %/ mL de bu""er MEP> %/ V U 2/ mL de agua dietilpirocarbonato 1+EP73$ Auardar a .g de Fris base # 00 g de (cido bórico en 2// ml de agua destilada$ Adicionar .% g de E+FA en -/ mL de agua! ajustar p8 -$/ con @aE8 # a"orar a %// mL3$ Ajustar el volumen "inal a % litro con agua$ Mezclar %/ mL de esta solución! m(s 2/ mL de agua destilada para 'acer FBE %V$ Almacenar a temperatura ambiente o a .g de acetato de sodio 1/$//0M3 # /$*& g de E+FA 1/$/% M3$ Almacenar a temperatura ambiente o a .2 MOPS =&)WN)?o2pCo4.1oX)p2op31. ?6./ ml de E+FA<@a )8 )E /$0M! p8 -$/ 1+isolver %-$. de "ormalde'ído 1*& B3! %$. mgJmL$ B6<<.2 TBE 90 X +isolver %/.s-23 p323 ARN =..mL de agua +EP7! /$../ mM3 # *&$) g de E+FA<@a )⋅)8)E 1)mM3 en 2// mL de agua destilada$ Adicionar 0&$% mL de (cido acético glacial # ajustar el volumen "inal con agua a % litro$ Fomar ) mL de este bu""er 0/ V # a"orar en %// mL de agua destilada para 'acer FAE %V$ Almacenar a temperatura ambiente o a .K7 protegido de la luz$ B6<<.mL de glicerol # /$. 5o22..2 .s13-6234.2 TAE '0 X +isolver )..5 35.

1o4 34 9 V +isolver /$% g 1%// mg3 de azul de bromo"enol en %/ mL de agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$ So465.43?. *2o?o<. 352..31o4 34 90 V +isolver % g de xileno cianol en %/ mL de agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$ B6<<.71 .71 .os 1654..So465.s)C4 9.F 66 .. L(4.71 .o 90 ?0/?4 Adicionar /$% g de bromuro de etidio 1cancerígeno3 a %/ mL de agua destilada! mezclar bien # 'acer alicuotas de % mL en tubos ependor"" 1cubiertos con papel aluminio3$ Almacenar una alicuota 1en uso3 a ..:5os =ADN ( ARN> Para preparar %/ mL de bu""er adicionar % ml de azul de bromo"enol al % B 1/$% B3! % mL de xileno cianol al %/ B 1% B3! 0 mL de glicerol 10/ B3! )// µl de bu""er FAE 0/ V 1% V3 # )$&0 mL de agua destilada$ Mezclar bien # dividir en alicuotas de % mL # almacenar a <)/K7$ Usar ) µL de este bu""er por cada %/ µL de la muestra$ Para AD@ adicionar %mM de E+FA U ) mL de >+> al %/B # a"orar en agua +EP7$ So465..s-23 p323 K5.g de bis<acrilamida # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a . T2.F V> +isolver */ g de acrilamida! m(s /$.1o 5.. 3J64 .3 =&0A0.71 ..-.. ?6..K7 en "rasco (mbar$ Usar guantes # cubrebocas! #a 4ue la acrilamida es neurotóxica en polvo ó solución$ So465.' M# pH F.K7 # el resto a <)/K7$ Usar guantes # evitar in'alación$ So465... *2o?62o .71 .2 .. .

-K7 para disolver bien # ajustar el p8 a &$) con 87l$ A"orar a %// mL con agua destilada # almacenar a temperatura ambiente$ PSA 34 90 V Pesar /$0 g de persul"ato de amonio # disolver en 0 mL de agua$ Almacenar alicuotas de 0// microlitros en tubos eppendor" cubiertos con papel aluminio para proteger de la luz # almacenar a <)/K7$ +ejar un vial a .BD -L 2.D0 -L D.con (cido clor'ídrico concentrado$ A"orar a %// mL con agua # almacenar a .E0 -L 2..s 90 X 6E . 5o22.00 -L 2.Pesar %-$) g de Fris base # disolver en .s 9 X Mezclar %// mL de bu""er de corrida %/ V! m(s 2// mL de agua destilada # m(s % g de >+>$ Almacenar a temperatura ambiente$ Este se puede reusar 'asta 0 veces$ B6<<.D0 -L B.K7 para su uso$ 7uadro 4ue muestra las cantidades necesarias! para realizar un gel separador a di"erentes concentraciones de poliacrilamida$ P!r*. B6<<.3 7 .%3C& /.2 .F0 -L 200 µL E0 µL A0 µL /5 8 C.con 87l concentrado$ A"orar a %// mL con agua destilada # almacenar a .71 .K7$ So465.4.3 7 .D0 -L C.en$! 1e& =e& ⇒ A*r.AD -L 200 µL 6D µL G µL // 8 B.DI8KBQ -L> SDS +& /0 8 PSA +& /0 8 Te"e1 9.1+ =HKBQ-L> Tr.D0 -L B.AD -L 200 µL 60 µL F µL C8 2.K7$ SDS 34 90 V +isolver %/ g del detergente duodecil sul"ato de sodio en 2/ mL de agua destilada$ 7alentar a .D0 -L D.D0 -L 200 µL E0 µL A0 µL La%--l 7..BD -L 2.C A='+ =E..&+".D0 -L C.5-2o<o2@s..F0 -L 200 µL 60 µL F µL D8 B.' M# pH B.00 -L 2. T2.$/0 g de Fris base # disolver en .F0 -L 200 µL D0 µL 6 µL <8 2.D0 -L 200 µL D0 µL E µL B8 2. 5o22.4.00 -L 2.F Pesar .D0 -L 2.s)C4 0. R.D0 -L 200 µL 6D µL G µL /0 8 B.D0 -L D..5-2o<o2@s..$.) M #E C.D0 -L C./ mL de agua$ Ajustar a p8 -$. AGE0.E0 -L 2.) 8 A.2 ./ mL de agua$ Ajustar a p8 .

.G.. po4.)0 M3! ..43?. g de glicina en una cantidad de agua destilada$ A"orar a % litro # almacenar a temperatura ambiente$ B6<<..5o 34 90 V Mezclar 0/ mL de (cido acético 1%/ B3 con .o23 p323 -. Mezclar /$/. Coo?3ss.71 .3 Mezclar 0/ mL de (cido acético 1%/ B3 con %0 mL de glicerol 1* B3 # a"orar a 0// mL con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465. g de azul brillante de 7oomassie A ó A<)0/ 1/$//. ToQ*.s-.o 35@-.1 6F ..1/$/.o p323 0. B3 con %// mL de (cido acético glacial 1%/ B3 # a"orar a % litro con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente en "rasco (mbar$ So465.. ?6.0/ mL de agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.:13s Para preparar )/ mL de bu""er= adicionar )$0 mL de solución de Fris<7l /$0 M! p8 ..+3.15. Coo?3ss..$0 mL de agua destilada$ Mezclar bien # 'acer alicuotas de % mL $ Almacenar a <)/K7$ So465.. K5.s .$/ mL de >+> al %/ B 1) B3! %$/ mL de Bis<mercaptoetanol 10 B3! -$/ mL de glicerol 1%/ B3! )/ µL de azul de bromo"enol al % B 1/$//% B3 # ..2 ...53.+isolver */ g de tris base! m(s %.352..4. Mezclar %)0 mL de metanol ó isopropanol 1)0 B3! con 0/ mL de (cido acético glacial 1%/ B3 # a"orar a 0// mL con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.71 .s-23 p323 p2o-. s.. 3J64 .71 . -..3 .$.71 ..71 <.15.71 2Kp.71 ..o23 .

.1-23.71 .. PBS '0 X A &// mL de solución de O )8PE.71 ... % M! ajustar el p8 a &$. /. con aproximadamente %0/ mL de solución de O8 )PE..71 .5C.o =F3s. PH!PO" 9 M =7 ..71 5o15.2.. g de glicina 1%2) mM3! )// mL de metanol 1)/ B3 # a"orar a % litro con agua destilada$ +ebe dar aproximadamente un p8 de -$*$ Almacenar a temperatura ambiente$ So465. PBS)4.. N3!HPO"> 22$*& g de "os"ato de potasio dib(sico 1P$M$Z %. Mezclar * g de lec'e descremada 1* B3 con calcio 1marca >velt# de @estle3 en %// mL de solución de PB> % V$ Preparar en "resco$ 6G . PBS 9 X Mezclar )/ mL de la solución concentrada de PB> 0/ V! m(s &$02 g de cloruro de sodio # a"orar a % litro con agua destilada$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.1> Mezclar /$% g de colorante "ast green 1/$% B3! 0 mL de (cido acético 10 B3! %/ mL de metanol 1%/ B3 # a"orar a %// mL con agua destilada$ Almacenar a temperatura ambiente en "rasco (mbar$ So465.. 2Kp.71 . % M$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ So465.3 .$%3 se disolvieron poco a poco en agua destilada # se a"oró a )// mL$ 7alentar la solución un poco para disolver los grumos$ So465. P!HPO" 9 M =7 .71 .%$2.Mezclar *$/* g de tris base 1)0 mM3! %.G2.3 se disolvieron poco a poco en agua destilada # se a"oró a &// mL$ 7alentar la solución un poco para disolver los grumos$ So465. N3H!PO"> )&$)) g de "os"ato de potasio monob(sico 1P$M$Z %*..$..

%! (% Cr !.% cal)r c" c"n!.*(r"c5l"r (% ac ( =Sc (" cl"r52(r c"> R l"&a!%! R l"(al.c.ran!cr '." Sc (" (%!"8 rr &"n.l:)n c"I-"r:"l n"> Nan)-%.r"! L .na !3r ca &"$ na> Ca.!'> .cl3 c" Sc (" (%!"8 rr &"n."r ac. PCR V RT)PCR 2p? RNP? E0 . !5"c< :ac. C. l ' r"car&"na. !5"c< 'r".cl3 c" -%n!a0%r" B"$ n% !%r.r"! M cr"1ra-"! M cr"l .cl%"'r".3r.%! ='r".r"! M cr"-"lar M l 1ra-"! M l l ..l:"n c ac ( =6c (" 'r"'an"!. $a> .a!%J4"l*-%ra!% c5a n r%ac.%2na! (% c5"+.. p* PSA P. !5"c< c"1na. M.NTP DEPC NC 0 g Hs5 Hsp Hs< HC4 P* ED3 E0 E? L ? µ0 µL µM ?0 ?L ?? ?M ?. ADN ADN5 ARN? BSA C3-. O.r"! M l2-%..r"! N"r-al NT-%r" 4ar%! (% &a!%! 4%r!.r"! M%.cl3 c" c"-'l%-%n.lar 4"l*-%ra!% c5a n r%ac.ran!cr 'c )n (% la! .71 ."r =:ac." (%l 4CR> Sc (" r &"n.cl3".% cal)r c" ) . . "n =R%$%r!a .n% =al&T.%a.. ("! D %.n..."! M"lar M"r'5"l n"I'r"'an%!.c"> .%2na (% c5"+.ar " (% ("&l% ca(%na ='r"(.r"! M l -"lar M n. $a("r (% la . .l:a.%a."n%! R l"1ra-"! R l)-%..." (% a-"n " 4%!" -"l%c.a!aI4CR> R%$"l.ran!cr '.So465. "n =r%acc )n %n ca(%na (% la '"l -%ra!a> 4"rc %n. D.6l"1" D%n! (a( )'.%a.% n! ='r"." R%$%r!% .21ra("! Gra-"! Gra$%(a(%! .c "n%! '"r .al&.%2na! -%n!a0%ra! 3. ca D (%"8 n. PBS)TQ." R &"n." Gra("! c%n.1 Mezclar % mL de FIeen<)/ 1/$% B3 en % litro de PB> % V$ Almacenar inde"inidamente a temperatura ambiente$ GLOSARIO An.1 M MOPS 1? N No.

%?a!> S"( .n("! S-all 5%a.% cal)r c" '%+.l:a.l:a.a V%r!.! =c"n."(%c l !." (% !"( "> 7l.% =(.S%1.ra$ "l%."(%c l !.(.%2na! (% c5"+.ra> V"l..-%n s s?HSP SDS U8 /s 8o4 EA . !5"c< 'r".% n! ='r".