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Oecologia aquatica, 5: 7-1 9.

1 981
El problema de la determi naci ón de clorofila a en
el fi tomicrobentos: di scusi ón sobre
la metodol ogía
MANUEL VARELA
Instituto Español de Oceanografía. Muelle de Animas s/n. Aptdo. I3O. La Coruña
INTRODUCCiN
Está demostrado que l os productos
de degradación de la clorofi la represen­
tan en el bentos una fracción importante
del total de pigmentos verdes presentes .
Estas formas degradadas o inactivas ab­
sorben luz en la parte roja del espectro
y esta abso.ción no es di stinguible de
la de l as formas activas . Las técnicas
empleadas para la determinación de pig­
mentos deben por tanto tener en cuenta
esta c ircunstancia, porque de lo contra­
rio los resul tados obtenidos serían poco
fiables .
El esquema de l a degradación de
la clorofi la-a es el s iguiente ( YENTSCH ,
1 967 ) :
-Mg - r.¡o1
_
reor:t.oa-�
_
c:oror.:a-�_ � Feof6rbido-� .
c:oror.:.da-a
-r.¡o: -
Mg
La pérdida del núcleo magnésico
y de la cadena fitol degrada la clorofi-
* \ \ 00 t

ü11Zü00 c0n !0n008
del programa cooperativo hispao-americano "IN­
VESTIGACIONES BIOLOGICAS DE LAS RIAS DE GALI-
CIA". nº de proyecto OUZU.
l a-a a feofórbido-a, a través de la
feofi tina-a o de la clorofi l i da-a , según
el esquema señalado .
La clorofi lida y sus formas oxida­
das presentan un espectro de absorción
idéntico al de la clorofila-a y , por
tanto , en los anál isis espectrofotomé­
tricos estas clorofilas degradadas se
valorarán como clorofi la activa . Por
otra parte , feofitina y feofórbido ( feo­
pigmentos ) presentan un espectro l igera­
mente diferente al de la cl orofi la acti­
va . La absorción en la parte roj a del
espectro se desplaza de 665 a 667 nm
y decrece aproximadamente en un 50 %
( fig. 1 ) . Sin embargo , esta diferencia
es tan escasa que no permite una clara
distinción entre los pigmentos , y por
tanto los feopigmentos pueden interferir
seriamente l as determinac iones especto­
fotométricas de clorofi la-a , ya que es­
tos productos se incluirán como s i casi
la mi tad de la correspondiente cantidad
de clorofi la estuviese presente .
La clorofila-a puede ser transfor­
mada en feofitina-a y l a cl orofilida
en feofórbido , acidificando los extrac­
tos de pigmentos con ácidos minerales
diluidos . Partiendo de esta base , se
8
han desarrollado procedimientos espec­
trofotométricos con los factores de co-
rrección adecuados para permitir discri­
minar entre clorofila-a (incluyendo clo­
rofilida y formas oxidadas) y feopigmen­
tos (suma de feofitina y feofórbido)
(LORENZEN , 1 967; TETT et al. , 1975).
La cantidad de pigmentos puede así obte-
nerse indirectamente de la relación en-
tre las absorbancias antes y después
de la acidificación . Esta relación puede
variar desde un mínimo de 1 , en el caso
de la existencia exc lusiva de feopigmen­
tos , hasta un valor máximo si éstos se
encuentran ausentes.
ELECCIÓN DEL SOLVENTE
Los criterios a tener en cuenta
para la elección de un sol vente están
basados en la capacidad extractora , por
600 650
LONGITUD DE ONDA
700
|1g l. ESpeCIDOS de BOSODC1ón de un exIDBCIO
de BCeIOnB B1 JUU % pDOCedenIe de1 B1gB veDde
SCenedeS0uS d10ODphuS¸ IDBIBdO COn d1ÍeDenIeS
MANUEL VARELA
TBDlB 1 - LÍ1C1enC1B del 0e1BnOl BOBOJU1O y
de ìB BCeIOnB BJ BO % en JB eXIDBCC1ón de C1O�
DOÍ1JB-B¸ en d1BIO0eBS y C1BnOÍíCeBS (de H0LN-
-HAYSLY & R1LMAXY, lB¯U;
URUP0 T)LMP0 (h
j ,
g `]0R0|41A-B/MUL¿
TRA
TA/0YDM1`0 L/TRA``JDY A`LTDYA BO"� MLTAY0[
D1BIO0eBS 34¸Z_0¸4 3¯¸U U¸Ô
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lZ 3Ô¸Z_U¸¯
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`1BnOÍíCeBS ZU,Ô_U,Z 34¸1 U¸4
Ô ZB¸4_U¸4
lZ ZB,U_U¸U
ZO 3U,0g0¸Ò
un lado , y la estabilidad de los pigmen­
tos en él durante los procesos de ex­
tracción y acidificación , por otro .
CAPACIDAD DE EXTRACCION
Los solventes más ampliamente uti­
lizados son , tanto en oceanografía como
en limnología , el metanol absoluto y
la acetona al 90 °. Como extractor , el
metanol es mucho más rápido y eficaz
que la acetona , como puede verse en la
tabla r. Al cabo de una hora , la extrac­
ción fue completa en metanol , pero in­
completa en el caso de la acetona. Des-
pués de 20 h las muestras de diatomeas
se aproximan al 100 ° de extracción ,
mientras que en cianofíceas son sólo
un 88 ° comparadas con las muestras de
metanol . Sin embargo , si l as muestras
son trituradas y extraídas durante unas
COnCenIFBC1On£S de `1H (M0LD & H(]]LÇR(L[[¸ pocas horas , los resultados son compara-
JB¯U,.
Fig. l. Abso:tior. spectra of 100 % acetone ex-ract
of the green alga Scenedesmus dimorphus, treated
wi th successi vely increasing molari ty of C1H
(MOEr & HALLEGRAEFF, 1978).
bIes en ambos solventes . Por tanto ,
cuando se emplea acetona, s i se desea
una extracción completa , l as muestras
deben triturarse o bien extraerse duran-
DETERMI NACI ÓN DE CLOROFI LA a EN EL FI TOMI CROBENTOS 9
te al menos 24 h , aunque en es te caso
la extracción no sea completa en algunos
grupos , especialmente clorofíceas y c ia­
nofíceas . Como se comprobará posterior­
mente , la acetona presenta durante los
procesos de acidificación numerosas ven­
taj as comparada con el metanol , haciendo
que su uso sea preferible al de éste .
Además , dado que las diatomeas constitu­
yen en general el grupo más abundante
del fitomicrobentos , el empleo de aceto­
na no conduce a grandes subestimaciones
de la cantidad de clorofi la . I ncluso
en el caso de la presencia de organi smos
en los que la extracción sea incompleta
con acetona , puede incrementarse la efi­
cacia de ésta, hasta el nivel de la del
metanol , util izando una mezcla de dime­
tilsulfóxido ( DMSO ) y acetona a partes
iguales ( V/v ) ( tabla IJ}. Por otra par­
te , el DMSO ro modifica el espectro de
absorción de I.. clorofi la-a .
ESTABILIDAD DE LOS PIGMENTOS
EN DISTINTOS SOLVENTES
Como ya se ha señalado , el cambio
en la absorbancia de una soluc ión de
pigmentos después de la acidificación ,
es la base de los métodos espectrofoto­
métricos para la estimación de clorofi la
en presencia de feofi tina. Los métodos
están basados en la suposición de que
el coeficiente de absorción de la feofi-
tina, próximo a 665 nm , no varía con
la acidi ficación . Esta supos ic ión es
s in embargo incorrecta, y el coefici ente
de absorc ión puede vari ar ampl iamente
dependi endo del tipo de solvente , su
contenido en agua y la molaridad del
ácido en el extracto y por tanto del
pH .
La figura 1 muestra claramente la
influencia en el espectro de distintas
concentraciones de ácido . Si la molari-
dad final del ác ido se mantiene por de­
baj o de ci ertos valores , la degradación
de la clorofi la-a a feofitina-a provoca
el desplazami ento del máximo de absor­
ción , en la parte roj a del espectro ,
de 665 a 667 nm . Un incremento en la
concentración de ácido origina un corri­
miento del máximo a 657 nm . Por la ob-
servac ión de la figura , resulta evidente
que la apl icación de baj as concentracio­
nes de ácido , j unto con cortos ti empos
de reacción , es insuficiente para asegu­
rar la conversión de toda la clorofi la
Tabla II - Comparación de la eficacia extracto­
ra de acetona al 90 % Y dimetilsulfóxido ( DMSO
+ acetona 90 %, v/v) ( de SHOAF & LIUM , 1976 ) .
mg/l
GRUPO TAXONOMICO EXTRACTOR CLOROFILA-a
Diatomeas
Nitzschia sp . DMO 1 , 32
Acetona 1 , 31
Clclotella sp . DMSO 0 , 86
Acetona 0 , 86
C1orofíceas
Chlorella prenoidosa DMSO 2 , 66
Acetona 0 , 64
Selenastrum caEricornutum DMSO 1 , 18
Acetona 0 , 02
Ankistrodesmus braunii DMSO 1 , 05
Acetona 0 , 21
Ciaofíceas
Anaclstis nidulans DMSO 0 , 40
Acetona 0 , 40
Anabaena flos-aquae DMSO 2 , 45
Acetona 2 , 45
Fremlella diplosiphon DMSO 3 , 28
Acetona 3 , 16
!0
presente en feofi tina , y en este caso
se obtendrían valores de feofi tina muy
elevados , y valores de la relación entre
las absorbancias antes y después de la
ac idificac ión (R) muy baj os . De otro
lado , una fuerte ac idificación hace que
el pi co de absorción se desplace de 667
a 657 nm. Esto se debe ( USACHEVA , 1 971 )
a .a exi stenc ia de un equi l ibrio , depen­
di el,te del pH, entre la forma neutra
de l a feofitina, su monocatión y su di­
catión. La aparición del pi co de absor­
ci ón a ô¯7 nm sería indi cativa de la
formac ión de dicationes de feofitina-
a . En aquell os casos en que estas trans­
formac iones no hayan sido detectadas ,
es to llevaría a 1& obtenc ión de valores
de feopigmentos muy baj os , i ncluso nega­
t ivos , y valores de n al t�s. Una concen­
trac ión de ác ido elevada puede incluso
<
L
2
<
æ
0
C
v
æ
<
,
'' ' -
��
o"
4õU
..., ......
õUU õõU
LLNLlÄ1O OE ÕNO^
MANUEl VARELA
l lega� a incrementar de forma consi dera­
ble la absorción de fondo , uti lizada.
para corregir la turbidez de la solu­
ción , introduc iendo de e sta forma nuevos
errores en el cálculo de pi gmentos . Este
incremento de la absorción a 760 nm se
debe a la escisión de la fucoxantina
en productos de tipo furano ( fig . 2).
El empteo de metanol como solvente
presenta prob lemas semejantes al de la
acetona , con desplazami entos de los má­
ximos de absorción hac ia l ongitudes de
onda menores de la esperada ( fi g. 3 ) .
Esta reacción es mucho más ráp ida
en metanol acuoso que en acetona acuosa .
La tran
.
sformación de monoca "iones de
feofitina en sus respectivos dicationes
ti ene lugar a un pH < 2 en me tanol acuo­
so y sólo a pH < 0, 6en acetona acuosa .
Este desplazamiento del espectro es com-
FucOxÐD!1DÐ
ôUU ôõU 7UO
Fi g. 2 . Espectros de absorción de la fucoxant ina antes (-  ) y después (---) de ser acidi ficado
el extracto lJUU % de acetona) hasta una molaridad final de ClH de 4, 4XlO
-2
M (MOED & HALLEGRAEFY,
\9701·
Fig. 2. Absortion spectra of fucoxantin befare ( -) and after (----) acidification with Clli. Final molar"ity
of the acid. 4. 4XIO
-2
M (MOED & IIIL['F.CRAEF"F. 1978).
o
õ
z
"
m
a
O
É
"
DFTERMI NACI 6N DE CLOROFILA ' EN EL FITOMICROBENTOS
!1
anles acidificar
_ (664)
presente formación de dicationes . HOLM­
-HANSEN & RIEMANN ( 1978 ) aconsejan e l
empleo d e 25 mg d e C0
3
Mg por ml d e ex­
tracto , para una concentrac ión final
de ác ido 3x10
-3
M, con un tiempo de reac­
ción de 10 minutos y agitac ión suave .
MEDIDAS DEL pH ANTES Y DESPU�S
DE LA ACIDI FICACIÚN
MOED & HALLEGHAEFF ( 1978 ) han l l e-
600 650
LONGITUD DE ONDA (nml
vado a cabo un completo estudia acerca
700
de la influencia del pH del extracto
en la absorbancia de los pigmentos , que
Fig. 3 . Espectros
'
de absorción de pigmentos
extraídos en metaol de un cultivo de Dunalie­
lla tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RIEMNN , 1978 ) .
Fig. 3 . Absortion spectra _f pigments extracted
in methaol from a culture of Dunaliella tertiolecta
(HOLM-HANSEN & RIEMANN, 1978).
pletamente revers ible mediante neutral i­
zación con CI
3
Mg , lo cual indica la
exi stencia de un cambio físico más que
de uno químico de transformación en feo­
fórbido .
Estos cambios espectrales de l a
feofi tina en relac ión con e l pH , han
si do señalados para metanol al 80 , 90 ,
95 y 100 % ( LIVINGSTONE et al . , 1 9�3 ;
MARKER , 1 972 ) y 100 % de acetona ( MOED
& HALLEGRAEFF , 1978 ) , y no fueron de-
tectados en acetona al 80 , 90 y 95 %.
Esto e s debido a que e n acetona acuosa
es necesario alcanzar un pH tan baj o
como 0 , 5 para que comience la formación
de dicationes de feofitina , mientras
que en metanol acuoso esta transforma­
c ión tiene lugar ya a un pH de 2 . Por
tanto , cuando se emplee el metanol como
66  espué s de la acidi ficac ión
es necesario neutral izar el extracto
hasta un nivel de pH en el cual no se
permite expl i car de forma cl ara numero­
sos problemas que plantea la acidi fica­
c ión , en un intento de caracterizar l as
condiciones óptimas de l a misma en rela­
c ión con l a molari dad final del ácido .
En este sentido , l a determinac ión del
pH en los extractos parece ser un crite­
rio más adecuado que el cálculo de la
molaridad del ácido puesto que aquél
no depende únicamente de l a cantidad
de ácido añadido s ino también del con-
tenido en agua del sol vente . De todas
formas l as medidaS de pH en solventes
acuosos orgánicos deberían ser interpre­
tadas con grandes precauc iones , ya que
el concepto de pH ha si do definido úni­
camente en relación con el agua como
solvente .
La adición de in

luso pequeñas can­
tidades de CIH di luido a sol Ventes orgá­
nicos con un bajo contenido en agua
( " 5 %) hace descender el pH , en sólo
un minuto , a val ores comprendidos entre
0 , 5 y 2 , 0 ; mi entras que la misma canti­
dad de ácido en solventes con un mayor
contenido en agua ( 10-20 % ) , da 1 ugar
a valores de pH que osci lan entre 2 , 5
y 3 , dependi endo de la natural eza del
solvente ( fi g. 4). El consumo de ácido
12
es , pues , mayor cuanto mayor sea l a can-
tidad de agua , y es superior en metanol
que en acetona para ·la misma cantidad
de agua. En so luciones acuosas de meta­
nol y acetona la completa degradación
de c l orofila en feofi tina tiene lugar
a un pH comprendido entre 2 , 6 y 2 , 8 .
L a rotura d e l a fucoxantina e n furanos
y e l incremento subsiguiente de la ab­
sorción a 750 nm es dependiente del
tiempo y comienza a un pH �2-2,G, veri-
6
4
3
5
10 15
n' gotas
Metanol �
095 '
• 80 '
10 15
n' gotas
Fig. 4. Variación del pH en relación con la
cantidad de ácido ( CIH 0.4 M ) añadido a 25 mI
de diferentes extractos de acetona y metanol
con distintas, concantraciones de agua ( MOED
& HALLEGRAEFF. 1978 ) .
Fig. 4. Effect of the addition of an increasing
amount of acid (0,4 � C1H) 0: the pH of extracts
(2' r1 ) of acetone ano methanol wi th different
water conten' s (MOEO & HALLEGRAEFF, 1978).
MANUEL VARELA
ficándose de forma muy lenta y siendo
mucho más rápida a un pH comprendido,
entre l y l,G.
Dado que el pH final del extracto
no es únicamente función de la molaridad
del ácido sino del contenido en agua
del mismo. los cálculos del pH del ex­
tracto. a partir de l a c oncentración
del ácido en'el mismo, no corresponden
al valor real. Por esta razón. aun cuan­
do teóricamente' una concentración de
ácido en e I extracto entre 2 y 3xl0-
3
daría e l rango de pH señalado como idó­
neo ( 2,6-2.8 ) , en la práctica esto no
es cierto. La figura 4 representa la
disminución del pH en relación con la
cantidad de ácido añadido a distintos
solventes con diferentes concentraciones
de agua. A partir de la misma se puede
deducir el volumen de ácido a añadir
a distintos volúmenes de extracto . Mu-
chos autores acidifican directamente
en la cubeta del espectrofotómetro aun­
que sería preferible utilizar extractos
de mayor volumen con objeto de poder
añadir cantidades exactas de ácido . Ade­
más. dado que numerosos investigadores
usan acetona, metanol e incluso etanol
con variadas concentraciones de agua.
sería conveniente que. en cada c aso ,
se establ eciese el volumen de ácido re-
querido para al canzar el pH señalado:
2.6-2.8 .
CÁLCULO DE LA CONCENTRACI ÓN
DE PIGMENTOS
Una vez obtenidos los extractos
en acetona del 90 °, l as l ecturas se
realizan en e l espec�rofotómetro a 665
nm, antes y después de l a acidificación
con CIH , corregidas por la l ectura a
DETERMI NACI ÓN DE CLOROFILA a EN EL FITOMI CROBENTOS
13
750 nm y con l as precauciones anterior­
mente señaladas en relación con la can-
tidad de ác ido añadido.
El cálculo de la concentración de
clorofi la-a se obtiene a partir de las
siguientes ecuaciones ( LO�SNZEN , 1967):
Clorofila'a (mg/m
2
) AxKx(6650-665a)xvxl0
LxS
Feofitina a (mg/m
2
)= AxKx(Rx665a-6650)xvxl0
LxS
( A , coeficiente de absorc ión d� l a c lo­
rofi la a = 1 1 , 0; ,K , factor para igual ar
la reducción en la absorbancia a la con­
centración inicial de c lorofila = 2 , 43;
6650 , absorbancia antes de la acidi fica­
ción , corregida; 665a , absorbancia des­
pués de la acidificación , corregida;
v , volumen de extracto acetónico en mi;
10 , factor de conversión a m
2
; L , longi­
tud de paso d' l a cubeta en cm; S , su­
perficie de la muestra , en :m
2
; R , máxi­
ma relación de 6650/665a en ausencia
de feopigmentos = 1,7).
LIMITACIONES DE LOS M�TODOS
NORMALMENTE UTILIZADOS
Los métodos espectrofotométricos
empl eados para la determinación de pig­
mentos , tal como e l descrito anterior­
mente ( LORENZEN , 1967) u otros similares
( HOLM-HANSEN & R IEMANN , 1978; T ETT e t
al., 1975), así como los de fluorescen­
cia ( YENTSCH & MENZEL , 1 963; HOLM­
-HANSEN et al . , 1965 ) , proporcionan es­
timaciones poco vál idas ya que la medida
de clorofi la-a corresponde a l a suma
 e clorofi la-a y cl orofi l ida-a y la de
feofi tina-a a la suma de feofi tina-a
y feofórbido-a . Esto supone un serio
inconveniente , especialmente en muestras
bentónicas , en donde estos productos
de degradación pueden representar un
elevado porcentaj e de la cantidad total
de pigmentos . Por otra parte , si la clo­
rofi la-b está presente , se obti ene un
valor de feofi tina-a muy al to , ya que
el espectro de absorción de la feofi tina
-a y de la feofitina-b en los extractos
acidificados

s muy semejante ( fig. 5 ) .
J EFFREY (1974) comenta estas l imitac io-
nes y señala que cualquier método que
no impl ique la separac ión física de los
pigmentos porporciona resul tados poco
precisos y está comprometido por la pre­
sencia de productos de degradación nue­
vos , resul tantes de la acidificación
de l as muestras . Este autor propone la
uti l i zación de técni cas de cromatografí a
en capa fina , l as cuales permi ten la
separación de l as formas principales
de clorofi la ( a , b y c ) y carotenoides ,
así como feofitinas , feofórbidos y cl o­
rofi l i das . Sin embargo , en l a estimac ión
de la biomasa de la microflora bentóni­
ca , en la que el problema de la patchi­
ness exige l a toma de numerosas mues­
tras son quizá preferibles a aquél los
más exactos pero lentos .
UNA APROXIMACI ÓN AL PROBLEMA
El empleo de técnicas de separación
de fase es sugerido por J EFFREY (1974)
como una opción para mej orar la metodo­
logía normalmente uti l i zada . WHITNEY
& DARLE Y (1979) desarrol lan en este sen-
tido un procedimiento para la determina­
ción precisa de c lorofila-a en muestras
que contienen grandes cantidades de pro­
ductos de degradación. La partic ión con
1 4
hexano de un extracto acetóni co da lugar
a un si stema de dos fases . La hiperfase
contiene los carotenos , c l orofi las a
y b Y feofi tinas a y b , debido a que
estos componentes retienen la cadena
no polar ( fi tol ) . La h ipofase conti ene
la c lorofila-c , parte de carotenos y
los productos de degradación de l a c lo­
rofi la que carecen del grupo fitol , clo­
rofi l i das a y b Y feofórbi dos a y b .
De esta forma , l a parti c ión con hexano
separa las formas degradadas de la clo­
rofi la activa . La c lorofi la a puede en­
tonces ser calculada en la capa de he­
xano , en presenc ia de feofi tina-a por
una ligera modi ficación de l as ecuac io-
A
Feofitina a
(655)
600 650
Clorofila a
(665)
700
c
(
z
c
a

O
e
a
c
MANUEL VARELA
nes de LORENZEN ( 1 967 ) . Dado que este
procedimiento supone una importante me-,
j ora en l a metodología , es más s imple
y rápido que l as técni cas cromatográfi­
cas en uso , y no requi ere equipo espe­
c ial , será descri to en detalle .
La partición con hexano es como
s igue : 10 ml de un extracto acetónico
( 90 % de acetona ) se añaden a 3 , 5 ml
de C1Na al 0 , 05% Y 1 3 , 5 ml de hexano
( de grado espectroscópico , rango de ebu­
l l ición : 68, 0-68, 8) en un embudo de de­
cantación de 60 ml . El embudo es agi tado
fuertemente durante 5 minutos en una
agi tadora recíproca a 60 vibraciones
por minuto , para alcanzar una máxima
B
600 650
Clorofila b
(655)
_Feofitina b
( 653)
700
LONGITUD DE ONDA
Fig. 5. Espectros de absorción de las clorofilas a y b Y feofitinas a y b en metanol. Acidifica­
ción hasta una molaridad de 3X10
-
2
M (HOLM
-
HANSEN & RIEMANN, 1978).
Fig. 5. Absortion spectra for chlorophylls a and b and phaeophytins a and b in methanol. Molarity 01' thc
acid in the extract. 3Xl0-2M (HOLM-IIANSEN & RIEMANN. 1978).
DHERMINACION DE CLOROFILA. EN EL FITOMICROBENTOS
I5
separación. Después de e l iminar l a hipo­
fase acetónica , dos al í cuotas de la hi­
perfase , de 5 ml cada una , se recogen
en vi ales d� vidrio de 20 mI de capaci­
dad . Una go�á�del CIH al 50 % se afade
a unó de l o

'viales agitándose a conti­
nuac ióD para convertir la c lorofi la en
feofitina. Aproximadamente 0 , 5 g de
SO 4 N

anhidro se afade a cada vial con
objeto de secar e l hexano . Las absorban­
ci as de las dos soluc iones de hexano
se miden contra un b l anco de hexano a
663 y 750 nm en un espectrofotómetro .
La concentración de c lorofila-a puede
entonces ser calculada a partir de las
ecuac iones de LORENZEN ( 1967 ) , adaptán-
dolas a l as muestras de hexano .
Clorofila a (mg/m
2
) = AxKx( 6630-663a) xVxvxl0
LxS
Feofi tina a (mg/m
2
)= AxKx( Rx663a-6630) xVxvxl0
LxS
( A, coeficiente de absorción de la cl o­
rofi la-a en hexano = 1 1 , 05 ; K , factor
para igual ar la reducc ión en la absor­
bancia a la concentración inic ial de
cl orofi l a = 1 , 82 ; 6630 , absorbanc ia del
extracto original corregida ; 663a , ab­
sorbanc ia del extracto ac idificado ; V,
factor de correcc ión para l a diferencia
de volumen entre l as capas de hexano
y acetona 1 , 6 ; v , volumen del extracto
acetónico original en ml ; 10 , factor
de conversión a m
2
L , l ongitud de paso
de cubeta en cm ; S , superficie de l a
muestra e n cm
2
; R , relación 6630/663a
para cl orofi la-a pura = 2 , 23 ) .
La transferencia de c lorofi la-a
a la capa de hexano es independiente
U� ¡¢ COuC6uIõC1Óu U6 COIO11õõ en
el rango estudi ado por l os autores ( has­
ta 3 mg/l de acetona ) y es prácti camente
compl eta ( 100 , 3

0 , 8%), de acuerdo con
las determi nac iones de la absorbancia
de l a cl orofi la remanente en la hipofase
acetónica . Aunque la presencia de ex­
tracto de sedimento interfiere algo la
transparencia , este probl ema se reduce
en gran parte agitando los sol ventes
durante 5 minutos .
Usando feofitina-a obtenida por
acidificación y neutral izac ión de c lo­
rofi la-a pura , se ve que su espectro
de absorción no varía con el pH ( MARKER ,
1 977 ) en hexano . Los valores de R próxi­
mos a l , O de muestras fecales apoyan
esta conclusión ( tabla I I I}. La relación
de l as absorbanc ias antes y después de
la acidi ficación , R , varía s i gnificati­
vamente con pequefos cambios en la lon­
gitud de onda para ambos solventes , pero
de manera especial en l os extractos de
hexano ( fig . 6 ) . El grado de hexano em­
pl eado afecta también a esta re lac ión .
Por esto es necesario cal ibrar cuidado-
samente el espectrofotómetro uti l izado ,
determinando l a l ongitud de onda a l a
cual se obtiene e l máxi mo de absorc ión ,
o bi en establ eci endo el valor de R para
el aparato , usando cl orofi la pur ificada
por cromatografí a.
Los pares de muestras anal izadas
por ambos métodos , acetona y hexano ,
son comparabl es , ya que proceden de l a
misma soluc ión de acetona . Los valores
obtenidos para clorofi la-a y feofitina-a
pura son iguales . Para muestras con
productos de degradac ión , el hexano pro­
porc iona valores de cl orofi l a-a más ba­
j os . Las c l orofi l idas son retenidas en
la hipofase acetónica durante la parti­
ciÓn y por tanto no son medidas como
pigmento activo . Estas di ferenc ias en
porcentaj e de p igmento activo pueden
16
MANUEL VARElA
Tabla III - Comparación de las cantidades de clorofila-a y feofitina-a obtenidas por los
métodos de acetona y hexano, en varios tipos de muestras. Concentraciones en mg de pigmento
por litro de extl'acto acetónico (de WIUTNEY & DARI.EY, 1979).
Acetona
R
6640: 664a Cla
Clorofila-ª pura 1,802 23,896
Cllindrotheca fusiformis (cultivo)I,768 37,893
Fitoplancton 1,569 5,400
Fango 1,544 9,583
Heces 1,054 0,525
Feofitina pura 1 , 021 0,128
ser de hasta el 62 ° (tabla IV) . Incluso
en la fase logarítmica de cultivo de
Cylindrotheca fusiformis, el porcentaj e
de productos degradados de la cl orofila­
-a puede al canzar el lO ° (tabla TTT}.
o
Ü
!

~
a

1
150
140
130
120
11
100
90 -
80
70
60
 

-
-
-
-
Q
--
--
-
-
-
Q -------¤ _____
-3 -2 -1
-
-- -g---
-
_ ACETONA

--:
0--__ _

-'(---
HEXANO

`
r 01 ofSVI"CION DE l' _, DE . aSO....NCI .. M"XIM4
Fig. S. Variación del valor de R (relación de
las abso!bancias a 663 nr antes y dfspués de
aCidi!icar) con la longitud de onda para la
clorofila-a pura, en acetona al 90 % Y hexano.
(WHITNEY & DARLE Y , 1979).
Hexano
R
feofitina 6630: 663a C1a feofitina
0,002 2,227 23,898 0,009
1,138 2,105 34,083 7,139
2,215 1,798 3,592 1,926
4,548 1,711 7,648 5,547
7,270 1,057 0,200 4,085
4,651 1,050 0, 164 3,958
Tabla IV - Comparación de los valores de cloro­
fila-a y feopigmentos obtenidos por los métodos
de acetona y hexano. En el caso de la clorofi­
la, los porcentajes corresponden a la relación
entre los valores de hexano y acetona, conside-
'
rando que los primeros representa la forma
activa del pigmento y los segundos el total
(activa + degradada = clorofila + clorofílida).
En el caso de los feopigentos, los porcentajes
expresan la relación entre los valores obteni­
dos por uno y otro método. Las muestras señala­
das con un * representa cantidades de feopig-.
mentos más elevados en acetona que en hexao.
Muestras procedentes de la ría de Arosa (VARELA
& PENAS , en preparación). N , número de mues­
tra .
% Cl-a activa
Clorofila-a FEOPIGMENTOS
(mg/m
2
) (mg/m
2
)
N acetona hexano % acetona hexano %
373 , 8 198,4 53 285,1 348 , 5 122
2 Z57,3 133,1 51 301,7 399 , 8 132
3 377,8 217 , 7 58 283 , 2 453 , 7 160
Fig, 6, Dependence af befare-ta-after acidificatian
' 4 133,4 52 , 3 39 365,8 628,5 171
ratic, E. wavelength faI' pure chlaIaphyl1-a
9:: ' % ace·ane anó hexane (WHITNEY & DARLEY,
1979) ,
5 203,0
6 245,2
118 , 5 58 225,9 210,1 *107
123,4 50 226,7 204 , 9 *110
DETERMI NACI ÓN DE CLOROFI LA a EN EL FI TOMI CROBENTOS
1 7
Las di ferenc ias entre las concen-
trac iones de feofitina no son consisten-
tes ; en algunos casos e l método del he­
xano :propopciona una mayor cantidad de
feofi tina . ��� �l de acetona ( tabl as TTT
y IV ) . E�, el caso de muestras de sedi­
mentos :procedentes de l a ría de Arosa
( VARELA
'
& PENAS , en preparación ) , e l
hexano proporc ionó e n l a mayoría de l os
casos valores más el evados que la aceto­
na ( tabl a I V) , en ocasiones hasta un
170 % mayores . Esto resulta probabl emen­
te de la di ferencia en el nivel de feo-
fórb ido en l as muestras ( WHITNEY & DAR­
LEY , 1979 ) o de algún t ipo de interfe-
renc ia no conocida , puesto que la aceto­
na debería proporcionar valores de feo­
pigmentos más e l evados que e l hexano ,
pues en éste l os feofórbidos son e l imi­
nados en l a hipofase acetónica durante
la partic ión y no son medidos como feo­
fi tina .
EL USO DE C03Mg DURANTE EL PROCESO
DE EXTRACCIÓN
El C0
3
Mg es ampl iamente util izado
durante la extracc ión de p igmentos en
fi toplancton , macrófitos y fi tomi croben­
tos , para pr

venir la acidi ficación de
los extractos . Sin embargo , su empleo
es discutido por HOLM-HANSEN & RIEMANN
( 1978 ) , qui enes encuentran poca o ningu­
na di ferenc ia entre muestras de fi to­
plancton con y s in tratamiento con
C0
3
Mg . Por otra parte , su uso en mues­
tras destinadas al estudio de pigmentos
por los métodos de acidificación descri­
tos puede causar serios problemas , ya
que hace que los valores de pH subsi­
guientes a l a acidi ficación sean mayores
que l os requeridos para una completa
feofi tinizac ión . Además , MOED & HALLE­
GRAEFF ( 1978 ) señalan que nunca los va­
lores de pH del extracto son tan bajos
como para permitir l a más mínima feofi­
tinización . Desde este punto de vi sta ,
por tanto , l a apl icación de C0
3
Mg sería
innecesaria y sólo debería ser empleado
en condic iones de acidez de muestras
procedentes de cuerpos de agua o sedi­
mentos ácidos .
Pero e l uso de C0
3
Mg pl antea además
otro grave problema , como es su tenden­
c ia a absorber cantidades s ignificativas
de c lorofi l i das y feofórbidos . Por todo
el l o , el empl eo de C0
3
Mg es desaconsej a­
do , mientras no se presente una al terna­
tiva adecuada .
CONCLUSIONES
Aunque la información existente
acerca de la determinac ión de pigmentos
en muestras con gran cantidad de produc­
tos de degradación , como son l as proce­
dentes del bentos , y que exigen la ac i­
di ficación de los extractos para distin­
guir l as formas activas de l as degrada­
das es abundante , numerosos autores si­
guen anal izando sus muestras si n l as
debidas precauciones , l o cual hace que
los resul tados obtenidos sean poco fia­
bles y en ocas iones difíci lmente compa­
rables . Está cl aro que es prec isa una
puesta ·a punto de la metodología y una
estandarización de l a mi sma . En este
sentido se proponen l os siguientes pun­
tos :
1 ) E l empleo de acetona con un con­
tenido en agua del 10 al 20 % es aconse­
j able sobre otros solventes , por propor­
cionar una mayor estab i l idad a los p ig-
1 8
mentos durante l o s procesos d e aci di fi-
cac ión , aunque su capac i dad extractora
sea i nferior a la del metanol .
2 ) La tri turac ión , sonicaci ón o
e l empleo de DMSO con acetona acuosa ,
permi ten una efi cac ia y una rapidez en
l a extracc ión comparable a l a del meta­
nol .
3 ) La acidi ficac ión de los extrac-
tos debe permi tir al canzar un pH final
comprendido entre 2 , 6 y 2 , 8. Si se em-
MANUEL VARELA
pl ea metanol como solvente , e l extracto
debe neutral i zarse con C0
3
Mg.
4 ) E l método del hexano se presen­
ta como una al ternativa adecuada por
reunir efi cac i a y rap idez en la determi­
nac ión de c l orofi la-a ac ti va. El uso
conj unto del método tradi cional de ace-
tona y el del hexano permi te conocer
la cantidad ° de productos de degradación
existente en l as muestras .
G) E l uso de C0
3
Mg debe omitirse .
SUMMARY
T HE PROBLEM OF CLOROPHYLL a DETERMINATI ON IN T HE P HYTOMICROBENTHOS:
A METODOLOGICAL DISCUSSION
A geneDa1 d1SCuSS1On aOOul 1he de�eD01na-
�iOn OÍ p1g0en1S in Sa0p.eS COnIa1n1ng h1gh
peDCen'ageS OÍ degDada�1On pDOduC�S , aS 1hOSe
ÍDO0 1he Oen1hOS , 1S pDeSen1ed. The �Dad1 11Ona1
0e1hOdS OaSed On 1he SpeC1DOphO1G0e1D1C Dea-
d1ngS OeÍODe and aÍ1eD aC1d1Í1Ca11On OÍ 1he
exL:aC1S aDe d1SCuSSeU 1n De1a11On w 11h 1he
SO1ven1S , 1he1D wa1eD COn1en1 , 1he 0O1BD11y
OÍ 1he a� 1d 1n 1he aC1d1Í1ed ex1DaC1 and 1he
uSe OÍ `O
3
Mg The 0e1hOd OÍ WH1TYLY & DARLLY
( 1979 ) , .. h1Ch 1nvO1veS paD1111On OÍ aCe1On1C
ex1DaC1S w11h hexane¸ a11O w S a be11eD d1S11nC-
11On Oe1 ween aC11ve and nOn~aCLve ÍOD0S OÍ
Ch1ODOphy11~�¸ w h1Ch 1S nO1 pOSS1O1e w11h U
CuDDen1 SpeC1DOphO1O0e1D1C pDOCeduDeS , and 1S
pDOpOSed aS a Su1 1aO1e a11eDna11ve
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