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Microarrays

Basado en presentación de Humberto Díaz

Antecedentes

Secuenciación del Genoma Humano (2001). Busqueda de genes y patrones de expresión. Instrumentos y técnicas.

Antecedentes
1800 1600

Nº de Publicaciones

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

Años
Microarrays Affymetrix

Evolución de las técnicas

Conceptos Generales Biochip Dispositivos de pequeño tamaño que contienen material biológico y que se emplean para la obtención de información genética. .

Clasificación de Biochips .

Microarray cDNA .

Exhaustivo .Ensayos reproducibles y transportables.Permite realizar ensayos simultáneos utilizando muestras diferentes o realizar varios ensayos utilizando una única muestra. .Arreglos a medida. Fácil .Alta capacidad: Genomas completos.Ventajas del uso de Microarrays Flexible . .

Ventajas del uso de Microarrays Rápido . . Barato .No se precisa un elevado costo de reactivos. .No se precisa disponer de un plan especial para la gestión de residuos.Alto rendimiento: análisis de miles de genes en pocas semanas.No se precisa el manejo de radiactividad. .

Incompatatibilidades entre los equipamientos.Artefactos con análisis de imágenes y de datos.Desventajas del uso de Microarrays Costo .Controles apropiados y replicas. Control . .Elevado costo de inversión en la adquisición del equipamiento necesario para el acceso a la tecnología. . .

ETAPAS EN LA EXPERIMENTACIÓN .

.

Diseño del Biochip .Preparación de la Muestra. .Hibridación y Lavado. Etapa 3 . .Revelado: Análisis de la Imagen.ETAPAS Etapa 1 .Almacenamiento y análisis de los resultados .Fabricación Etapa 2 .

Fuente Celular . Densidad de integración ⇒ Método de fabricación. Cepa. Bases de Datos LIMS ⇒ Laboratory Information Management System .Protocolos de hibridización. etc.Organismos.Etapa 1 Diseño del tipo y cantidad de material biologico a inmovilizar ⇒ Tipo de Experimento.Condiciones del tratamiento . . Selección de estándares internos ⇒ “Housekeeping” y controles negativos.Protocolos de extracción del RNA .

. P40s.Ejemplos OncoChip: identifica las mutaciones de 6. YeastChip: contiene 4. oncogenes y genes supresores de tumor.) (NIEHS: National Institut of Environmental Health Sciences). etc.000 genes humanos (respuesta a HAP/Dioxinas.514 genes cuya actividad se relaciona con distintos tipos de cáncer (CNIO) ToxiChip: Contiene cerca de 12.824 genes de la levadura.

000 96 .Tecnologías de fabricación Tecnología de fabricación Química fotolitográfica Química digito óptica Litografía fotoresistente Pin & Ring Inyectores piezoeléctricos Permite síntesis “in situ” Capacidad de miniaturización Densidad Máx.000 No No 10-100 µm ---- x 1.000 Sí 20-80 µm x 1. (Ptos/matriz) Sí <10 µm >106 Sí 20 µm 2x106 Sí No 0.5-100 µm 100 µm >106 x 1.000 Microimpresión húmeda Inmovilización en gel XNA on gold Sí 50 µm x 1.

Fotolitografía: Síntesis in-situ .

Robots Piezoeléctricos (Spotted Arrays) .

Robots Piezoeléctricos (Spotted Arrays) .

Preparación para formar una capa uniforme de grupos reactivos químicamente estables.Preparación (coated) de “Slides” (Spotted Arrays) Activación de la superficie y las sondas. para evitar uniones no específicas de las sondas en el soporte. .

Fuentes de variabilidad Fabricación: Síntesis de oligos Oligos truncados Salto de nucleótidos Diferente concentración de oligos o productos de PCR Secuencia de ácidos nucleicos Estructura secundaria Contenidos de G+C Hibridización cruzada Impresión Variación de los pin Orden de la impresión en los “Slide” Plataforma de Array Curvatura de los Glass-slide .

Artefactos que producen variabilidad en los puntos (Spot) Punto negro Punto fuera del centro Punto donut Punto saturado .

Químicos: biotina. Métodos directos: ej. ARN o proteínas). Marcaje de la Muestra (Variable). Métodos indirectos: ej. Extracción y Purificación del Material a Analizar (ADN. Fluorocromos: fluoróforos (Cy3 y Cy5). Amplificación (material genético).Etapa 2: Preparación de la Muestra. .

Marcaje de la muestra (Affymetrix) .

Marcaje de la muestra (Spotted Arrays) .

A partir de este paso el procedimiento de trabajo es prácticamente igual para los chips comerciales y personalizados Hibridizador Lavado Centrífuga .Etapa 2: Hibridización y Lavado.

Etapa 2: Revelado Detección de marcadores fluorescentes: cámaras ccd (couple charge device. dispositivo multiplicador de carga) o escáner láser. .

Revelado: visualización de los datos FORMA NUMÉRICA APOYO DE SOFTWARE INFORMÁTICO IMÁGEN DE 16 BITS .

.Revelado: visualización de los datos condición 1 (chip 1) condición 2 (chip 2) condición m (chip m) gen 1 gen 2 .. gen n .

Fuentes de variabilidad Manipulación de los Array en el laboratorio Tratamiento de las células Polvo. etc. Extracción de la muestra Variabilidad técnica Variabilidad técnica Variabiliadad método de extracción Incorporación y detección del marcador Degradación del marcador durante el almacenamiento Distribución no uniforme de las muestras Temperatura no uniforme de la cámara de hibridización Foco del escáner Fijación de la intensidad del láser Marcaje Hibridización Escaner Hibridización . huellas.

. para obtener información que sea fácil de interpretar.Etapa 3: Análisis de los resultados Extraer las intensidades de las sondas o los radios de cada uno de los puntos de hibridación (blancos .cDNA).

.Análisis de imagen Objetivo: Obtener un valor representativo para cada sonda.

Pasos para el análisis de imagen Establecimiento de la malla conformada por los puntos inmovilizados ⇒ hibridización positiva.Manual o automática. Asignación de las intensidades de cada punto ⇒ relación entre intensidades de c/fluoróforo . Detección y eliminación del ruido de fondo de las señales (tipo de biochip y tipo de marcaje). . centros y coordenadas. Limitación del tamaño de los puntos detectados.

Transformación logarítmica de los datos .

Transformación logarítmica de los datos log rojo/verde: log ratio 1 = sobre-expresado por un factor de 21 = 2 -1 = sub-expresado por un factor de 2-1 =1/2 .

COLOR ROJO: Aumento en la abundancia de mRNA. COLOR GRIS: Ausencia de datos o datos de baja calidad. . COLOR VERDE: Disminución de la abundancia de mRNA de la muestra experimental respecto a la control.Interpretación de los datos COLOR NEGRO: La razon del control/cDNA experimental es igual a 1.

1 1.1 0.3 1.3 1.2 2.8 0.2 0.3 1.2 1.4 1.3 1.5 1. 1.0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 -1 1 -1 gen n ..1 1.2 1.5 0.1 1.2 0.0 0.0 1.5 1..Análisis de Datos de Microarray condición 1 (chip 1) condición 2 (chip 2) condición m (chip m) gen 1 gen 2 .2 1.1 3.0 1.1 0.2 1.3 1.0 1.3 0.4 1.

. permitiendo comparar datos de un array a otro. Existen distintos métodos de normalización. . .Normalización de los datos La normalización trata de corregir el sesgo sistemático de los datos.Housekeeping genes .Técnicas de regresión. Minimiza la variación no biológica entre arrays.Intensidad total.

. PCA: Principal Component Analysis.Comparación de los datos de expresión: representaciones Clusters. Métodos Supervisados: SVM (Super Vector Machine).

Aplicaciones de los Microarray Expresión diferencial de genes: cuantificación simultánea de número elevado de genes y aproximación cualititativa de patrón de expresión. . Diagnóstico clínico genético: teleconsulta mediante biochips. Seguimiento de terapia (identificación de la mejor terapia). Medicina preventiva. Detección de mutaciones y polimorfismos (SNP). Screening y toxicología de fármacos.

Independiente de los resultados histológicos o histoquímicos..817 genes para distinguir entre la leucemia linfoide aguda (ALL) y la leucemia mieloide aguda (AML). fue posible clasificar 36 de los 38 casos “desconocidos” Comparación = cánceri x cáncerj (N2) Ref: Golub et al. 1999 Leucemia linfoide aguda Leucemia mieloide aguda .Ejemplo 1: Cáncer ¿Qué genes están involucrados en diferentes tipos de cáncer? Se utilizaron 6.

2001 .Ejemplo 2: Estados de Desarrollo ¿Qué genes están presentes solamente en estados diferentes de desarrollo normal? Comparición = estadoi x estadoi+1 (N) ¿Qué genes se expresan diferencialmente en el desarrollo de cepas “knock-out”? Comparación = estadoWTi x estadoKOi (N) Resultados a Largo Plazo: Atlas del desarrollo de invertebrados Ref: Brivanlou et al.

Ejemplo 3: Comparación de Tejidos ¿Qué genes caracterizan únicamente a un tipo de tejido? Comparación = tejido X tejido (N2) Resultados a Largo Plazo: Atlas del cerebro del ratón Ref: Barlow et al. 2001 ..

Ejemplo 4: Comparación de células de levadura con y sin plasmidio ¿Qué genes se expresan en forma diferencial? SOD Ref: Laboratorio CIBYB .

CIT ExpressDB y BIGED .ebi.Bases de datos de biochips Categoría Nombre del Programa PEDB .NCGR .AECOM GENEX .Gene Express2.ac. GEO .NCI .org/menus/expression/m enu.Jackson Lab HuGeIndex CBIL .edu/PEDB/ http://www.NCBI ArrayDB .uk/arrayexpress/ http://genomewww4.sigenetics.edu/MicroArray/MDEV/ .geneindex.Whitehead Inst. MIT Glaxo-Wellcome HESI .jax. Univ.washington.Silicon Genetics Stanford BASES DE DATOS DE EXPRESIÓN GÉNICA Y/U OBTENIDOS CON BIOCHIPS Genelogic .edu/ExpressDB/ Fuente http://chroma. NHGRI www.Gene expression database .med. Pennsilvania ChipDB .Genexpress DDBJ RZPD RAD .stanford.org http://genex.Seattle Array Express .Prostate Expression Database.ILSI & S.EBI cDNA microarray database . of Washington .Harvard MAT .B.Gene expression omnibus .com http://arep.shtml http://www.mbt.Univ.harvard.informatics.000 GXD .

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