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Laboratorio No.

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN CLARA DE HUEVO.

Luisa Fernanda Santafé Casas, Código 20072140051; Diana Marcela Santana


Martínez, Código 20072140052.

Marco Teórico

Como ya sabemos las proteínas son macromoléculas compuestas por cadenas de


aminoácidos, el orden en el cual estos aminoácidos se ensamblan varía según la
proteína que estemos analizando.
Podemos hablar d diferentes tipos de estructuras de las proteínas en las cuales
encontramos:
La estructura primariaque es la secuencia de los residuos de aminoácidos
enlazados covalentemente, describe la estructura lineal de la proteína. Dicho de
otra forma es:

“el esqueleto covalente de la cadena polipeptidica y establece de modo


especifico la secuencia de sus restos de aminoacidos”
(Lehninger, 2001)

La estructura secundaria nos muestra que tipo de ordenamiento tienen los


aminoácidos en el espacio. Existen dos formas básicas para estructura secundaria:
a. Alfa-helice
b. Beta-lamina
c. También existen secuencias que no alcanzan una estructura secundaria bien
definida y se dice que forman enroscamientos aleatorios. (loops)

“ se refiere al ordenamiento regular y periódico en el espacio de las cadenas


polipeptidicas a lo largo de una dirección”

(Lehninger, 2001)

La estructura terciaria esta representada por los superplegamientos y


enrollamientos de la estructura secundaria, constituyendo formas tridimensionales
geométricas que se mantienen por enlaces fuertes (puentes disulfuro entre dos
cisteínas) y otros débiles (puentes de hidrógeno; fuerzas de Van der Waals;
interacciones iónicas e interacciones hidrofóbicas).

(Horton, 1995)

No todas las proteínas llegan a formar estructuras terciarias. En estos casos


mantienen su estructura secundaria alargada dando lugar a las llamadas proteínas
filamentosas, que son insolubles en agua y disoluciones salinas siendo por ello
idóneas para realizar funciones esqueléticas. Entre ellas, las más conocidas son el
colágeno de los huesos y del tejido conjuntivo; la -queratina del pelo, plumas, uñas,
cuernos, etc.; la fibrina del hilo de seda y de las telarañas y la elastina del tejido
conjuntivo, que forma una red deformable por la tensión.
Como en este laboratorio trabajamos con albumina de igual forma mencionaremos
algo de historia.

En el Siglo XIX, el químico Holandés Gerardous Johannes Mulder investigaba las


propiedades de las albúminas y encontró que estas contenían Carbono, oxigeno,
nitrógeno e Hidrogeno. En 1838 el científico sueco Jöns Berzelius sugirió que estas
sustancias deberían denominarse como proteínas, que significa lo primero, ya que
sospechaba que bebían ser las más importantes sustancias biológicas. Las
siguientes son funciones que tienen las proteínas en las funciones biológicas:

1. Muchas proteínas funcionan como catalizadores bioquímicos que se


reconocen como enzimas. Las enzimas catalizan casi todas las reacciones
que se efectúan en el organismo de los seres vivos.
2. Las proteínas pueden fijar a otras moléculas a fin de participar en su
almacenamiento y transporte. Ej. Hemoglobina transporta hierro.
3. Las proteínas estructurales proporcionan a las células soporte mecánico y
forma por consiguiente a los tejidos y los organismos.
4. Conjuntos de proteínas ensambladas que pueden realizar trabajo mecánico,
por ejemplo, el movimiento de los flagelos, la separación de los cromosomas
en la mitosis y la contracción de los músculos.
5. Algunas proteínas son hormonas.
6. Las proteínas de los ribosomas son importantes para decodificación de la
información en las células.
7. Algunas funcionan como inmunológicas, ayudando al sistema inmune.

(Horton, 1995

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION

La desnaturalización de una proteína se refiere a la ruptura de los enlaces que


mantenían sus estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria, conservándose
solamente la primaria. En estos casos las proteínas se transforman en filamentos
lineales y delgados que se entrelazan hasta formar compuestos fibrosos e
insolubles en agua. Los agentes que pueden desnaturalizar a una proteína pueden
ser: calor excesivo; sustancias que modifican el pH; alteraciones en la
concentración; alta salinidad; agitación molecular; etc. El efecto más visible de éste
fenómeno es que las proteínas se hacen menos solubles o insolubles y que
pierden su actividad biológica.
La mayor parte de las proteínas experimentan desnaturalizaciones cuando se
calientan entre 50 y 60 ºC; otras se desnaturalizan también cuando se enfrían por
debajo de los 10 a 15 ºC.
La desnaturalización puede ser reversible (renaturalización) pero en muchos casos
es irreversible.)

ESPECTRO FOTOMETRIA

La espectrofotometría es un método que nos permite identificar y cuantificar


sustancias puras o en mezclas a partir de la luz absorbida por un determinado
sistema químico, todo esto llevado a cabo gracias a un espectrofotómetro. El cual
es un instrumento que proyecta un haz de luz monocromática a través de una
muestra y mide la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra,
comparando la longitud de onda emitida por el espectro con la que llega al
fotodetector.

(Del Pozo, 2007)


El espectro UV-visible de una molécula, se obtienen midiendo la absorción de la luz
de una muestra en función de la longitud de onda empleada. Resultando en un
espectro de líneas característico para cada molécula, lo cual sirve para identificarlas
a manera de una huella digital.
Un espectro de absorción puede servir para la identificación de una molécula
porque la absorción de una longitud de onda depende de los grupos funcionales o el
arreglo de átomos en la molécula. Las medidas cuantitativas en espectrofotometría
son dadas apartir de la Ley de Lambert-Beer.

A = am l c ó I = I0 e - A

Donde: A = Absorbancia.
Io = Intensidad de la luz irradiada a la muestra.
I = Intensidad de luz transmitida a través de la muestra.
am = Coeficiente de Absorción. (E)
l = Longitud del camino recorrido de la luz a través de la cubeta.
c = Concentración del material absorbido en la muestra.
El coeficiente de absorción o extinción es una constante que define la
eficiencia de absorción de una molécula en una longitud de onda específica. Las
unidades de E dependen de las unidades del ancho de la muestra y de la
concentración de ésta. Si la concentración es expresada en molaridad entonces E
será coeficiente de absorción molar y si es expresado en g/litro E será coeficiente de
absorción específica y si la concentración es expresada en % w/v, entonces el
coeficiente de absorción está dado como E %. Al tener 2 compuestos A y B con
concentraciones [A] y [B] y coeficientes de absorción am1 y am2 respectivamente, se
tiene que las absorbancias individuales en cada caso son:

Compuesto A
L

I0 I
1 am1 A = am1 L [A]

I = Io e - A = Io e -am1 L [A]

Compuesto B
L

I0 I

2 am2 A’ = am2 l [B]

I = Io e - A’ = Io e - am2 L [B]

Si ahora mezclamos los compuestos A y B y los ponemos en una cubeta de ancho


2L, suponiendo que ambas soluciones no interactúan, la situación es equivalente
a tener los compuestos A y B separados en sus cubetas originales cada uno muy
junto al otro (o en todo caso el aire que los separa y el material de las cubetas no
absorbe algo significativo), de manera que la absorbancia de la mezcla la podemos
calcular como la absorbancia efectiva luego de que la luz atraviesa las 2 cubetas.

A B

I0 Io’ I

1 2

I0’ = I0 e - a m 1 L [A]
I = I0 e - am1 L [A] e - am2 L [B]
I = I0 e - (A + A’) = Io e - Atotal

De esta manera se demuestra que la absorbancia total (de la mezcla) si se la


pone en una cubeta de ancho 2L es sencillamente la suma de las absorbancias
individuales. Obviamente si la mezcla se vierte en una cubeta de ancho L, la
absorbancia total es igual a la semisuma de las absorbancias individuales { ( A+ A’)
/ 2 }.
En caso de que se agregen diluciones de cada uno de los compuestos, (por
ejemplo una dilución “a” del compuesto A, y una dilución “b”del compuesto B, se
tiene que la absorbancia observada en una cubeta de ancho 2L, es sencillamente
aA + bA’.

I = I0 e - a (am1 L [A]) e - b(am2 L [B]


I = I0 e - (aA + bA’) = I0 e- Atotal
Atotal = a A + b A’

Obviamente en caso de verter la mezcla con las mismas diluciones “a” y “b”, en
una cubeta de ancho L, se tendría que la absorbancia total sencillamente es
(aA+bA’) / 2.
Objetivos

1. Separar mediante procesos químicos proteína de clara de huevo.

2. Realizar pruebas comunes para la identificación de proteínas en el


laboratorio

3. Determinar la acción que tiene el pH, el calor, los metales pesados sobre las
proteínas.

MATERIALES

Materiales Reactivos

2 pipetas Disoluciones de albúmina de 2 y 10


mg/ml)
Pipeteadores
NaOH 2.5N
2 Beacker
Acido tricloroacético 10 %
Lamina de calentamiento
Acetona
Pinzas para tubo
Acetato de plomo 0.2 M
Espectrofotómetro
Reactivo de Biuret.
Cubetas
Tampon fosfato pH, 10mM
Pipetas Pasteur

Agitador de vidrio

METODOLOGIA

1. Se toma el huevo y se le hace extaccion de la albumina (clara).


2. Se pone la clara en un beaker y la yema en otro diferente.
3. Se toman 2 ml de albumina con una pipeta y se diluyen en 20 ml de agua
destilada para evitar la contaminación.
4. Tomamos 6 tubos de ensayo y ponemos en cada uno 2 ml de la solución
anterior (albumina más agua).
5. a cada tubo le realizamos el siguiente procedimiento:

TUBO PROCEDIMIENTO
1er. tubo de ensayo Se pone al baño de maria
2. tubo de ensayo Se agrega 1 ml de Acido tricloroacético
3er. Tubo de ensayo Se agrega 1 ml de Hidroxido de
Sodio(Na(OH))
4º. Tubo de ensayo Se agrega 2 ml de acetona
5º. Tubo de ensayo 1 ml Acetato de plomo

6. Se toman otros 4 tubos de ensayo y seles agregaban los siguientes


compuestos:

TUBO 7 TUBO 8 TUBO 9 TUBO 10


Albúmina - 0.2 1 2
2mg/ml
Agua destilada 2ml 1.8 ml 1ml -
R. Biuret 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

RESULTADOS

Los resultados correspondientes a cada tubo de ensayo se consignaron en la


siguiente tabla:

TUBO resultado
1er. tubo de ensayo La proteína se desnaturalizo, la solución
de albumina se endurece y pasa de ser
translucido,a blanco solido.
2. tubo de ensayo la proteína se desnaturaliza, cambiando
de un color transparente a un color
blanco en una única fase.
3er. Tubo de ensayo se desnaturalizo la proteína, cambia
bruscamente de pH,
4º. Tubo de ensayo Se desnaturalizó pasa a un color blanco
claro.
5º. tubo de ensayo Toma un color azul claro
6º. Tubo de ensayo Azul claro.
7º.Tubo de ensayo Violeta claro
8º. Tubo de ensayo Violeta

ANALISIS

Tubo 1: Disolución de albúmina 2 mg/ml, al baño de María.


Al poner a calentar nuestro primer tubo de ensayo al baño de Maria al retirarla
después de 20 minutos, la proteína se desnaturaliza, es decir pierde su estructura
inical pasando a ser una estructura primaria o lineal, también se modifico la
solubilidad de la proteína, en consecuencia el moviendo de la proteína es
cambiado, ya no se mueve libremente y hace que se compacte lo que más pueda,
provocando su precipitación, como se observo en el laboratorio. Como la estructura
de la proteína cambio, también cambio su naturaleza y sus propiedades tanto
físicas como químicas, por consiguiente la desnaturalización es irreversible.

“Esto se evidencia cuando en la disolución de albúmina calentada, se


observa un precipitado blanco que no es más que la proteína de la albúmina
desnaturalizada. Se precipita por que la disolución en la que estaba la
proteína fue cambiada, en este caso por el aumento de calor y su
estabilidad en la misma se ve alterada provocando la precipitación.”
(Peña, 2004)

Tubo 2: Disolución de albúmina 2 mg/ml con 1ml de acido tricloroacético.

La proteína igualmente se desnaturaliza, cambiando de un color


transparente a un color blanco en una única fase.

Al colocar un acido en la disolución, (en este caso el acido


tricloroacético) el pH del medio cambia provocando en la proteína,
cambios en el patrón de iotizaciónde los grupos carboxilo y amino en
las cadenas laterales de los aminoácidos, provocando una
desorganización y una inestabilidad en las atracciones o repulsiones
iónicas, que contribuyen a la formación de una estructura terciaria
normal. al agregar el acido, modifica el punto isoeléctrico de la proteína, es decir
cambia sus valores netos de cargas que la mantiene estable haciendo que su
conformación se vea alterada y por consiguiente se desnaturalice.

(Peña, 2004)

Tubo 3: Disolución de albúmina 2 mg/ml con 1ml de hidróxido de sodio.


Para este caso se le agrego a la disolución de albumina 2 ml de
hidróxido de sodio, luego de lo cual, se desnaturalizo la proteína
por lo mismo que ocurre en el caso anterior, cuando el pH de una
solución donde se encuentra inmersa la proteína cambia
bruscamente de pH, las interacciones entre las cadenas laterales
de aminoácidos básicos y ácidos se ven afectadas, por que
desactiva la proteína y las interacciones iónicas se ven afectadas.
Lo que ocurre en esta desnaturalización con relación a la de temperatura es que
algunas veces cuando la desnaturalización ocurre en medios ácidos y alcalinos,
puede ser reversible es decir que las interacciones entre las cadenas laterales de
aminoácidos ácidos y básicos se pueden restablecer y la proteína vuelve a su
estado original.

Tubo 4: Disolución de albúmina 2 mg/ml con 2 ml de acetona.

Los solventes organicos, como la acetona, el de las proteinas, porque en su


presencia disminuye la capacidad de los solventes acuosos para separa y
solubilizar a los grupos cargados de la proteinas

Tubo 5: Disolución de albúmina 2 mg/ml con 2 ml de acetato de plomo

Se precipito desnaturalizandose la proteína ya que reacciona con los metales


pesados en este caso el Plomo.

Tubos 7, 8, 9 y 10 Biuret

En el tubo 10 dio mas fuerte el color ya que hay mayor densidad de proteína
albumina

Los niveles de absorvancia están dados asi:

Tubo Concentraci Absorbanc


ón albumina ia
Tubo nº7 0 0
Tubo nº8 0.2 0,016
Tubo nº9 1 0,04
Tubo nº 10 2 0,086
CONCLUSIONES

– En la precipitación de las proteínas por metales pesados se realizó el


experimento con la albúmina ya que las proteínas cuando se encuentran en
solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar
con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinados
insolubles

– En el experimento (Biuret) hace que cambie de color la solucion indicando


que poseía 2 grupos carbamino unidos directamente o a través de un solo
átomo de carbono o nitrógeno formando un complejo de coordinación entre
los iones Cu2+y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que
forma parte de los enlaces peptídicos provocando el cambio de coloración
ya fuera violeta o rosado.

– La reacción xantroproteica es un método que se puede utilizar para


determinar la cantidad de proteína soluble en una solución. El reactivo del
biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del
péptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia. El
espectrofotómetro se puede entonces utilizar para medir la intensidad del
color que se produjo. Mientras más cantidad de proteína esté presente en la
solución, más oscuro es el color.

CUESTIONARIO

1. para desproteinizar el plasma sanguíneo ¿qué seria mejor adicionar al


mismo, acido tricloroacetico o hidróxido sódico?
2. Los ácidos grasos van unidos a la albúmina que equivale a un 50% del
plasma.
los lípidos son buenos disolventes en la acetona
“Son biomoléculas orgánicas formadas básicamente por carbono e
hidrógeno y generalmente también oxígeno; pero en porcentajes mucho más
bajos. Además pueden contener también fósforo, nitrógeno y azufre.”
(Briceño, 1999)

Es un grupo de sustancias muy heterogéneas que sólo tienen en común


estas dos características:
Sin insolubles en agua.
Son solubles en disolventes orgánicos como acetona, alcohol, éter,
cloroformo y benceno etc.”

3. Da un color azul claro. El tubo Blanco con el reactivo y agua era de un color
celestito pero mucho más claro, porque el reactivo es de ese color. Al
mezclarlo con las muestras si se hace mucho más intenso
4. Es mas sensible hallar con Biuret ya que el análisis de Bradford se ha convertido
en el método preferido para cuantificar la proteína en muchos laboratorios. Esta
técnica es más simple, más rápidamente, y más sensible que el método de Lowry.
Además, en comparación con el método de Lowry, está conforme a menos
interferencia por los reactivo comunes y los componentes sin proteínas de muestras
biológicas, En contraste, la forma azul más aniónica del tinte, que ata a la proteína,
tiene un máximo de la absorbencia en 590 nm mientras que la de biuret es de 400nm.

BIBLIOGRAFIA
Campbell Mary k. Bioquimica. Editorial Thompson internacional. Estados Unidos
Traducido en Mexico. Páginas 41- 51. Cápitulo 2. 2005
Briceño, Carlos, Rodríguez Lilia. Quimica Organica e inorgánica Editorial Educativa
ltda. Colombia. Páginas 520-521. Capitulo 2. . 1999.

LEHNINGER, A.L.. NELSON, D.L. y COX, M.M. Principios de Bioquímica. Omega


3ª Edición. (2001)

Del Pozo. R, Texto guía de Bioquímica Medicina, volumen I, Universidad Católica


de la Santísima Concepción, Facultad de Medicina, 2007 disponible en
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/