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UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES


ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES DEPARTAMENTO DE SILVICULTURA

ELABORACIN Y EVALUACIN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE Melia azedarach L. COMO INSECTICIDA NATURAL

Memoria para optar al Ttulo Profesional de Ingeniero Forestal

DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS

Profesores Guas: Ingeniera Forestal, Dra. Amanda Huerta Fuentes Bioqumico, Dr. Italo Chiffelle Gmez

SANTIAGO CHILE 2005

UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS FORESTALES ESCUELA DE CIENCIAS FORESTALES DEPARTAMENTO DE SILVICULTURA

ELABORACIN Y EVALUACIN DE EXTRACTOS DEL FRUTO DE Melia azedarach L. COMO INSECTICIDA NATURAL

Memoria para optar al Ttulo Profesional de Ingeniero Forestal

DIEGO REINALDO LIZANA ROJAS

Calificaciones: Prof. Gua Dra. Amanda Huerta F. Prof. Gua Dr. Italo Chiffelle G. Prof. Consejera Sra. Mara Teresa Serra V. Prof. Consejero Dr. Jaime Araya C.

Nota 7,0 7,0 7,0 7,0

Firma

SANTIAGO CHILE 2005

A mis padres por su apoyo, entrega y educacin entregada. Son inigualables. A mi hermana por su apoyo constante y por darme a mis dos primeras princesas. A mi novia Paula, y por nuestro futuro. A todos aquellos que creen en s mismos, que tienen ambiciones y sueos.

AGRADECIMIENTOS Agradezco a todos aquellos que fueron parte directa o indirecta de esta memoria, principalmente a: Mis profesores guas, Amanda Huerta e Italo Chiffelle, quienes me ensearon que un profesor gua no solo revisa y califica, sino que aconseja y escucha, respetando todas las ideas y opiniones que el memorante pueda tener. Su incentivo y responsabilidad fueron fundamentales para el desarrollo y pronto termino de este estudio. Laboratorio de Qumica, a la seora Julia y especialmente a Tania quienes me aguantaron en el laboratorio y disfrutaron de la comida que les preparaba a mis moscas. Laboratorio de Biodeterioro y Preservacin, en especial a Luis Fras por su ayuda en distintas etapas de esta memoria. Mis profesores consejeros por su apoyo y consejo preciso que permitieron el desarrollo normal de esta memoria. A mis fieles amigos, Gustavo, Techi, Gabi chica, Gabi grande, Andrea, Carola, Chupones, y todos aquellos que confiaron en m y me apoyaron en todo momento.

INDICE 1. INTRODUCCIN ............................................................................................................ 10 2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 11 2.1. 2.2. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. Objetivo general.................................................................................................... 11 Objetivos especficos............................................................................................ 11 Insecticidas sintticos y la proteccin ambiental................................................. 12 Clasificacin de los insecticidas .......................................................................... 13 Ventajas y desventajas de los insecticidas naturales ......................................... 14 Persistencia de los insecticidas naturales........................................................... 15 Especies vegetales con propiedades insecticidas .............................................. 15 Caractersticas de un insecticida ideal ................................................................ 16 Antecedentes generales sobre Melia azedarach ................................................ 16 Descripcin botnica y caractersticas ecolgicas...................................... 16 Propiedades insecticidas ............................................................................. 18

3. REVISIN BIBLIOGRFICA .......................................................................................... 12

3.7.1. 3.7.2. 3.8. 4.1. 4.2.

Antecedentes generales sobre Drosophila melanogaster .................................. 21 Materiales............................................................................................................. 22 Mtodo ................................................................................................................. 23 Obtencin de los frutos ................................................................................ 23 Anlisis proximal .......................................................................................... 24 Elaboracin de los extractos........................................................................ 25 Evaluacin de la eficacia del insecticida ..................................................... 25 Anlisis de polifenoles ................................................................................. 26

4. MATERIALES Y MTODO............................................................................................. 22

4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 4.2.4. 4.2.5. 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 6.1. 6.2.

5. RESULTADOS................................................................................................................ 28 Caracterizacin fsica y qumica de los frutos de Melia azedarach .................... 28 Propiedades insecticidas del producto ................................................................ 29 Evolucin de la mortalidad de Drosophila melanogaster.................................... 32 Anlisis de polifenoles ......................................................................................... 34 Caracterizacin fsica y qumica de los frutos de Melia azedarach .................... 38 Propiedades insecticidas del producto ................................................................ 38

6. DISCUSIN .................................................................................................................... 38

6.3. 6.4.

Tendencia de mortalidad de Drosophila melanogaster ...................................... 41 Anlisis de polifenoles ......................................................................................... 41

7. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 42 8. BIBLIOGRAFA ............................................................................................................... 44 APNDICE 1. Anlisis Estadstico 1 .................................................................................. 50 APNDICE 2. Anlisis Estadstico 2 .................................................................................. 54 ANEXO 1. Medio de cra de Drosophila melanogaster....................................................... 56

INDICE DE CUADROS Pgina CUADRO 1: Compuestos fenlicos patrones y recta de calibracin utilizada. CUADRO 2: Caracterizacin del fruto de M. azedarach. CUADRO 3: Anlisis proximal segn el estado de madurez del fruto de M. azedarach. CUADRO 4: Mortalidades promedio de D. melanogaster por efecto de extractos de frutos de M. azedarach de dos estados de madurez, solventes y concentraciones. CUADRO 5: Resultados de la prueba Probit sobre la mortalidad de D. melanogaster ante extractos del fruto de M. azedarach en etanol y agua para el EM1. CUADRO 6: Compuestos fenlicos de bajo peso molecular en los frutos de M. azedarach. 35 31 29 27 28 28

INDICE DE FIGURAS Pgina FIGURA 1: FIGURA 2: FIGURA 3: FIGURA 4: Melia azedarach. A) rbol; B) Frutos en racimo. Estructuras moleculares. A) Meliartenin; B) Azadirachtina. Frutos de M. azedarach. A) Estado verde; B) Estado maduro. Representacin grfica de la prueba Probit de la mortalidad de D. melanogaster frente a distintas concentraciones de extractos del fruto de M. azedarach con dos solventes. FIGURA 5: Mortalidad de D. melanogaster con extractos en etanol y agua de los frutos de M. azedarach a distintas concentraciones. A) 3.200 ppm; B) 7.500 ppm y C) 10.700 ppm. FIGURA 6: FIGURA 7: Cromatografa por HPLC de la harina obtenida del fruto EM1 y EM2 de M. azedarach. Espectros correspondientes a los compuestos fenlicos de M. azedarach. 36 35 33 17 19 22 32

RESUMEN
Se elaboraron extractos insecticidas a base dos estados de madurez del fruto de Melia azedarach L. con los solventes etanol y agua. Las concentraciones ensayadas correspondieron a 3.200, 7.500 y 10.700 ppm del extracto, el cual fue incorporado en la dieta de Drosophila melanogaster a fin de determinar la efectividad del producto y su DL50. Con el propsito de caracterizar el fruto en cuestin se le realiz un anlisis proximal, el cual permiti establecer diferencias fsicas y qumicas entre los dos estados de madurez estudiados. Los experimentos realizados fueron satisfactorios desde el punto de vista de efectividad de los extractos, sin importar solvente ni concentracin, logrndose mejores resultados a concentraciones ms elevadas. La DL50 correspondi a 2.071 y 4.382 ppm para etanol y agua, respectivamente. Adicionalmente, se realiz un anlisis preliminar de polifenoles, donde se intent identificar los principales compuestos causantes del efecto insecticida del fruto de M. azedarach, encontrndose 14 compuestos, de los cuales tres corresponderan a flavonoides: una catequina y dos kaempferol. Se recomienda en futuras investigaciones realizar pruebas de campo, para ver el efecto de los extractos en condiciones reales de aplicacin y continuar con la bsqueda de los compuestos qumicos del fruto de M. azedarach, a fin de contribuir al control integrado de plagas.

PALABRAS CLAVES Melia azedarach, insecticida botnico, insecticida vegetal, insecticida natural, control integrado de plagas.

SUMMARY
Insecticide extracts were elaborated based on two states of maturity of the fruit Melia azedarach L. using ethanol and water as solvents. The tried concentrations correspond to 3,200, 7,500 and 10,700 ppm of the extracts, which was added to Drosophila melanogaster diet by means of determining the product effectiveness and his LD50. With the objective to characterize the fruit in question, an approximate analysis was made, which allows us to establish the physical and chemical differences between the two states studied. The experiments done were satisfactory to the extract effectiveness point of view, without concerning the solvents concentration, resulting in a better outcome with higher concentrations of the extract. The LD50 correspond to 2,071 and 4,382 ppm for ethanol and water, respectively. In addition, a preliminary substance analysis was made, where the objective was to identify the main cause of the insecticide effect of the M. azedarach fruit, finding 14 compounds, which three of them correspond to a flavonoides, another to a catequina and other two were kaempferol.

It is recommended in future investigations to make in-field tests, in order to see the effect of the extracts in real application environments, and continue the search for the chemical compounds from the M. azedarach fruit, to finally play an integral roll in the control of plagues.

KEYWORDS Melia azedarach, botanical insecticide, vegetal insecticide, natural insecticide, integrated control of plagues.

1. INTRODUCCIN El sector forestal chileno orienta el destino de sus productos principalmente hacia mercados externos cada vez ms exigentes, obligando a mejorar la productividad y calidad del recurso. Adems, el intercambio producido por la apertura de mercados ha trado consigo el incremento de las probabilidades de ingreso de nuevas plagas al pas, lo que ha significado un endurecimiento en la aplicacin de medidas sanitarias. En este contexto, el control de plagas con insecticidas qumicos ha sido eficiente en la mayora de los casos. Sin embargo, su uso ha causado una serie de problemas: niveles altos de residuos en los alimentos, desequilibrio biolgico por la eliminacin de los enemigos naturales, contaminacin ambiental, intoxicacin de personas y surgimiento de poblaciones de insectos resistentes. Con el fin de disminuir el uso de insecticidas sintticos y apoyar el control de plagas, se propone una bsqueda de insecticidas botnicos que resulten ms saludables, ecolgicamente aceptables y eficientes, en un retorno a una prctica antigua, pero con nuevas tecnologas. Estos compuestos son de naturaleza biodegradable y presentan una seguridad relativa para los organismos benficos, evitando el surgimiento de poblaciones de insectos resistentes. Existen estudios preliminares que indican que los extractos de hojas y semillas del rbol melia, Melia azedarach L., (Meliaceae), causan una disminucin en el consumo de alimento, con efecto disuasivo que evita la accin de los fagoestimulantes de la dieta en insectos con aparato bucal mordedor. Adems, estos productos no son txicos para el hombre, animales domsticos ni insectos benficos; son repelentes, inhiben la alimentacin del insecto; no daan a los cultivos ni causan mal gusto en los productos. Esta investigacin es un estudio preliminar de la elaboracin de extractos naturales del fruto de M. azedarach como agentes insecticidas y la evaluacin de su eficacia contra Drosophila melanogaster Meigen, a travs de bioensayos de laboratorio, con el fin de contribuir al manejo integrado de plagas.

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2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo general Evaluar la capacidad insecticida de extractos naturales del fruto de M. azedarach a travs de bioensayos de laboratorio.

2.2. Objetivos especficos 2.2.1 Caracterizar distintos estados de madurez del fruto a nivel fsico y qumico. solventes y concentraciones. 2.2.3. Evaluar la eficacia del insecticida natural en distintos estados de desarrollo del fruto mediante bioensayos de laboratorio con D. melanogaster.

2.2.2. Elaborar los extractos de dos estados de madurez del fruto, con diversos

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3. REVISIN BIBLIOGRFICA 3.1. Insecticidas sintticos y la proteccin ambiental En general, los insecticidas son sustancias con propiedades biocidas para los insectos. Su efecto sobre la fisiologa de estos organismos es complejo y tiene una serie de reacciones fsico-qumicas que afectan a una especie de insecto en particular (Romanyk y Cadaha, 2002). Aunque los plaguicidas son herramientas importantes de control, su uso ha demostrado tambin consecuencias negativas, como el desarrollo de resistencia a los productos fitosanitarios por plagas y enfermedades, aparicin de nuevas plagas, eliminacin de la fauna benfica y contaminacin ambiental y de cultivos alimenticios (Carrero, 1996; Niemeyer, 1996; Villalobos, 1996). El uso de extractos de plantas como insecticidas data de la poca del Imperio Romano. Sin embargo, slo a partir de los aos 30 del siglo recin pasado se produjeron los avances ms importantes en el uso de los insecticidas como: nicotina, rotenona, cuasina y piretrinas (Villalobos, 1996, Rodrguez et al., 2003). Estos avances fueron seguidos por el desarrollo de los compuestos orgnicos de sntesis, incluyendo insecticidas clorados, fosforados y carbamatos, algunos de los cuales han sido retirados del mercado por tener efectos no deseados en el ambiente. En la actualidad existen centenares de materias activas y millares de productos tcnicos que se encuentran registrados en diversos pases, y hay una tendencia hacia la elaboracin de productos cada vez ms especficos, cuyo objetivo es alterar slo alguna de las fases del ciclo del insecto, como por ejemplo, inhibir la formacin de la cutcula, alterar la muda o la actividad hormonal juvenil, entre otros (Villalobos, 1996). Las investigaciones destinadas a solucionar estos problemas han apuntado a la bsqueda de productos naturales capaces de apoyar la labor de los insecticidas sintticos, disminuyendo sus efectos negativos (Pizarro y Diana, 2002).

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3.2.

Clasificacin de los insecticidas Los insecticidas pueden dividirse de acuerdo a sus componentes qumicos y

propiedades, en la siguiente clasificacin (Carrero, 1996; Mota-Snchez et al., 2003): Insecticidas inorgnicos: Los productos inorgnicos son de origen mineral y carecen, por ende, de carbono. Comnmente contienen arsnico, cobre, boro, mercurio, azufre, estao o zinc. Actualmente se usan principalmente en el control de enfermedades de las plantas. Sin embargo, no son especficos y pueden ser txicos a una gran variedad de organismos; es decir, son de amplio espectro. Estos productos son generalmente menos efectivos que muchos de los compuestos orgnicos. Algunos ofrecen la ventaja de tener una toxicidad aguda relativamente baja en las personas, aunque aquellos que contienen plomo, mercurio y arsnico causan serios problemas de salud y contaminacin del medio ambiente, por lo que su uso se ha prohibido. Insecticidas orgnicos: Los insecticidas orgnicos contienen carbono y pueden ser

tanto de origen natural como artificial. Tambin contienen oxgeno, nitrgeno, fsforo, azufre, y otros elementos. La mayora de los insecticidas usados en la actualidad son compuestos orgnicos. Cabe sealar que orgnico no quiere decir natural, y como sustancias txicas, estos productos deben usarse con precaucin. Insecticidas microbiales: Los insecticidas microbiales son un grupo distinto de

productos para el manejo de plagas y estn constituidos por bacterias, virus u hongos; capaces de causar enfermedades en ciertas plagas. Aunque estos organismos pueden generarse en forma natural, tambin son producidos a gran escala e introducidos intencionalmente en cantidad suficiente, de manera que garanticen un alto nivel de control de la plaga en cuestin. especies. Son altamente especficos, y por ello no afectan a otras Hasta el momento slo un pequeo nmero de estos insecticidas ha sido

registrado para su uso. El ms conocido es Bacillus thuringiensis Berliner, bacteria que ha sido usada efectivamente contra larvas de distintas especies, especialmente lepidpteros. Insecticidas vegetales: Los insecticidas orgnicos son derivados o extrados

directamente de plantas y corresponden principalmente a mecanismos de defensa frente a posibles daos por insectos.

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3.3.

Ventajas y desventajas de los insecticidas naturales Al usar compuestos vegetales se debe ser cuidadoso y no depender de esta

tctica de manera nica y exclusiva para el control de plagas, ya que se podran producir efectos no deseables para la salud humana o bien generar resistencia, de manera similar a lo que ocurre con los insecticidas sintticos, los de mayor toxicidad para el ser humano. Por tanto, estos insecticidas son una herramienta ms dentro de un sistema de Manejo Integrado de Plagas. Entre las ventajas y desventajas de un insecticida natural es posible mencionar las siguientes (COLPROCAH, 1996; Caarte, 2000; Maggi, 2004): Ventajas Material renovable. Biodegradable. Alta disponibilidad de material. Bajo costo. Menor efecto negativo sobre enemigos naturales y otros organismos benficos. No contaminante. Bajo riesgo a la salud humana. Mantenimiento del equilibrio de la fauna entomolgica. Desventajas Poca informacin en pruebas de toxicologa. Variabilidad en cantidad del ingrediente activo. Mayor requerimiento de personal calificado y mano de obra. Requiere equipo de procesamiento. Costo de oportunidad. No muy buena estabilidad en los extractos. Otra gran ventaja de los insecticidas orgnicos, que paradjicamente Isman (1994) defini como desventaja, se refiere a la inestabilidad de los componentes dentro de la planta debido a factores climticos; si dos extractos tienen los mismos compuestos, no necesariamente estn en las mismas concentraciones, y por ello, los insectos no son

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sometidos siempre a la misma presin y por ende es muy difcil que desarrollen resistencia. 3.4. Persistencia de los insecticidas naturales Los compuestos vegetales no persisten mucho tiempo en el medio y sus parmetros farmacocinticos son poco txicos a organismos superiores (Isman, 1994), y causan menos daos al medio ambiente (Lemma, 1973). La actividad de los insecticidas naturales perdura normalmente entre 4 a 15 das bajo condiciones de campo. En general, estos productos no presentan efectos nocivos para artrpodos benficos debido a su especificidad contra larvas de lepidpteros. Esto constituye una ventaja en programas de proteccin donde se necesita una poblacin alta de insectos benficos para combatir otras plagas (Caarte, 2000).

3.5.

Especies vegetales con propiedades insecticidas Se ha estudiado diversa familias vegetales con propiedades bioinsecticidas. Entre

ellas destacan Meliaceae, Asteraceae, Fabaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Apiaceae, Brassicaceae, Euphorbiaceae, entre otras, de las que se han aislado algunos compuestos activos (Villalobos, 1996). Los factores climticos influyen en la acumulacin de compuestos qumicos en los rboles y sus estructuras morfolgicas. Las regiones tropicales tienden a favorecer la acumulacin de sustancias qumicas en los vegetales, por lo que las concentraciones menores de un producto elaborado con material originario de esas zonas geogrficas producen mejores resultados que los elaborados en otras latitudes (Espinosa y Villaseor, 2002). Dos especies importantes de plantas con propiedades insecticidas pertenecen a la familia Meliaceae, el rbol neem, Azadirachta indica L y el neem chino, Melia azedarach L. Ambos son nativos de Asia y Australia meridional, y se cultivan principalmente con fines ornamentales desde el siglo XVI. En la actualidad, estas especies se han naturalizado en diversos pases tropicales y subtropicales (Martnez, 1991; Villalobos, 1996). Este estudio se centra en M. azedarach, dada su buena adaptacin en Chile.

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3.6.

Caractersticas de un insecticida ideal Un insecticida no slo debe cumplir con la exigencia mnima de matar una plaga

especfica, sino que debe cumplir una serie de caractersticas para otorgarle la calificacin de insecticida ideal, entre las que destacan (Caarte, 2000): a. b. c. d. e. f. Eficacia para eliminar o disminuir la accin daina de una plaga. Precio adecuado para su aplicacin en dosis correctas tanto en cultivos intensivos como extensivos. Posibilidad de adquisicin permanente. Caractersticas fsico-qumicas adecuadas, que permitan que sea fcilmente aplicado, sin causar daos al equipo ni a las plantas. No comprometer la salud de quien lo aplica. No ser perjudicial para el medio ambiente. Otra caracterstica de un buen insecticida es que el solvente aconsejado para su disolucin, que muchas veces acarrea ms problemas que el propio insecticida, debe permanecer en el medio el tiempo suficiente que permita su ingesta por el insecto, por lo que su grado de volatilizacin debe ser lo ms bajo posible (Rodrguez et al., 2003). Otros factores que ayudan a decidir el solvente ms conveniente son su toxicidad para el ser humano, precio, disponibilidad en el mercado y facilidad de manipulacin (Rodrguez, 1997). 3.7. Antecedentes generales sobre Melia azedarach

3.7.1. Descripcin botnica y caractersticas ecolgicas Melia azedarach fue introducida en Chile con fines ornamentales y se conoce como melia, rbol del paraso, cinamomo o neem chino. Es un rbol caducifolio de unos 10 a 15 m de altura, tronco recto y delgado, con corteza oscura y fisurada, y copa globosa (Hoffmann, 1995) (Figura 1A). Tiene hojas alternas, normalmente bipinnadas, de hasta 60 cm de longitud, con pinnas de 57 fololos peciolados, ovales, ligeramente dentados, de 25 cm de longitud, de color verde oscuro en el haz y ms claro en el envs. Las flores se disponen en panculas axilares, colgantes, numerosas, fragantes, de color

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blanco y violeta, con los estambres reunidos en un tubo central. Florece entre abril y mayo. Frutos drupceos, globosos, de 1 cm de dimetro, amarillo-naranjados al principio, dispuestos en racimos muy ornamentales que permanecen en el rbol todo el invierno, y contienen 45 semillas (Roig, 1974; Martnez, 1991; Pennington y Sarukn, 1998; Fuentes et al., 2001) (Figura 1B).

Figura 1. Melia azedarach. A) rbol; B) Frutos en racimo. Foto: Diego Lizana R.

De su ecologa se ha escrito poco, pero segn descripciones generales de su hbitat es probable que M. azedarach requiera sol directo, pues no es tolerante a la sombra, y se adapta a una gama amplia de condiciones de humedad de suelo (Henderson y Musil, 1984; Henderson, 1991). Entre las caractersticas ambientales ptimas para su desarrollo, la altitud ptima estara en torno a los 500 msnm, con temperatura media de 18C y precipitaciones que promedien anualmente los 500 mm. Esta especie es muy adaptable y puede soportar heladas y perodos de sequa (Flinta, 1960; Niembro, 1986; Martnez, 1991; Von Carlowitz et al., 1991; Pennington y Sarukn, 1998). Melia azedarach se desarrolla en suelos preferentemente podzlicos, con profundidad en torno a 50 cm, de texturas arcillosas, ligeramente arenosas y francas o franco-arenosas, con buen drenaje, tanto en pH cidos, alcalinos o neutros, con materia orgnica abundante (Flinta, 1960; Evans y Rombold, 1984; Martnez, 1991; Von Carlowitz et al., 1991).

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Las hojas cadas de M. azedarach pueden aumentar significativamente la alcalinidad y ceniza del suelo, junto con reducir el nivel de aluminio (Noble et al., 1996). Adems, estas hojas pueden reforzar la concentracin de nitrgeno mineralizable del suelo en una cantidad comparable a un abono nitrogenado con leguminosas (Singh et al., 1996). Melia azedarach florece y fructifica cuando alcanza el tamao de un arbusto. Tiene una alta produccin de frutos y semillas, que persisten a la ltima cada de la hoja. Los frutos son de larga maduracin, venenosos para las personas y algunos otros mamferos. Sin embargo, los pjaros los consumen y dispersan las semillas, aunque a veces se producen intoxicaciones (Burks, 1997). Las semillas de M. azedarach son muy tolerantes al desecamiento, y llegan a sobrevivir hasta con 3,5% de su volumen de humedad normal. 1998). Melia azedarach tambin se reproduce vegetativamente por formacin de brotes desde la raz, capacidad que a menudo permite producir bosquecillos monotpicos densos (Langeland y Burks, 1998). 3.7.2. Propiedades insecticidas Muchas clases de compuestos naturales, tales como grasas, hidratos de carbono, protenas y cidos nucleicos, intervienen en los procesos vitales de las plantas, tales como respiracin, fotosntesis, entre otros. Estos productos naturales, junto con un nmero relativamente pequeo de sustancias anlogas, existen en casi todos los organismos y se denominan metabolitos primarios, y los procedimientos por los cuales se producen se llaman procesos metablicos primarios. La mayora de los organismos vivos, producen cidos grasos corrientes y cidos carboxlicos sencillos (Izco, 1998; Troiani, 2003). Una segunda clase de productos naturales se denominan metabolitos secundarios, los cuales, como su nombre indica, son el resultado del metabolismo secundario, formando parte de procesos no vitales para las plantas. Estos compuestos Adems pueden permanecer viables por perodos prolongados, hasta al menos 26 meses (Hong y Ellis

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son precisamente a los que se adjudica las cualidades insecticidas de las plantas; los grupos ms destacados en esta labor son los flavonoides, terpenoides y alcaloides (Izco, 1998; Troiani, 2003). La actividad insecticida de M. azedarach se encuentra en hojas, tallos, frutos y semillas. De estas estructuras se han extrado, con acetona, agua, alcohol, cloroformo, diclorometano y ter de petrleo, los siguientes compuestos: paraisina, cumarinas, azederacol, meliacarpina, meliacarpinina, melianol, melianona, meliantriol, meliatina, meliatoxina, nimbolida, nimbolidina, nimbolinina, oquinolida, sendanina, toosendanina y vilasinina (Rodrguez, 1999; Gusberti et al., 2000; Padrn et al., 2003). principalmente meliartenin (Figura 2A), limonoide (triterpeno) con Destacan cualidades

antialimentarias, y azadirachtina (triterpeno) (Figura 2B), el mayor compuesto natural antialimentario conocido, proveniente de Azadirachta indica A. Juss (Pimentel, 1995; Carpinella et al., 2002, 2003). A
O HO OH CH3 H O AcO HO H CH3 O OH O CH3

Figura 2. Estructuras moleculares. A) Meliartenin; B) Azadirachtina. Fuente: Maggi, 2004.

La actividad insecticida de M. azedarach se debe a un grupo de triterpenoides biolgicamente activos, que tienen efecto antialimentario; es decir, inhiben la alimentacin de insectos fitfagos mordedores como colepteros y larvas de lepidpteros (Vergara et al., 1997; Gusberti et al., 2000; Carpinella et al., 2003; Maggi, 2004). Los insecticidas naturales actan de manera gradual. Por lo general, ninguna de las especies vegetales insecticidas tiene la accin fulminante de los insecticidas sintticos. La poblacin de insectos no disminuye rpidamente con el uso de insecticidas botnicos. Entre los efectos de los insecticidas naturales en las plagas se encuentran: a) repelencia en larvas y adultos, b) suspensin de la alimentacin, c) reduccin de la movilidad del intestino, d) impedimento de la formacin de quitina, e) bloqueo de la muda en ninfas y larvas, f) reduccin del desarrollo y crecimiento, g) toxicidad en larvas y

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adultos, h) interferencia de la comunicacin sexual en la cpula, i) suspensin de la ovipostura, y j) esterilizacin de adultos. La mayora de los efectos de los insecticidas naturales son fisiolgicos, por lo que el insecto tiene que ingerirlos (Rodrguez, 1998). El efecto del o los compuestos activos de un insecticida vegetal depende de factores genticos, fenolgicos, ambientales, fitosanitarios e incluso la elaboracin y aplicacin del producto. Generalmente no se conoce el modo exacto de accin de estos insecticidas, por lo que se debe mantener una experimentacin constante (Rodrguez, 1998). El mecanismo de accin de la mayora de las substancias provenientes de M. azedarach consiste en inhibir la accin de las oxidasas en el intestino medio, por lo que el insecto inmaduro muere o se convierte en pupa o adulto anormal por deficiencia de nutrientes o interferencia en los procesos fisiolgicos. Esto se traduce en inhibicin de la alimentacin, disminucin del crecimiento y desarrollo, descenso de la tasa metablica relativa, emergencia de adultos deformes, inhibicin de la ovipostura o mortalidad. La inhibicin de la alimentacin ha sido estudiada a travs de la repelencia a la alimentacin, reduccin del consumo, tasa de consumo relativo, proteccin del 95% del rea foliar y descenso de peso. La inhibicin del crecimiento se ha cuantificado por medio del aumento de duracin de la fase larvaria, ndice de crecimiento, concentracin que inhibe el 50% de crecimiento y la tasa de crecimiento relativo (Rodrguez, 1999; Gusberti et al., 2000). Existen varias maneras de cuantificar y comparar la toxicidad de distintos productos qumicos y dosis. Una medida comn es la dosis letal 50, o DL50. Este ndice significa que una dosis determinada es letal para el 50% de los individuos expuestos. Mientras menor es la DL50, mayor es la toxicidad del producto (Rodrguez, 1998). Muoz et al. (1998) estudiaron los efectos de extractos de frutos de M. azedarach, A. indica y piretroides, sobre larvas de tercer estado de la polilla del brote del pino, Rhyacionia buoliana Den. et Schiff., y dedujeron que los extractos de frutos verdes de M. azedarach fueron ms activos (0,0077 ppm), requiriendo menos producto para matar el 50% de los insectos (DL50) en comparacin con el piretroide cipermetrina (0,124 ppm), extractos de frutos maduros de M. azedarach (0,229 ppm) y un preparado comercial de A. indica (Bionim; 0,29 ppm).

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En un estudio de Donoso (1998) sobre los efectos de extractos de A. indica y M. azedarach sobre cuatro hongos fitopatgenos, esta ltima acta sobre los hongos Botrytis cinerea Pres. ex Fr. y Sclerotinia esclerotorium (Lib.) Massee, con un efecto considerable, y caractersticas ms selectivas que A. indica. Como se seal, el principal compuesto causante de la actividad insecticida en M. azedarach corresponde a meliartenin, extrado principalmente de sus frutos, el cual acta como regulador de crecimiento y antialimentario. Sin embargo, la extraccin y aislamiento de este compuesto es difcil y cara (Carpinella et al., 2002; Troiani, 2003). Los intentos por sintetizar el compuesto activo de M. azedarach no han sido satisfactorios debido a la complejidad de la molcula. Las sntesis logradas han sido slo parciales y los hemi-compuestos obtenidos, no tienen actividad biolgica, por lo que se deduce que la bioactividad reside en la molcula completa (Gusberti et al., 2000). 3.8. Antecedentes generales sobre Drosophila melanogaster La mosca del vinagre es pequea (1 a 2 mm), de color ocre y con ojos generalmente rojos. Su vuelo es lento y puede ser localizada fcilmente en frutas maduras en proceso de descomposicin o cerca de recipientes abiertos que contengan vinagre o vino (Godoy, 2001). El perodo medio desde la eclosin de los huevos hasta que D. melanogaster emerge como adulto flucta entre 10 y 15 das a 25C, acortndose bastante en verano, pues en gran medida depende de la temperatura. Las fases de desarrollo pasan por el estado de huevo, que una hembra deposita en un medio apropiado (mezcla cida) y en pocos das se pueden ver larvas diminutas que se alimentan y recorren el recipiente. Estas larvas se sitan a media altura de las paredes del recipiente, donde pasan al estado de pupa, fase en la que permanecen unos das, hasta que la metamorfosis se completa y la mosca adulta sale, vuela e inicia de nuevo el ciclo (Godoy, 2001). Drosophila melanogaster es muy utilizada en pruebas de gentica y ensayos de toxicidad de insecticidas, pues permite hacer bioensayos simples para determinar la DL50 de componentes activos de extractos en un medio cido (Moreno et al., 2000).

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4. MATERIALES Y MTODO 4.1. Materiales El material vegetal utilizado en este estudio fue el fruto de M. azedarach en dos estados de madurez, obtenido desde rboles en el Campus Antumapu de la Universidad de Chile en Santiago, donde se ha establecido como rbol ornamental, pues no existen plantaciones de esta especie. Los frutos colectados se denominaron EM1 y EM2, los cuales presentaban caractersticas de estado verde (Figura 3 A) y maduro (Figura 3 B), respectivamente.

Figura 3. Frutos de M. azedarach. A) Estado verde; B) Estado maduro. Foto: Diego Lizana R.

El anlisis proximal y la elaboracin de extractos de los frutos se hicieron en los laboratorios de Qumica del Departamento de Agroindustria y Enologa de la Facultad de Ciencias Agronmicas de la Universidad de Chile. Para ello se usaron los siguientes equipos y materiales: molino mecnico, extractor Soxhlet, estufa de aire forzado, mufla, centrfuga, colormetro Minolta CR 300, balanzas analticas, frascos de vidrio, lupa, microscopio, reactivos y equipos de laboratorio de vidrio.

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Los ejemplares de D. melanogaster fueron proporcionados por el Laboratorio de Biologa Celular y Gentica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. Los bioensayos con este insecto se llevaron a cabo en el Laboratorio de Entomologa Forestal, Departamento de Silvicultura, Facultad de Ciencias Forestales. El medio de cra fue una mezcla cida (Anexo 1) compuesta de agua, agar-agar, smola (nutrina), levadura seca, Nipagin (fungicida), azcar, nitrato de sodio, fosfato y cloruro de potasio, y sulfatos de magnesio y fierro1. Esta mezcla permiti que el insecto se desarrollara en forma controlada, sin alteraciones que pudieran distorsionar los resultados. Para el anlisis de polifenoles de los frutos se us un equipo de cromatografa lquida de alta resolucin Merck de Hitachi, el cual consta de una bomba Intelligent Pump L-6200, un inyector automtico Autosampler L-7200, un detector de arreglo de fotododos alineados L-7455, y una columna Waters Nova-pak C18 de 3,9mm de dimetro interno por 300 mm de longitud para fenoles de bajo peso molecular.

4.2.

Mtodo El mtodo utilizado en esta memoria consider cuatro etapas: obtencin de los

frutos, anlisis proximal, elaboracin de extractos y evaluacin de la eficacia del insecticida. Adems se hizo un anlisis de polifenoles, no incluido en el proyecto original. 4.2.1. Obtencin de los frutos Los frutos de M. azedarach se obtuvieron a travs de un muestreo aleatorio sobre 37 rboles, seleccionndose 15 ejemplares para la extraccin del material. Los frutos se colectaron al azar desde la copa de los rboles, sin identificar sectores en ella a causa de la heterogeneidad en la maduracin de los frutos, los que se pueden encontrar en distintos estados de madurez dentro de una misma rama. Cada fruto se clasific segn el estado de madurez, obtenido mediante su diferenciacin de color y apariencia externa. Esto permiti seleccionar los dos estados de madurez con los que se trabaj durante el desarrollo de la investigacin (Figura 3).

Sr. Enrique Zrate, Laboratorio de Biologa Celular y Gentica, Facultad de Medicina, Universidad de Chile (Comunicacin personal, 2003).

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De cada estado de desarrollo de los frutos se colect aproximadamente 1 kg. Posteriormente se determin el color a las muestras claramente diferenciadas y rotuladas, utilizando el colormetro bajo el mtodo CIELab, a travs de una medicin triestmulo identificando las coordenadas L*: correspondiente a la claridad (desde el negro al blanco); a*: espectro desde el verde al rojo; y b*: espectro que oscila entre amarillo y azul (Escalona, 1997). Las muestras se secaron a continuacin en una estufa de aire forzado a 37C durante 70 h y luego se molieron en un molino mecnico con un tamiz de graduacin N 60, para obtener la harina que sirvi para los anlisis posteriores. 4.2.2. Anlisis proximal Con una porcin de la harina generada luego de la molienda de los frutos se determin una serie de caractersticas qumicas y fsicas de los estados de madurez estudiados, para as obtener un patrn de referencia para el producto y lograr una mejor caracterizacin del fruto. Rendimiento: se determin la prdida de material producto de la molienda respecto al fruto hmedo. Nmero de frutos por kg: se adapt el mtodo de cuantificacin de semillas por kg (Sandoval y Cabello, 2003). Lpidos: por extraccin con solvente orgnico en extracto Soxhlet (AOAC, 1984). Fibra cruda: se determin en caliente, mediante hidrlisis cida y bsica con cido sulfrico e hidrxido de sodio, respectivamente (AOAC, 1984). Cenizas: se obtuvo mediante incineracin en mufla a 550C hasta obtener la calcinacin total de los componentes orgnicos (color blanco) (AOAC, 1984). Protenas: se determin mediante el mtodo de Microkjeldahl (AOAC, 1984), utilizndose el factor 6,25 para multiplicar el porcentaje de nitrgeno obtenido. Extracto no nitrogenado: se obtuvo por diferencia de anlisis anteriores. Humedad: se determin a travs de secado en estufa de aire forzado a 105C hasta obtener un peso constante (AOAC, 1984).

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4.2.3. Elaboracin de los extractos Los extractos se prepararon con la harina obtenida de los dos estados de madurez del fruto, con tres solventes: agua, agua/etanol y etanol, en tres concentraciones (3.200, 7.500 y 10.700 ppm). stas se determinaron de acuerdo a la solubilidad de la harina en el solvente respectivo. Para ello se secaron muestras de los extractos en estufa de aire forzado, resultando como residuos remanentes la harina capaz de disolverse en el solvente respectivo. Los resultados obtenidos se ajustaron mediante funciones matemticas para identificar la ms adecuada y con ella obtener la concentracin ideal respecto a la DL50. Cabe sealar que el solvente agua/etanol en ensayos preliminares no tuvo el xito esperado por lo que se decidi eliminarlo del anlisis global de este estudio. 4.2.4. Evaluacin de la eficacia del insecticida Para evaluar la eficacia de los extractos del fruto de M. azedarach se utilizaron las variables: estado de madurez del fruto, solubilidad y concentracin del producto. melanogaster en funcin de las concentraciones patrones. Para estos bioensayos se modific el mtodo propuesto por Csares et al. (1997) para un ensayo de toxicidad con moscas de la guayaba (Anastrepha striata Schiner). La mezcla cida descrita en materiales se puso en un frasco de vidrio de 300 mL, que sirvi de alimento a los insectos, la que contena adems el extracto elaborado en base a M. azedarach, segn solvente y concentracin definida para cada tratamiento. Luego se introdujeron 10 moscas adultas (de unos 5 das despus de la emergencia), que se mantuvieron bajo observacin permanente durante la duracin del bioensayo (22 das), contando las moscas muertas y vivas cada dos das, aproximadamente. Su eficacia se evalu mediante bioensayos de laboratorio con ejemplares adultos de D.

El estudio de los dos estados de madurez se hizo por separado, bajo los siguientes modelos, para facilitar la comprensin y anlisis de los datos (Canavos, 1988; Taucher, 1999): A) Modelo de efectos fijos: se utiliz para validar la efectividad del testigo en los bioensayos, para discriminar si el experimento era vlido.

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B)

Diseo bifactorial con tres repeticiones y dos variables (3x2), donde los factores considerados fueron solubilidad y concentracin del extracto. evaluados. Para ambos anlisis estadsticos se utiliz la prueba de rango mltiple de Duncan Este anlisis permiti determinar las diferencias entre los tratamientos y concentraciones

(1955), cuando hubo diferencias estadsticas. Para discriminar el mejor solvente y determinar el estado ms efectivo se compararon los resultados de mortalidad obtenidos con los dos estados de madurez. Para estudiar la evolucin de la mortalidad de las moscas en los solventes y concentraciones de los extractos con el estado de madurez ms efectivo, se hicieron grficos de tendencias hasta obtener modelos tentativos de mortalidad de los insectos. Adems se hizo un anlisis Probit con los mejores resultados a fin de determinar la DL50 (Cabrera, 2000). 4.2.5. Anlisis de polifenoles Para identificar los principales compuestos asociados al poder insecticida se hizo un anlisis de polifenoles para obtener los taninos totales y un anlisis pormenorizado de los compuestos polifenlicos de bajo peso molecular para los dos estados de madurez de los frutos. Taninos totales, mediante la reaccin de Bate-Smith (1981). Anlisis pormenorizado de compuestos polifenlicos de bajo peso molecular, mediante tcnicas de individualizacin por cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a un detector de fotododos alineados (HPLC-DAD). Los compuestos fenlicos se identificaron, comparando su espectro de absorcin y tiempo de retencin con su respectivo estndar. Su cuantificacin se hizo utilizando los mismos patrones que utiliz Erazo (2004), los que correspondieron a compuestos distribuidos por la empresa qumica Sigma S.A. (Cuadro 1), y rectas de calibrado obtenidas a una absorbancia de 280 nm.

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Cuadro 1. Compuestos fenlicos patrones y recta de calibracin utilizada. Compuesto identificado (+) catequina c. p-cumrico c. fetrico c. ferlico astilbin miricetina (-) epicatequina galato isoramnetina quercetina c. p-cumrico+kaempferol flavonol glicsido kaempferol c. Glico procianidina B3 procianidina B1 (+) catequina procianidina B4 procianidina trmero procianidina B2 (-) epicatequina galato procianidina galato trmero Fuente: Erazo (2004). Recta utilizada catequina c. p-cumrico c. p-cumrico c. ferlico quercetina quercetina epicatequina quercetina quercetina kaempferol quercetina kaempferol c. Galico catequina catequina catequina catequina catequina catequina (-) epicatequina catequina

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5. RESULTADOS 5.1. Caracterizacin fsica y qumica de los frutos de Melia azedarach Los frutos utilizados en el estudio presentaron un peso y dimetro promedios de 5,20 0,19 g y 14 0,53 mm, y 4,06 0,45 g y 12,8 0,19 mm para los estados de madurez EM1 y EM2, respectivamente (Cuadro 2).
Cuadro 2. Caracterizacin del fruto de M. azedarach. Parmetro Peso (g) Dimetro (mm) Color del fruto L* a* b* EM1 5,20 0,19 14,0 0,53 50,9 -20,7 34,3 EM2 4,06 0,10 12,8 0,45 60,3 -17,6 47,7

L*: claridad; a*: espectro desde verde a rojo; b*: espectro entre amarillo y azul.

El nmero de frutos por kilogramo fue variable, dependiendo de su tamao, estado de madurez y contenido de humedad. En promedio, el nmero de frutos se calcul en 576 unidades por kg para EM1 y 738 unidades por kg para EM2. Los resultados del anlisis proximal de los dos estados de madurez de los frutos se presentan en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Anlisis proximal segn el estado de madurez del fruto de M. azedarach. ANLISIS REALIZADOS (%) Rendimiento Humedad del fruto Humedad de la harina Cenizas Protenas Lpidos Fibra Cruda EM1 Promedio DE 38,06 59,66 2,38 0,04 94,88 0,10 6,87 0,15 5,23 0,17 35,70 0,13 EM2 Promedio DE 52,22 44,10 5,05 0,05 95,56 0,06 5,98 0,56 5,17 0,29 38,68 0,93

El rendimiento promedio correspondi al porcentaje final obtenido con relacin al peso del fruto verde, contemplndose prdidas en los dos estados de madurez de 38%

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(EM1) y 52% (EM2), producto de la molienda y el secado del fruto para obtener la harina utilizada en los distintos tratamientos (Cuadro 3). El contenido de humedad de la harina con la cual se elaboraron los extractos fue bajo (25%), producto del proceso de secado (Cuadro 3). En el anlisis de cenizas, lpidos y protenas de los distintos estados de madurez de los frutos, no hubo diferencias significativas en las proporciones obtenidas, y ambos casos tuvieron desviaciones estndar bajas y similares entre s. En la medicin de la fibra cruda, EM2 super en 3% a EM1 (Cuadro 3). 5.2. Propiedades insecticidas del producto El anlisis estadstico entre los tratamientos y sus respectivos testigos arroj diferencias estadsticas entre los factores, lo que indic que el solvente utilizado no tuvo inferencia sobre la mortalidad de las moscas, comprobndose que el agua y el etanol por s solos no causan su muerte, por lo que los resultados de los bioensayos son producto del extracto insecticida evaluado. En un slo caso hubo ausencia de diferencia entre el testigo y el tratamiento, explicado por el bajo poder insecticida de esa combinacin (EM2, solvente etanol y concentracin de 3.200 ppm) (Apndice 1). Las mortalidades de D. melanogaster alcanzadas con los extractos a base de etanol fueron superiores a las obtenidas con agua para un mismo estado de madurez de los frutos, con la excepcin de EM2 en la concentracin ms baja (3.200 ppm), que tuvo la misma mortalidad en ambos solventes (Cuadro 4).
Cuadro 4. Mortalidades promedio de D. melanogaster por efecto de extractos de frutos de M. azedarach de dos estados de madurez, solventes y concentraciones. Solvente Etanol Agua Estado de madurez EM1 EM2 EM1 EM2 Mortalidad (%) 7.500 ppm 76,67 A 43,33 B 60,00 A 36,67 B

3.200 ppm 56,67 B 16,67 C 43,33 B 16,67 C

10.700 ppm 76,67 A 63,33 A 73,33 A 53,33 A

EM1 y EM2: Estados de madurez 1 y 2. Las letras distintas en forma horizontal indican diferencias significativas entre las concentraciones (P5%).

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Los resultados ms efectivos se observaron en los extractos del EM1 con etanol a 7.500 y 10.700 ppm, con cerca del 77% de mortalidad en ambos casos. Le sigui en efectividad el extracto del mismo estado de madurez con la concentracin de 10.700 ppm, pero con agua, con 73% de mortalidad. Los tratamientos menos eficaces se presentaron en los extractos de concentracin ms baja (3.200 ppm) del EM2 con ambos solventes, con slo 17% de mortalidad. Se distingue claramente el efecto de los extractos sobre los insectos, esto es, a mayor concentracin del producto la mortalidad fue mayor, independiente del estado de madurez del fruto y de los solventes utilizados (Cuadro 4). No obstante, el anlisis estadstico bifactorial entre solventes y concentraciones (Apndice 2), no arroj diferencias significativas entre los solventes utilizados, aunque s diferencias claras entre las concentraciones de los distintos extractos de los frutos (Cuadro 4). El comportamiento de D. melanogaster durante los bioensayos fue cambiando, segn el estado de madurez evaluado y la concentracin en que se encontraba el extracto. Dado que el producto estaba mezclado con el alimento de las moscas, stas tendan inicialmente a bajar hacia el medio contaminado, alejndose de l con el transcurso de los das, especialmente en los extractos a base del EM1. Este distanciamiento de las moscas del medio de crianza fue ms notorio en aquellos tratamientos con las dosis mayores del producto, en los que las moscas bajaban a comer durante los tres primeros das para despus permanecer en la parte superior del frasco. Una observacin importante durante el seguimiento fue comprobar la incapacidad del insecto para reproducirse, principalmente en los bioensayos con las concentraciones mayores del producto insecticida, en los que no hubo puestas de huevos por las hembras, lo que fue ms notorio en los frascos con extractos a base del EM1. En los extractos originados del EM2 hubo ovipostura, aunque la mayora de las veces el insecto permaneci en estado de larva o pupa, y muri en etapas intermedias. Aunque en las concentraciones ms bajas de los extractos elaborados con ambos estados de madurez hubo oviposturas, stas no fueron capaces de desarrollarse normalmente, y quedaron en su mayora en etapas intermedias. Aquellos individuos que lograron pupar y emerger, originaron adultos con alas vestigiales. Sin embargo, en los

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frascos con medio de alimentacin sin extracto insecticida (testigos), el comportamiento, alimentacin y reproduccin de las moscas fueron completamente normales. En los frascos con extracto insecticida se observ adems una baja descomposicin del medio de crianza, a diferencia de los frascos testigos, donde la proliferacin de hongos se desarroll normalmente. Los resultados de la prueba Probit para determinar la DL50 se presentan en el Cuadro 5, en el que se aprecia que los extractos a base de etanol fueron ms efectivos, con una DL50 para D. melanogaster de 2.071 ppm, a diferencia de los extractos en agua, los que requirieron 4.382 ppm para alcanzar este mismo resultado de mortalidad.
Cuadro 5. Resultados de la prueba Probit sobre la mortalidad de D. melanogaster ante extractos del fruto de M. azedarach en etanol y agua para el EM1. VARIABLE DL50 (ppm) R2 Ecuacin Probit ETANOL 2.071 0,918 y = 17,835x - 86,181 AGUA 4.382 0,972 y = 23,885x - 150,28

La mortalidad de D. melanogaster frente a las distintas concentraciones de etanol y agua con el EM1 se presenta en la Figura 4. En ella se verifica, por un lado, la mayor efectividad de los extractos al aumentar su concentracin y por otro, la efectividad permanente de los extractos en etanol sobre los en agua en todas las concentraciones evaluadas. Tambin se diferencian las DL50 obtenidas con los extractos de los frutos en ambos solventes, con una efectividad mayor de los extractos en etanol.

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Agua
90 80 70

Etanol

Lineal (Etanol)

Lineal (Agua)

Mortalidad (%)

60 50 40 30 20 10 0 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 9,2 9,4

Ln Concentracin del extracto 2.071 2.441 2.981 3.641 4.447 5.432 6.634 8.103 9.897

Concentracin del extracto (ppm)


Figura 4. Representacin grfica de la prueba Probit de la mortalidad de D. melanogaster frente a distintas concentraciones de extractos del fruto de M. azedarach con dos solventes.

Este anlisis complementa los resultados obtenidos y expuestos en los puntos anteriores, parece ms adecuado que el planteado en el proyecto original, y deja un precedente de la forma correcta de evaluacin de los bioensayos de mortalidad en laboratorio. 5.3. Evolucin de la mortalidad de Drosophila melanogaster La tendencia de la mortalidad obtenida con los extractos en etanol y agua a 3.200, 7.500 y 10.700 ppm se presenta en la Figura 5, respectivamente, considerando el estado de madurez que obtuvo mejores resultados en los bioensayos (EM2). La regresin con mejor ajuste en todos los casos fue polinomial de 2.

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8 7 6 5 y = -0,0056x + 0,3855x + 0,1119 R = 0,9562


2 2

4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
8 7 6 y = -0,0089x + 0,5445x + 0,0157 R = 0,9724
2 2

y = -0,0144x + 0,5103x - 0,3375 R = 0,9608


2

N de moscas muertas

5 4 3 2 1 0

y = 0,0038x + 0,173x + 0,1225 R = 0,8923


2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

8 7 6 5 y = -0,0021x + 0,4373x - 0,1536 R = 0,9799


2 2

4 3 2 1 0 y = 0,0124x + 0,0502x + 0,4179 R = 0,9417 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22


2 2

Das

Mortalidad acumulada Etanol Lnea tendencia etanol (polinmica)

Mortalidad acumulada agua Lnea tendencia agua (polinmica)

Figura 5. Mortalidad de D. melanogaster con extractos en etanol y agua de los frutos de M. azedarach a distintas concentraciones. A) 3.200 ppm; B) 7.500 ppm y C) 10.700 ppm.

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Como se observa en la Figura 5, la mortalidad de D. melanogaster con los extractos a 3.200 ppm en ambos solventes, fue inicialmente muy similar, y aument del mismo modo. A partir del da 12, los extractos en etanol marcaron una tendencia ascendente superior a la obtenida con los extractos en agua. La mortalidad de D. melanogaster producto de los extractos en 7.500 ppm con ambos solventes aumentaron al transcurrir los das, pero en etanol hubo una superioridad evidente respecto al agua. Tendencias similares de mortalidad se obtuvieron con la concentracin de 10.700 ppm con ambos solventes. 5.4. Anlisis de polifenoles Este anlisis es muy importante en el estudio de los componentes qumicos de las plantas, y debe ser tratado como tema principal en un trabajo posterior. En este caso se consider un complemento del estudio principal, que no estaba en el proyecto original y se abord en forma preliminar. La mayor proporcin de taninos totales se concentr en EM1, con 3,9 g/L, mientras que en EM2 fue slo 2,56 g/L. En el anlisis de compuestos fenlicos de bajo peso molecular se obtuvieron 14 sustancias, identificndose slo tres. El resto no correspondi a ninguno de los patrones indicados en el Cuadro 1. Los principales compuestos encontrados con sus respectivos tiempos de retencin se presentan en el Cuadro 6.

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Cuadro 6. Compuestos fenlicos de bajo peso molecular en los frutos de M. azedarach.


Cima N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Compuesto Desconocido Desconocido Desconocido Catequina Desconocido Desconocido Desconocido Kaempferol Kaempferol Desconocido Desconocido Desconocido Desconocido Desconocido Tiempo de retencin 2,75 3,72 18,72 23,00 30,48 42,27 48,43 57,36 62,33 2,81 3,87 19,59 31,25 49,23

En las cromatografas obtenidas para EM1 y EM2 (Figura 6) se observa con claridad el comportamiento de los compuestos constituyentes del fruto de M. azedarach.
0,25 Unidades de absorbancia (280 nm)
1 10

0,20

0,15
11 3 12 5 13 6

7 14

0,10

0,05
4

0,00 0 10 20 30 40 Tiempo de retencin (min)


EM1 EM2

50

60

70

Figura 6. Cromatografa por HPLC de la harina obtenida del fruto EM1 y EM2 de M. azedarach. Los nmeros sobre las cimas se relacionan con aquellos en el Cuadro 6.

Entre los compuestos con mayor participacin en el fruto slo se pudo reconocer los correspondientes a las cimas 4, 8 y 9. El primero podra ser una catequina y los dems kaempferol (Erazo, 2004). El espectro de las cimas ms importantes se presenta en la Figura 7.

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Figura 7. Espectros correspondientes a los compuestos fenlicos de M. azedarach. Los nmeros sobre los espectros se relacionan con los del Cuadro 6.

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En los cromatogramas de las muestras EM1 y EM2 (figura 6), se observan compuestos que tienen caractersticas similares (tiempo de retencin, forma y espectros de absorcin), lo que podra indicar que la gran mayora de las molculas estn presentes en ambos estados de madurez. Eso se puede observar al comparar la cima nmero 2 del EM1 con la molcula encontrada en la cima nmero 11 del EM2. La misma situacin ocurre entre la cima 7 y 14.

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6. DISCUSIN 6.1. Caracterizacin fsica y qumica de los frutos de Melia azedarach El peso y dimensiones anatmicas de los frutos con que se elaboraron los extractos fueron levemente inferiores a los presentados por Gusberti et al. (2000), quienes obtuvieron un dimetro promedio de 15 mm entre todos los estados de madurez. Estas diferencias se explicaran por las condiciones semi-desrticas o xerfitas del rea de nuestro estudio, siendo ms favorable su desarrollo en zonas con climas tropicales. Se observaron diferencias de color entre los frutos; EM2 present mayor claridad (L*) y tonalidad ms amarilla (b*) que EM1, el cual tendi a un color ms verdoso (a*). El rendimiento del EM1 en el anlisis proximal fue inferior al del EM2, debido al mayor contenido de humedad del fruto verde, el que al ser secado perdi casi 60% de agua, mientras que EM2 slo 44%. Cabe mencionar que los bajos contenidos de humedad de las harinas obtenidas (2,38% en EM1 y 5,05% en EM2) facilitaron su manipulacin y almacenamiento, evitando la descomposicin o deterioro de los compuestos qumicos, vitales para una investigacin de esta ndole. Por otra parte, la proporcin de fibra cruda detectada fue levemente superior en EM2, lo que se debera al incremento de este elemento con la maduracin. Durante la investigacin no se encontraron referencias sobre el anlisis proximal ni su aplicacin en la caracterizacin del fruto de M. azedarach, principalmente porque este anlisis se efecta en frutos o alimentos comestibles. Sin embargo, se consider de inters caracterizarlo en beneficio de su conocimiento general y de posibles comparaciones con investigaciones futuras. 6.2. Propiedades insecticidas del producto Los resultados de mortalidad en torno al 77% de los adultos de D. melanogaster expuestos a los extractos de los frutos concuerdan con los obtenidos por varios autores, sobre el poder antialimentario de M. azedarach. As, Valladares et al. (1997) evaluaron tres concentraciones (2, 5 y 10%), que tuvieron un efecto antialimentario en adultos de

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Xanthogaleruca luteola (Mller) (Coleoptera: Chrysomelidae), que vari desde 75% hasta un 100% de inhibicin con la concentracin mayor. Los anlisis estadsticos indicaron que el uso de etanol o agua como solvente para elaborar extractos insecticidas a base de M. azedarach no influye significativamente en la mortalidad de D. melanogaster. No obstante, los cuadros y figuras evidencian la superioridad de los extractos obtenidos con etanol en vez de agua, sin importar los estados de madurez y concentraciones evaluados. Esto puede deberse a que existe una leve diferencia de efectos entre los solventes utilizados en ensayos, aunque no perceptible estadsticamente. Las concentraciones ms eficaces obtenidas en esta investigacin contrastan con las de Vergara et al. (1997), quienes evaluaron extractos etanlicos de M. azedarach sobre el crustceo Artemia salina (L.) y obtuvieron resultados favorables con concentraciones muy bajas, con niveles entre 1.000 a 3.000 ppm. Esto se explica por la estrecha relacin entre el clima y la acumulacin de compuestos insecticidas en esta especie y la sensibilidad del organismo animal objeto de estudio, segn indican Espinosa y Villaseor (2002). Por otra parte, la prueba Probit sobre el EM1 corrobor tambin la efectividad del etanol. Considerando los dos solventes, las dosis para matar el 50% de los individuos fluctuaron entre 2.071 y 4.382 ppm. Estos resultados son similares a los de Vergara et al. (1997), quienes determinaron un ptimo aproximado para sobre Spodoptera frugiperda J. E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae) de 3.000 ppm. Pero al igual que lo comentado en los puntos anteriores, estos niveles son mayores que los obtenidos en otras latitudes o en estados inferiores de desarrollo del insecto. Rhyacionia buoliana Den et Schiff. La accin repelente de los extractos insecticidas y las malformaciones presentadas por algunos individuos fueron similares a las observadas por Rodrguez y Vendramim (1998). Estos autores comprobaron que el mecanismo de actividad de la gran mayora de las substancias a base a M. azedarach consiste en inhibir la accin de las oxidasas en el intestino medio. Por ello, el insecto juvenil se convierte en pupa o adulto anormal por la deficiencia de nutrientes o interferencia en los procesos fisiolgicos, o bien muere. Como ejemplo, Muoz et al. (1998), obtuvieron DL50 inferiores a 1.000 ppm para larvas de la polilla del brote del pino,

39

Por otro lado, Vergara et al. (1997), Rodrguez (1999) y Gusberti et al. (2000), sostienen que los efectos combinados de los compuestos en el fruto son ms poderosos que en forma individual. Esto permite inferir que es mejor un extracto a base del fruto completo, en vez de aislar el principio activo, dado que al existir un conjunto de compuestos, no slo se incrementan las posibilidades de mortalidad de los insectos, sino que adems disminuye la probabilidad que stos desarrollen resistencia a una mezcla de ingredientes activos. Por tanto, el uso del fruto completo aumentara la eficacia del extracto si se compara con el efecto de cada componente por separado, pues es ms difcil destoxificar un complejo de sustancias que a una nica molcula (Islan, 1997). Al comparar cada tratamiento del EM1 con su similar en el EM2 en el Cuadro 4, para todos los casos, el extracto elaborado con frutos en EM1 fue ms eficiente, logrando porcentajes mayores de mortalidad con concentraciones menores, siendo indiferente el solvente o concentracin utilizada. Esto se debera al proceso natural de disminucin de los compuestos polifenlicos una vez alcanzado el punto ptimo de madurez del fruto, que una vez sobrepasado comienzan los cambios por deterioro y descomposicin (Garca, 1999. Por ltimo, cuando el insecticida se aplica en terreno, las diferencias entre los solventes a utilizar respecto a su efectividad y costo de elaboracin pueden ser significativas. Si se compara en estos aspectos al agua y etanol, este ltimo presenta desventajas asociadas principalmente a su mayor costo, a los cuidados que deben tener los operadores al elaborar el extracto insecticida y a sus propiedades de volatilizacin. Las condiciones ambientales que un producto debe soportar ser aplicado en un bioensayo de laboratorio son controladas, a diferencia de las que ocurren en un vivero, plantacin forestal o cultivo agrcola, donde generalmente ocurren inclemencias climticas. En este sentido, el agua sera superior al etanol por su grado de volatilizacin menor, con lo que el producto permanece ms tiempo en el lugar aplicado. Estas observaciones son compartidas por Rodrguez (1997) y Rodrguez et al. (2003), quienes indican que la volatilizacin del solvente a utilizar es importante para lograr los efectos deseados en la poblacin de insectos perjudiciales. Todos estos factores favoreceran el uso del agua para elaborar el extracto insecticida a nivel masivo, puesto que presenta cualidades globales ms favorables que el etanol.

40

6.3.

Tendencia de mortalidad de Drosophila melanogaster La regresin polinmica se ajust mejor a la tendencia de mortalidad acumulada

de D. melanogaster, pues esta mortalidad fue incrementndose con el transcurso de los das. Las moscas dejaron primero de comer por el efecto antialimentario, con un lapso de tiempo en que soportaron la falta de alimentacin para posteriormente comenzar a morir. Si bien la Figura 5 presenta ecuaciones de mortalidad, stas son exclusivas del experimento dado que la composicin del extracto vara segn la procedencia del material con que fue elaborado, lo que conlleva a extractos insecticidas con cualidades similares pero con diferencias en la velocidad y efectividad de accin. 6.4. Anlisis de polifenoles Con los resultados obtenidos slo se identific en forma preliminar dos compuestos fenlicos, catequina y kaempferol, pertenecientes a los grupo de los flavanos 3-oles y a los flavonoles, respectivamente. Ambos constituyen parte de los compuestos llamados flavonoides, grupo al cual Izco (1998) y Troiani (2003) adjudican parte de los efectos insecticidas de los vegetales. Los compuestos identificados en este estudio son asociados principalmente al sabor y cualidades antioxidantes y prooxidantes, como lo menciona Prez (2003) en un estudio de flavonoides desarrollado para evaluar cualidades antioxidantes y prooxidantes de dichos compuestos. Se sugiere continuar con esta lnea de investigacin, que permitira conocer los compuestos responsables de las cualidades insecticidas de los frutos de M. azedarach y contribuir con ello al manejo integrado de plagas va insecticidas botnicos.

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7. CONCLUSIONES Las caractersticas fsicas del fruto, especficamente peso y dimetro de M. azedarach con que se trabaj en este estudio fueron inferiores a los de estudios similares con frutos de climas tropicales. El anlisis proximal de ambos estados de madurez del fruto determin un aumento leve en el contenido de cenizas y fibra cruda en el transcurso de este proceso. Los extractos del fruto de M. azedarach evaluados mediante bioensayos de laboratorio fueron eficaces como bioinsecticidas, y alcanzaron mortalidades de D. melanogaster de hasta 77% con el EM1, etanol y las concentraciones de 7.500 y 10.700 ppm. Las mortalidades de D. melanogaster por efecto de los extractos a base de etanol fueron superiores a las obtenidas con agua, para un mismo estado de madurez de los frutos de M. azedarach, con excepcin del EM2 con la concentracin menor (3.200 ppm), que tuvieron la misma mortalidad con ambos solventes. anlisis estadstico. En general, en los bioensayos con extractos no hubo descendencia viable de D. melanogaster. Algunos individuos que s se reprodujeron dieron origen a insectos incapaces de desarrollarse o con malformaciones en sus alas. La menor dosis letal para matar al 50% de los individuos de D. melanogaster (DL50) se logr con los extractos de EM1 con etanol (2.071 ppm). La mortalidad acumulada de D. melanogaster aument paulatinamente con el transcurso de los das. Al comienzo los insectos se alimentaban de los extractos, pero luego se manifestaba el efecto antialimentario del producto insecticida, hasta producirse su muerte. Sin embargo, estas diferencias en mortalidad con etanol y agua no se reflejaron en el

42

En el anlisis de polifenoles de los frutos de M. azedarach se encontraron preliminarmente 14 compuestos, identificndose tres posibles flavonoides, una catequina y dos kaempferol.

En futuras investigaciones se recomienda hacer pruebas de campo, para ver el efecto de los extractos en condiciones reales de aplicacin. Tambin se sugiere continuar con la bsqueda de los compuestos qumicos en extractos del fruto de M. azedarach, a fin de incluirlos en control integrado de plagas.

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APNDICE 1. Anlisis Estadstico 1


Modelo de efectos fijos entre el solvente agua y su correspondiente testigo para el EM1 Testigo to 2 2 3 Concentraciones (ppm) 3.200 7.500 10.700 t1 t2 t3 3 6 8 5 5 7 5 7 7 SC 42,00 6,00 48,00 CM 14,00 0,75 RAZON F 18,67 F0>Fc Razn f tabla 4,07

Repeticiones 1 2 3

FV gl 3 Tratamiento 8 Error 11 total gl: grados de libertad SC: suma de cuadrados CM: cuadrados medios

Test de Rangos Mltiples de Duncan T3 T2 T1 T0 7,33 6,00 4,33 2,33 2,33 5,00* 3,67* 2,00* T0 4,33 3,00* 1,67* T1 6,00 1,33 T2 7,33 T3 * Existe diferencia estadstica. Tratamientos Resultados t0 C t1 B t2 A t3 A Tratamientos con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

50

Modelo de efectos fijos entre el solvente etanol y su correspondiente testigo para el EM1 Concentraciones (ppm) 3.200 7.500 10.700 t1 t2 t3 5 8 10 6 7 4 6 8 9

Repeticiones 1 2 3

Testigo to 3 2 2

Test de Rangos Mltiples de Duncan FV gl SC 3 57,00 Tratamiento 8 22,67 error 11 79,67 total T3 7,67 5,33* 2,00 0,00 -

CM 19,00 2,83

RAZON F 6,71 F0>Fc

Razn f tabla 4,07

2,33 T0 5,67 T1 7,67 T2 7,67 T3 * Existe diferencia estadstica. Tratamientos Resultados t0 B t1 A t2 A t3 A Tratamientos con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

T2 7,67 5,33* 2,00 -

T1 5,67 3,33* -

T0 2,33 -

51

Modelo de efectos fijos entre el solvente agua y su correspondiente testigo para el EM2 Testigo to 0 0 0 gl 3 8 11 Concentraciones (ppm) 3.200 7.500 10.700 t1 t2 t3 3 5 5 1 3 6 1 3 5 SC 48,67 6,00 54,67 CM 16,22 0,75 ECM RAZON F Razn f tabla 21,630 4,066 F0>Fc

Repeticiones 1 2 3 FV Tratamiento error total

Test de Rangos Mltiples de Duncan T3 T2 T1 T0 5,33 3,67 1,67 0,00 0,00 5,33* 3,67* 1,67* T0 1,67 3,67* 2,00* T1 3,67 1,67* T2 5,33 T3 * Existe diferencia estadstica. Tratamientos Resultados t0 D t1 C t2 B t3 A Tratamientos con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

52

Modelo de efectos fijos entre el solvente etanol y su correspondiente testigo para el EM2 Testigo to 0 1 1 gl 3 8 11 Concentraciones (ppm) 3.200 7.500 10.700 t1 t2 t3 2 5 6 2 4 6 1 4 7 SC 59,58 2,67 62,25 CM 19,86 0,33 RAZON F 59,58 F0>Fc Razn f tabla 4,07

Repeticiones 1 2 3 FV Tratamiento Error total

Test de Rangos Mltiples de Duncan T3 T2 T1 T0 6,33 4,33 1,67 0,67 0,67 5,67* 3,67* 1,00 T0 1,67 4,67* 2,67* T1 4,33 2,00* T2 6,33 T3 * Existe diferencia estadstica. Tratamientos Resultados t0 C t1 C t2 B t3 A Tratamientos con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

53

APNDICE 2. Anlisis Estadstico 2

Anlisis estadstico bifactorial entre solventes y concentraciones para el EM1


Concentracin ppm promedio 3.200 7.500 10.700 a b c 5 8 10 6 7 4 6 8 9 3 6 8 5 5 7 5 7 7 SC 27,11 20,11 5,56 1,44 27,33 54,44 CM 10,06 5,56 0,72 1,52 F0 6,62 3,66 0,48 Fc 3,55 4,41 3,55

Solvente Etanol R1 R2 R3 R1 R2 R3 gl 2 1 2 18 23

Agua

FV Tratamiento Concentracin Solvente Ambos Error Total

Test de Rangos Mltiples de Duncan c 22,5 7,5* 2 b 20,5 5,5* a 15 -

a 15 b 20,5 c 22,5 * Existe diferencia estadstica. Concentracin Resultados a B b A c A Concentraciones con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

54

Anlisis bifactorial entre solventes y concentraciones para el EM2


Concentracin promedio ppm 3.200 7.500 10.700 a b c 2 5 6 2 4 6 1 4 7 3 5 5 1 3 6 1 3 5 SC 54,5 52,33 1,39 0,78 8,00 62,5 CM 26,17 1,39 0,39 0,44 F0 58,88 3,13 0,87 Fc 3,55 4,41 3,55

Solvente Etanol R1 R2 R3 R1 R2 R3 gl 2 1 2 18 23

Agua

FV Tratamiento Concentracin Solvente Ambos Error Total

Test de Rangos Mltiples de Duncan c 17,5 12,5* 5,5* b 12 7* a 5 -

a 5 b 12 c 17,5 * Existe diferencia estadstica. Concentracin Resultados a C b B c A Concentraciones con letras iguales no acusan diferencia significativa al nivel 0,05

55

ANEXO 1. Medio de cra de Drosophila melanogaster

MEZCLA CIDA Agua (L) Agar-Agar (g) Smola (Nutrina) (g) Levadura seca (g) Nipagin (mL) * Azcar (g) Nitrato de sodio (g) Fosfato de potasio (g) Cloruro de potasio (g) Sulfato de magnesio (g)

1/4 4 15 3 3 10,75 1,05 0,3 0,175 0,175

Cantidad de medio a preparar 1/2 1 2 3 8 16 32 48 30 60 120 180 5 10 20 30 6 12 24 36 21,5 43 86 129 2,1 4,2 8,4 12,6 0,6 1,2 2,4 3,6 0,35 0,7 1,4 2,1 0,35 0,7 1,4 2,1

4 64 240 40 48 172 16,8 4,8 2,8 2,8

* Para preparar nipagin de utiliza la relacin 1 L de alcohol absoluto por 120 g de nipagin en polvo.

Se ponen todos los ingredientes en un recipiente a excepcin del nipagin. El recipiente se calienta a fuego fuerte sin dejar de revolver; una vez que la mezcla hierve se espera 10 minutos, sin dejar de revolver. Luego se apaga el fuego y se incorpora el nipagin a la mezcla. La mezcla obtenida debe ser introducida caliente en los frascos de cultivo, los cuales deben ser previamente esterilizados. La cantidad promedio de mezcla por frasco es 24 g. Idealmente se debe utilizar mascarilla para evitar inhalar compuestos txicos.

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