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Durchfhrung: 19.12.

2012

Sophie Reisener / 764129 sophie.reisener@uni-potsdam.de Irene Husler / 751179 - Irene.Haeusler@web.de

Biochemisch-Zellbiologisches Grundpraktikum WS 2012/2013

Versuch 12

Enzymkinetik

Gruppe C 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin (TMB)

Ergebnisse KM vmax pH-Optimum

0,05 mmol/L 0,026 mmol/L*min 5,0

Inhalt
1. Einleitung ............................................................................................................................................. 3 2. Grundlagen .......................................................................................................................................... 3 3. Durchfhrung ...................................................................................................................................... 5 4. Auswertung und Diskussion ................................................................................................................ 7 4.1 Erster Versuchsteil......................................................................................................................... 7 4.2 Zweiter Versuchsteil ...................................................................................................................... 7 4.3 Dritter Versuchsteil ..................................................................................................................... 11 4.4 Vergleich der Ergebnisse ............................................................................................................. 12 Quellen .................................................................................................................................................. 12

1. Einleitung
Ziel dieses Versuches ist es, die kinetischen Parameter vmax (Maximalgeschwindigkeit) und KM (Michaelis-Menten-Konstante) fr die enzymatische Umsetzung von ??? durch die MeerrettichPeroxidase (POD) zu bestimmen. Die Bestimmung erfolgte ber photomoetrische Absorptionsmessungen. Zudem soll das pH-Optimum der Meerrettich-Peroxidase fr ABTS bestimmt werden.

2. Grundlagen
Enzyme sind Proteine, die als biologische Katalysatoren wirken, die also katalytisch aktiv sind. Sie beeinflussen biochemische Reaktionen, in dem sie die Aktivierungsenergie der Reaktion senken und die Reaktionsgeschwindigkeit verndern. Sie gehen jedoch selbst unverndert aus der Reaktion hervor und treten in der Bruttoreaktionsgleichung nicht auf. Enzyme katalysieren nur reversible Reaktionen. Zudem sind Enzyme substratspezifisch. Sie binden das Substrat (S) nach dem SchlsselSchloss-Prinzip in ihrem aktiven Zentrum und bilden einen spezifischen Enzym-Substrat-Komplex, aus dem in der Folge das Produkt (P) hervorgeht. + + Die Enzymkinetik beschftigt sich mit eben solchen durch Enzyme katalysierten Reaktionen und betrachtet dabei besonders die Reaktionsgeschwindigkeit. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist nicht nur von der Temperatur und dem pH-Wert abhngig, sondern auch von der Substratkonzentration. Die Reaktionsgeschwindigkeit gibt demnach an, wie sich die Substratkonzentration mit der Zeit verndert. Diese Abhngigkeit wird durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben. = [] + [] v Reaktionsgeschwindigkeit vmax maximale Reaktionsgeschwindigkeit [S] Substratkonzentration KM Michaelis-Menten-Konstante

Damit diese Gleichung gltig ist, mssen einige Voraussetzungen erfllt sein. Der Zerfall des EnzymSubstrat.Komplexes soll dabei geschwindigkeitsbestimmend sein und nicht dessen Bildung. Auch die Rckreaktion des Produktes soll vernachlssigt werden. Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt normalerweise eine Einsubstratreaktion, kann in einigen Fllen aber auch auf Zweisubstratreaktionen angewendet werden. Die POD-Reaktion ist eine solche Zweisubstratreaktion. Diese Bedingungen sind hufig zu Beginn der Reaktion gegeben. Aus diesem Grund wird fr die Bestimmung der KM- und vmaxWerte der lineare Bereich der Anfangsgeschwindigkeit genutzt. Fr verschiedene KM-Werte und Substratkonzentrationen kann die Michaelis-Menten-Gleichung vereinfacht werden: 1. Ist [S] << KM, so gilt: = []

In diesem Fall ist die Reaktionsgeschwindigkeit also von der Substratkonzentration abhngig. Demnach liegt eine Reaktion erster Ordnung vor. 2. Ist Ist [S] >> KM, so gilt:

[] = []

Die Reaktionsgeschwindigkeit ist also unabhngig von der Substratkonzentration, somit liegt eine Reaktion nullter Ordnung vor. Dies ist oft im Bereich der Substratsttigung der Fall, also wenn alle aktiven Zentren des Enzyms mit Substrat besetzt sind und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht ist. 3. Ist [S] = KM, so gilt: = 2

Dies bedeutet, dass der KM-Wert dem der Substratkonzentration entspricht, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hlfte ihres Maximalwertes erreicht hat. Es sind somit genau die Hlfte der aktiven Zentren des Enzyms besetzt. Eine andere Methode, um die kinetischen Parameter vmax und KM zu bestimmen ist die nach Lineweaver-Burk. Diese Gleichung ist die linearisierte Form der Michaelis-Menten-Konstante. 1 1 1 = + Die Meerrettich-Peroxidase wird einer bestimmten Gruppe von Enzymen zugeordnet, den sogenannten Oxidoreduktasen. Die POD katalysiert die Oxidation von Wasserstoffdonatoren durch Wasserstoffperoxid. + 2 + Eine weitere Aufgabe erfllt die POD bei der Ligninsynthese. Lignin ist fr die Verholzung von Pflanzenzellen verantwortlich. Die POD bildet Ligninradikale, die Voraussetzung fr die Synthese von Ligninpolymeren sind. Die POD ist ein Glycoprotein, das aus den Zuckern Mannose, Arabinose und Xylose besteht. Sie hat ein Molekulargewicht von ca. 40 kDa. Peroxidasen tragen oft prosthetische Gruppen. Koenzyme binden nicht-kovalent nur fr die Dauer der Reaktion an die das Apoenzym und dissoziieren nach deren Abschluss wieder ab. Bindet ein sogenannter Kofaktor kovalent und dauerhaft an ein Enzym, so handelt es sich um eine prosthetische Gruppe. Die POD trgt als prosthetische Gruppe eine Hm-Gruppe. Die Hm-Gruppe trgt als Zentralion Eisen, um welches herum sich ein stickstoffhaltiger Porphyrinring mit konjugierten Doppelbindungen befindet. Eine Hm-Gruppe lsst sich auch beim Hmoglobin finden.

3. Durchfhrung
Das TMB stand zu Versuchsbeginn bereits in folgenden Verdnnungsstufen bereit: Lsung Stammlsung Lsung A Lsung B Lsung C Lsung D Lsung E Lsung F Lsung G Konzentration in mmol/l 20 15 10 7,5 5,0 2,5 1,0 0,5

Tabelle 1: Verdnnungsschema TBM

Im ersten Versuchsteil wird die Wellenlnge bestimmt, bei der die Absorption nach Umsatz des Substrates maximal ist. Dazu werden eine Referenzlsung sowie eine Reaktionslsung hergestellt. Die Referenzlsung besteht aus 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 6,0), die Reaktionslsung aus 3,0 ml BrittonRobinson-Puffer (pH 6,0), 0,1 ml H2O2-Lsung mit einer Konzentration von 10 mM und 0,1 ml TMBStammlsung mit einer Konzentration von 20 mM. Beide Lsungen werden ins Photometer gesetzt und ein Nullabgleich durchgefhrt. Nach dem Nullabgleich werden zu der Reaktionslsung 0,05 ml 1:100fach verdnnte POD-Lsung hinzugegeben, um die Reaktion zu starten. Nach grndlichem Mischen mit einem Rhrstbchen lsst man die Reaktion 3 Minuten lang ablaufen und nimmt das Spektrum auf. Im zweiten Versuchsteil soll die Anfangsgeschwindigkeit der Enzymreaktion in Abhngigkeit zur Substratkonzentration bestimmt werden. Die Referenzlsung bleibt die gleiche, whrend bei der Reaktionslsung aufsteigende Konzentrationen von TBM-Lsung verwendet werden (siehe Tabelle 1). Fr jede Verdnnung des TBM wird eine Dreifachbestimmung durchgefhrt und ein neuer Nullabgleich gemacht. Zum Reaktionsstart werden jeweils 0,05 ml POD-Lsung hinzugegeben und mit einem Rhrstab grndlich gemischt. Anschlieend wird die Vernderung eine Minute lang mit dem Photometer gemessen. Im dritten Versuchsteil soll das pH-Optimum der Enzymreaktion bestimmt werden. Der pH-Wert beeinflusst die Reaktionsgeschwindigkeit stark, da die Seitenketten der Aminosuren der Enzyme ionisierbar sind und somit Auswirkungen auf deren Aktivitt, sowie auf die Substratbindung haben. Hier werden Britton-Robinson-Puffer mit den pH-Werten 4,0; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 und 7,5 fr die Messungen verwendet.

Die Lsungen sind wie folgt angesetzt: Reaktionslsung 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 4,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 5,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 5,5) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 6,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 6,5) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 7,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 7,5)
Tabelle 2: Anstze fr die Bestimmung der pH-Abhngigkeit

Referenzlsung 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 4,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 5,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 5,5) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 6,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 6,5) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 7,0) 3,0 ml Britton-Robinson-Puffer (pH 7,5)

0,1 ml H2O2-Lsung (10 mM) 0,1 ml TMB-Lsung (10 mM)

Auch hier werden jeweils drei Messungen durchgefhrt und fr jeden neuen pH-Wert ein Nullabgleich gemacht, bevor die Reaktion durch Hinzugeben von 0,05 ml POD gestartet wird. Anmerkung: Bei allen Messungen wird je eine neue Kvette verwendet.

4. Auswertung und Diskussion


4.1 Erster Versuchsteil
Im ersten Versuchsteil wurde ein Absorptionsmaximum von 650,00 nm ermittelt (siehe Anlage). Alle folgenden Messungen wurden bei dieser Wellenlnge durchgefhrt. Der Grund hierfr ist, dass an diesem Punkt die maximale Extinktion stattfindet und die Bildung des Produktes am besten zu verfolgen ist.

4.2 Zweiter Versuchsteil


Fr die weiteren Berechnung der folgenden Werte muss bedacht werden, dass die Substratkonzentration in der Kvette nicht der im Schema entspricht. Der Verdnnungsfaktor kann folgendermaen berechnet werden: = = 0,1 = 0,03076 3,25

Um die Verdnnung des Substrats in der Kvette zu berechnen, muss die Substratkonzentration der Stammlsung mit dem Verdnnungsfaktor multipliziert werden. Beispielrechnung: = 15 0,03076 = 0,46 Substratkonzentration Konzentration des der Stammlsung in TMB in der Kvette in mM mM 20 0,62 15 0,46 10 0,31 7,5 0,23 5,0 0,15 2,5 0,08 1,0 0,03 0,5 0,02
Tabelle 3: Tatschliche Verdnnung des TMB

Um die Konzentrationsnderung pro Minute zu berechnen, wird das Lambert-Beersche-Gesetz angewendet: = E Extinktion - Extinktionskoeffizient (TMB = 10,27 L/mmol/cm) d Schichtdicke der Kvette (1 cm) c Konzentration in der Kvette

Die Extinktion wird mit dem Mittelwert von und die Konzentration mit dargestellt. = = In der folgenden Tabelle sind die aufgezeichneten Extinktionswerte dA/min sowie deren Mittelwerte und die Vernderung der Konzentration dc/min aufgefhrt: Konzentration in der Kvette (in mmol/L) 0,62 dA/min (in 1/min) 0,0368 0,0393 0,042 0,0688 0,671 0,0707 0,1267 0,1196 0,1326 0,1694 0,1566 0,1744 0,1897 0,1897 0,1769 0,1897 0,1831 0,1831 0,1973 0,1883 0,2044 0,1901 0,1963 0,1644 Mittelwerte der dA/min (in 1/min) 0,1654 Konzentrationsnderung dc/min (in mmol/l*min) 0,0161

0,46

0,2702

0,0263

0,31

0,1263

0,0123

0,23

0,1668

0,0162

0,15

0,1854

0,0181

0,08

0,1853

0,0180

0,03

0,1967

0,0191

0,02

0,1836

0,0179

Tabelle 4: Werte fr die Messung der Konzentrationsabhngigkeit

Nun wird die dc/min als Funktion der Substratkonzentration in der Kvette aufgetragen. Diese graphische Darstellung entspricht der nach Michaelis-Menten

dc/min als Funktion der Substratkonzentration


0,0250

0,0200 dc/min in mmol/L*min

0,0150

0,0100

0,0050

0,0000 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Substratkonzentration der Kvette in mmol/L

Abbildung 1: dc/min als Funktion der Substratkonzentration

Die Werte der kinetischen Parameter vmax und KM knnen mithilfe der graphischen Darstellung abgeschtzt werden. = 0,018 = 0,05

Die zweite Graphik wird nach Lineweaver-Burk aufgetragen: 1/v in l*min/mmol 50 33,3 12,5 6,67 4,35 3,23 2,17 1,61
Tabelle 5: Werte fr Lineweaver-Burke-Auftragung

1/c in l/mmol 260,88 149,13 81,31 61,57 55,384 55,424 52,220 55,937

Auftragung nach Lineweaver-Burk


300,000 250,000

y = 4,0754x + 38,479 R = 0,968

1/v in l*min/mmol

200,000

150,000

100,000

50,000

0,000 0,000

10,000

20,000

30,000 1/c in l/mmol

40,000

50,000

60,000

Abbildung 2: Auftragung nach Lineweaver-Burk

Die Lineweaver-Burk-Gleichung ist eine linearisierte Form der Michaelis-Menten-Gleichung und hat somit die Form einer linearen Gleichung (y = mx + n). Der Schnittpunkt mit der y-Achse (dargestellt durch n) entspricht bei Lineweaver-Burk 1 = 38,479

= 0,026 Der Anstieg m entspricht

: = 4,0754 = 4,0754

= 0,026

4,0754 = 0,106

4.3 Dritter Versuchsteil


Im letzten Versuchsteil soll die pH-Abhngigkeit der Enzymreaktion bestimmt werden. Die fr die Berechnungen notwendigen Werte werden in der Tabelle 6 zusammengestellt: dA/min (in 1/min) 0,1328 0,1356 0,1248 0,1611 0,1557 0,1636 0,1542 0,1521 0,1467 0,1460 0,1558 0,1457 0,1260 0,1179 0,1143 0,0755 0,0759 0,0726 0,0290 0,0318 0,0350 Mittelwerte der dA/min (in 1/min) 0,1311 Konzentrationsnderung dc/min (in mmol/l*min) 0,0128

pH-Wert

4,0

5,0

0,1601

0,0156

5,5

0,1510

0,0147

6,0

0,1492

0,0145

6,5

0,1194

0,0116

7,0

0,0747

0,0073

7,5

0,0319

0,0031

Tabelle 6: Werte fr die Messung der pH-Abhngigkeit

dc/min in Abhngigkeit vom pH-Wert


0,0180 0,0160 0,0140 dc/min in mmol/l*min 0,0120 0,0100 0,0080 0,0060 0,0040 0,0020 0,0000 3,5 4 4,5 5 5,5 pH-Wert 6 6,5 7 7,5 8

Die Darstellung zeigt eine leicht verzogene Glockenkurve, bei der das pH-Optimum bei einem Wert von 5,0 liegt. Als Puffer wrden sich in diesem Bereich Essigsure-Acetat-Puffer (pH 3,7-5,7) und der Barbital-Acetat-Puffer (pH 2,6-9,2) eignen. Bei der Betrachtung des Ergebnisses muss allerdings noch bedacht werden, dass in der vorhergehenden Messung zur Konzentrationsabhngigkeit fr die verwendete Verdnnung ein sehr viel hherer Wert ergeben hat als selbst beim pH-Optimum in dieser Messung. Dies ist darauf zurckzufhren, dass die Peroxidase bei Raumtemperatur zerfllt, was spter vorgenommene Messungen beeintrchtigt. Da wir keine Vorgaben fr den optimalen pH-Wert haben, mssen wir jedoch zum Zweck der Auswertung davon ausgehen, dass der von uns ermittelte Wert 5,0 richtig ist. Die Endverdnnung der POD berechnet sich folgendermaen: = 0,05 0,05 = 4,95 = 0,000505 /

0,000505/ 0,05 = 3,25 = 7,77 10

4.4 Vergleich der Ergebnisse


Substrat A B C D ortho-Phenylendiamin p-Phenylendiamin TMB ABTS KM 0,193 0,05 0,2051 vmax in mmol L min 0,0142 0,026 0,0022 pHOptimum 4,5 5,0 4,5 Wechselzahl in L mg min 3,61 20,79 10,21 Endverdnnung in g/ml 4,161*10^-6 7,77*10^-6 8,20*10^-6

Tabelle 7: Vergleich der Ergebnisse fr verschiedene Substrate

Nach den Wechselzahlen zu urteilen, wirkt die POD am effektivsten auf TMB. Hier wird pro Milligramm POD das grte Volumen an Substrat umgesetzt. Leider fehlten uns bei der Auswertung die Werte der Gruppe B, wodurch wir nicht mit Sicherheit sagen knnen, ob p-Phenylendiamin nicht doch ein geeigneteres Nachweissubstrat ist.

Quellen
de.wikipedia.org/Puffer_(Chemie); Zugriff 5.1.2012