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Método cromogénico para la identificación y/o recuento de Enterococcus por la Técnica de Filtración por Membrana con el empleo del medio

m-CromoCen ENT
BioCen, código 4451

Aplicación en muestras de aguas
El método incluye una fase de identificación y enumeración presuntiva con el empleo del medio cromogénico m-CromoCen® ENT para la detección y enumeración de Enterococcus en muestras de aguas. Garantiza los resultados en 18-24 h y requiere la confirmación adicional con la prueba rápida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) y/o la prueba rápida de LAP (Leucina aminopeptidasa). Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este método: Todos los tipos de aguas donde se sospeche la presencia de Enterococcus. Resumen de la aplicación El medio basa su funcionamiento en la reacción cromogénica del sustrato 6-cloro-3-indolil-beta-Dglucopiranósido (ROSA-GLU) para la detección de actividad glucosidasa presente en el género Enterococcus, permitiendo un procedimiento sencillo en el que la presencia de Enterococcus se identifica por la aparición de colonias de color rosado claro a oscuro. En la fase confirmativa, se comprueba la presencia de Enterococcus con la prueba rápida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) y/o la prueba rápida de LAP (Leucina aminopeptidasa). La combinación de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-negativos, permite el adecuado crecimiento y recuperación de los microorganismos de interés. Procedimiento El esquema general para el método se presenta en el Esquema A. La recogida y preparación de las muestras se ejecuta según los procedimientos establecidos para la toma, transportación y recepción. Las muestras no deben sufrir daños o cambios en su composición y estado. Deben transportarse en refrigeración o en contenedores con hielo para mantener la temperatura de 1 a 4 °C. En el momento de su colecta, aquellas que contienen cloro residual, deben tratarse con 1 mL de solución al 10 % de tiosulfato de sodio por litro de muestra. Analice las muestras en el laboratorio lo antes posible. Ensaye el agua potable antes de las 30 h posteriores a su recolección y el agua bruta antes de las 6 h. Selección del tamaño de la muestra Determine el tamaño de la muestra teniendo en cuenta la densidad microbiana esperada. Para analizar aguas potables, limite el tamaño de la muestra sólo por el contenido de sólidos en suspensión (turbiedad) o por el crecimiento de los microorganismos en su conjunto en el medio. Para propósitos regulatorios, el tamaño oficial de la muestra es 100 mL. Un volumen óptimo de muestras debe proporcionar entre 20 y 80 colonias de Enterococcus por placa, aunque se logran mejores resultados al obtener de 20 a 60 colonias por placa y no más de 200 UFC/placa en la superficie de la membrana filtrante. Analice el agua potable filtrando entre 1 y 100 mL, filtre volúmenes más pequeños tales como duplicados de 50 mL o porciones de cuatro réplicas de 25 mL. Analice otros tipos de aguas con mayor densidad microbiana esperada o de mayor turbiedad filtrando hasta tres volúmenes diferentes (diluidos o no diluidos). Si el volumen de muestra a filtrar, es menor de 10 mL (diluida o no diluida), previo a la filtración, añada aproximadamente 10 mL de agua para dilución estéril al embudo, o tome con una pipeta el volumen de muestra y traspáselo a un frasco para diluciones estéril y filtre posteriormente la dilución completa. Dilución de la muestra En caso de muestras en que se sospeche un alto nivel de contaminación, prepare el agua para diluciones tamponada. Seleccione la dilución a preparar de forma tal que el número total de UFC de microorganismos diana a obtener en la placa se encuentre entre 20 y 60. No mantenga las diluciones preparadas por un período mayor de 30 min a temperatura ambiente, para evitar la multiplicación o muerte de los microorganismos. Volúmenes de muestras recomendados a filtrar en dependencia de la fuente de agua. Para consumo humano directo o indirecto:  Agua para consumo humano: 100 mL  Agua de pozos, manantiales, lagos, presas y reservorios: 10-100 mL  Puntos de entrada al procesamiento de agua: 0,1-10 mL  Agua de río: 0,001-1 mL Aguas recreacionales: Aguas residuales:  Piscinas: 100 mL  Cloradas: 0,01-1 mL  Playas: 0,1-10 mL  Sin clorar:0,0001-0,1 mL Procedimiento de cultivo en placas Prepare el medio m-CromoCen® ENT de ser necesario. Si las placas están preparadas con antelación y refrigeradas, permita que éstas alcancen la temperatura ambiente. Si la superficie del medio está húmeda seque las placas en la incubadora durante 30 min a 40 °C. Rotule las placas adecuadamente. Utilizando la pinza flameada, coloque la membrana filtrante con la superficie cuadriculada hacia arriba sobre la base

1. Realice los enjuagues del filtro con agua para diluciones tamponada estéril. El uso de los medios de cultivo cromogénicos y/o fluorogénicos en los laboratorios •Más rápido. Luego de la incubación. Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos 1.0 g. •Más fácil de utilizar.2 Preparación de las placas del Medio m-CromoCen® ENT: Transfiera inmediatamente a un baño con temperatura de 44 a 47 °C.2 Preparación: Disolver todos los ingredientes del medio basal en 900 mL de agua desionizada. Coloque esta membrana sobre la superficie del medio m-CromoCen® ENT teniendo especial cuidado en que no queden burbujas de aire entre la membrana y el medio. por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio esté seca.0. seque las placas en posición invertida en el horno a temperatura entre 35-55 °C.8 ± 0.porosa del filtro. Interpretación El crecimiento típico de Enterococcus en el medio m-CromoCen® ENT son colonias de color rosado claro a oscuro. Esto permite la identificación directa (o con un mínimo de pruebas adicionales).01 g. Dihidrógeno fosfato de potasio-1. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Fosfato de sodio-0. Agite vigorosamente la muestra unas 25 veces y tome posteriormente en un contenedor estéril el volumen de la muestra de agua y fíltrela conectando la bomba de vacío. 2.0 g. Disminución de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras.476 g. Esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 min. incube a 35 ºC durante 4 h.5 g.01 g. 28 h. de ser necesario.4 g. Acetato de talio.2 mL de medio en tubos estériles. Dispensar 0. abra la unidad de filtración y retire la membrana filtrante con ayuda de la pinza flameada. Agar13. Ventajas •Identificación directa. en columnas de no más de 4 placas. 2. Púrpura de bromocresol-0. el cual después de esterilizar deberá encontrase en pH 7. La detección directa de la actividad enzimática en el medio eleva la exactitud del análisis. Al terminar estos pasos. Xilosa-10.0 g. Dextrosa-2.0 g. Enfriar hasta temperatura ambiente y añadir 100 mL del suplemento esterilizado por filtración. con la tapa hacia abajo. Incube por un período de 18 a 24 h.0 g. Posteriormente.0 ± 0.0 g.5 g. introduce cambios en los criterios de identificación de las muestras (son identificados directamente). Coloque las placas en la incubadora a temperatura de 35 ± 2 °C en posición horizontal. La identificación y/o recuento de Enterococcus se realiza en un período máximo de de microbiología dedicados al control de calidad de las aguas.1 g.1 Preparación del medio: De acuerdo a la cantidad deseada. Ajustar el pH. Composición del Reactivo revelador: p-dimetilaminocinaldehído-0. Los microorganismos Gram-negativos resultan inhibidos en el medio. La aparición de un color rojo intenso tras la adición del reactivo 2 . Inmediatamente ante de su uso. 2. Esterilizar en autoclave a 115 ºC durante 10 min. Cloruro de sodio-2. examine las placas para determinar la presencia de colonias típicas de Enterococcus o para su enumeración.01 g. agua desionizada o destilada-900 mL.06 g/L de agua destilada o desionizada. antes y después de procesar cada una de las muestras. El medio debe tener el pH 7. La presencia de colonias coloreadas no permiten confusión. Realice otro enjuague de aproximadamente 20 mL de agua para diluciones. Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos.1 Composición del Medio de cultivo basal para la prueba rápida PYR (Caldo Todd-Hewit): Infusión cerebro corazón-10.2. •Más preciso.0 g. teniendo en cuenta no dañar la membrana. Una el filtro con la base con la ayuda del cierre. 1.3 Procedimiento: Con un asa estéril pique una colonia de interés e inocule el Caldo PYR. agua desionizada-100 mL. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE A TEMPERATURAS MAYORES DE 115 °C. Su Sensibilidad y Especificidad diagnósticas son superiores a las de los medios convencionales destinados al mismo propósito para los microorganismos de interés. •Más confiable. Las colonias incoloras o con pigmentación propia corresponden a otras bacterias Gram-positivas. adicione una gota del reactivo revelador p-dimetilaminocincaldehído y espere 1 min para leer la reacción. Composición del suplemento: L-pirrolidonil--naftilamida-0. Prueba Rápida de PYR (Pirrolidonil arilamidasa) 2. Peptona-20. Mezcla cromogénica-0. Medio m-CromoCen® ENT Composición: Bases nutritivas-8.2: debe ser de color amarillo y estar transparente. Hervir hasta disolución completa.0 g. agua desionizada-100 mL. Fosfato dipotásico-5. Carbonato de sodio-2. pesar el polvo en proporción de 38. Coloque aproximadamente un volumen de 20 mL de agua para diluciones estéril y fíltrela previamente. cuyos resultados no presentan diferencia con la identificación realizada por bioquímica tradicional.

4. 4. Almacenamiento del medio m-CromoCen® ENT  Mantener el frasco con el medio deshidratado herméticamente cerrado en lugar seco. solución salina-100 mL. tel. avium y E. Incube a 35-37 ºC durante 30 min. 8-81-70-24. 4. 4. 3. dispense en contenedores apropiados (frascos graduados o frascos de Erlenmeyer para el enjuague del filtro) y esterilice en el autoclave. Agua destilada-1000 mL.2 con el NaOH 1N y complete el volumen a 1000 mL con agua destilada.34. Diagrama de flujo para la determinación de Enterococcus en muestras de aguas. -LAP Negativo: Disco y/o solución de color amarillo o incoloro. e-mail: raisa@biocen.2): Añada 1. esterilizar por filtración y distribuir cantidades de 2 mL en tubos de ensayo estériles. Carlos Prendes. de color rosado claro a oscuro) Ejecutar.revelador indica una prueba positiva. particularmente E. Esterilice en autoclave a 121ºC durante 15 min. Para mayor información dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. a temperatura de 15 a 30 °C  Se podrá almacenar las placas listas para el uso por un período de 30 días a temperatura de 2 a 8 °C. tel. 047-68-2441. raffinosus. Algunas cepas de Enterococcus.01 g del sustrato leucina-β-naftilamida a 100 mL de solución salina.cu Diagrama A.25 mL de la solución stock de buffer fosfato y 5 mL de la solución stock de MgCl2 para cada litro de agua destilada preparada. pueden no producir LAPasa.1 Preparación Pesar la cantidad deseada y esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 min. fresco.1 Preparación Ajuste el pH de la solución a 7. e-mail: prendes@biocen.2. adicionando los discos al tubo que contiene el sustrato disuelto en solución salina. 3.5-1 mm de Ø). Prueba rápida de LAP (Leucina aminopeptidasa) Composición: leucina-β-naftilamida-0. la confirmación de las colonias sospechosas de Enterococcus con la prueba PYR y/o la prueba LAP 3 . protegido de la luz.1 g del hexahidratado). Almacene en refrigeración ambas soluciones stock después de la esterilización y manipúlelas asépticamente. Agua para diluciones tamponada. protegidas de la luz.1 Preparación: Añadir 0. Mezcle bien. Agua destilada-500 mL. 4. de ser necesaria. Solución de trabajo final (pH 7. 3. la prueba se considera negativa.0  0.N-dimetilaminocincaldehído y deje a temperatura ambiente hasta 5 minutos.1 Solución stock de buffer de fosfato Composición: Dihidrógenofosfato de potasio (KH2PO4).01 g.2 Procedimiento: Prepare una suspensión densa a partir de un cultivo puro en solución fisiológica estéril y e inocule los tubos que contienen el sustrato disuelto en solución salina.2 Solución stock de MgCl2 Composición: MgCl2 anhidro-38 g (o 81. Interpretación: -LAP Positivo: Disco y/o solución de color rosado a rojo. Proteger de la luz. Si aparece un color amarillo o anaranjado.1. La prueba se realizará de forma alternativa si posee los discos LAP.cu Asistencia técnica: DrC Raisa Zhurbenko. en aerobiosis.0 g. Muestra de agua Tomar en un contenedor estéril muestras con el volumen a filtrar Enjuagar del filtro con el agua para diluciones tamponada estéril (20 mL) Filtrar el volumen de la muestra Realizar el enjuague posterior (20 mL) Colocar la membrana filtrante en el medio m-CromoCen ENT Incubar las placas a 35  2 ºC durante 18-24 horas Identificar las colonias de Enterococcus (colonias de pequeño tamaño (0. Adicione una gota del reactivo revelador N.