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Método cromogénico-fluorogénico para el aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 con el empleo del medio CromoCen® ECCS

BioCen, código 4293

El método incluye una fase de identificación presuntiva con el empleo del medio cromogénico CromoCen® ECCS para el aislamiento e identificación de Escherichia coli O157:H7 en muestras de diferentes alimentos. Garantiza los resultados en 18-24 h y requiere la confirmación adicional con las pruebas rápidas de citocromo oxidasa, GAD (Glutamato descarboxilasa) o Indol y aglutinación con antisueros O157 y H7. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este método: alimentos cárnicos no procesados térmicamente o cualquier otro tipo de alimentos en los que se sospeche la presencia de Escherichia coli O157:H7. Resumen de la aplicación El medio basa su funcionamiento en la combinación del sustrato cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-Dgalactopiranósido (X-GAL) para la detección de la enzima β-D-galactosidasa y del sustrato fluorogénico 4metilumbeliferil-β-D-glucurónido (MUG) para la detección de la actividad glucuronidasa, que conjuntamente con la degradación del sorbitol presente en el medio, posibilita la diferenciación de Escherichia coli O157:H7 (MUG negativa, sorbitol negativa) de E. coli, los coliformes y otras bacterias Gram-negativas, permitiendo un procedimiento sencillo, mediante el cual Escherichia coli O157:H7 se identifica por la aparición de colonias de coloración azul verdosa, con bordes traslúcidos y sin fluorescencia bajo luz UV a 366 nm. En la fase confirmativa, se comprueba la presencia de este microorganismo con las pruebas rápidas de Citocromo oxidasa, GAD (Glutamato descarboxilasa) o Indol y las serológicas. Otras bacterias Gram-nagativas pueden ser diferenciadas o identificadas presuntivamente en este medio, tales como Salmonella spp. y Pseudomonas. La combinación de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Grampositivos, permite el adecuado crecimiento y recuperación de los microorganismos de interés. Procedimiento (Ver esquemas del método). Siembra en placas e identificación. Los métodos de siembra en el medio CromoCen® ECCS dependen del tipo de muestras a ensayar y el propósito (identificación o recuento). Para la identificación se recomienda la siembra por agotamiento del inóculo en la superficie por estrías y/o el método de inundación de la superficie. Para el recuento, se recomienda el método de inundación de la superficie. Es importante que el laboratorio reciba muestras que no hayan sufrido daños o cambios en su composición y estado. Asegúrese que el pH no disminuya a valores inferiores a 4,5 durante el proceso de preenriquecimiento (si se requiere para E. coli O157:H7 ó Salmonella). El pH de alimentos ácidos y acidificantes es más estable en agua peptona buferada de doble concentración. El método de siembra por agotamiento del inóculo en la superficie (por estrías) consiste en sembrar un inóculo con el objetivo de obtener colonias aisladas para su estudio. Coloque la placa con el medio de cultivo CromoCen® ECCS sobre una superficie lisa. Se esteriliza a la llama un asa de nicrom, se enfría y se toma el inóculo. Se levanta ligeramente la tapa de la placa de Petri y se va arrastrando el inóculo desde un borde de la placa al otro realizando líneas rectas en zig-zag bien apretadas, avanzando hacia el centro. Se gira la placa en un ángulo de aproximadamente de 70 a 90 º y se realiza el estriado entrecruzando los cuadrantes. En el último cuadrante se realiza el zig-zag menos frecuente, es decir, con líneas más separadas para garantizar el aislamiento de las colonias. Este método puede hacerse flameando el asa al pasar de un cuadrante a otro, sobre todo si el inóculo de partida está muy concentrado. El método de siembra por inundación de la superficie, se ejecuta distribuyendo homogéneamente el inóculo con ayuda de una espátula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule de 0,1 a 0,5 mL de la porción de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen® ECCS. Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una espátula de Drigalsky estéril (embeber en alcohol y flamear), girando esta última siempre en posición totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Deje la placa en reposo por 5–10 min para que la muestra penetre en el lecho del agar. Para E. coli O157:H7: Para algunas muestras, los procedimientos establecidos pueden recomendar el enriquecimiento de las muestras sospechosas previo a su identificación en diferentes medios de enriquecimiento, tales como agua peptona alcalina, incubando a 35 ± 2 °C por 18-24 h. El recuento se realiza a partir de la siembra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ningún paso previo de enriquecimiento. Incube el medio a 35 ± 2 ºC durante 18-24 h.

Aplicación en muestras de alimentos

• Pantoea agglomerans crece en el medio como colonias azules con o sin halo azul. • Pseudomonas aeruginosa se distingue en el medio por la presencia de colonias rosa pálidas con fluorescencia verdosa. Para la detección y/o recuento de coliformes fecales. a 37 ± 1 ºC durante 24 ± 3 h. rojas con centro verdoso o violetas con fluorescencia amarilla o verdosa. bordes traslúcidos con o sin fluorescencia amarilla y con o sin precipitado biliar. crecen como colonias rojas con centro verdoso y fluorescencia amarilla. se recomienda incubarlo a 42 ± 2 ºC. En la incubadora. Algunos órganos regulatorios pueden exigir la confirmación de E. Tenga especial cuidado para que la temperatura de incubación no exceda los 42.L. (medio selectivo). Interpretación En el medio CromoCen® ECCS. coli por algunas pruebas adicionales a la detección de actividad galactosidasa y glucuronidasa. Para Salmonella: Incube la suspensión inicial para el pre-enriquecimiento no selectivo a 37 ± 1 ºC durante 18 ± 2 h procediendo luego al enriquecimiento selectivo. • Salmonella spp. Para esto. con o sin fluorescencia amarilla o verdosa. coli O157:H7) pueden crecer en el medio como colonias violetas o azul verdosas. sembrando por estriado (agotamiento del inóculo) en las placas. Con posterioridad a la incubación. observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Los coliformes (excepto E. utilice dos placas pequeñas. y CromoCen® ECCS). El medio brinda posibilidades adicionales de diferenciación para el personal debidamente entrenado según se explica a continuación: • Las cepas de Escherichia coli crecen en el medio como colonias violetas o azul verdosas. se procederá a identificar las colonias que pudieran ser consideradas como atípicas en el medio CromoCen® ECCS. así como para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras especies de Pseudomonas productoras de pigmento pioverdina.5 ºC por 24 ± 3 h y el CTT. Incube las placas invertidas a 37 ± 1 ºC (X. En el caso de muestras en las cuales no sea detectado crecimiento de colonias sospechosas en el medio CromoCen® ECCS. una a continuación de la otra. con las pruebas bioquímicas establecidas en el estándar ISO 6579. con la tapa hacia abajo. Proceda de igual forma con el medio CromoCen® ECCS. citocromo oxidasa negativas. en columnas de no más de 4 placas. o Serratia spp. crecen como colonias de diferentes tonalidades de violeta. respuestas características en el medio CromoCen® ECCS. Incube el CRVS inoculado a una temperatura de 41. Realice tantas réplicas como sean necesarias a partir de cada uno de los medios de enriquecimiento selectivo.5 ºC. examine las placas para determinar la presencia de colonias típicas de los microorganismos diana y las atípicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. el crecimiento típico de Escherichia coli O157:H7 se identifica por la presencia de colonias de color azul verdosas. inocule con la ayuda del asa la superficie de la placa de Agar X. por agotamiento del inóculo con el objetivo de obtener colonias aisladas. en su mayoría con fluorescencia azul. Incube el medio a 35 ± 2 ºC durante 18-24 h. 2 . también pueden presentarse de color azul con o sin halo azul. • Las cepas de Citrobacter spp.Para E. • Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio. Al finalizar la incubación. se procederá a ensayar las colonias sospechosas provenientes de X. transfiera 0. coloque las placas en posición horizontal. sin fluorescencia. con bordes traslúcidos. examine las placas de ambos medios para determinar la presencia de colonias típicas de Salmonella y las atípicas (sospechosas) que pudieran considerarse Salmonella. • Las cepas de Klebsiella spp. GAD o indol positivas. se recomienda incubarlo a 42 ± 2 ºC. utilizando los cultivos procedentes de CRVS y CTTN.L. agrúpelas en no más de 4 placas por columnas. utilizando la misma asa. En este caso.1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de Caldo Rappaport Vasiliadis con Soya (CRVS).D. coli y coliformes: El recuento se realiza a partir de la siembra de la muestra o sus diluciones directamente en la placa sin ningún paso previo de enriquecimiento. • Las colonias incoloras o con pigmentación propia son características de otras bacterias Gramnegativas. • Las cepas de Enterobacter spp. Luego de la incubación. En caso de no contar con placas grandes. Para la identificación y/o recuento de coliformes fecales. Con posterioridad a la incubación. De manera similar.L. crece como colonias rojas o rojas con centro beige. Incube la placa en una incubadora bacteriológica a 35 ± 2 °C por 18-24 h.D.D. de diferentes tonalidades de violeta. coli se puede ejecutar con la prueba de glutamato decarboxilasa y/o la prueba rápida de indol (positivas ambas). la confirmación de las colonias sospechosas de E. mucoides. transfiera 1 mL del cultivo obtenido a un tubo que contenga 10 mL de (Caldo Tetrationato (CTTN)). crecen en el medio como colonias violetas.

pesar el polvo en proporción de 44. el cual después de esterilizar deberá encontrase en 7.4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptófano. Bajo estas condiciones el producto permanecerá útil hasta la fecha de caducidad que figura en la etiqueta. de ser necesario. Disminución de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras. Interpretación: La presencia de una coloración azul o marrón (en dependencia del reactivo que se use) indica una prueba positiva y por consiguiente la presencia de la enzima citocromo oxidasa en el microorganismo. 1. Agar-13.1 Preparación: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada. Prueba de Citocromo oxidasa La prueba debe realizarse con un asa de platino para evitar los resultados falsos positivos. Incube a 37 ºC durante 2 h. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. cloruro de sodio. asegurándose que los recipientes queden en posición vertical. 2.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0.2. la colonia de interés y frotarla sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo.48 g. indirecto de Kovacs y el método de tiras o discos impregnados con el reactivo tetrametil (o dimetil)–p–fenilendiamina. 3 . Tras su utilización colocar los bulbos en refrigerador. Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos 1. por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio esté seca. Su Sensibilidad y Especificidad diagnósticas son superiores a las de los medios convencionales destinados al mismo propósito para los microorganismos de interés. La detección directa de la actividad enzimática en el medio eleva la exactitud del análisis. • Más preciso. mezclar bien. Almacenamiento: El reactivo debe ser almacenado entre 2 – 8 °C.Ventajas Más rápido. Manipulación: No dejar que el reactivo se contamine por mal manejo de las muestras.0 g/L de agua destilada o desionizada.10. Dispense el medio en placas de Petri estériles y deje solidificar.0 g. 3.2 Preparación de las placas del Medio CromoCen® ECCS. más económico. Existen 3 métodos para su detección: en placa directa. • Más confiable. 3. Procedimiento: Tomar con un asa de platino. cuyos resultados no presentan diferencia con la identificación realizada por bioquímica tradicional. 4.1 Preparación De acuerdo a la cantidad deseada. 1. La identificación presuntiva de Escherichia coli O157:H7 se realiza en un período máximo de 28 h.0 g. este último tiene la ventaja de ser más rápido. 3. Prueba Rápida de indol Prueba de Arnold Weaver Medios de cultivo: Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptófano. Asegurarse que los bulbos están bien cerrados tras su uso para evitar la contaminación y desecación del reactivo.0 g. Mezcla cromogénica-1. Transfiera inmediatamente a un baño con temperatura de 44 a 47 °C. previamente esterilizada a la llama. Cloruro de sodio-5.0 g. Prueba Rápida de GAD (Glutamato descarboxilasa) Forma de presentación: Bulbo con 5 mL del reactivo suficiente para 25 pruebas.5 g.0 g.0 ± 0. distribuir y esterilizar a 121 °C por 15 min. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. No necesita esterilización durante su preparación. Sorbitol-7. Composición: Hidrolizado enzimático de caseína. Medio CromoCen® ECCS Composición: Bases nutritivas-17. • •Más fácil de utilizar. Hervir hasta disolución completa y distribuir. Esto permite la identificación directa (o con un mínimo de pruebas adicionales).5. y que el reactivo permanece estable por lo menos hasta 6 meses después de preparado. seque las placas en posición invertida en el horno a temperatura entre 35-55 °C. Interpretación: El color rojo en la capa reactiva indica formación de indol. Ajustar el pH. Inmediatamente ante de su uso. La presencia de colonias coloreadas no permiten confusión.

Para coliformes fecales o para diferenciar Pseudomonas aeruginosa de otras Pseudomonas (opcional) incube a 42 ± 2 °C por 18 . e-mail: prendes@biocen. caldos. identificación y/o recuento de E.cu Asistencia técnica: DrC Raisa Zhurbenko. agua peptonada tamponada. coli.24 h.2 mL de solución salina al 0. Procese los resultados. 4. por el método cromogénico con el medio CromoCen® ECCS Prepare la muestra según su origen y el método de siembra a emplear. coliformes y Pseudomonas. Interpretación: Cualquier cambio de color de amarillo a verde o azul se considera como reacción positiva. protegido de la luz. Almacenamiento del medio CromoCen® ECCS: • Mantener el frasco con el medio deshidratado herméticamente cerrado en lugar seco. fresco.Procedimiento: 1. protegidas de la luz. 047-68-2441. o según proceda. sin fluorescencia.85 % estéril. o a partir de las diluciones seriadas. Identifique y/o cuente las colonias diana según se describe en el presente método. e-mail: raisa@biocen. Procese los resultados. Incube a 35 ± 2 °C por 24 h. coli O157:H7 por el método cromogénico con el medio CromoCen® ECCS Muestra en agua peptona buferada (opcional. no ejecutar) (Homogeneice). 0. Incube a 35 ± 2 °C por 18 . Para mayor información dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Picar una colonia de interés y suspenderla en la solución salina antes mencionada.5 mL para muestras líquidas. De ser necesario. 2. Confirme si es necesario con las pruebas adicionales que se describen (GAD o indol para E. B: Detección. coli. Incube a 35 ± 2 °C por 18 .. El tubo se incuba a 35 ºC durante 4 h observando cada 30 min. a temperatura de 15 a 30 °C • Se podrá almacenar las placas listas para el uso por un período de 30 días a temperatura de 2 a 8 °C. Inocule la placa de CromoCen® ECCS por agotamiento del inóculo en la superficie (estrías) o por inundación de la superficie. con bordes traslúcidos. tel. directamente de la muestra o del cultivo en caldo. tel. GAD (o indol) y aglutinación con antisueros O157 y H7. 3. prepare diluciones seriadas según los niveles de contaminación esperados. Permitir que el reactivo alcance la temperatura del ambiente.cu Diagramas de flujo para la determinación de Escherichia coli O157:H7 en muestras de alimentos con el empleo del medio CromoCen® ECCS A: Aislamiento e identificación de E.2-0.24 h. o a partir de diluciones.5 mL para muestras líquidas. Para muestras sólidas. 8-81-70-24. A la suspensión preparada se le añade 0. o con el tamaño de muestra recomendado. Las colonias son confirmadas para su reacción positiva a la prueba de citocromo oxidasa. si es para recuento.2 mL del reactivo de GAD en condiciones asépticas. Carlos Prendes.24 h. suspenda la muestra en agua peptonada. 4 . o citocromo oxidasa para Pseudomonas). 5.2-0. coli O157:H7 como colonias de color azul verdosas. Identifique E. directamente de la muestra. Dispensar en tubos de cultivo transparentes y estériles 0. Inocule la placa de CromoCen® ECCS por agotamiento del inóculo en la superficie (estrías) o por inundación de la superficie con 0.

identificación y/o recuento de Salmonella.C: Detección. por el método cromogénico con el medio CromoCen® ECCS 5 .