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PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS POR CUPRIAVIDUS NECATOR USANDO ÁCIDO ACRÍLICO COMO FONTE DE CARBONO

Leandro Finkler

TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS

NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS EM ENGENHARIA QUÍMICA.

Aprovada por: ________________________________________________ Prof. Tito Livio Moitinho Alves, D.Sc.

________________________________________________ Prof. José Carlos Costa da Silva Pinto, D.Sc.

________________________________________________ Profa. Denise Maria Guimarães Freire, D. Sc.

________________________________________________ Prof. Márcio Nele de Souza, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Marco Di Luccio, D. Sc.

RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL FEVEREIRO DE 2006

FINKLER, LEANDRO Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono [Rio de Janeiro] 2006 IX, 144 p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ, D.Sc., Engenharia Química, 2006) Tese - Universidade Federal do Rio de Janeiro, COPPE 1. Produção de polihidroxialcanoatos 2. Processo de separação 3. Monitoramento de processo 4. Bioreator coluna de bolhas I. COPPE/UFRJ II. Título ( série )

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Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo...

Fernando Pessoa

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Dedico sem dúvida alguma a meus pais Elio e Isolde que sempre me incentivaram a acreditar nos meus sonhos desde há 16 anos quando saí de casa para estudar e não parei mais, e também a meus irmãos Cristiano e Francieli que mesmo nos poucos encontros dos últimos anos sempre nos fizemos família.

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AGRADECIMENTOS

Aos professores Tito Livio Moitinho Alves e José Carlos Costa da Silva Pinto por supervisionarem os trabalhos.

Ao sempre lembrado e “bom velhinho” Professor Giulio Massarani que nos únicos 20 minutos de conversa, marcados no relógio, que tivemos, conseguiu me apresentar um pesquisador autêntico.

Aos colegas e técnicos dos diferentes laboratórios do PEQ: LMSCP, LabBio, LSP, LabPol, PAM, NUCAT pelo auxílio nas atividades.

Aos amigos de todas as horas Márcio Schwaab, Paulo Farinas e Nielson pelo companheirismo na república na Ilha do Governador.

À Christine Lamenha Luna por disponibilizar o seu tempo, sua alegria, sua paciência, seus conselhos, sua compreensão e seu afeto.

Aos meus familiares, por acreditarem que chegar aqui não era apenas um sonho de um “menino” da pequena cidade de Selbach.

Ao CNPq pelo apoio financeiro na forma de bolsa.

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Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)

PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS POR CUPRIAVIDUS NECATOR USANDO ÁCIDO ACRÍLICO COMO FONTE DE CARBONO

Leandro Finkler

Fevereiro/2006

Orientadores: Tito Livio Moitinho Alves José Carlos Costa da Silva Pinto

Programa: Engenharia Química Neste trabalho foi desenvolvido um processo para produção de

polihidroxialcanoatos a partir de células bacterianas de Cupriavidus necator DSM 545 utilizando ácido acrílico como única fonte de carbono. O alto custo de produção de polihidroxialcanoatos exige que certas estratégias de operação não convencionais sejam adotadas. No presente trabalho algumas destas estratégias foram estudadas, tais como: I) monitoramento da produção de biomassa em cultivos em meio complexo (caldo nutriente) através do emprego de uma sonda de potencial redox para sinalizar o final da fase de crescimento das células; II) concentração de células cultivadas em meio complexo utilizando os agentes floculantes tanino (2800 mg/L) e sulfato de alumínio (800 mg/L), com posterior sedimentação para recuperação do concentrado; III) desenvolvimento de biorreatores não convencionais, como um biorreator tipo coluna de bolhas, assistido por membrana de diálise proposto neste trabalho de forma inovadora. Os resultados obtidos mostram que as células consomem ácido acrílico a uma taxa de 0,01 g/L.h para crescimento celular e 0,18 g/L.h para manutenção em condição washed cells. O potencial redox pode ser utilizado com eficiência para o monitoramento do crescimento em meio complexo, bem como para determinar a alimentação do biorreator coluna de bolhas. As células concentradas a partir da adição de sulfato de alumínio como agente floculante mostraram menor inibição da atividade metabólica, quando comparada à adição de tanino.

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III) development of non-conventional bioreactors.h to cellular grow and 0. necator uses acrylic acid at rate 0. which was originally designed in the present work. The results obtained indicate that C. and to define the feeding time in bubble column bioreactor. II) concentration of bacterial cells produced in complex medium by using the flocculating agents tannin (2800 mg/L) and aluminum sulphate (800 mg/L).Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Science (D. vii . such as those analyzed in the present work: I) monitoring of the bacterial cells concentration using a redox probe to indicate the end of the growth phase of C. necator cells in broth nutrient medium. such as a bubble column bioreactor assisted by dialysis membrane.01 g/L. Redox potential can be employed efficiently for monitoring growth of the bacterial cells in complex medium.18 g/L. with posterior sedimentation to obtain a concentrate of cells.Sc.h to maintaining in washed cells condition. The high costs to produce polyhydroxyalkanoates requires non-conventional production strategies.) PRODUCTION OF POLYHYDROXYALKANOATES FROM CUPRIAVIDUS NECATOR USING ACRYLIC ACID AS CARBON SOURCE Leandro Finkler February/2006 Advisors: Tito Livio Moitinho Alves José Carlos Costa da Silva Pinto Department: Chemical Engineering A process for production of polyhydroxyalkanoates by Cupriavidus necator DSM 545 using acrylic acid as the single carbon source was developed. Concentrate of bacterial cells obtained through aluminum sulphate addition presented lower inhibition effect on the metabolic activity when compared to tannin addition.

ALVES. Brasil. PINTO.C. T. “Acrylic acid consumption by Cupriavidus necator DSM 545 using resting cells system”..L. 2004. T.M.C. Recife.C.. 4o Congresso Mercosul de Engenharia Química. XV Simpósio Nacional de Bioprocessos. Rio de Janeiro. “Use of byproducts of the bean industry for polyhydroxyalkanoates production”. 2005. T. FINKLER. Este trabalho foi financiado pelo CNPq: FINKLER. J.L.L.Partes desta tese foram apresentadas e publicadas em anais de congressos. Congresso Brasileiro de Sistemas Particulados/ENEMP. Brasil. Uberlândia. FINKLER. ALVES. J.. L.M. PINTO. Congresso Brasileiro de Engenharia Química. 2004. Curitiba. Brasil.M... PINTO. T. L. ALVES.L. ALVES. C.. L.. L.. “Concentração de células de Ralstonia eutropha DSM 545”. 2005... “Utilização de fontes alternativas de carbono para produção de polihidroxialcanoatos por Ralstonia eutropha DSM 545”. viii . PINTO..C.. J. J.M. Brasil. LUNA.L.. FINKLER.

Capítulo 6....... Capítulo 3........... Capítulo 2..... Anexos .............ÍNDICE GERAL Capítulo 1................ 1 8 25 50 69 Capítulo 5.... Introdução .............. Polihidroxialcanaoatos ................................. Capítulo 4................................................ 99 Capítulo 7.............. 119 138 141 Capítulo 8................................... Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545.............. Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e biodegradação de ácido acrílico visando a produção de polihidroxialcanoatos .. Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico ..................................................... Conclusões e Sugestões ............................................................................................... ix .......................................................................... Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação .................................. Estratégias para biodegradação de ácido acrílico visando a produção de polihidroxialcanaotos por Cupriavidus necator DSM 545 .........

. Referências bibliográficas ........... 2 5 ..CAPÍTULO 1 Introdução Índice 1...1............................................................................ 1..2............................................................ Introdução ....................................

PRIETO et al.. 1999) são estabelecidas para maximizar a produção de massa celular e atingir alta densidade (RYU et al. 1997) no biorreator. este depende da sua composição e da pureza obtida na etapa de extração. PREUSTING et al. haja vista o crescente aumento da população mundial e o grande intervalo de tempo necessário para a degradação dos resíduos.1. 1998. RUSENDI e SHEPPARD.. Quanto ao destino do produto final. A combinação de substratos pode resultar na biossíntese de polihidroxialcanoatos com propriedades distintas.. a fim de aumentar a produtividade. com linhagens selvagens. SNELL e PEOPLES. permitindo a economia de energia com a centrifugação e a redução do custo final da produção. 2001).. Muitos trabalhos são publicados com o objetivo de apresentar soluções para minimizar os custos de produção de biopolímeros. como por exemplo a utilização de agentes floculantes para separação das células (RYU et al. Também há a preocupação com a etapa de “downstream”. Em alguns.. uma vez que a etapa de extração pode modificar algumas propriedades do material como a distribuição de massa molar. Uma alternativa vem sendo desenvolvida como uma tentativa de substituir os polímeros de origem de derivados do petróleo por biopolímeros. 1995. 1995).CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 1. mutantes ou recombinantes (HUISMAN et al. 2001.. JUNG et al. 1999). 1992. estratégias de cultivo contínuo (KOYAMA e DOI. 2000.. 2002. Introdução A preocupação com a poluição do ambiente vem ganhando cada dia mais importância.. 2002)). eucariotas (leveduras (BREUER et al. é proposta a utilização de substratos alternativos para utilização na produção de polihidroxialcanoatos (BRAUNEGG et al. 2002) e plantas (POIRIER.. 1995. Em outros.. 1991) ou descontínuo (KOYAMA e DOI. e não retirar toda a impureza incrustrada ao biopolímero (RAMSAY et al. CHEN et al.. 2005). a presente tese de doutorado tem como objetivo principal desenvolver um processo que permita a biodegradação de ácido acrílico por células de 2 . cuja vantagem principal está no menor tempo necessário para biodegradação. Dessa forma. MANTZARIS et al. MARANGONI et al. que melhoram as propriedades do polímero final e facilita a confecção de utensílios em geral. 2001). 1994. 1993).. em especial daqueles pertencentes à classe dos polihidroxialcanoatos (PHAs).. em especial quando as células são capazes de sintetizar co-polímeros (DU et al.. Os trabalhos descrevem experiências com diferentes tipos de células procariotas (POIRIER et al.

No Capítulo 2 é feita uma revisão sobre os polihidroxialcanoatos. os flocos foram caracterizados quanto à densidade. necator a partir do ácido acrílico. são concentradas pela adição de um agente floculante e este concentrado é utilizado na câmara interna (zona de biorreação) de um biorreator assistido por membrana de diálise construído no Laboratório de Bioprocessos. 2004). monitorado pela variação do potencial redox. A alimentação de ácido acrílico como fonte de carbono é realizada através da membrana. devido à variação do gradiente de concentração do ácido. No Capítulo 3 são apresentados os resultados referentes aos ensaios de crescimento das células em ácido acrílico. diâmetro médio e distribuição de tamanhos. Também são apresentados resultados referentes à definição da concentração de ácido acrílico que inibe o crescimento de C. Primeiramente. necator pelo processo de floculação/sedimentação. a alimentação de ácido acrílico foi realizada através do controle do pH do meio de cultura durante o cultivo celular. visando a produção de polihidroxialcanoatos. necator e os referentes ao monitoramento do crescimento celular pela variação dos valores da densidade ótica e do pH. no Capítulo 5 é apresentado o monitoramento do crescimento de células de C. A fim de obter o concentrado celular para o sistema “washed cells”. necator foi concentrada e utilizada num sistema “washed cells”. as células de C. tendo sido utilizados os agentes de floculação tanino e sulfato de alumínio. No Capítulo 4 são apresentadas as estratégias para a produção de PHAs por C. necator foram transferidas para um meio de cultura sem a presença de fonte de nitrogênio. a partir da variação dos valores de potencial redox e da correlação destes valores com a concentração de massa celular. enfatizando aqueles produzidos por Cupriavidus necator*. avaliando-se ainda a capacidade operacional de um sedimentador contínuo a partir de testes de sedimentação * O nome Ralstonia eutropha será mantido na Revisão Bibliográfica sendo substituído por Cupriavidus necator em Materiais e Métodos. 3 . nova nomeação para Ralstonia eutropha (VANDAME e COENYE.CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Cupriavidus necator DSM 545. As células cultivadas em meio complexo. necator em meio complexo. no Capítulo 6 é apresentada a etapa de concentração de células de C. a massa celular de C. e por último. Tendo sido definido o sistema “washed cells” para a continuação dos trabalhos. Para cada um dos agentes floculantes. numa segunda estratégia. verificar se a relação entre potencial redox e biomassa é verdadeira quando observada em um sistema de microfiltração utilizando membranas de fibras ocas. Resultados e Discussão e Conclusões. Além disso.

1). Hidrolisado Protéico ou Ácido Acrílico Substrato Efluente isento de ácido acrílico X S Monitoramento REDOX Cupriavidus necator DSM 545 2X Concentração Separação Biocatalisador Caixa Preta X Extração Reciclo PHA Figura 1. necator. a obtenção de massa de células de C. Além disso. com alimentação descontínua de caldo nutriente sinalizada pela variação do potencial redox do meio de cultivo. As conclusões gerais e as sugestões para trabalhos futuros são apresentadas no Capítulo 8.1. Na primeira etapa do processo proposto (Figura 1.CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono em batelada. conforme é observado no fluxograma da Figura 1. e para suprimento de ácido acrílico ao concentrado celular mantido no interior da membrana. necator DSM 545 a partir de meios complexos (hidrolisado protéico) tem um forte apelo uma vez que é grande a variedade de efluentes industriais que também não possuem uma composição química definida. também foi avaliado o efeito dos agentes floculantes sobre a atividade das células. Também são apresentados os resultados obtidos a partir do uso deste equipamento para crescimento de células de C. quando estas foram inoculadas em meio caldo nutriente.1. O crescimento de células em meio complexo pode ser monitorado por uma 4 . No Capítulo 7 é apresentado um desenho de um biorreator não convencional assistido por membrana de diálise. Os trabalhos desenvolvidos em cada capítulo permitem propor a seqüência de um processo. mas estão disponíveis a preços muito baixos. Fluxograma para um processo alternativo para biodegradação de ácido acrílico e verificação da produção de polihidroxialcanoatos.

PARK. 153-157. TERENTIEV. I. K. pp.W. G. ou ainda conduzido para extração do biopolímero. LUN. 380-386. G. Macromolecular Bioscience. LEFEBVRE. 2005. W. 103-110.. J. PREUSTING. G. A etapa de concentração de células é proposta ao processo uma vez que é importante..L. 1999. YU.. CHIEN. DU. CHEN. HUISMAN. 1998.. O concentrado celular pode ser utilizado em um processo de biodegradação em um bioreator coluna de bolhas. pp. LUN. v.. v. 2001. B.2. 34. cuja parede é uma membrana de diálise que permite haver o suprimento de ácido acrílico como fonte de carbono a partir da variação do gradiente de concentração. KIM. C. G.. “Recovery of poly-3hydroxybutyrate from Alcaligenes eutrophus by surfactant-chelate aqueous system”. biopolyesters from renewable resources: physiological and engineering aspects”. K. 8. DU. v... Research in Microbiology. 38... K.CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono sonda que mede a variação do potencial redox do meio de cultivo. H... Applied Microbiology and Biotechnology. Esta forma de monitoramento é interessante. ou reciclado para obter maior volume de concentrado celular.G. I.... KUNZE.. pois a sonda é barata e a aquisição dos dados é simples. “Yeast as producer of polyhydroxyalkanoates: genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae”. BREUER. 1992. v. pp.H.C. de KONING. 5 . 1. Y. G. 156. S. em processos de biodegradação ou de produção de biopolímeros. WONINK.. Uma maneira de conseguir alta densidade celular a partir de células crescidas em meio complexo é através da adição de agentes floculantes seguida de sedimentação. “Synthesis of poly(3-hydroxyalkanoates) by mutant and recombinant Pseudomonas strains”. Biochemical Engineering Journal.. G. Referências bibliográficas BRAUNEGG. trabalhar com alta densidade celular para aumentar a produtividade e/ou taxa de biodegradação de um composto xenobiótico.. WITHOLT. 65.. v. v. pp. CHEN. GENSER. Y. 2002. U.. J. “Spontaneous liberation of intracellular polyhydroxybutyrate granules in Escherichia coli”. “Feeding strategy of propionic acid for production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) with Ralstonia eutropha”. BABEL. S.C. E. 2. pp. 1-5. YU.. 865-873. KIM. Process Biochemistry. pp. J. G. 127-161.. “Polyhydroxyalkanoates.. H.K. PHYO. JUNG. Journal of Biotechnology.

... Biotechnology.. “ Engineering of stable recombinant bacteria for production of chiral medium-chain-length poly-3-hydroxyalkanoates”. R. 1991. v.F.. ARAGÃO. WITHOLT. 3. v. “Production of polyhydroxyalkanoates a family of biodegradable plastics and elastomers in bacteria and plants”. C. pp. Y. KINGMA.. N. SRIENC. v. “Continuous production of poly(3-hydroxybutyrate-co3-hydroxyvalerate) by Alcaligenes eutrophus”.A. RAMSAY. p. SHEPPARD. “Physiology and polyester formation of Pseudomonas oleovorans in continuous two-liquid phase culture”. 175-180. v.. 18. KELLERHALS. Journal of Environmental Polymer Degradation.CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono KOYAMA. M. RAMSAY. DOI. “Hydrolysis of potato processing waste for the production of poly-β-hydroxybutyrate”.. 6 . v. RUSENDI.. G. Y.M. v. Applied and Environmental Microbiology. CHAVARIE.. A.B.A. AIChE Jounal. POIRIER. 65.B.. MARANGONI. “Polyhydroxyalkanate synthesis in plants as a tool for biotechnology and basic studies of lipid metabolism”. 281-284. MANTZARIS. C. 47. SOMERVILLE. v. Lipid. 235-240. aiming at the production of polyhydroxyalkanoate”.. Res. POIRIER. v. 589-594. H. N. 13.. J. Y. “The influence of substrate source on the growth of Ralstonia eutropha. 13. RADNOVIC. E. pp.. 41. M. C. 54. KOYAMA. pp. 1999. D. 1994. 1995. v.D... 1993.. 2002. BERGER.... G. Enzyme Microbiology Technology. Bioresource Technology. PREUSTING. B.. pp. 770-780. Prog.. 3265-3271... pp. B. “Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3hydroxyvalerate) from various carbon sources by batch-fed cultures of Alcaligenes eutrophus”. J. A. pp. 8. VOYER. pp.. Brazilian Journal of Chemical Engineering. WOTHOLT. C. 142-150.V. B. 2001. N. 17. “Extraction of poly-3-hydroxybutyrate using chlorinated solvents”. Biotechnology Techniques.. 727-743. 1995... B. F. KESSLER.A. 2001. PRIETO. 1995. 191196. NAWRATH.. BOZZATO.S. v. “Optimal carbon source switching strategy for the production of PHA copolymers”. J.. pp. 131-155. Y. Biotechnolgy Letters. pp. FURIGO Jr. DOI.. KELLEY.

T. pp. CHANG.D.K.K.W.. pp. 28-32. Biotechnology Progress.S. O. RYU. Metabolic Engineering. 16. 2004. CHANG.. 2285-2289. E. pp. COENYE.. LEE. PEOPLES. CHO. Y... H. S.W. “Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found”.P. 4. K.G. v 54. “Production of poly(3-hydroxybutyrate) by high cell density fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with phosphate limitation”. 55. SNELL. CHANG. “Recovery of poly(3hydroxybutyrate) from coagulated Ralstonia eutropha using a chemical digestion method”..K..... 2000. “Polyhydroxyalkanoate polymers and their production in transgenic plants”. HAHN. Y.. 7 . P.. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 676-679. 2002. v.CAPÍTULO 1 – Introdução Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono RYU. H.N. v. 29-40. v. pp. K. VANDAME. Biotechnology and Bioengineering. H. 1997.

........................................ 2...... Conceito ......... 2.......9.........10..........2..............6........ 2.. 2............ Bioquímica das reações ..........5...2...............................................................3.......... 2................................................ Aplicações dos polihidroxialcanoatos ...CAPÍTULO 2 Polihidroxialcanoatos Índice 2..............................1............. Extração dos polihidroxialcanoatos ..........................................................................2............... Microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos ..................................2..1............................ Biodegradação de polihidroxialcanoatos .. Referências bibliográficas ............ 9 9 10 10 10 11 12 13 13 18 18 19 20 ......................................................................... Plantas ........................7......................4.........................8............ 2............. 2........................1.......... Bactérias .................1........................... 2....... Vias de biossíntese de polihidroxialcanoatos .................. 2. 2..................2........ Dificuldades encontradas na produção de polihidroxialcanoatos .... 2...................................... Organismos recombinantes produtores de polihidroxialcanoatos ........... Propriedades dos polihidroxialcanoatos ...1....................... 2......

1996b. 1987) acumulados como inclusões de poliésteres insolúveis (hidrofóbicos) no citoplasma (DAWES e RIBBONS. 1999). 2001b). 1999. 2001).. 2002. 1998. ou seja. REDDY. dentre as PHA sintases investigadas (STEINBÜCHEL e VALENTIN. Pseudomonas oleovorans possui duas isoformas de PHA sintases. 2. DU et al.. 2004)) é o organismo mais usado para a sua produção porque cresce facilmente e acumula grande quantidade de biopolímero (acima de 80 % do peso seco). REDDY et al. 1994). KIM et al..2. 1995). STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH. Isto ocorre quando há condições desfavoráveis de crescimento (DU et al. Conceito Os polihidroxialcanoatos (PHAs) são materiais de reserva de energia e carbono (BYROM. magnésio (LEE et al. LEE e CHOI. 1998). KESSLER e WITHOLT. podendo corresponder a 90% do massa celular (MADISON e HUISMAN. enxofre. A fisiologia e a bioquímica das reações para síntese de P(3HB) são bem compreendidas para diferentes microrganismos (KIM et al. que incorpora hidroxialcanoatos (HAs) de comprimento de cadeia curta (3 a 5 átomos de carbono). 1998). tal como nitrogênio. 1996b.. LEE et al.1.. TSUGE. 2003).. A bactéria Ralstonia eutropha possui uma única enzima PHA sintase.. Os PHAs são constituintes intracelulares produzidos a partir de vários hidroxialcanoatos. oxigênio (LINKO et al. A PHA sintase de Thiocapsa pfennigii apresenta a mais diversificada faixa de substratos que podem ser transformados em PHA. 1994. 1993. 1999. A condição desfavorável ao crescimento é gerada pela exaustão de algum nutriente. potássio ou ferro (LEE et al..CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 2. Uma ampla variedade de microrganismos acumula PHAs para realização de sínteses metabólicas e crescimento (STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH. Ralstonia eutropha (atualmente denominada Cupriavidus necator (VANDAME e COENYE. que incorporam preferencialmente compostos alifáticos insaturados e substitutos de 3HA de comprimento de cadeia médio (6 a 14 átomos de carbono).. Microrganismos produtores de polihidroxialcanoatos Atualmente existem pelo menos 75 gêneros diferentes de microrganismos já conhecidos produtores de poli–3-hidroxibutiratos P(3HB) (MADISON e HUISMAN. 2003). fósforo. 1996b. 1962). 9 . menor especificidade. 2001a) na presença de excesso de carbono (STEINBÜCHEL e FÜCHTENBUSCH.

Azotobacter beijerincki. Lampropaedia. genes para utilização do substrato podem ser introduzidos na célula produtora de PHA. β-cetotiolase e acetoacetil-CoA redutase de R. Alcaligenes latus. coli.2. Chromatium. 2003). Derxia.. Os microrganismos que também acumulam P(3HB) em alguma quantidade são dos gêneros: Actinomycetes. Azospirilum.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Vários outros microrganismos como Bacillus megaterium.2. Beijerinckia. Vibrio e Zoogloea (BYROM. 1998).. resultando em acúmulo de P(3HB) (QI et al. Plantas POIRIER et al.1.1. Bactérias Duas estratégias de manipulação genética podem ser consideradas para o desenvolvimento de linhagens bacterianas produtoras de PHA a partir de fontes de carbono mais baratas (LEE. Rhodospirillum. 1996b): I. 2002). (1995) conseguiram sintetizar PHAs em plantas Arabidopsis transgênicas expressando genes de bactérias produtoras de PHA. Pseudomonas putida. Micrococcus.. eutropha H16 já foram clonados e expressos em E. O operon associado à biossíntese de P(3HB).1. têm sido clonado em vários procariotos. 2000. REDDY. que representam valores muito inferiores aos 10 . Rhizobium. 1994).1. Streptomyces. Ferrobacillus. eutropha. Spirillum. Rhizobium. 1987) além das linhagens selvagens de cianobactérias. O acúmulo de P(3HB) em folhas variou de 20 μg/g a 100 μg/g. como Synechococcus sp MA19 (TSUGE. contendo os genes codificadores de P(3HB) sintase. 2. Nocardia.2. Organismos recombinantes produtores de polihidroxialcanoatos 2. 2. Hyphomicrobium. eucariotos e plantas. sintetizam PHAs (KALIA et al. Rhodopseudomonas. Methylobacterium.2. II. Os genes responsáveis pela biossíntese de P(3HB) em R. Noscardia. Bacillus. genes da biossíntese de PHA podem ser introduzidos em células não produtoras de PHA que podem utilizar substratos baratos. Chlorogloea. resultando em um valor expressivo de 89 g/L de P(3HB) em um cultivo em batelada alimentada com controle de pH (KIM et al. Essa é uma linha de investigação que vem sendo utilizada para permitir a produção de P(3HB) em quantidades e condições mais favoráveis que as normalmente encontradas na natureza. Sphaerotilus.

Diagrama esquemático de reações em uma célula bacteriana (REDDY et al. com posterior incorporação à cadeia de PHA. Na Figura 2.. na biossíntese de aminoácidos (glutamato) pela Reação 21 e na reação de polimerização pela Reação 28. podendo ser identificadas as etapas apresentadas na Figura 1 na geração de energia na forma de ATP pelo conjunto de reações r25.2 está representada a rede metabólica de R.. eutropha. Essa mesma divisão das reações pode ser analisada em relação à biossíntese de PHA.3. por uma tioquinase ou uma transferase-CoA em um tioéster HA-CoA correspondente (STEINBÜCHEL e VALENTIN. Os organismos unicelulares apresentam diferentes reações químicas para funções metabólicas distintas. fornecida como fonte de carbono às células.1 estão representadas três classes de reações. 2003). tornando o P(3HB) um produto competitivo com os produtos plásticos derivados do petróleo.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono da concentração de reservas de lipídeos. HUISMAN et al. 1988. 1989). 1995). que atingem 20 a 40% do peso seco. Se forem alcançados percentuais de acúmulo iguais aos apresentados para os lipídeos em plantas isso poderá ser uma alternativa para a redução do custo de produção. Figura 2. à biossíntese (Classe II) e à polimerização (Classe III). 2. mais especificamente reações associadas à geração de energia (Classa I). Na Figura 2.1. 11 . O tipo de reação mais simples é a conversão de uma molécula de HA. Bioquímica das reações A composição do PHA resultante depende muito do substrato usado (BRANDL et al..

Glum: ácido glutâmico. dando origem ao poli-3-hidroxibutirato (Figura 2. NADP+: nicotinamida adenina P dinucleotídeo fosfato oxidada. PYR: piruvato.PHB: polihidroxibutirato. Finalmente. CO2: dióxido de carbono Figura 2.2. PEP: fosfoenolpiruvato. ATP: adenosina tri fosfato. 12 .fosfato. SUC: succinato. IsoCit: isocitrato. OAA: oxaloacetato. ADP: adenosina di fosfato. AcAcCoA: acetoacetil-CoA. αKG: α-cetoglutarato. 1990. Muitas bactérias conseguem converter acetil-CoA a D-(-)-3-hidroxibutiril-CoA.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono G-6-P: glicose-6. pela via do acetoacetil-CoA. A segunda reação é a redução de acetoacetil-CoA a (R)-3-hidroxibutirilCoA por uma acetoacetil-CoA desidrogenase NADPH dependente. Vias de biossíntese de polihidroxialcanoatos... Rede metabólica de Ralstonia eutropha (LEE et al.. NAD: nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada. GAP: gliceraldeido-3-fosfato. 1995). 2.. A primeira reação consiste da condensação de duas moléculas de acetil-Coenzima A (acetil-CoA) em acetoacetil-CoA pela βcetotiolase. reação 28) (ANDERSON e DAWES.4. NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida. STEINBÜCHEL e VALENTIN. SUCCoA: succinil-CoA.hidroxibutiril-CoA. L-(-)HBCoA: L-(-)-hidroxibutiril-CoA. 1989).1995). F-6-P: fructose-6-fosfato.3). R5P: ribose-5-fosfato. MAL: malato. os monômeros (R)-3-hidroxibutiril-CoA são polimerizados pela P(3HB) polimerase (HUISMAN et al. Glut: glutamato. NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida. A via biossintética de P(3HB) consiste de três reações enzimáticas catalisadas por três enzimas diferentes (Figura 2. AcCoA: acetil-CoA. D-(-)HB-CoA: D-(-).

. 1989. são potenciais substitutos do polipropileno em várias aplicações (MADISON e HUISMAN. JIN et al. 1996). são oticamente ativos e isotáticos. são altamente cristalinos. 13 . fazendo-se extração com hipoclorito de sódio (BERGER et al.3. 1995. 1994). apresentam características piezoelétricas e são insolúveis em água. utilizando uma solução aquosa de surfactante e quelato. Em 1932. A fase de extração também é uma fase crítica do processo. 1993.6. 1997) que normalmente apresentam alta massa molar. dicloroetano (RAMSAY et al. 2. 1999).5. HAHN. 2001) ou hipoclorito de sódio junto com clorofórmio (HAHN.. FULLER.. STEINBÜCHEL e VALENTIN. Propriedades dos polihidroxialcanoatos O poli-3-hidroxibutirato (P(3HB)). 1994). cloreto de metileno. Extração dos polihidroxialcanoatos A extração do biopolímero pode ser realizada de diferentes maneiras: utilizando solventes como clorofórmio.. 1999.. por causa do longo tempo de extração e da possível degradação do material polimérico.. 1999). tipo de PHA encontrado mais comumente na natureza.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono β-cetotiolase Acetoacetil CoA redutase PHB polimerase Acetil CoA Acetoacetil CoA Poli 3-OH butiril CoA Poli 3-OH butirato Figura 2. RIBEIRA et al. respectivamente. carbonato de propileno. betaína e EDTA disódio (TSUGE. realizando-se a digestão enzimática (LEE. Os PHAs produzidos por bactérias são termoplásticos completamente degradáveis (MIGUEL et al. Por causa do conjunto particular de propriedades. 2002). 1926. 2000). (RAMOS-COMERZANA e MONTEOLIVA-SÁNCHEZ. o P(3HB) foi o primeiro polihidroxialcanoato (PHA) identificado quimicamente a partir de depósitos granulares no citoplasma de uma ampla gama de bactérias. 2003). Via e enzimas envolvidas na biossíntese de P(3HB) (REDDY et al. 2. foi descoberto como um composto de estocagem em Bacillus megaterium em 1926 (LEMOIGNE.

000 a 1.4. As unidades de repetição apresentam a estrutura geral apresentada na Figura 2. 1991. enquanto os PHAs com unidades monoméricas de tamanho de cadeia médio contêm principalmente o 3-hidroxioctanoato (3HO) e 3-hidroxidecanoato (3HD) (ANDERSON e DAWES. Quando as unidades fundamentais de repetição no PHA apresentam comprimento de cadeia na faixa de C6-C16. em função da alta cristalinidade. A massa molar dos PHAs varia tipicamente de 50. os PHAs não são flexíveis o suficiente para formar filmes mas tendem a ser quebradiços. a maioria dos microrganismos sintetiza ambos os tipos de PHA. Estas limitações podem ser contornadas pelo melhoramento das formulações de misturas com outros polímeros e/ou aditivos (HÄNGGI. PREUSTING et al. 1990.000 Da. o que compromete sua propriedade de barreira ao vapor d´água. compreendendo os monômeros de 6 a 14 carbonos (TSUGE. os poliésteres bacterianos também são resistentes à água e podem ser processados por injeção e por moldagem com sopro. Mais de 100 diferentes unidades monoméricas já foram identificadas como constituintes dos PHAs armazenados por microrganismos. e hidroxialcanoatos de cadeia média. 1996). 2002). 1995).000. em que a substituição do radical R caracteriza um novo polímero ou copolímero. Contudo. 1989.. sendo que os PHAs de tamanho de cadeia curta contêm primariamente unidades de 3HB. Esses PHAs têm uma faixa de aplicação diferenciada daqueles obtidos de monômeros de cadeia curta (GROSS et al.. STEINBÜCHEL.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Como todos os poliésteres. Os monômeros de hidroxialcanoatos que formam o PHA podem ser divididos em duas classes: hidroxialcanoatos de comprimento de cadeia curta.. 14 . 2003). 1991. STEINBÜCHEL e SCHLEGEL. os PHAs são mais flexíveis e considerados como termoelastômeros e borrachas. Contudo. conforme o organismo produtor do PHA e as condições de produção (REDDY et al. compreendendo os monômeros de 3 a 5 carbonos. 1990). LEE.

II.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono H O C R (CH2)n C O 100-30. V. 3-HA compreendidos entre os ácidos 3-hidroxipropiônico e 3- hidroxihexadecanóico. 15 . IV. 3-HA apresentando radical R ramificado. 6-HA. VI. 3-HA apresentando radical R funcionalizado. HA com radical R na posição alfa ou com ligações duplas entre carbonos que influenciam no esqueleto do poliéster. ácidos 3-hidroxialcenóicos insaturados. 1992.. Dentre os diferentes hidroxialcanoatos (HAs) detectados na biossíntese de PHA estão (STEINBÜCHEL e VALENTIN. 1995): I. Estrutura geral dos polihidroxialcanoatos (LEE. das condições de cultivo e da rota metabólica que levam à formação do PHA (EGGINK et al. A composição dos comonômeros de PHA depende principalmente da fonte de carbono. III. 4-HA.4. STEINBÜCHEL e VALENTIN. 5-HA. com uma ou duas ligações duplas no grupo R-pendente dos constituintes nos poliésteres. 1995).000 n=1 R = hidrogênio R = metil R = etil R = propil R = pentil R = nonil R = hidrogênio R = metil R = hidrogênio R = metil R = hexil Poli (3-hidroxipropionato) Poli (3-hidroxibutirato) Poli (3-hidroxivalerato) Poli (3-hidroxihexanoato) Poli (3-hidroxioctanoato) Poli (3-hidroxidodecanoato) Poli (4-hidroxibutirato) Poli (4-hidroxivalerato) Poli (5-hidroxivalerato) Poli (5-hidroxihexanoato) Poli (6-hidroxidodecanoato) n=2 n=3 n=4 Figura 2. 1996).

O P(3HB) isolado de R. isso potencializa sua utilização na manufatura de filmes (TSUGE. o polipropileno. 2002). a expressão funcional do gene phaG para gerar monômeros (R)-3-HA com comprimento de cadeia médio (C8-C12) em Ralstonia eutropha metabolicamente engenheirada (contendo o gene pha C1ps que codifica) resulta na síntese de um novo tipo de copolímero P(3HB-co-3HA) a partir de açúcar (MATSUMOTO et al.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono O P(3HB) é o poliéster termoplástico biodegradável mais conhecido. As células recombinantes de E. 1994. Contudo. tais como polilactatos e poli(εcaprolactona).. a Ralstonia eutropha produz P(3HB) homopolimérico a partir de glicose. com índice de polidispersão aproximadamente igual a 2. contornam os problemas de rigidez e fragilidade excessivas do P(3HB). a 4 oC e 177 oC (TSUGE. 2002). P(4HB) e copolímeros P(3HBco-3HV) são apresentadas na Tabela 1. enquanto que no interior das células as moléculas de P(3HB) são essencialmente amorfas e existem como inclusões insolúveis em água. quando comparados com o homopolímero P(3HB). por exemplo. Outra forma de melhorar as propriedades físicas de P(3HB) é a incorporação de diferentes unidades de HA na seqüência polimérica. 3 a 20x106 Da. A formação dos copolímeros é dependente das vias de biossíntese do PHA e das fontes de carbono usadas (TSUGE. possibilitando seu uso (KIM et al. coli podem produzir P(3HB) com massa molar ponderal média (Mw) muito grande.0. O peso molecular médio de P(3HB) produzido por bactéria de linhagem selvagem está geralmente na faixa de 1x104 a 3x106 Da.0 a 6. A temperatura de transição vítrea (Tg) e a temperatura de fusão (Tm) do homopolímero P(3HB) são iguais. 2002). 16 . encontrando aplicações similares às de alguns plásticos derivados da indústria petroquímica como. TSUGE. A composição monomérica dos PHAs pode ser controlada em bactérias recombinantes que possuem uma combinação de PHA sintases substrato específicas e adequadas quantidades de enzima(s)/monômero. O P(3HB) é um material altamente cristalino e duro. para formar copolímeros. Algumas propriedades dos biopolímeros P(3HB). mais fáceis de moldar e mais resistentes. 2002). é quebradiço e tem qualidades elásticas muito pobres. respectivamente. eutropha apresenta 55-70% de cristalinidade. Por exemplo. quando o pH é mantido na faixa de 6. Os copolímeros são mais dúcteis..5. As misturas de P(3HB) com outros polímeros biodegradáveis. 2001).

Propriedades dos polímeros (LEE. polihidroxioctanoato e polipropileno (GOMES e NETTO.1 Resistência à Pressão (MPa) 38 37 35 32 30 40 104 34.5 1. Principais características dos polímeros poli-3-hidroxibutirato.10-5 8MPa 9MPa 380% --1700MPa 38MPa 400% 2.9 1.35 0C 1. P(3HB-co-3HV) Ponto de Fusão ( C) 3% mol de HV 9% mol de HV 14% mol de HV 20% mol de HV 25% mol de HV P(3HB) P(4HB) Polipropileno Poliestireno 170 162 150 145 137 179 53 170 110 0 Rigidez (GPA) 2.1.5 149 1.25 g/cm3 70% 45 (cm /m /atm/dia) 2 0 PHO 61 C . Tabela 2. Em particular.2. 1996).10 0C 0. observa-se que a introdução de cerca de 10% de HV resulta em um material muito parecido com o polipropileno.9 1.10-5 17 .905 g/cm3 70% 1700 (cm /m2/atm/dia) Transmissão de vapor Módulo de Young Tensão de Cisalhamento Resistência à ruptura Peso molecular 60-70 (g/cm2/dia) 3500MPa 40Mpa 5% 1-8.5 50 Resistência ao Impacto (J/m) 60 95 120 200 400 50 --45 21 Algumas dessas propriedades são comparadas com as propriedades do polipropileno (PP) na Tabela 2. Observa-se que a introdução de hidroxivalerato (HV) na cadeia polimérica provoca enorme impacto sobre as propriedades finais do material.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 2.2 0.02 g/cm3 25% --3 0 PP 176 0C .18 – 1. 1997) Característica Ponto de Fusão Tg Densidade Cristalinidade Permeabilidade ao oxigênio 3 P(3HB) 180 C 5 0C 1.7 3.2-7. o que pode justificar o uso do co-monômero para ajuste de grades.7 3.

Essas aplicações normalmente requerem alta rigidez e alto brilho.. Os PHAs também podem ser usados para a preparação de microcápsulas ou nanocápsulas para aplicações médicas e farmacológicas. Por causa de suas propriedades. 2000). 1999).8. manutenção do crescimento celular. sendo que as características ecologicamente corretas do P(3HB). O tempo de degradação do produto formado por P(3HB) é da ordem de poucos meses quando submetidos à digestão anaeróbica (Figura 2. Aplicações dos polihidroxialcanoatos Uma das aplicações mais comuns dos PHAs é a produção de embalagens e frascos para diferentes produtos. Isto permite que o princípio ativo seja liberado lentamente. vários microrganismos podem degradar PHAs pelo uso de PHA hidrolases e PHA depolimerases. capacidade de organizar as células na forma prevista e desejada ao redor da prótese. o P(3HB) e copolímeros como P(3HB-co-3HV) têm sido também utilizados para a produção de frascos para o transporte de líquidos. 1997). No Brasil a Plasvale juntamente com a PHB Industrial tem iniciado estudos de produção de potes com tampa a partir de PHB (BUCCI. conferem ao produto embalado um diferencial mercadológico importante. permitir o desenvolvimento tissular e não gerar produtos tóxicos durante a degradação (RAMOS-COMERZANA e MONTEOLIVA-SÁNCHEZ. Biodegradação dos polihidroxialcanoatos Uma importante característica dos PHAs é a sua biodegradabilidade. 18 . Na natureza..CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 2. prolongando sua ação (OGAWA. gases e vapores (MIGUEL et al. As atividades destas enzimas podem variar e dependem da composição do polímero. para a fabricação de próteses e outros componentes médicos. cinco propriedades são requeridas: biocompatibilidade. sobretudo cosméticos. das dimensões das amostras e das condições ambientais. 1999). 2. sua forma física (amorfa ou cristalina). 2003). como biodegradabilidade e obtenção a partir de recursos renováveis. Para estes tipos de aplicação. em concordância com suas propriedades biocompatíveis (WILLIAMS et al. Uma aplicação muito interessante dos PHAs é seu emprego em engenharia tissular. a anos quando lançados à água do mar (MADISON e HUISMAN. 1997).7.5).

reduzindo o impacto sobre os aterros (HÄNGGI. 19 . 2000). 2. 1999). dependendo da natureza do polímero e do ambiente. amido e poliésteres alifáticos). que é muito alto. 1995).CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Figura 2. 1995).9. O segundo é a peroxidação. A biodegradação dos polímeros ocorre por dois mecanismos distintos. 1994). seguida por bioassimilação (hidrobiodegradação)..5. O grande custo com aterros poderia ser amenizado com o emprego de biopolímeros. quando comparado ao dos plásticos sintéticos não biodegradáveis (KIM et al. 6. 8 e 10 semanas (MADISON e HUISMAN. Embalagens de P(3HB-co-3HV) degradada em lodo ativado aeróbico durante 0. O primeiro é a hidrólise biótica ou abiótica. Esse é o processo primário envolvido na biodegradação das heterocadeias poliméricas (tais como celulose. 2. dos quais polímeros de ácido lático (PLA) e polihidroxialcanoatos (PHAs) são típicos. que têm exigido maiores áreas para a disposição de resíduos/rejeitos (HÄNGGI. Os baixos custos de produção de plásticos petroquímicos explicam os hábitos de consumo e o desenvolvimento generalizado de produtos de conveniência. Dificuldades encontradas na produção de polihidroxialcanoatos A principal dificuldade da produção de PHAs está em reduzir o seu custo. 4. seguida por bioassimilação de produtos de baixa massa molar (oxo-biodegradação). Produtos que não exigem um tempo de prateleira muito grande e que tendem a ser misturados com o material residual orgânico poderiam ser produzidos com biopolímeros. Esse processo é aplicado usualmente à cadeia de carbono dos polímeros (SCOTT.

A presença de endotoxinas constitui um dos principais problemas dos fabricantes. E. 59. R. 1993).. v.10.W. v.. W. IV..A. III. R. 1999). “PHB recovery by hypochlorite digestion of non-PHB biomass”.. CHAVARIE. C. RAMSAY.. p. satisfazer os requerimentos para o registro como embalagens de alimentos. pp. v.C. 1977-1982. Applied and Environmental Microbiology.U. 1990.. n. “Occurrence.CAPÍTULO 2 – Polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Devido à origem microbiológica. 8. 20 . RAMSAY...A..A. pp. A. Polymer Degradation and Stability. presentes no PHA. p. possuir qualidade e desempenho de processamento compatíveis com os plásticos petroquímicos atuais. BRANDL. Dessa forma. LENZ. Microbiology Reviews. Biotechnology Techniques. 2. 450-472.. 183-186. J. 1998). II. FULLER. As proteínas estranhas. G. 1998. encontrando fontes alternativas de carbono (LINKO et al. GROSS. pois bactérias gram-negativas normalmente são empregadas para a produção de PHAs (LEE et al. BABEL. A viabilidade econômica da produção de P(3HB) é determinada pela eficiência e velocidade de crescimento. possuir um preço competitivo. 54. PHAs podem conter proteína residual.J.. H. “Pseudomonas oleovorans as a source of poly-(β-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters”. J. agentes surfactantes residuais e elevados níveis de endotoxina. atender a um mercado específico de aplicação. “Approaches to increase the economy of the PHB production”.. BERGER. v.. podem ocasionar processos alérgicos. 1988.A. metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates”. V. formação do produto e conteúdo intracelular do biopolímero. para melhorar a viabilidade econômica e reduzir o preço do produto é preciso maximizar a conversão de carbono e a produtividade em todo o processo (ACKERMANN e BABEL. BRAUNEGG. 1990. metabolism. HÄNGGI (1995) afirma que os poliésteres bacterianos precisam atender as seguintes exigências para serem aceitos em larga escala: I. 1989. 54. 3. DAWES. Referências bibliográficas ACKERMANN.. B. R. 227-232.. ANDERSON. E. possuir sistemas eficientes de compostagem instalados em áreas urbanas.

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........4... 3..............2.......CAPÍTULO 3 Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Índice 3.......4..................3................................................ 3....4...................... 3................ 3.................................................................. Espectrofotometria .......... Efeito da concentração do ácido acrílico .............. 3......................................2.......................................4..............3..........3...3. Microrganismos degradadores de ácido acrílico ..2...3.....1................................................................................. 3.6................. Resultados e Discussão .................................... Referências Bibliográficas ............. Meios de Cultura ............................. pH ...........................................4................... 3............ Fontes alternativas de carbono ..............2......... 3..................4... Microrganismo ...........2.... Definição da concentração de substrato .3.........2... Vias de degradação de xenobióticos .........................................................................4........... 3.....................1..................................5.......................... 3......................1.....................................1..2.........................................3....... Análise da concentração celular .................................... 2..........3................... 3..................4.................................................... 3................ Análise de ácido acrílico ............ 3.................................. 3.4..........1............3.... Introdução ................................... 3....3.........3.... Conclusões ..........4.........2.......................4..................................4..3.......................4................................................................................. 3........ 3......... 43 44 45 26 26 27 29 30 31 31 33 33 33 33 35 35 35 36 36 37 37 38 38 40 42 .. Ácido acrílico ....... 3........................................2.....3...........................3................... 3...... Experimental ............. Análise da concentração de poli-3-hidroxialcanoatos (PHAs) .............1...............................2.....3.............. Condições de Cultivo ....1...... Monitoramento do crescimento celular ..............2.....1....... 3.......... Procedimentos Analíticos .................................................1...4......... Adaptação simultânea ................................................................................ 3.....4................................................ 3...1........................................... Avaliação do consumo de ácido acrílico com vistas à produção de P(3HB) ......3..........3................................1.. Gravimetria ................ 3........................................ Análise do ácido acrílico .....

a fim de aumentar tanto a produtividade da síntese como a produção de novos PHAs (REDDY et al. 1993). a engenharia metabólica está sendo intensivamente explorada para introduzir novas vias metabólicas e aumentar a diversidade de substratos utilizáveis. BYROM (1987) observou que concentrações de 0. eutropha estão apresentadas na Tabela 3. óleos vegetais e dióxido de carbono. 2002). subprodutos de outros processos (melaço. ácidos orgânicos.3% ou mais de ácido propiônico..2. produtos químicos (ácido propiônico. 1993).. Contudo. 26 . fósseis (metano.1. Ouras fontes de carbono acumuladas por R. triacilglicerídeos). Porém. (1990) observaram que o crescimento de R. eutropha. ácido 4-hidroxibutírico) e dióxido de carbono.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 3. por exemplo. 1998). esse microrganismo metaboliza ainda outras fontes de açúcares. glicerol). 1994). os PHAs podem ser produzidos a partir de uma ampla variedade de substratos. Fontes alternativas de carbono Açúcares tais como glicose e sacarose são as fontes de carbono mais comuns usadas para produção de PHA porque podem ser obtidas a preços relativamente baixos (TSUGE. Por outro lado. 3. eutropha é conhecida por acumular altos níveis de P(3HB) a partir de frutose sob condições de restrição de crescimento (LINKO. Introdução O custo da produção de PHAs ainda é muito alto quando comparado ao dos plásticos sintéticos não biodegradáveis (KIM et al. Para melhorar a viabilidade econômica e reduzir o preço do produto é preciso maximizar a conversão de carbono e a produtividade em todo o processo (ACKERMANN e BABEL.1. tais como fontes renováveis (amido. Embora haja esta preferência. lignita). 2002). óleo mineral. Isso pode ser feito. convertendo essas fontes de carbono a PHA em até 80% de peso seco celular (TSUGE. soro de queijo.. R. celulose. encontrando fontes alternativas de carbono (LINKO et al. RAMSAY et al.1% (w/w) de ácido propiônico no meio já provoca a inibição da produção de PHA por R. eutropha e produção do polímero são inibidos por concentrações de 0. 2003).

Os ácidos graxos voláteis (AGV). sendo necessária a adição de um inibidor de polimerização nos produtos comerciais. Ácido acrílico O ácido acrílico é um líquido incolor. Entre as fontes de carbono estão a xilose. 1993 DOI et al. o ácido lático e o ácido acético (TSUGE et al... 2000). como melaço.. 1990 A bactéria R. 1992). luz e metais. obtidos pela digestão anaeróbia. Fontes de AGV incluem resíduos municipais (KALIA e JOSHI.20-3. Polimeriza facilmente quanto exposto ao calor. além dos ácidos graxos presentes em plantas produtoras de óleo (YAMANE. A concentração para o ácido acrílico ser sentido difundido no ar é baixa. grãos deteriorados. Células recombinantes de E. eutropha pode usar CO2 inorgânico como fonte de carbono (TANAKA et al. banana (KALIA et al. bagaço de maçã e efluente de indústria de óleo de palma (KALIA et al. Substratos normalmente assimilados por R. Os resíduos agrícolas e da indústria de alimentos podem ser utilizados como fontes baratas de carbono e nitrogênio.. 1999. TSUGE et al. 1988 BRAUNEGG et al. lactose e xilose) presentes em fontes baratas desses substratos. que mostraram que a concentração de CO2 no ar de alimentação afeta fortemente a biossíntese de P(3HB). Isso está de acordo com as observações de HUGES e RICHARDSON (1984).. para produzir PHAs (LEE et al. 1995). sacarose... Ácido fumárico e Ácido itacônico Ácido butírico Ácido lático Ácido pentanóico Referência HOLMES et al. 3. o segundo açúcar mais abundante nesses resíduos. Substrato Glicose e Ácido propiônico Xilose.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 3. 1992). 1995)..2. aproximadamente 0. 1978 RAMSAY et al.. com um odor ácreo irritante à temperatura e pressão ambiente. eutropha. coli podem utilizar várias fontes de carbono (incluindo glicose.. É miscível em água e na maioria dos solventes orgânicos.. 2001) obtidos de fermentações anaeróbias. casca de ervilha. são também precursores para formação de PHA. 27 .1. 1995). soro de queijo e hidrolisado de celulose.14 mg/m3.1. 1985 LINKO et al.

Em 1962. No ambiente. ao etileno para síntese de resinas poliméricas de troca iônica e a ésteres metílicos para síntese de polímeros. 1992) e linhagem ML-D (DIAZ e TAYLOR. É usado primariamente como um iniciador na produção de ésteres acrílicos e como um monômero para ácido poliacrílico e sais. a célula não fermenta o acrilato produzido da reação de clivagem.. como por exemplo o poliacrilato de sódio (PSA). LIJINSKY e ANDREWS. selantes. e Fusarium lateritium (BACIC e YOCH.. 1989).. mostrou-se que uma linhagem de Desulfovibrio acrylicus isolada apresenta a capacidade de reduzir sulfato e acrilato. de fibras e de adesivos (FREDERICK e REYNOLDS. 1996). fibras sintéticas e detergentes. O ácido acrílico é amplamente usado na indústria química. sendo usados por isso como agentes dispersantes. O ácido acrílico também aparece como um produto da clivagem do dimetilsulfonilpropionato (DMSP). O ácido acrílico pode aparecer como poluente na forma de polímero de seus sais. quelantes e floculantes (IWAHASHI et al. leveduras e fungos (TAKAMIZAWA et al... Contudo. 1995). 1997). linhagem MD14-50 (DIAZ et al. 1984.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono A produção mundial de ácido acrílico em 1994 foi estimada em aproximadamente 2 milhões de toneladas. WAGNER e STADTMAN demonstraram a clivagem anaeróbia de DMSP por Clostridium propionicum. 28 . o ácido acrílico foi avaliado negativamente para carcinogenicidade da pele e mutagenicidade (DePASS et al. Embora corrosivo quando puro e irritante em soluções concentradas. Alcaligenes sp. exibindo alta toxicidade para microrganismos tais como bactérias. 1993). utilizando-o como aceptor de elétrons (VAN DER MAAREL et al.. Também é usado como um co-monômero. 2003). associado à acrilamida para a síntese de polímeros que serão usados como floculantes. Em água é um poliânion de cadeia longa devido aos seus muitos grupos carboxilas. 1998). carcinogênicos e tóxicos sobre os organismos vivos (IGNATOV et al. o ácido acrílico pode produzir efeitos mutagênicos. Recentemente. além de clivar rapidamente DMSP. sendo uma importante matéria-prima para produção de resinas adesivas. Também é um monômero utilizado para produção de enorme variedade de polímeros na indústria de tintas. que é uma macromolécula sintética preparada pela polimerização radicalar de acrilato de sódio ou do ácido acrílico. sendo que diferentes microrganismos realizam tal reação. de cobertura. PSAs lineares são higroscópicos e solúveis em água. 1996). linhagem M3A (DE SOUZA e YOCH. 1980). Entre os microrganismos aeróbios podem ser citados Pseudomonas doudoroffi.

2. Alguns microrganismos. como estireno e acrilonitrila (Figura 3. o ácido acrílico foi primeiramente sintetizado a partir da hidrólise de etileno de cianoidrina em ácido sulfúrico (KIRK-OTHMER. O processo de degradação do ácido acrílico não foi ainda estudado suficientemente.1. 3. Clostridium propionicum e Prevotella ruminicola apresentam a via do acrilato ou via de redução direta. 1984). especialmente sob condições aeróbias.. O acrilato é convertido a propionato. 1989). sendo necessário o aporte do equivalente redutor flavoproteína. Atualmente é produzido a partir da oxidação do vapor de propileno a acroleína.1. para transferência de elétrons (CALDWELL. causando acúmulo de lactato no rúmen. Observaram que o acrilato é consumido antes de que seja produzida uma apreciável quantidade de propionato. 2004). Ainda. Vias de degradação de xenobióticos O acrilato é um intermediário de algumas vias de degradação de xenobióticos. WHANGER e MATRONE (1967) estudaram a produção de propionato a partir de acrilato. 1997). Industrialmente. a qual é então oxidada a 300oC na presença do catalisador vanádio-molibdênio a ácido acrílico (NLM. 29 .1) por Pseudomonas chlororaphis K22 e B23 (KEGG.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono O ácido acrílico ocorre naturalmente em algas marinhas e também tem sido encontrado no fluido do rúmen de ovelhas e no rum obtido pela fermentação do suco de cana de açúcar pela ação de Micrococci spp. pode ser formado pela hidrólise de acrilamida de resíduos industriais no solo. na forma reduzida. 1995). Também verificaram que a deficiência de enxofre diminui ou inibe completamente a via do acrilato para conversão de lactato a propionato. utilizando células microbianas presentes no rúmen de carneiros. como Megasphaera elsdenii. mas sabe-se que o ácido lático é um intermediário da via metabólica de consumo de ácido acrílico (IGNATOV et al.

O método adotado foi o teste de inibição da multiplicação celular. (1992) estudaram o efeito do ácido acrílico no solo. dentre os quais Pseudomonas putida. Entretanto. Níveis de 100 mg de ácido acrílico/Kg de solo não afetam a respiração da microflora do solo.2. concentrações de 500. acetato de vinila e estireno que inibiram o crescimento de P. respectivamente. Vias descritivas da degradação do estireno e acrilonitrila (KEGG. A concentração de 100 mg/L de ácido acrílico teve efeito mínimo sobre a utilização de acetato pela metanogênese. putida foi de 41 mg/L. (1995) estudaram a degradação anaeróbia de ácido acrílico em 55 dias de teste em culturas enriquecidas com glicose e acetato. 6 mg/L e 72 mg/L.1. 1000 e 1500 mg/L inibiram a utilização de acetato no sistema de tratamento anaeróbio. O limiar de concentração de ácido acrílico. Efeito da concentração do ácido acrílico STEWART et al. contudo. BRINGMANN e KUHN (1980) realizaram um estudo do efeito da concentração de ácido acrílico sobre o crescimento de alguns organismos. 30 .1. que sugerem como solução a aclimatação das culturas anaeróbias a presença de ácido acrílico. uma concentração de 1000 mg de ácido acrílico/Kg de solo inibiu completamente a respiração. 3.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Via de degradação do estireno Estireno Via de degradação da acrilonitrila Acrilonitrila Acrilato Acrilato Lactato Lactato Metabolismo do Piruvato Metabolismo do Piruvato Acetil-CoA Acetil-CoA Figura 3. 2004). HOSSACK et al. A inibição da utilização de acetato pela presença de ácido acrílico também foi observada por DEMIRER e SPEECE (2004).2.

DURST et al.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 3. Diferentes são os microrganismos degradantes de ácido acrílico. 10 mg/L a 100 mg/L.1. 1994)..0 (TAKAMIZAWA et al.1. (1990) mostraram que Alcaligenes denitrificans. usando como padrão interno acetamida.. para crescimento. sendo utilizada como única fonte de carbono e nitrogênio. As células de Pseudomonas chlororaphis K22 e B23 (KEGG.4. P. Ensaios realizados com Bissochlamys sp. quando o meio de cultura inicial continha 7% de ácido acrílico e 2% de glicose e o pH inicial da cultura era ajustado a 7. isolada de aterro sanitário. 1995). 13A. quando cresce em meio contendo alta concentração de ácido acrílico. do solo que consegue degradar acrilamida na concentração de 4 mg/L a ácido acrílico e amônia. 1 mg/L (MAO et al. mostraram que esta linhagem consegue produzir ácido β-hidroxipropiônico (β-HPA). por HPLC. 1975) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (IGNATOV et al. Os limites de detecção de ácido acrílico em solução por cromatografia gasosa é de 1 mg/L (STEWART et al. 2004) e de Brevibacterium sp.. 1993).... SHANKER et al. 1975). 1997. consegue degradar ácido acrílico..2. alcaligenes 5g e Brevibacterium spp. Análise do ácido acrílico Diferentes métodos físico-químicos têm sido desenvolvidos para a análise quantitativa de ácido acrílico.2. DURST et al. Microrganismos degradadores de ácido acrílico MOISEEVA et al. ANDREONI et al. 1997.. Entre estes estão incluídos a fotometria (IGNATOV et al. acrilamida e ácido acrílico como única fonte de carbono e/ou nitrogênio foram isoladas do ambiente. As linhagens com maior atividade de decomposição foram identificadas como sendo Pseudomonas pseudoalcaligenes 6P. que foram posteriormente metabolizados.3.. (1990) isolaram uma linhagem de Pseudomonas sp. 3.8%. 1997). IGNATOV et al. A bactéria degrada o ácido acrílico através da formação dos intermediários ácido-L-(+)-láctico e ácido acético. Candida rugosa gera ácido β- 31 . e por técnicas polarográficas. a cromatografia gasosa (IGNATOV et al. hidrolisam acrilamida a ácido acrílico e amônia. (1997) analisaram acrilamida e ácido acrílico por cromatografia gás-líquido. (1991) isolaram várias linhagens que utilizam acrilonitrila. A máxima produção de β-HPA foi de 4. respectivamente.

(1990) demonstraram que Pseudomonas sp. Contudo. ácido pirúvico e ácido acético (IGNATOV et al. 1997). (1997) estudaram a possibilidade de determinar acrilamida e ácido acrílico através da atividade respiratória de células microbianas de Brevibacterium sp. representando uma melhor adaptação ao substrato quando comparado a concentração de 41 mg/L apresentada por Pseudomonas putida nos estudos de VERSCHUEREN (1977). Byssochlamys sp.. PHA contribui para aproximadamente 1. Contrariamente. linhagem NO-18 degrada 70-80% de um oligômero de acrilato em duas semanas. quando glicose é adicionada durante o cultivo (HASEGAWA et al. coli JK109 (pBHR71) em meio Luria Bertani (LB) contendo 40 g/L de decanoato. 32 . quando a concentração de enxofre é adequada.5 g D-HIBA/L. WHANGER e MATRONE (1967) mostraram que a via do acrilato está ativa na conversão de lactato a propionato em microrganismos no rúmen de carneiros. as exigências das vias metabólicas podem ser diferentes para cada espécie de microrganismo para que haja o metabolismo do ácido acrílico. quando Ca(OH)2 é utilizado como agente neutralizante e 2% de glicose é adicionado ao meio.. multiplica-se em uma concentração de 7% de ácido acrílico. (1996) produziram ácido D-β-hidroxiisobutírico (D-HIBA) a partir de ácido metacrílico. 1947). 1993). 1953) e em células de Megasphera elsdenn (CARDON e BARKER.2 mg de ácido acrílico/mL de meio foi o ótimo observado para o crescimento e o acúmulo de PHA. configurando um rendimento de conversão de 70%. uma concentração de 0. IWAHASHI et al. 1998).8% de ácido β-hidroxipropiônico foi conseguida. As fermentações de acrilato a acetato e propionato foram observadas em células de Clostridium propionicum (BOCK e ALBERTY. é importante observar que várias espécies de bactérias. (2003) demonstraram que Arthrobacter sp. usando Candida rugosa IFO 0750 numa concentração de 21. a máxima produção de 4.1% do peso seco celular (QI et al..CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono hidroxipropiônico com 90% de rendimento a partir de 2% de ácido acrílico. Dados referentes ao metabolismo de ácido acrílico por células de Alcaligenes dinitrificans mostram sua degradação a ácido lático.. que representa 30% (w/w) do peso seco celular. 1982). C-3 isolada para degradação de acrilamida pode tolerar concentrações de ácido acrílico de 500 mg/L. SHANKER et al. num período de 11 dias (TAKAMIZAWA et al. Dessa forma. LEE et al. Assim. IGNATOV et al. sem a presença de ácido acrílico. leveduras e fungos apresentam potencial para degradar o ácido acrílico. No cultivo de E.

2H2O. 15. a 180 rpm e 30oC por 24h. ZnSO4.06. 0. Solução 2 (g/L): Na2HPO4.3.2H2O. b. 3.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 3.2. 0.3. 0.7H2O. 0. cuja composição é: Solução 1 (g/L): Citrato Férrico de Amônia. MgSO4. CoCl2. a fim de obter massa celular. Etapa 1: Crescimento em meio caldo nutriente (NB).6H2O. modificado por ARAGÃO et al. MnCl2. cujas concentrações dependem do ensaio a ser realizado. estireno e acetato de vinila que foram fornecidos pela RHODIA. obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Microrganismo Foi utilizada a bactéria Cupriavidus necator DSM545.0. 33 . 0..1. 0.3.00. 0. 0. 5. Meio Mineral (MM) utilizado nos ensaios com cultura de Cupriavidus necator DSM 545.3.6H2O. 0.3. 0. c.5H2O.5.07.0. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne.0 . Peptona de carne. Solução 3 (g/L): (NH4)2SO4.02. Solução 4 (g/L): H3BO3. Solução 5 (g/L): Ácido acrílico ou estireno ou acetato de vinila ou glicose. está baseado em RAMSAY et al. CuSO4. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC QUÍMICA FINA LTDA. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a.03. Agar.03. A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC.01.1.4H2O. Na2MoO4. 0.2. 3. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne. exceto o padrão de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA-ALDRICH e os solventes ácido acrílico. As soluções foram esterilizadas separadamente a fim de evitar precipitação dos sais. 3. Condições de Cultivo As células foram cultivadas nas seguintes etapas: a.0 .01. 3. NiCl2. Peptona de carne.0 . 3. 7H2O. 5. CaCl2.51.3. KH2PO4. (1996). 5. 0. (1990).

* Cultivo em tubos de ensaio O cultivo seguiu a seqüência apresentada no esquema da Figura 3.... ácido acrílico. estireno e acetato de vinila foram utilizados para definição da fonte de carbono a ser utilizada durante tese a partir do ensaio de adaptação simultânea.. também em MM. As células foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24h. NaCl (0. Posteriormente.. acetato de vinila) aumentada. estireno. sendo o volume de inóculo retirado do mesmo meio já cultivado. 7 . O cultivo seguiu a seqüência apresentada no esquema da Figura 3... Ácido acrílico.. Um volume de meio NB cultivado em frasco agitado a 180 rpm e 30oC por 24h foi retirado assepticamente.85 %) Água 1 mL 1 mL 1 mL 0 Centrifugar Centrifugar 24 h 30 oC 1 .. Um volume de meio NB cultivado em frasco agitado a 180 rpm e 30oC por 24h foi retirado assepticamente.2. lavado duas vezes com solução salina 0. volumes correspondentes a 1 mL (10% (v/v)) do volume total foram inoculados no mesmo meio com a concentração da fonte de carbono em estudo (glicose. lavado duas vezes com solução salina 0. centrifugado. NB Lavagem das células Adaptação simultânea Figura 3. Etapa 2: Crescimento em meio mineral (MM). 34 . Este volume corresponde a 1% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente.. * Cultivos em frascos Erlenmeyer. um volume igual a 1 mL (10% (v/v)) do MM foi utilizado para inoculação. Esquema do procedimento para cultivo de Cupriavidus necator em tubos de ensaio.. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte.3. centrifugado.85% (v/v) e ressuspendido em água destilada estéril.2. Deste.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono b.85% (v/v) e ressuspendido em água destilada estéril..85 %) NaCl (0....

1% (v/v) NaCl (0. centrifuga-se um volume de meio de cultura. Análise da concentração de ácido acrílico: I. Esquema do procedimento para cultivo de Cupriavidus necator em frascos agitados.1. 35 . III.4.3.85 %) Água Centrifugar Centrifugar NB MM Lavagem das células Cultivo Figura 3. armazena-se o material amostrado a -20oC para análise posterior. modelo MP220. Preparo da amostra: I. utilizando um potenciômetro Metler Toledo. equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Nesta etapa. conforme a estratégia adotada. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente. com injeção direta do sobrenadante.3. Em ambas as etapas as células foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas.3. Análise de ácido acrílico A quantificação da concentração de ácido acrílico foi realizada por cromatografia gasosa. II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugação a 5000 x g por 20 min. pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria.4.2. Procedimentos Analíticos 3. a fonte de nitrogênio estava limitada ou ausente.4.3. 3.85 %) NaCl (0. 3.

3. a 250 °C. detector e coluna são iguais.3. misturam-se 180 μL do sobrenadante a 20 μL de solução de ácido acético 5 g/L. O gás de arraste utilizado é o nitrogênio a 9 mL/min e as temperaturas do injetor.1.4.0 até 0. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 1 μL. calcula-se a concentração de ácido acrílico (AA) no meio conforme segue: ⎡⎛ A3 ⎞ ⎤ AA( g / L) = ⎢⎜ ⎟ × a⎥ + b ⎣⎝ A4 ⎠ ⎦ (3. 3. com a concentração de ácido acrílico variando entre 1 g/L e 4 g/L.32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono II. equipado com um detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio).4. Espectrofotometria Analisa-se a concentração de massa celular de C. 36 .8. medindo-se a absorbância no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de água. que é então injetado na coluna. são feitas diluições para manter a linearidade. modelo CP 9000. A coluna utilizada para dosagem do ácido acrílico é de sílica fundida (∅0. Análise da concentração celular A concentração celular é determinada por dois métodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria. necator do material coletado em um espectrofotômetro Spectronic 20D+. respectivamente. IV. Para manter uma precisão adequada (região linear). 3. III. A partir deste valor. O cromatógrafo é um Chrompak. a faixa de absorbância utilizada é de 0. respectivamente. o coeficiente angular e o coeficiente linear.3. A4 é a área obtida para a concentração do padrão interno ácido acético e "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão. A curva padrão de ácido acrílico (Anexo 1) foi feita utilizando o ácido acético como padrão interno.1) onde A3 é a área obtida para a concentração de ácido acrílico. 250 °C e 120 °C.3.

entre 1 mL e 10 mL. II.3.000 rpm por 5 minutos. separa-se um volume conhecido do meio de cultura. conforme o método de metanólise baseado em BRAUNEGG et al. lava-se o sedimentado duas vezes com água destilada. calcula-se a concentração de massa celular (X) na forma: ( MM f − MM i ) × 1000 VA X ( g / L) = (3.2) onde MMf é a massa da membrana final (g).4 g/L como padrão interno. 3. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85°C até peso constante.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 3. com as modificações propostas por BRANDL et al. centrifuga-se a amostra a 15. coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1. Análise da concentração de poli-3-hidroxialcanoatos (PHAs) A quantificação da concentração de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa. III.01M.2. Gravimetria A medida da massa celular compreende as seguintes etapas: I. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0. IV. 37 . armazena-se o sedimentado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. Metodologia: I. MMi é a massa da membrana inicial (g) e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL).4.4. II. III. V. contendo ácido benzóico 0. ressuspende-se o sedimentado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%).4. Preparo da amostra: I.3.3. (1988). filtra-se o meio através de membranas Millipore de poliamida pré-pesadas (poro de 0. A curva de calibração da concentração celular em função da absorbância (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentração de células durante a fase de crescimento da cultura. IV. para remover íons e sais presentes na biomassa.2 μm).5 e 2 mL. (1978).

O cálculo da concentração de P(3HB) é realizado conforme a seguinte equação: ⎡⎛ ⎛ A1 ⎞ ⎞ ⎤ ⎢⎜ ⎜ ⎜ A2 ⎟ × a ⎟ ⎟ + b⎥ × 1000 ⎠ ⎝⎝ ⎠ ⎦ P (3HB)( g / L) = ⎣ VA (3. Submetem-se os padrões à mesma metanólise que as amostras. para posterior análise do polihidroxialcanoato em cromatografia gasosa. deixando separar as fases. a 250 °C. e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL).19 mL/min e as temperaturas do injetor. sendo que após 60 minutos de aquecimento a mistura é agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento. resfria-se a mistura até a temperatura ambiente. "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão. respectivamente. A coluna utilizada para dosagem do P(3HB) é de sílica fundida (∅0. A curva padrão (Anexo 3) é feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma) como padrão externo.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono II. necator.3) onde A1 é a área obtida para o P(3HB). 3. respectivamente. O gás de arraste utilizado é o nitrogênio a 9. A2 é a área obtida para o padrão interno ácido benzóico. adiciona-se 1mL de água destilada.32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. O volume injetado é de 1 μL. III.4. O cromatógrafo é um Chrompak. equipado com um detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio). estireno ou acetato de vinila foi realizado inicialmente com a adaptação simultânea das células de C. Estudos qualitativos de adaptação simultânea 38 . 250 °C e 120 °C. VI. armazena-se a fase aquosa em geladeira. IV. com massa variando entre 0.4.0010 g e 0. V. modelo CP 9000. detector e coluna são iguais. Adaptação simultânea O estudo de produção de P(3HB) a partir de fontes alternativas de carbono como ácido acrílico. VII. aquece-se a mistura a 100°C durante 140 minutos em tubos fechados.0100 g. retira-se a fase orgânica (inferior) com uma pipeta Pasteur. VIII. agitam-se as amostras durante 30 segundos. adicionam-se 2 mL de clorofórmio.1. o coeficiente angular e o coeficiente linear. Resultados e discussão 3.

00 + 0 20.50 + 0.33 1. 1994). A cultura de C. necator DSM 545 Estireno Glicose C. em meio MM.5 1.13 2.67 + 0.11 3.00 + 0.09 5.00 + 0.00 + 0.05 10.11 3. Como a cultura assimila a glicose como fonte de carbono para crescimento (KIM et al.00 + 0. A bactéria foi cultivada em tubos de ensaio.33 1.00 + 0 20.5 1. necator em acetato de vinila.13 2. Os resultados foram obtidos de forma visual.2). necator DSM 545 Ácido Acrílico Glicose C.5 1. (±) : crescimento razoável.13 2. ao final do período de cultivo a turbidez do meio foi observada e assinalado o amplo crescimento (+).09 5. Ensaio 0 (g/L) Acetato de Vinila Glicose C.30 + 0. sendo possível verificar que a cultura de C.01 20. (-) : crescimento ruim ou não crescimento.2.50 + 0.67 0.. necator suportou a concentração de ácido acrílico no nível mais alto.00 + Ensaio 2 (g/L) 0. necator foi inibida apenas quando a concentração do monômero acetato de vinila foi de 0. necator DSM 545 0 20.00 + 0.00 + 0.50 + Ensaio 6 (g/L) 0.67 + 0.01 20.67 + Ensaio 7 (g/L) 0.00 + Ensaio 3 (g/L) 0.33 1.30 + 0. 39 . As concentrações de glicose e dos demais monômeros no meio de cultivo variaram nos ensaios 1 a 7. Resultados obtidos para o crescimento de C.01 20. embora ainda em presença de 1.5 g/L.00 + Ensaio 1 (g/L) 0.05 10.11 3. a partir do qual foram realizados os ensaios. crescimento razoável (±) e crescimento ruim ou não crescimento (-) (Tabela 3. em períodos de 24 horas. foram realizados repiques sucessivos. ácido acrílico e estireno em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio.09 5.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono permitem verificar se a célula é capaz de crescer em um meio de cultura contendo algum dos monômeros como substrato e avaliar de forma preliminar qual é a concentração de substrato que limita o crescimento de Cupriavidus necator.67 + 0. ou seja. estireno e acetato de vinila) e redução da concentração de glicose.05 10.00 + Ensaio 4 (g/L) 0. com aumento gradual da concentração do substrato em estudo (ácido acrílico.30 + Ensaio 5 (g/L) 0.67 g/L de glicose no meio. Tabela 3.67 ± (+) : amplo crescimento.

Os perfis obtidos para a biomassa celular mostram que os oligoelementos adicionados ao meio de cultura não melhoraram o crescimento celular.2.0 e incubados a temperatura de 30oC sob agitação de 180 rpm.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 3.3).67 g/L (Δ e ▲) em frascos Erlenmeyers agitados a 180 rpm a 30oC. 0.21 0.18 0. necator DSM 545 em meio mineral contendo ácido acrílico como fonte de carbono nas concentrações de 0. em meios de cultura MM com pH inicial ajustado a 7. Outra observação importante está no fato de que o pH aumenta com o crescimento celular (Figura 3. necator apresentaram melhor adaptação ao substrato ácido acrílico. Isso parece ser um claro indicativo do consumo de ácido acrílico pela bactéria.4 Absorbância (600 nm) A 0.00 B pH 7.4 mostra os resultados do cultivo de C. 0.2 7.33 g/L (Tabela 3. Na Figura 3. ensaios em frascos Erlenmeyer foram realizados a fim de obter o parâmetro velocidade específica de crescimento. Símbolos cheios (com oligoelementos).03 0.24 0. conforme observado no aumento dos valores da absorbância.0 6. nesse intervalo de tempo. de maneira que o meio de cultura pode ser simplificado.8 0 20 40 60 80 100 120 20 40 60 80 100 120 Tempo (h) Tempo (h) Figura 3.4A). Definição da concentração de substrato Visto que as células de C.16 g/L ( ◊ e ♦). Observa-se na Figura 3. símbolos vazios (sem oligoelementos).16 g/L.5 40 .4.09 0. Resultados do crescimento de células de C. Três concentrações de ácido acrílico foram escolhidas: 0. Também foi observada a influência da presença e ausência de oligoelementos no crescimento celular.029 h-1) foi obtida somente com ácido acrílico na concentração inicial de 0.12 0.33 g/L (□ e ■) e 0. A Figura 3. 7.06 0.4.4B que o crescimento ocorre até 70 horas de cultivo e.15 0.6 0.30 7. necator em frascos agitados.33 g/L e 0.27 0. e diminui quando não há mais crescimento.67 g/L. conforme apresentado no item anterior. a maior velocidade específica de crescimento (0.

3.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono é possível observar que as condições do processo para o crescimento celular são melhores para a concentração inicial de 0.015 0.33 0.3 0. necator. conforme observado no ensaio de adaptação simultânea (Tabela 3.020 0.010 0. Observa-se que provavelmente a concentração inferior (0.021 0. Os resultados obtidos para os ensaios da Figura 3. por falta de fonte de carbono e por exceder a concentração inibitória para o crescimento de C.7 Concentração de ácido acrílico (g/L) Figura 3. Tabela 3. necator DSM 545 em meio mineral com ácido acrílico como fonte de carbono.2 0. 0.6 0.015 0.1 0.5 estão detalhados na Tabela 3.010 41 .2).67 μ (h-1) Sem Oligoelementos 0.33 g/L de ácido acrílico nas condições de adição e não adição de oligoelementos ao meio de cultura.010 Com oligoelementos 0. necator em meio mineral com e sem a adição de oligoelementos.16 0. respectivamente.030 Sem oligoelementos μ (h ) -1 0.3. pois a velocidade específica de crescimento é maior em ambos os casos.5. Velocidades específicas de crescimento de C.67 g/L) tenham inibido o crescimento.4 0.025 0.016 μ (h-1) Com Oligoelementos 0.029 0.16 g/L) e superior (0.025 0.019 0.010 0. Relação entre concentração de ácido acrílico e a velocidade específica de crescimento (µ) para o cultivo de C. Ácido Acrílico (g/L) 0.030 μ (h ) -1 0.5 0.020 0.

6A. Na primeira adição da fonte de carbono foi observado que a cultura respondeu com um aumento imediato da densidade ótica. O momento das alimentações foi considerado como aquele em que a densidade ótica do meio diminuiu. com fonte de carbono ácido acrílico. 3. Após a segunda alimentação foi observado um tempo de estagnação do crescimento celular. com e sem oliogoelementos.75 7.2 0. Cada adição visou incorporar ao meio de cultivo ácido acrílico de forma a restabelecer a concentração inicial de ácido acrílico no meio.25 7.33 g/L no início do processo. As linhas tracejadas perpendiculares ao eixo da abscissa representam os momentos em que foram realizadas as alimentações com ácido acrílico durante o andamento do bioprocesso. sendo que a primeira adição ocorreu a 99 horas de cultivo e a segunda.6 0. 42 . com oligoelementos (● e ■). conforme observado na Figura 3. 1. Resultados do crescimento de células de C. Sem oligoelementos (○ e □). necator DSM 545 em meio mineral.0 A B 8.75 6.3.4 0. com uma concentração de ácido acrílico de 0.00 6. em frascos Erlenmeyers agitados a 180 rpm a 30oC.8 0.00 7.4.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Assim. o sistema foi realimentado com ácido acrílico na mesma concentração do início do cultivo (0. a 169 horas.33 g/L) a fim de observar se a cultura responde positivamente aumentando os valores da absorbância. Monitoramento do crescimento celular Os perfis apresentados na Figura 3.6.50 7. até ser observada uma variação na densidade ótica do meio de cultivo.50 0 40 80 120 160 200 240 280 Tempo (h) Figura 3.6 mostram o crescimento de células em meio mínimo.0 Absorbância (600 nm) pH 0.

6.151.72h Com Oligoelementos 0. Estes ensaios iniciais mostram que as células de C. foi observado que para a concentração de 0. Produtividade Celular (g/L.033 g/L. necator cultivadas 43 .17h 98. Produtividade celular durante o crescimento de C. necator. Avaliação do consumo de ácido acrílico com vistas à produção de P(3HB) A Figura 3. Após esse período não ocorre mais consumo.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Novamente. A fase de crescimento apresenta um perfil linear. Novamente é observado que o pH varia à medida que ocorre o crescimento celular.4. tanto que a concentração de ácido acrílico permanece num valor aproximado de 0. necator obtida para o ensaio de crescimento celular a partir de duas alimentações de ácido acrílico.0008 0.7C e 3. Ainda.h.0008 3.7E). necator assimilam o ácido acrílico e mantém a concentração de P(3HB).4. O consumo de ácido acrílico ocorre nas primeiras 18 horas (Figura 3.7A). Os valores para a produtividade de células de C.75h 151. o que pode estar limitando o crescimento da cultura de C.7D).7B). ou seja. Importante observar que as células de C. necator DSM 545 em meio mineral com ácido acrílico como fonte de carbono. Tabela 3.6B). é observado que o pH assume um valor igual a 8. A presença ou ausência de oligoelementos também não interferiu nos perfis de crescimento celular.0008 0. representado na Figura 3.01 g/L. com uma velocidade específica de crescimento aproximada de 0.5h . o pH varia à medida que aumenta a densidade ótica.7 apresenta os resultados referentes ao crescimento de C.4. Observa-se que a melhor produtividade celular é alcançada nas primeiras horas podendo ser reflexo de uma possível inibição pela concentração do ácido acrílico.7A) e a manutenção da concentração de P(3HB) intracelular (Figura 3.242.h) Intervalo 19.68.33 g/L de ácido acrílico no meio. estão apresentados na Tabela 3.035 h-1 a um taxa de consumo de ácido acrílico igual a 0. necator DSM 545 em ácido acrílico (Figura 3. uma vez que o mesmo não foi quantificado.0 após 39 horas de cultivo (Figura 3.67h . à medida que a cultura cresce (Figura 3.75h .0014 0.4.0009 Sem Oligoelementos 0. coincidindo com a fase de crescimento da cultura (Figuras 3.0013 0.

5.05 0. apresentando maior velocidade específica de crescimento (0. 44 . A rota de assimilação do ácido acrílico pelas células de C.CAPÍTULO 3 – Cupriavidus necator DSM 545 e o ácido acrílico Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono em meio NB.6 -1.4 -1. necator parece ser constitutiva.0 -1. necator.10 0.5 8. em frascos Erlenmeyer sob agitação orbital de 160 rpm a 30oC.5 7.20 0.33 g/L de ácido acrílico no meio de cultura. A P(3HB) Ácido Acrílico (g/L) (mg/L) ln (abs) pH 0. necator à presença de ácido acrílico. Resultados do crescimento de células de C.0 0 10 20 30 40 B C D E Absorbância (600 nm) Tempo (h) Figura 3.25 0. ou seja.01 g/L. para o preparo do inóculo.00 6 4 2 0 -1.8 0.7.0 7. a biodegradação ocorre sem haver necessidade de adaptar as células de C.1 8. 3.4 0. necator DSM 545 e biossíntese de P(3HB) em células cultivadas em meio mineral contendo ácido acrílico como fonte de carbono.h na concentração inicial de 0. apresentaram imediata atividade sobre o ácido acrílico mostrando ser esta rota de assimilação constitutiva.2 -1.2 0. Conclusões A fonte de carbono ácido acrílico é assimilada para crescimento em meio mínimo pela cultura de C.035 h-1) e uma taxa de consumo de 0.15 0.3 0.

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............1................4...6...........4.... 4..2.........2.. Meios de Cultura ...5...............................3......................... 4........4........2...........................................4........................................1..4.............................7...... ........ 4............................ 4..............4.............. Condições de Cultivo .......4.... 4........................ Índice 4.................................3............................... Resultados e discussão .............................3.........................................5............................ 4.................... 4.......................................... Análise da concentração de polihidroxialcanoatos ... Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em sistema “washed cells” 4... Análise da concentração de ácido acrílico ..........4..3.............2..4....4.. 4........................4........ 4....................................................... Microrganismo ...........CAPÍTULO 4 Estratégias para biodegradação de ácido acrílico visando a produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator.....3..........................................4......... 4..... Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em biorreator ........................................................... 4....... Análise da concentração celular .........5.................... Experimental ........................2.........3................................................... Produção/Produtividade ..4.................4........... Referências bibliográficas ........................... 4.. Conclusões .............. Espectrofotometria ....................4...4....................... Procedimentos Analíticos ... Processo ............... 4......................... 51 51 53 55 55 55 55 56 56 56 57 57 58 58 60 60 60 63 66 66 .......................... Gravimetria ...... 4........................................1......................................... 4................................ 4....1...........................................4........................4.. 4. Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em frascos agitados.............................................................................................................. pH ......4............... 4.5............... Introdução ........1.......

CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.2.1. 1995). II. 4. que é um substrato usado pela PHA sintase. 1995). Segundo. a via que gera monômeros de (R)-3-HB a partir de acetil-CoA. a fonte de carbono desejada para biossíntese de PHA precisa entrar na célula.1. conforme é observado na Figura 4. Introdução Três fases metabólicas podem ser identificadas durante a biossíntese de PHA em bactérias. a via que gera monômeros de (R)-3-HA a partir de intermediários da biossíntese de ácidos graxos. Para isso existe um sistema de transporte específico. a PHA sintase. com concomitante liberação de coenzima A (STEINBÜCHEL e VALENTIN. Terceiro. reações anabólicas ou catabólicas convertem a fonte de carbono em um tioéster hidroxiacil-CoA. 51 . síntese e acúmulo de produto (P(3HB)). que é a enzima chave da biossíntese de PHA. usa estes tioésteres como substratos e catalisa a formação da ligação éster.1. Processo O processo de produção de P(3HB) microbiano compreende alguns estágios: I. 2. Fases da biossíntese de PHA (STEINBÜCHEL e VALENTIN. localizado na membrana citoplasmática. síntese do biocatalisador: crescimento e multiplicação celular do organismo. Três são as vias de biossíntese de PHAs bem conhecidas (TSUGE. 3. Primeiro. a via que gera monômeros de (R)-3-HA a partir de intermediários da βoxidação de ácidos graxos. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 4. Fase I (Proteínas associadas à membrana) Fase II (Proteínas solúveis) Fase III (Proteínas associadas aos grânulos) Anabolismo P(HA)n Fonte de carbono Fonte de carbono Hidroxiacil-CoA PHAsintase P(HA)n+1 Catabolismo CoA-SH Figura 4. 2002): 1.

. 1997). maior produtividade e menores custos de recuperação do produto (LEE et al. 1990). como apresentado na Figura 4. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono III.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.. que pode ser vista a partir de técnicas microscópicas.2. A operação em batelada alimentada também permite minimizar os efeitos inibitórios de substratos e de alguns subprodutos. tais como maior concentração de produto. Os cultivos com alta densidade celular apresentam muitas vantagens em relação às culturas de baixa densidade. quando os grânulos do biopolímero não aparecem diferenciados no meio intracelular.2A está apresentada a célula na fase de crescimento. 2000). é possível produzir P(3HB) com as estratégias de batelada alimentada e contínua. 1984). Os nutrientes são normalmente adicionados de forma intermitente ao reator. Na Figura 4. permitindo a nítida diferenciação no meio intracelular. o que é freqüentemente necessário para que se obtenha alta produtividade e alto rendimento do produto desejado (YAMANE e SHIMIZU. 1978) ou de pH de forma contínua (SUZUKI et al. Na fase de produção do biopolímero (Figura 4.2B)... Em alguns cultivos é feito o monitoramento de oxigênio dissolvido (YANO et al.2 para Ralstonia eutropha. Nas etapas I e II as células apresentam uma composição diferenciada. O cultivo em batelada alimentada permite que seja alcançada alta densidade celular. isolamento do produto desejado da célula (extração e purificação do P(3HB)). Além da estratégia de batelada.. Esses sinais são usados para alimentar e controlar o processo (KIM et al. A B Figura 4. os grânulos aparecem em dimensões maiores. Uma das desvantagens 52 . 1994). Ralstonia eutropha nas fases de crescimento (A) e produção (B) (JUNG et al.

53 . Geralmente a concentração de subprodutos produzidos pelo ciclo TCA excede a capacidade tamponante da solução fosfato de potássio (5 g/L). uma unidade piloto de produção foi instalada nas dependências da Usina da Pedra. Produção/Produtividade A eficiência e a velocidade de obtenção do produto em um bioprocesso são parâmetros normalmente relacionados ao genótipo do microrganismo e ao substrato. 15/01/2006).. A produção é realizada em tanques agitados e aerados em condições controladas de pH. O copolímero é produzido pela adição concomitante de ácido propiônico e açúcar (http://www. Ainda. Nos processos conduzidos com bactérias do gênero Alcaligenes o pH geralmente diminui por causa dos subprodutos ácidos produzidos no ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) (SEO et al. a concentração de fosfato de potássio precisa ser menor que 5 g/L. 1998). Uso de controlador de pH com ácidos e bases. Por isso.comciencia. 1998). oxigênio dissolvido e aporte de matériasprimas. No Brasil. Na biossíntese de P(3HB) o controle do pH parece ser um dos mais importantes fatores.br/reportagens/biodiversidade/bio15. A adição de ácido ou base pode reduzir a atividade das enzimas. II. utilizando a tecnologia desenvolvida no país..CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. tais como HCl e NaOH. contudo. pois HCl e NaOH são conhecidos como desnaturantes de proteínas. Alguns métodos usados para manter o pH constante são (SEO et al. O coeficiente de rendimento teórico do substrato em produto depende do substrato usado (ACKERMANN e BABEL. frutose e sacarose. mas também das condições de operação do sistema de biorreação. É necessário observar.3. 1998): I. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono que pode ser citada é o aumento da viscosidade e da tensão cisalhante. que pode ocasionar a ruptura da membrana celular e a maior demanda por oxigênio dissolvido em cultivos aeróbios. que a alta concentração de tampão fosfato impede o crescimento celular. 4. Uso de uma solução tampão. desde 1996. a adição de NaOH aumenta a concentração de íons Na+ que entram na célula juntamente com os substratos glicose. temperatura. Os íons de sódio permeados são bombeados para fora da célula pela Na+K+ ATPase e este bombeamento requer energia pela hidrólise de ATP.htm. por exemplo. interior do Estado de São Paulo.

O mesmo valor foi obtido com 24 h de cultivo em meio contendo 20 g/L de frutose (LINKO et al.21 h-1).4 32 24.5 250 233 37.1 65 3.32 2.08 0.68 1.03 2.h de P(3HB) foi obtida com 6 horas de cultivo de Ralstonia eutropha em meio contendo 10 g/L de ácido lático.5 130 149 12. coli recombinante permitem alcançar concentrações relativamente altas de P(3HB) (89 g/L) em processo tipo batelada alimentada com controle de pH (KIM et al.3 106 158 PHA (g L-1) 121 61. extrato de carne (0. Produção de PHA por várias bactérias (LEE et al. 143 40. Propiônico Sacarose Glicose Ácido valérico Metanol Tempo (h) 50 40 59 46 X (g L-1) 164 91.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.07 h-1).8 62 52 64 33 80. Bactéria PHA Fonte de carbono Glicose CO2 Hidrolisado de tapioca Glicose + ác..86 0.1 81..42 1.1.1 101.8 57. Tabela 4. 1992).. extrato de carne e polipeptona (1:1) (0.55 Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus* Alcaligenes eutrophus* P(3HB) P(3HB) P(3HB) P(3HBco-3HV) Alcaligenes latus P(3HB) 18 Azotobacter vinelandii P(3HB) 47 Chromobacterium P(3HV) violaceum Methylobacterium P(3HB) 70 organophilum Protomonas P(3HB) Metanol 170 extorquens Pseudomonas P(3HHxn-octano 38 co-3HO) Oleovorans Escherichia coli P(3HB) Glicose 39 recombinante Klebsiella aerogenes P(3HB) Melaço 32 recombinante * Alcaligenes eutrophus: atualmente Cupriavidus necator.97 0.75 54 . necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Uma produtividade volumétrica de 0.4 37 71.9 117 PHA (%) 76 67. (1998) obtiveram para as diferentes fontes de nitrogênio orgânico os seguintes valores para a velocidade específica de crescimento: extrato de levedura (0.2 24 50 79.55 1.9 61.5 74 Produtividade (g L-1 h -1) 2.25 h-1). Cultivos de E. polipeptona (0. 1993). Observa-se que as maiores produtividades reportadas na literatura estão associadas ao consumo de sacarose por Alcaligenes latus.88 0.22 g/L. Alguns dados típicos de produção de PHA por diferentes bactérias a partir de substratos distintos são apresentados na Tabela 4.1. 1999).1 39. SEO et al.41 h-1).

0 . CaCl2.5.3. MnCl2. 0. a 180 rpm e 30oC por 24h. Etapa 2: Crescimento em meio mineral (MM).6H2O. obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). Solução 2 (g/L): Na2HPO4.1.4.6H2O.2. 4. 0.5H2O. A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC. 55 . MgSO4.4. 3.0. Microrganismo Foi utilizada a bactéria Cupriavidus necator DSM545. 0. Solução 5 (g/L): Ácido acrílico.4H2O. c. 0. modificado por ARAGÃO et al. Na2MoO4.0.07.2H2O. 3. cuja composição é: Solução 1 (g/L): Citrato Férrico de Amônia. (1990). Condições de Cultivo As células foram cultivadas nas seguintes etapas: a.51.4. 5. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Peptona de carne.2. 4.0 .4. 7H2O. KH2PO4. está baseado em RAMSAY et al. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC exceto o padrão de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA e o solvente ácido acrílico que foi fornecido pela RHODIA. 0. b. Peptona de carne.1.02. 4. A fonte de nitrogênio não foi adicionada em função das condições exigidas para os ensaios.2H2O.01.03. Agar. 0.01. Solução 3 (g/L): H3BO3. As soluções foram esterilizadas separadamente a fim de evitar precipitação dos sais. CoCl2. ZnSO4. 15. (1996). Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 4. 0.06. b.7H2O. a fim de obter massa celular.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. 0. 5.03. NiCl2. 0. CuSO4. 0.3. * Cultivos em frascos Erlenmeyer. 0. Meio Mineral (MM) utilizado nos ensaios com cultura de Cupriavidus necator DSM 545. Etapa 1: Crescimento em meio caldo nutriente (NB).0 . 0.

4. 56 . cultivado em frascos agitados a 180 rpm e 30oC por 24 horas. foi retirado assepticamente.1.4. modelo Bioflo III). cujas condições de trabalho são definidas de acordo com o ensaio em andamento.4.2. * Biorreação em Sistema “Washed Cells” A fim de obter alta concentração celular. sendo o volume de inóculo retirado do mesmo meio já cultivado. também em MM. centrifuga-se um volume de meio de cultura. Nesta etapa. equipado com eletrodo Ag/AgCL com termopar para ajuste de temperatura. as células foram cultivadas previamente em meio NB e então concentradas por centrifugação. Procedimentos Analíticos 4.4. Preparo da amostra: I. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Um volume de meio NB. utilizando um potenciômetro Metler Toledo.85% (v/v) e ressuspendido em água destilada estéril. com injeção direta do sobrenadante.85% (v/v) e ressuspendidas em meio mineral sem a presença de fonte de nitrogênio. modelo MP220. a fonte de nitrogênio estava limitada ou ausente. * Cultivos em Biorreator. 4. pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte. centrifugado.4. lavado duas vezes com solução salina 0. conforme a estratégia adotada. 400 mL de meio NB correspondente a 10% (v/v) do volume de meio no biorreator (4L) foi cultivado em frasco Erlenmeyer de 1000 mL de capacidade a 160 rpm e 30oC por 24 horas. lavadas por duas vezes com solução salina 0. Este volume corresponde a 10% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente.4.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. Análise da concentração de ácido acrílico A quantificação da concentração de ácido acrílico foi realizada por cromatografia gasosa. 4. Em ambas as etapas as células foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas. Em seguida foi transferido assepticamente para o biorreator (New Brunswick.

1. a 250 °C.4.4. 250 °C e 120 °C. medindo-se a absorbância no comprimento de 57 .3. A coluna utilizada para dosagem do ácido acrílico é de sílica fundida (∅0. o coeficiente angular e o coeficiente linear. misturam-se 180 μL do sobrenadante a 20 μL de solução de ácido acético 5 g/L. Espectrofotometria Analisa-se a concentração de massa celular do material coletado em um espectrofotômetro Spectronic 20D+. Análise da concentração de ácido acrílico: I. equipado com um detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio). armazena-se o material amostrado a -20oC para análise posterior.32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. 4. A4 é a área obtida para a concentração do padrão interno ácido acético e "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão. detector e coluna são iguais.1) onde A3 é a área obtida para a concentração de ácido acrílico.4.3. II.4.. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente. O cromatógrafo é um Chrompak. modelo CP 9000. calcula-se a concentração de ácido acrílico (AA) no meio conforme segue: ⎡⎛ A3 ⎞ ⎤ AA( g / L) = ⎢⎜ ⎟ × a⎥ + b ⎣⎝ A4 ⎠ ⎦ (4. respectivamente. 4. com a concentração variando entre 1 g/L e 4 g/L. que é então injetado na coluna. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 1 μL. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugação a 5000 x g por 20 min. O gás de arraste utilizado é o nitrogênio a 9. IV.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. respectivamente. Análise da concentração celular A concentração celular é determinada por dois métodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria. III. III.19 mL/min e as temperaturas do injetor. A curva padrão de ácido acrílico (Anexo 1) foi feita utilizando o ácido acético como padrão interno.

2. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0.01M.2) onde MMf é a massa da membrana final (g). são feitas diluições para manter a linearidade. separa-se um volume conhecido do meio de cultura. MMi é a massa da membrana inicial (g) e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL). Gravimetria A medida do peso seco celular compreende as seguintes etapas: I. para remover íons e sais presentes na biomassa.4. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85°C até peso constante.8. (1988).4. IV. II. filtra-se o meio através de membranas Millipore de poliamida pré-pesadas (poro de 0. Para manter uma precisão adequada (região linear).4. lava-se o sedimentado duas vezes com água destilada. III.000 rpm por 5 minutos.4. 58 .5 e 2 mL.3. (1978). Análise da concentração de polihidroxialcanoatos A quantificação da concentração de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa.0 até 0. coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. III. 4. V.4. a faixa de absorbância utilizada é de 0. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono onda de 600 nm contra um branco de água.2 μm). A partir deste valor. entre 1 mL e 10 mL. II. conforme o método de metanólise baseado em BRAUNEGG et al. Preparo da amostra: I. calcula-se a concentração celular (X) na forma: X ( g / L) = ( MM f − MM i ) × 1000 VA (4. centrifuga-se a amostra a 15. 4. A curva de calibração de concentração celular em função da absorbância (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentração de células durante a fase de crescimento da cultura. com as modificações propostas por BRANDL et al.

Submetem-se os padrões à mesma metanólise que as amostras. V. e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL). aquece-se a mistura a 100°C durante 140 minutos em tubos fechados. o coeficiente angular e o coeficiente linear. 250 °C e 120 °C. III. 59 .CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono IV. adiciona-se 1mL de água destilada. retira-se a fase orgânica (inferior) com uma pipeta Pasteur. a 250 °C. como padrão externo. O cromatógrafo é um Chrompak. A2 é a área obtida para o padrão interno ácido benzóico. O cálculo da concentração de P(3HB) é realizado conforme a seguinte equação: ⎡⎛ ⎛ A1 ⎞ ⎤ ⎞ ⎢⎜ ⎜ ⎜ A2 ⎟ × a ⎟ ⎟ + b ⎥ × 1000 ⎠ ⎝⎝ ⎠ ⎦ P(3HB )( g / L) = ⎣ VA (4. respectivamente. resfria-se a mistura até a temperatura ambiente.0100 g. adiciona-se um volume de 2 mL de clorofórmio. equipado com um detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio). armazena-se a fase aquosa em geladeira. A coluna utilizada para dosagem do P(3HB) é de sílica fundida (∅0.32mm X 50m) modelo CP-WAX 57 CB. "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão. sendo que após 60 minutos de aquecimento a mistura é agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento. O gás de arraste utilizado é o hélio a 9. agitam-se as amostras durante 30 segundos. armazena-se o sedimentado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. respectivamente. O volume injetado é de 1 μL. VII. Metodologia: I. deixando separar as fases. VIII. detector e coluna são iguais. contendo ácido benzóico 0. para posterior análise em cromatografia gasosa. II. modelo CP 9000. IV.4 g/L como padrão interno. A curva padrão (Anexo 3) é feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma). ressuspende-se o sedimentado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%). VI.0010 g e 0.3) onde A1 é a área obtida para o P(3HB).19 mL/min e as temperaturas do injetor. com massa variando entre 0.

33g/L). 1976).5.5.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. Na Figura 4.6 0. A produção de P(3HB) com adição de um agente para controle de pH já foi observada na literatura. em meio mínimo. as células de Cupriavidus necator DSM 545 produziram o P(3HB) até 140 horas de cultivo. O controle do pH é importante porque ele parece afetar bastante tanto o crescimento celular quanto a produção de P(3HB). Resultados e discussão 4.3 é possível observar que. SEO et al.05 0.1.01 0. A diminuição dos valores de pH pode ser um reflexo da liberação de metabólitos intracelulares e/ou da despolimerização do P(3HB).02 0.7 0.4 0.3.00 0.06 0.03 0. Também a absorbância e o pH têm seus valores diminuídos. sem a fonte de nitrogênio.2 9 8 A B Absorbância (600 nm) pH P(3HB) (mg/L) C 7 6 5 0 50 100 150 200 250 Tempo (h) Figura 4.3 0. 4. Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em biorreator. A produção de P(3HB) em meio mínimo em ausência de fonte de nitrogênio já foi observada na literatura para cultivos de Alcaligenes eutrophus (REPASKE e REPASKE. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 4. Perfis da biorreação das células de Cupriavidus necator DSM 545 em MM com ácido acrílico como única fonte de carbono e ausência de fonte de nitrogênio em frascos Erlenmeyer agitados a 160 rpm a temperatura de 30 oC (concentração inicial de ácido acrílico de 0. 0. Para controlar o pH do meio nutriente utilizado para biossíntese de P(3HB) por Ralstonia eutropha.5. Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em frascos agitados.2. 60 .04 0.5 0. A despolimerização do P(3HB) acumulado nas células é observada após esse instante.

4A é possível verificar que as células cultivadas nessa condição apresentaram uma limitação de crescimento por volta de 10 horas de cultivo. Absorbância Peso Seco Celular (g/L) (600 nm) pH 2. que começam a aumentar de forma pronunciada após início da limitação do crescimento. sob agitação de 300 rpm. (1992) utilizaram um método de manutenção do valor de pH pela adição de uma solução de ácido propiônico para obter o copolímero poli-(3-hidroxibutirato-co-3hidroxivalerato) (P(3HB-co-3HV)).4 estão representadas as respostas das células de Cupriavidus necator DSM 545 cultivadas em biorreator em meio caldo nutriente. Na Figura 4. que apresentou um conteúdo de 50% de unidades HV no polímero. 61 . Na Figura 4. KIM et al.4. uma vez que CO2 é gerado e pode ser assimilado como fonte de carbono pelas células.0 3 2 1 0 9 8 A B C 7 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Tempo (h) Figura 4. A solução de Na2CO3 foi a mais bem sucedida. temperatura de 30 oC e pH inicial 7. KOH e Na2CO3. Perfis do crescimento de células de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente (NB) em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração de 0.125 vvm. Reflexo dessa mudança de estado fisiológico é observado nos valores de pH.3 g/L.5 1.5 0. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono (1998) utilizaram soluções de NaOH.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. uma vez que pode ser observada a manutenção dos valores para o peso seco celular em torno de 1.0.125 vvm e pH inicial 7. pois foi capaz de minimizar o efeito da inibição por substrato.0. aeração de 0.0 0.0 1.

necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono O efeito do aumento do pH no meio de cultivo caldo nutriente foi investigado fazendo uso de uma solução de ácido acrílico (2 g/L) para regular o pH. mas é mantido linearmente durante o processo.4 0. conforme a Figura 4.12 0.3 0. Se for considerado o direcionamento do ácido 62 . embora em ambos os experimentos seja alcançada a mesma concentração celular final. Resultados do crescimento de células de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm.0 controlado pela adição de solução de ácido acrílico a uma concentração de 2 g/L.1 0.5D).0 1 D B E C pH 0 -1 -2 -3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 F Tempo (h) Tempo (h) Figura 4.08 0.4A para uma condição experimental inicial similar.16 P(3HB) (g/L) Ácido Acrilico (g/L) ln (abs) A 1. o crescimento celular parece retardado por força de alguma limitação. contrário ao que foi observado na Figura 4.5.0 1.5E). Isto pode ser reflexo da adição de ácido acrílico que. é observado o início da produção de P(3HB) (Figura 4.04 0. O crescimento é retardado.47 g/L no meio de cultura até aproximadamente 11 horas.20 0.5 0. Instantes antes do ácido acrílico começar a ser consumido. Após este período.0 4 3 2 1 0 9 8 7 6 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 0.0 0. Absorbância Peso Seco Celular (g/L) (600 nm) 2.125 vvm e pH 7.2 0.5A apresenta o perfil de crescimento das células quando o pH é mantido aproximadamente igual a 7.00 0.5 0. uma vez que é observada a redução da velocidade específica de crescimento (Figura 4. A Figura 4. aeração de 0.5F) e o consumo de ácido acrílico no meio (Figura 4.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. apresentou acúmulo de 0.5E. devido à adição de ácido acrílico.5 0.

0 e 7. sendo os valores observados iguais. em E.3.34 gP(3HB)/gÁcAcrilico e uma concentração de P(3HB) em relação a biomassa total igual a 12% após 23 horas. (1996) mostraram que o ácido acrílico resultante da clivagem do substrato DMSP pode ser utilizado como um agente aceptor de elétrons. o que faz com que os intermediários sejam direcionados para a via de P(3HB).6 h). QI et al. 63 . 7. mais especificamente da β-oxidação de ácidos graxos. uma vez que já é conhecido que as células de Ralstonia eutropha crescem em anaerobiose na presença de íon nitrato (BERGEY et al. respectivamente. é observado um fator de conversão de substrato em produto (YP(3HB)/ÁcAcrilico) igual a 0. quando o acúmulo de P(3HB) é interrompido. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono acrílico para a via de biossíntese de P(3HB).9 h) e no final do cultivo (13 h). 4. de 60% do peso seco de células cultivadas em meio contendo decanoato como fonte de carbono. na condição experimental de concentração celular equivalente a 12g/L. Interessante é observar que o biopolímero é acumulado por Cupriavidus necator DSM 545 durante o período de crescimento celular. 1983). Além disso. Para uma concentração de 0. (1998) explicam a ação do ácido acrílico sobre a produção de P(3HB) como um possível inibidor de vias metabólicas. os autores obtiveram um acúmulo máximo de PHA. necator DSM 545. Estratégia em batelada para produzir P(3HB) em sistema “washed cells” Na Figura 4.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. O pH do meio de cultivo foi determinado em quatro momentos do processo: no começo do cultivo. Assim. a qual foi totalmente consumida após 4 horas de cultivo. A concentração de ácido acrílico alcançou 0.24 g/L de ácido acrílico. Este tempo é 6 vezes menor do que aquele obtido quando o sistema de crescimento celular foi utilizado (Figura 3.4). VAN DER MAAREL et al. após a alimentação (8. as células bacterianas foram mantidas por 6 horas em meio mineral sem fonte de carbono.5.0.5 g/L de ácido acrílico foi exaurida após 3 horas de cultivo. é possível verificar que o sistema de washed cells pode ser uma boa alternativa para o consumo de ácido acrílico por C. a 7.7 g/L.0. necator DSM 545. quando então a alimentação foi realizada.6 está representada a curva de consumo do ácido acrílico na condição de washed cells para C. uma vez que a exaustão de oxigênio no meio de cultura induz a biossíntese de P(3HB). antes da alimentação (8. Contudo. Observa-se que uma concentração de 0. A introdução do ácido acrílico como um aceptor de elétrons parece ser uma alternativa possível para cultivos anaeróbicos. 8. coli RS3097 (pBHR71).9.. o que pode ser uma alternativa para a produção de P(3HB).

2 0 . respectivamente. Também é possível observar que.6.0 e 0.4 0 .95.58 g/L e o pH foi rapidamente alterado a 7. A análise de P(3HB) (Figura 4.0. enquanto o ácido acrílico estava presente no meio de cultura.15 horas de cultivo e a concentração de ácido acrílico alcançou 0. alcançando um valor igual a 7.6 g/L no meio de cultura. Todo o ácido acrílico foi consumido após 5 horas de cultivo.0.17 g/L.4 g/L em meio mineral com ausência de nitrogênio.4 g/L. a concentração de P(3HB) foi mantida praticamente constante.7A mostram que os valores iniciais para o pH e a concentração de ácido acrílico foram iguais a 7. Perfis de variação da concentração de ácido acrílico em sistema de washed cells para Cupriavidus necator DSM 545 em bioreator agitado magneticamente à temperatura de 30 oC. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 0 .6. uma nova alimentação foi realizada e o pH ajustado novamente a 7. quando o pH foi também ajustado a 7. a 64 .5 0 .7C e 4.5. Quando a fonte de carbono foi totalmente consumida. No final do cultivo o pH alcançou um valor igual a 7.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. O conteúdo de ácido acrílico atingiu 0. A alimentação do meio com o ácido acrílico foi realizada após 6.1 0 .0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 T e m p o (h ) Figura 4. As células foram concentradas a 4.8 e a concentração de ácido acrílico atingiu 0. As Figuras 4.3 0 . o pH aumentou rapidamente. Após uma hora.7B) mostra que as células apresentam acúmulo do biopolímero no início do cultivo.6 0 .7 Á c id o a c r í lic o ( g / L ) 0 . quando o pH alcançou um valor igual a 7. No instante em que o pH apresentou um valor igual a 7. necator DSM 545 sobre a síntese do biopolímero. O sistema washed cells foi utilizado para avaliar a biossíntese de P(3HB) e a influência de uma menor concentração inicial de células de C.7 nas primeiras horas após a segunda alimentação.

0 6 . da concentração de P(3HB) e do pH em sistema washed cells para C.5 B 0 .6 p H C 7 .1 0 5 1 0 1 5 2 0 T e m p o (h ) 8 . necator DSM 545 mantidas em bioreator agitado magneticamente a 30 oC.3 0 . 65 .8 0 5 1 0 1 5 2 0 T e m p o (h ) Figura 4.7 Á c id o a c r ílic o ( g / L ) 0 . 0 .6 0 .0 0 5 1 0 1 5 2 0 A T e m p o (h ) 0 . necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono concentração de P(3HB) diminuiu e uma nova alimentação foi realizada.4 0 .6 P (3 H B ) (g /L ) 0 .4 7 .2 0 .1 0 . Perfis de variação da concentração de ácido acrílico.4 0 .CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.2 g/L até o cultivo bacteriano ser finalizado com ácido acrílico ainda presente no meio.2 7 .7. Esta alimentação parece ter desativado o sistema de depolimerização pois a concentração de P(3HB) permaneceu praticamente constante a 0.5 0 .3 0 .8 7 .2 0 .0 7 .7 0 .

33 g/L em meio mínimo em frascos agitados. utilizando-se para isso uma solução de ácido acrílico. 59. necator DSM 545 em meio mínimo sem a presença de fonte de nitrogênio.C.U.W. Conclusões É possível obter P(3HB) a partir da assimilação de ácido acrílico pelas células de C. G.. “Approaches to increase the economy of the PHB production”. Polymer Degradation and Stability. LINDLEY. 1996. “Pseudomonas oleovorans as a source of poly-(β-hydroxyalkanoates) for potential applications as biodegradable polyesters”.. GROSS. 4. onde as condições de aeração podem ser controladas. 1977-1982. HOLT. BRANDL.6. Biotechnology Letters. 937-942.. O tempo para o ácido acrílico ser completamente metabolizado por células de C. 1. J. PAREILLEUX. 1998. J. BERGEY. 66 .CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.. Baltimore: Williams & Williams. “Maintaining controlled residual growth capacity increases the production of polyhydroxyalkanoate copolymers by A. É possível aumentar a produção de P(3HB) com o controle dos valores de pH do meio de cultura (NB). pp. v. p. D... Referências bibliográficas ACKERMANN. LENZ. N... N. uma vez que o consumo do ácido acrílico ocorreu em um tempo 6 vezes menor no esquema de washed cells. FULLER.. KRIEG. R. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 4.5 g/L em meio caldo nutriente em biorreator.L. v. de 0. pp.7. Com essa estratégia é possível aumentar a concentração de ácido acrílico no meio. v. R. W. (1983) Bergey’s manual of determinative bacteriology. para 0. G. necator DSM 545 mantidas em sistema washed cells é dependente da concentração celular.D. H. p. URIBELARREA. eutrophus”. v. 54. O consumo de ácido acrílico pode ser monitorado pelos valores de pH porque estes valores aumentam enquanto a concentração de ácido acrílico diminui. 167-168. BABEL. H. necator DSM 545. R.M. R.. A. O sistema washed cells parece melhor para esse fim do que o sistema de crescimento celular. 1988. Applied and Environmental Microbiology.F.A. 18.. 183-186. A exaustão da fonte de carbono em meio de cultura MM com ausência de fonte de nitrogênio provavelmente ativa o mecanismo de depolimerização nas células de C. ARAGÃO. diminuindo a concentração de P(3HB).. J.

201-208. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. PARK. REHM.Y. FEMS Microbiology Letters. 1994... KIM. v. HONG. LINKO. International Journal of Biological Macromolecules. H..25. v..H. P.. S. pp.S.. DUBE.. LIM. 56. Q.I. “Metabolic routing towards polyhydroxyalkanoic acids synthesis in recombinant Escherichia coli (fad R): inibition of fatty acid β-oxidation by acrylic acid”. pp. RAMSAY. v.I. 20932098. v. “Experimental optimization of fed-batch culture for poly-β-hydroxybutyric acid production”. 6.. J. LEE. 26.. WOO. v.C.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C.. LEE. CHANG. 11-15. pp. J. LEE..C. “Recent advances in polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation: mini-review”. 892-898. 697-705..Y. A.. 1990. Y. 1993... CHANG. B.. 1992.. Applied Microbiology and Biotechnology. LEE.. C.A. 1978. CHAVARIE... pp. “Production of poly-(β-hydroxybutyric-co-β- hydroxyvaleric) acids”. "Effect of propionic acid on poly-(βhydroxybutyric-co-β-hydroxyvaleric) acid production by Alcaligens eutrophus".. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono BRAUNEGG. 14. S. J. p. S. 1999. v. pp. H. 1998. “A rapid gas chromatographic method for the determination of poly-β-hydroxybutyric acid in microbial biomass”. S.. G. “Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with glucose concentration control”.S. KIM.. H. JUNG.H. C. v. 31-36. Enzyme and Microbial Technology. K. G.. RAMSAY. Y. KIM. pp. 2000. WONG. J.. B. v. pp. 903-906.J. v.N. Metabolic engineering of Alcaligenes eutrophus through the transformation of cloned phbCAB genes for the inverstigation of the reculatory mechnism of polyhydroxyalkanoate biosynthesis. 1997. Biotechnology and Bioengineering.M. STEINBÜCHEL. B. R. QI. CHOI..K.. 89-94.. M. 67 . BATAILLE. Biotechnology Letters.Y.A. H. B. B. LOMALIZA. 56. SEPPÄLÄ. 167. Y. LAFFERTY. Biotechnology and Bioengineering. LEE... S.43. 39. “Production of poly-β-hydroxybutyrate by Alcaligenes eutrophus on different carbon sources”. 29-37. J. J.. p. Applied Environmental Microbiology.H.H. H. CHOI. B.. VAHERI.A. SONNLEITNER.

SHIMIZU. STEINBÜCHEL. 292-297. sp nov”. necator visando a produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono REPASKE. “Optimum growth conditions and pH control solution for PHB biosynthesis in A.. 1984. C. “Metabolic improvement and use of inexpensive carbon sources in microbial production of polyhydroxyalkanoates”. 1990.J. FEMS Microbiology Letters. eutrophus”. 147-194.C. 94.... YOON. “Fed-batch techniques in microbial processes”. W. Archive of Microbiology. T. VALENTIN. S.. A. v. Journal of Bioscience and Bioengineering. Journal of Fermentation Technology. T.Y. 166. 1998.M. pp. 128. A.S. 4. REPASKE. TSUGE.G.. v. 68 . LAVERMAN. 225-238. v. J.T. 2002. OH.. J. pp. 1995. v. W. “Quantitative requirements for exponential growth of Alcaligenes eutrophus”. SHIMIZU..A. T.. 416-420. KIM. YAMANE.. H.. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology. T.. p.T. J.. Journal of Fermentation Bioengineering. T. pp. VAN BERGEIJK. v. v. 1996. pp.. STAM. “Cleavage of dimethylsulfoniopropionate and reduction of acrylate by Desulfovibrio acrylicus..... YAMANE. v. A. T.F. S. R. Journal of Industrial and Engineering Chemistry. SHIMIZU. 32. pp109-115. Applied Environmental Microbiology. YANO.. SUZUKI. 1976. pp.CAPÍTULO 4 – Estratégias para biodegradação de ácido acrílico por C. A. pp. 30. MEIJER. KOBAYASHI. “Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids”.E... VAN WERKHOVEN. 219-228.. “Fed-batch culture methanolutilizing bacterium with DO-stat”. 579-584. S. v. 69. M. SEO.. T.K. 56. W. S. VAN DER MAAREL. 215-220.E. “Phenomenological background and some preliminary trials of automated substrate suply in pH-stat modal fed-batch culture using a setpoint high limit”. 1978. HANSEN.

5.2.. 5.........4.........................…..…......... 70 72 79 79 79 79 79 79 80 80 5...… 82 82 82 83 83 94 5..............……......... 94 .....….3..............2...3. 5..........2............. Conclusões ……………………………………………………………….....5.....2.. 5.............4. Potencial Redox .....……..3. 5..........1...................4....... Medida do potencial redox ……………………………………………… 82 5.......3... Experimental .. Procedimentos Analíticos ……………………………………………...... 81 5.3. 5......4....2...........2...... Referências bibliográficas …………………………………………………..5... 5.......2......2..... Condições de Cultivo …………………………………………………....2.. Módulo de permeação ...... Análise da concentração celular ……………………………………........... 82 5............ Medida do pH …………………………………………………………..........................1................2..1..3......1... Espectrofotometria …………………………………………………..... Gravimetria ……………………………………………………….1......... 5.....… 5..................… 5..... Preparo do inoculo ………………………………………………......................... Introdução ...4...5..2..... Membranas de microfiltração ..1......... 80 5.......................2...............5.....4............ Concentração de células por microfiltração ...5....5..4....4..2..............2........ Microrganismo ………………………………………………………..1.............2...................... Resultados e discussão ………………………………………………….2. Meios de Cultura ……………………………………………………….......……....................... 5... 82 5.....……...5...CAPÍTULO 5 Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Índice 5........….2.2......….... 5..... 5.. Medida da concentração de oxigênio dissolvido …………....... Crescimento em meio caldo nutriente (NB) ……………………..2.2.2..1..... Sistema de microfiltração ..................... 5..2......

1997). As propriedades biológicas de um sistema apresentam especial desafio quanto a sua mensuração devido ao seu comportamento dinâmico não convencional e à complexidade dos fenômenos envolvidos (SONNLEITNER. freqüência de análises. A concentração de biomassa é uma das variáveis mais importantes em processos de cultivo submerso e muitos sensores têm sido introduzidos para monitoramento desta variável “in situ” e em linha (OLSSON e NIELSEN. Na Tabela 5. robustez. 1999). ópticos e acústicos.1 estão apresentados alguns dos métodos mais conhecidos e utilizados para monitoramento da concentração celular em condições controladas. Esta técnica não pode ser usada para medidas em linha. rapidez de análise. cultivos com baixas concentrações ou meios definidos quimicamente.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5.. mas a concentração de biomassa pode ser medida indiretamente por via elétrica ou óptica (HARMS et al. sensibilidade. Isso aumenta a significância estatística das análises e possibilita a observação e interpretação de efeitos que poderiam ser negligenciados ou mal interpretados de outra forma (SONNLEITNER e FIECHTER. em cultivos em escala de laboratório. 1992). risco de contaminação e custo (VAIDYANATHAN et al. consumo de reagente. potenciométricos. precisão. 2002). condutométricos. obtendo-se o peso seco das células. facilidade de operação. Diferentes são as técnicas de medidas que podem ser utilizadas para o monitoramento de bioprocessos.1. isto é. enquanto que os fatores biológicos fornecem informações sobre seu comportamento. 70 . 1997). Introdução Os fatores que influenciam o desempenho de um bioprocesso podem ser classificados como físicos. Os fatores físicos e químicos descrevem o ambiente do biocatalisador. Cada uma dessas técnicas apresenta atributos específicos que podem ser avaliados de acordo com a acurácia.. A possibilidade de fazer uma medida em linha e em tempo real permite que seja aumentada a freqüência de medidas e melhorada a amostragem dos dados. seletividade. químicos ou biológicos. flexibilidade. DOCHAIN e PERRIER. térmicos. facilidade de manutenção. A maneira convencional de medir a biomassa é através da gravimetria. Dentre as técnicas mais comumente utilizadas podem ser citadas aquelas que empregam os princípios amperométricos. consumo de analito. confiança. multiplicidade de análise. 1996.

geralmente de forma indireta. 1985.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. Principais variáveis monitoradas para avaliação do meio de cultura e da atividade celular (WILSON. Monitoramento do meio de cultura pH Temperatura Oxigênio dissolvido Potencial redox Dióxido de carbono dissolvido Substrato Produto Fluxo de massa Monitoramento da atividade celular Oxigênio gasoso Dióxido de carbono gasoso Evolução de calor ATP NAD/NADH Metabólitos Massa celular Concentração de enzimas Os sensores disponíveis para bioprocessos podem ser normalmente classificados em duas categorias: (I) aqueles que medem o ambiente do processo e (II) aqueles que medem. Na Tabela 71 . RNA. 2001. ATP ou fosfolipídeos) Gravimetria (biomassa em base seca) Centrifugação (fração volumétrica de micélio compactado) Ópticos (densidade óptica) Espectroscópicos em linha e in situ (fluorescência) Métodos físicos Análise de imagens digitais utilizando luz visível e marcadores moleculares (epifluorescência) Espectroscopia dielétrica em linha e in-situ Contagem de células (contador de Coulter) Viscosidade aparente do meio de cultura Métodos inferenciais Métodos de inferência com modelos matemáticos ou estequiométricos (taxa de consumo de O2 ou de produção de CO2 em processos aeróbios) Tabela 5. Métodos mais utilizados para o monitoramento da concentração celular (NEVES et al. Métodos Métodos químicos Finalidade Quantificação química dos constituintes da célula (DNA. alguma das propriedades das células. REARDON e SCHEPER.. HARRIS e KELL. 1991).1. 1984).2.

KJAERGAARD e JOERGENSEN (1977) utilizaram o sinal do potencial redox do meio de cultura como sinal para controlar a taxa de alimentação de glicose no meio.1. em princípio. O valor do potencial redox depende.. (1988) monitoraram os níveis de concentração de certos subprodutos para controlar a taxa de alimentação de glicose. o desenvolvimento de um método que permita monitorar e controlar as concentrações de substrato parece ser essencial (LEE e YOO. Para uma eficiente produção de P(3HB) por R. MORI et al. monitoramento da taxa de evolução do CO2 (CER). entretanto. 1987. SUZUKI et al. 72 .. eutropha em altas concentrações são: I. 5. monitoramento em linha de glicose (MITZUTANI et al.. com maior capacidade para trocar elétrons com a superfície da platina do eletrodo (JANSSEN et al.1. utilizado para estimar o consumo de substrato (SUZUKI et al. a concentração da fonte de carbono precisa ser mantida em torno de um valor ótimo. O potencial redox pode ser calculado através da Equação de Nernst. 1992). do potencial padrão (Eho) das meias reações e da concentração dos reagentes. (1979) usaram a concentração de oxigênio dissolvido como um indicador do estado de fermentação e para manipular a alimentação de glicose. O potencial redox (Eh) é um parâmetro global que representa o potencial para reação de óxido-redução de uma variedade de compostos. eutropha. Assim. (1990) usaram medidas de pH para monitorar o sistema e controlar a taxa de alimentação de glicose e outros nutrientes. isto é.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5. se existir uma condição de equilíbrio termodinâmico. PARK et al. 1998). II. 1991).2 estão apresentadas as principais variáveis monitoradas em cada uma dessas duas categorias. 1988). Potencial Redox A primeira medida eletroquímica do potencial redox de uma cultura bacteriana foi realizada em 1910. a medida do potencial redox é determinada pelo composto com maior densidade de carga elétrica disponível para troca. a fim de conseguir alta densidade celular de cultura. Na prática.. SHIMIZU et al. Alguns métodos usados para manter a concentração de glicose em torno de um valor ótimo para produção de P(3HB) por R.

CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Uma definição química para o potencial redox está relacionada a um par de componentes dos quais um na forma oxidada (Ox) pode ser reduzido de maneira reversível em outro na forma reduzida (Red) por meio do movimento de elétrons (e): Ox + ne. Apesar da natureza complexa dessa medida que depende de uma diversidade de parâmetros ambientais e celulares. logo. 1998). medido por um eletrodo redox. O potencial redox resultante. necator por microfiltração. ele é um indicador que representa a possibilidade de ligações redox agirem como doadores e aceptores de elétrons (LEE et al. Diferentes são as aplicações em que os eletrodos redox são utilizados em bioprocessos.. baratos e estáveis para medidas “in situ”. 73 . 1997. otimização de desempenho dos processos e para propostas de controle e de monitoramento (HIGAREDA et al. uma vez que os eletrodos disponíveis comercialmente são esterilizáveis. O potencial redox é medido potenciometricamente com eletrodos feitos de metais nobres (Pt.. o monitoramento do potencial de óxido-redução de culturas celulares tem sido aplicado com sucesso para a identificação de estados fisiológicos. Au). Visto que é possível monitorar o crescimento de células de C. 1998)... Também será verificada a correlação dos valores de potencial redox com a concentração de massa celular e a correlação destas variáveis em um sistema de concentração das células de C. Os meios de cultura contêm muitos componentes diferentes que são sujeitos a diferentes reações redox de natureza biológicas e químicas. está relacionado à disponibilidade global de elétrons e não pode ser associado a um composto específico (WINTER et al. JANSSEN et al. O potencial redox indica a concentração relativa de agentes oxidantes e redutores no meio. 1988). Alguns exemplos estão apresentados na Tabela 5.↔ Red Em culturas de microrganismos o potencial redox é uma das variáveis mais facilmente mensuráveis.3. A construção mecânica é similar a dos eletrodos de pH e o eletrodo de referência deve satisfazer as mesmas exigências. necator no presente capítulo este monitoramento será realizado com as células crescendo em meio NB.

1972 74 .001N de K3Fe(CN)6 Manter o pH constante Candida utilis foi comum a todos eletrodos. inosina não foi acumulada para valores de Eh ≤ -160 mV. A diminuição dos valores de Eh WIMPENNY e NECKLEN. Candida utilis KANTERE. O valor de Eh na fase estacionária leva a produção de SUKHAREVICH. Determinação da quantidade de agentes redutores produzidos durante o crescimento celular.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. et al. KANTERE. 1971 Medir as variações dos valores de Eh com diferentes tipos de eletrodos. Levorina A foi produzida com Referência TENGERDY. 1970 Influência do Eh sobre o metabolismo celular Mudança da vazão de ar e velocidade de agitação do meio de cultura diferentes subprodutos. Há geração de compostos redutores durante o crescimento celular. 1961 Influência de Eh na biossíntese de antibióticos levorina A e levorina B métodos físicos (variação da taxa de aeração) e químicos (adição de compostos químicos) Actinomyes levoris valores de Eh altos ao contrário da Levorina B. 1972.3. mas ácido lático. porém a magnitude dependeu do tipo de eletrodo. Aplicação/Estudo Transformação de L-sorbose em ácido 2-ceto-L-glicônico Estratégia Ensaios com diferentes taxas de aeração. além Bacillus subtilis disso. Titular o meio de cultura com solução 0. Aplicações de eletrodos redox em bioprocessos.. Fixar os valores de Eh utilizando Microrganismo Linhagem mutante de Pseudomonas Observado O Eh conseguiu indicar a demanda de oxigênio pela cultura.

1974 Influência do Eh sobre as mudanças fisiológicas e bioquímicas Adição de ácido ascórbico e hexacianoferrato (III) de potássio Candida utilis celular. Há variação na amplitude do sinal.. 1974 75 .. porém aumentou o consumo da fonte de carbono (glicerol) e da fonte de nitrogênio (NH4+).CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. Aplicação/Estudo Estratégia Definição da capacidade tamponante π Correlação entre oxigênio dissolvido e Eh Medida de Eh em diferentes meios de cultura Microrganismo Observado Referência BALAKIREVA et al. 1974 O valor de Eh diminui 10 vezes mais que o valor de oxigênio dissolvido A adição dos agentes redutores resultou em baixo rendimento ISHIZAKI et al. porém não no perfil ANDREEVA.3 (cont.). A maior amplitude é observada quando o eletrodo está coberto com membrana JACOB. Aplicações de eletrodos redox em bioprocessos. 1974 Influência da limpeza do eletrodo e do seu recobrimento com uma membrana nos valores de Eh Polimento do eletrodo Limpeza do eletrodo com HNO3 Cobertura do eletrodo com membrana Proteus vulgaris Staphylococcus aureus SC511 obtido para a variação dos valores.

1979 Escherichia coli obtido para μmax. Aplicação/Estudo Estratégia Injeção de argônio. Referência Cândida utilis BALAKIREVA et al. 1976 Clostridium botulinum type E O melhor crescimento celular ocorreu com baixa concentração de agente redutor A quinidrona não afetou o valor SMITH e PIERSON. contudo.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. ácido ascórbico. tioglicolato de sódio) em diferentes concentrações. Identificação do estado metabólico da cultura durante a produção de aminoácidos Variação da agitação do meio Microrganismo Observado O eletrodo redox de vidro não sofreu a influência de sistemas que competem pelo oxigênio. Aplicações de eletrodos redox em bioprocessos. ar e oxigênio em Avaliação de diferentes tipos de eletrodos de Eh diferentes etapas do monitoramento redox com eletrodos de platina. ouro e vidro. 1985 Corynebacterium glutamicum ATCC 14296 sinalizar o instante do término da produção de ácido lático.). Os valores de Eh permitiram THOMPSON e GERSON.3 (cont. Formulação de uma teoria: o valor de Eh é apenas uma medida de apenas alguns compostos (doadores de elétrons) Examinar o efeito de diferentes agentes redutores sobre o Eh e o crescimento bacteriano Adicionar agentes redutores (2mercaptoetanol. 1991 76 . bem como início e fim da produção de aminoácidos KWONG e RAO. o neutral red afetou um pouco. Crescimento de microrganismos em Seleção de microrganismos na presença de agentes redutores meios de cultura contendo diferentes concentrações de “neutral red” e quinidrona. 1974 WIMPENNY. permanecendo constante durante todo o tempo..

3 (cont. 1998 Produção de ácido cítrico pelo controle do potencial redox. Aspergillus niger potencial redox é regular a aeração e a agitação. etanol. Além Referência Saccharomyces cerevisiae recombinante HALLBORN et al. (b) variação dos níveis de oxigenação.. Foi desenvolvida uma função polinomial para correlacionar Eh às variáveis de estado. Adição de ferrocianeto do potássio. o perfil de Eh é mantido diferentemente de seus valores quando a concentração de oxigênio dissolvido é variada. Aplicação/Estudo Estratégia Três condições foram adotadas: (a) adição de glucose. Variação da aeração e agitação.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. 1994 Correlacionar Eh com variáveis de estado de culturas Crescimento celular com oxigênio dissolvido e pH controlados Brevibacterium ketoglutamicum disso. A maneira de regular o nível do LEE et al. 1999 77 .. BEROVIC. Microrganismo Observado O rendimento de xilitol foi maior conforme foi aumentada a razão xilose:cosubstrato O consumo do cosubstrato fez com que o potencial redox intracellular fosse balanceado pela regeneração de NAD(P)+ Os valores obtidos para Eh apresentaram quatro intervalos distintos que parecem estar correlacionados com o crescimento celular. acetato Produção de xilitol ou glicerol como cosusbstratos.). (c) variação das razões entre xilose e o cosubstrato. Aplicações de eletrodos redox em bioprocessos.

. Entre os metabólitos analisados foi observado que o aumento nos valores de Eh fez com que a concentração de lactato aumentasse em 30%.3 (cont. mostrando um claro deslocamento do fluxo de carbono na célula.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Tabela 5. A presença de ditiotreitol diminui em 30% o Referência Estudo da modificação dos fluxos de elétrons e carbono a partir da modificação dos valores de Eh extracelular Adição de agentes redutores químicos (ditiotreitol. O potencial redox sinaliza o instante da exaustão de fosfato. Ralstonia eutropha DSM 545 FINKLER. Foram observados picos com maior e menor intensidade nos gráficos obtidos para dE/dt x Escherichia coli tempo e um deslocamento destes em função da concentração de células presentes no meio.). Aplicações de eletrodos redox em bioprocessos. 2000 Identificar diferentes fenótipos bacterianos Monitorar no tempo suspensões com diferentes linhagens bacterianas Monitoramento de cultivos celulares Limitação em fosfato do meio mineral. Aplicação/Estudo Estratégia Microrganismo Observado A biomassa foi afetada pelo valor de Eh e pela taxa de diluição. SILVA e WONG. borohidreto de sódio) e borbulhamento de nitrogênio/hidrogênio Escherichia coli valor da biomassa final. 1995 RIONDET et al. 2002 78 .

também em MM. 79 .0. O mesmo procedimento foi adotado para a etapa seguinte. Nesta etapa. Peptona de carne. Este volume corresponde a 1% (v/v) do MM e foi inoculado assepticamente. centrifugado. Microrganismo Foi utilizada a bactéria Cupriavidus necator DSM545. sendo o volume de inóculo retirado do mesmo meio já cultivado.1. 5.3. 5.2. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne. 5.3. 5. conforme a estratégia adotada. * Cultivos em frascos Erlenmeyer. 3. Preparo do inóculo. 5. Em seguida foi transferido assepticamente para o biorreator (New Brunswick.0 . obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). a 180 rpm e 30 oC por 24h. O inóculo foi preparado a partir do crescimento das células de C.2. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. Um volume de meio NB correspondente a 1% (v/v) do volume de meio no biorreator (4L) foi cultivado em frasco Erlenmeyer (1000 mL) a 160 rpm e 30oC por 24 horas.2.1.0 .2. Condições de Cultivo 5. * Cultivos em Biorreator.2.3.85% (v/v) e ressuspendido em água destilada estéril.0.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5.0 .2. 5. A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC. 3. necator em meio caldo nutriente (NB). Peptona de carne. Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne. a fonte de nitrogênio estava limitada ou ausente. b. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC.2. Em ambas as etapas as células foram incubadas a 180 rpm e 30oC por 24 horas. Agar. lavado duas vezes com solução salina 0. Crescimento em meio caldo nutriente (NB). Um volume de meio NB cultivado foi retirado assepticamente. 15.2.

4.1) desenvolvidas no Laboratório de Separação por Membranas – PAM/PEQ/COPPE. 80 . Concentração de células por microfiltração.4. Membranas de microfiltração Para o desenvolvimento deste trabalho serão utilizadas membranas de microfiltração do tipo fibra ocas (Figura 5. Membranas dispostas longitudinalmente no interior da carcaça de acrílico.2.) como aditivo. segundo metodologia proposta por FARIA et al. Feixe de membranas microporosas de geometria cilíndrica do tipo fibra oca.2.2.1.2 de diâmetro interno (Figura 5.2 – Módulo de permeação.PEI (ULTEM®) polímero base e polivinilpirrolidona (PVP – Fluka Chemika Co. Módulo de permeação O módulo de microfiltração foi preparado numa conformação semelhante a um trocador de calor tipo casco e tubo.1. (2002).2). Resina epóxi nas extremidades do módulo. As fibras ocas foram posicionadas longitudinalmente em uma carcaça de acrílico com 10 cm de comprimento e 1.4. 5. Figura 5. Figura 5. cujas condições de trabalho são definidas de acordo com o ensaio em andamento. 5. 5. As membranas microporosas eram constituídas por poli (éter imida).2.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono modelo Bioflo III).

válvula para pressurização do sistema. O sistema de microfiltração será operado a baixa pressão de operação (0.69 A alimentação dos módulos é realizada pelo interior da carcaça. 8 7 6 1 3 5 4 1. rotâmetro (alimentação).3. o acúmulo de material sobre a mesma. Bomba de circulação 3.2. O escoamento tangencial visa à redução da camada de polarização e. reduzindo a possibilidade de incrustações e o efeito de polarização de concentração.1. Sistema de microfiltração com escoamento tangencial. conseqüentemente. manômetro.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono As características do módulo de permeação estão apresentadas na Tabela 4. Módulo de permeação 4.3.3 bar durante de 120 minutos. 81 . Manômetro 5. módulo de permeação. Permeado 8.1 – Características dos módulos de permeação. Densidade de empacotamento (m2/m3) 1000 Número de fibras 38 Área de permeação (m2) x 105 2. Sistema de microfiltração O sistema de microfiltração montado explora o escoamento tangencial da alimentação através do módulo de permeação. Válvula para pressurização 6.350). Após o processamento da solução os módulos de microfiltração são imersos em água pura e levados ao um ultrasom por cerca de 60 minutos. O sistema de microfiltração (Figura 5.4. bomba de engrenagem (Cole Parmer. variandose tanto a densidade de empacotamento quanto o vazão de escoamento.3 bar). para promover a limpeza destes. Concentrado 2 Figura 5. Rotâmetro 7. Tabela 4.3) é constituído de tanque alimentação.Tanque de alimentação 2. 201. a uma pressão de 0. 5. sendo o permeado coletado no interior das fibras ocas em uma das extremidades do módulo de microfiltração.

modelo MP220. Medida do potencial redox O monitoramento do potencial redox (Eh) foi realizado por potenciometria.2. o meio de cultura foi agitado a 500 rpm e aerado a 1 vvm por 1 hora para ajustar a concentração do oxigênio dissolvido em 100%.1. o cabo do eletrodo foi desconectado do fermentador e foi feito o ajuste da concentração de oxigênio dissovido em 0%.1. modelo mPA 210.5. IV. II. utilizando um potenciômetro MS Tecnopon. são feitas diluições para manter a linearidade. Espectrofotometria Analisa-se a concentração de biomassa do material coletado em um espectrofotômetro Spectronic 20D+. A partir deste valor.5. 5.5. Procedimentos Analíticos 5.2.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5. modelo ROX 673-C/S8) com termopar para ajuste de temperatura. após resfriado o reator. o 82 .5. medindo-se a densidade ótica no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de água.2. polarizando o eletrodo.3. Análise da concentração celular A concentração celular foi determinada por dois métodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria. Para manter uma precisão adequada (região linear). utilizando um potenciômetro Metler Toledo. equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura. 5.4.5. III. 5.2.2. Medida do pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria. equipado com eletrodo redox (Analion. Medida da concentração de oxigênio dissolvido A medida da concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura obedeceu algumas etapas: I.8. 5. após esse período. a sonda foi conectada ao fermentador e mantida por um período de 8 horas antes do cultivo.0 até 0. a faixa de absorbância utilizada é de 0.5.4.2.2. a sonda de oxigênio (Mettler Toledo) foi autoclavada junto com o biorreator a 121 C e 1 atm por 20 minutos.

Na Figura 5.4. V. o término da fase exponencial ocorreu mais rapidamente (4 horas de cultivo) quando o volume de inóculo foi maior (10%) diferente das 6 horas quando foi realizada uma inoculação com um volume menor (1%).2. que foi realizado com um volume maior de meio e com 1% de volume de inóculo. aumentando em seguida. Gravimetria A medida da massa celular seca compreende as seguintes etapas: I. II. A mudança de comportamento do pH pode sinalizar uma mudança metabólica da cultura em meio caldo nutriente. calcula-se a concentração do peso seco celular (X) na forma: ( MM f − MM i ) × 1000 VA X ( g / L) = (5.01M. filtra-se o meio através de membranas Millipore de poliamida pré-pesadas (poro de 0.5. A curva de calibração de biomassa em função da absorbância (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentração de células durante a fase de crescimento da cultura. separa-se um volume conhecido do meio de cultura.3.2 μm). para remover íons e sais presentes na biomassa.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5.1 os ensaios I e II foram realizados para verificar a influência do volume de inóculo sobre a cinética de crescimento de C. quando os valores de pH não são controlados. porém. IV. necator DSM 545 em meio caldo nutriente foram realizados preliminarmente em frascos agitados. respectivamente. A medida de pH durante o cultivo permitiu observar que há um instante em que os valores do pH diminuem. MMi é a massa da membrana inicial (g) e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL).1F). III. A mesma observação pode ser feita no ensaio III. entre 1 mL e 10 mL. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0.1C e Figura 5. 5. Para estes ensaios a velocidade específica de crescimento foi similar.1) onde MMf é a massa da membrana final (g). μI = 0.42 h-1 (Figura 5. Nos ensaios 83 .44 h-1 e μII = 0. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85°C até peso constante. necator.2. Resultados e discussão Estudos cinéticos do crescimento de C.

84 . A partir dos resultados apresentados nas Figuras 5. a fase estacionária é iniciada.2C e Figura 5. Para ambas as culturas foi observado o mesmo valor para a velocidade específica de crescimento (μ) igual a 0. que pode ter ocasionado uma menor aeração. há uma desaceleração da variação do Eh do meio.3A). mostra que a mudança do comportamento da curva de pH ocorre no instante em que os valores de Eh são iguais a zero. necator em meio NB para ensaios em batelada como as etapas de diminuição.2B e Figura 5. necator DSM 545 em meio caldo nutriente.2 e 5. Para avaliar a utilização de uma sonda redox para fins de monitoramento. A fase lag observada no ensaio III pode ser devido ao maior volume de meio. comparada à leitura de Eh (Figura 5.4).3B).CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono apresentados. Após a passagem pelo valor zero.2A e Figura 5. A leitura de pH. estabilização e brusca diminuição dos valores de Eh durante o cultivo. o que coincide com a desaceleração do crescimento e o início da fase estacionária. novos ensaios foram realizados e os valores de pH e Eh comparados com as fases de crescimento das células de C. Perfis semelhantes para a variação dos valores redox podem ser observados nos ensaios realizados por KWONG e RAO (1991) quando investigaram a variação dos estados metabólicos de células de Corynebacterium glutamicum. a mudança de inclinação na curva de pH que aparece em todos os ensaios parece sinalizar a desaceleração do crescimento. Em seguida.3C) no instante em que as culturas desaceleram o crescimento (Figura 5. é possível descrever o crescimento das células de C. Comparativamente aos perfis de crescimento celular representados pelos valores de absorbância do meio.3 é possível observar uma diminuição dos valores de pH (Figura 5.41 h-1 (Figura 5.

Ensaio III: 1%) 85 .CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Figura 5. sem controle de pH. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono sob agitação orbital de 160 rpm. (Volume de inóculo = Ensaio I: 1%. Ensaio II: 10%. Resultados do crescimento de células de C.1.

2 7.2 B e 5.997 0 2 4 6 8 -2 -3 y = a. 1 1 0 0 ln (abs) ln (abs) -1 -1 -2 -3 y = a.5 7. x + b a = 0.2 7.3.2.991 0 2 4 6 8 10 12 14 16 -4 10 12 -4 Tempo (h) Tempo (h) Figura 5.6 7.41 b = -1.3 7. Perfis do crescimento de células de C.4 7.. sem controle de pH. necator DSM 545 meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC sob agitação orbital de 160 rpm.3 7. Perfis do crescimento de células de C. 86 .4. Linearização dos valores de absorbância obtidos nos cultivos apresentados nas Figuras 5.41 b = -3.57 r = 0.75 r = 0.1 7. necator DSM 545 meio caldo nutriente em frascos agitados a temperatura de 30 oC sob agitação orbital de 160 rpm.5 7.1 0 2 4 6 8 10 12 Tempo (h) Tempo (h) Figura 5.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Absorbância (600 nm) pH 3 2 1 0 7.4 7.3 B. x + b a = 0. Figura 5.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 150 300 A B C Eh (mV) 50 0 -50 Eh (mV) Absorbância (600 nm) pH 100 200 100 0 -100 -100 3 2 1 0 7. sem controle de pH.

O primeiro estágio apresenta uma velocidade específica de crescimento ao redor de 0. 0 7. A retomada de um patamar superior para os valores de redox pode estar correlacionada com o segundo estágio observado para o crescimento celular.x + b a = 0.5D). A partir da linearização podem ser considerados dois estágios de crescimento.32 h-1.35 r = 0.32 b = -1. é possível observar que os valores são negativos. em biorreator. sendo possível assinalar o término desta fase após aproximadamente 4 horas de cultivo.9 -50 -100 -150 7. 87 .125 vvm sem controle de pH. Uma queda no pH é observada neste período.4 7.5.5C) do meio de cultura. com o auxílio do pontencial redox (Figura 5.6 7.2 7. como visto anteriormente.7 Eh (mV) pH 2 4 6 8 -200 -250 -300 -350 -400 0 3 A Tempo (h) 7. ao contrário do que foi observado nas culturas em frascos agitados. Inicialmente.5A).3 7.5 7.1 10 0 2 B 2 4 6 8 10 Tempo (h) Absorbância (600 nm) 1 2 ln (abs) C 1 0 0 2 4 6 8 0 D y = a. Esse comportamento fica mais evidente quando os valores são linearizados (Figura 5.995 -1 -2 10 0 2 4 6 8 10 Tempo (h) Tempo (h) Figura 5.5. indicando uma desaceleração do crescimento. são apresentados na Figura 5.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Os resultados do comportamento dos valores de potencial redox em cultivos de C. necator realizados em meio caldo nutriente. Também observa-se que não são bem definidas as fases de crescimento celular no perfil obtido para os valores de absorbância (Figura 5. uma vez que novamente é observada a estabilização do sinal do potencial neste instante. Perfis do crescimento de células de C.8 7. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração de 0.

necator DSM 545 em biorreator.0 6. necator em meio caldo nutriente. os valores de oxigênio dissolvido aumentam. Resultados do crescimento de células de C.3 7.6 estão apresentados os perfis para as variáveis pH.6A e 5. respectivamente) são parecidos.125 vvm sem controle de pH. Observa-se que os perfis de Eh e OD (Figuras 5. 5. quando a cultura atinge a fase de desaceleração do crescimento. assumindo um valor ao redor de -80 mV.8 6. como também observado nas Figuras 5. uma vez que as células são aeróbias.1D. oxigênio dissolvido e Eh para o cultivo de C.6C fica nítida a queda dos valores de pH. 88 . indicando a fase de desaceleração do crescimento celular. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator.7B).7A). com uma velocidade específica de crescimento de 0.6.1 7.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Além da comparação dos valores de pH e Eh em diferentes cultivos de C. diferindo ligeiramente na estabilização de seus valores no patamar inferior das curvas. Quando o Eh começa a manter seus valores no menor nível. tanto em frascos agitados quanto em biorreator.3C.1A. parece também útil fazer a comparação com o perfil de oxigênio dissolvido. Na Figura 5.6B.7 6.47 h-1 (Figura 5.9 6.6 100 C pH OD (%) Eh (mV) 80 60 40 20 0 40 0 -40 -80 -120 0 2 4 6 B A Tempo (h) Figura 5. a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração 0.1G. Na Figura 5. Essa cultura celular apresentou um crescimento exponencial desde o início do cultivo (Figura 5. 5. 7.2 7.2C e 5. O ensaio foi conduzido até o instante em que os valores de Eh começaram a estabilizar no patamar inferior da curva. 5.

5 horas de cultivo). foi realizada uma alimentação com meio caldo nutriente para que o volume do meio atingisse o nível e a concentração de nutrientes presentes no início da cultura. 5. se comparado ao perfil obtido para a linearização dos valores da absorbância do meio de cultura (Figura 5.8C.47 b = -3. necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator. Como a indicação de início da fase de desaceleração do crescimento celular pode ser obtida com o monitoramento dos valores de potencial redox.20 0.00 -4 0 2 4 6 0 2 4 6 ln (abs) -2 y = a. Na Figura 5. O nível inferior dos valores para o perfil do potencial redox antes da alimentação foi atingido apenas duas horas após a concentração de oxigênio dissolvido ter sinalizado o final do crescimento. representa exatamente o período compreendido pela fase de desaceleração do crescimento celular. Todas as variáveis medidas sofreram variação.8B e 5. Os valores do pH e da absorbância diminuíram muito pouco.35 0.15 0.5h de cultivo. Durante as primeiras 6 horas de cultivo os perfis para pH.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 0. OD e Eh (Figuras 5. ou seja.10 0. de 75% para menos de 10%. Tendo a cultura atingido o início da fase estacionária (7. necator em meio caldo nutriente em biorreator. onde as únicas variáveis controladas são a temperatura (30 oC).125 vvm).6. Esse intervalo observado entre a concentração de oxigênio dissolvido e o Eh. a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração 0.7. ao contrário do que foi observado para a concentração de oxigênio dissolvido. que diminuiu drasticamente. é possível realimentar o sistema. Resultados do crescimento de células de C. 89 . após 7. a agitação (300 rpm) e a aeração (0.81 r = 0.05 0.998 -3 Tempo (h) Tempo (h) Figura 5.8A.8 estão apresentados os resultados obtidos para o cultivo de C.x+b a = 0.25 0.125 vvm sem controle de pH.40 0. respectivamente) apresentam comportamentos similares àqueles apresentados na Figura 5.30 0 -1 Absorbância (600 nm) 0.8F).

CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

imediatamente após a adição da solução de alimentação. A concentração de biomassa foi afetada pela diluição do meio após a alimentação, como pode ser observado na Figura 5.8E, aumentando rapidamente a seguir por causa do crescimento celular. Os valores de Eh sofreram uma variação e assumiram um novo perfil para o período após a alimentação; contudo, a observação de um novo valor mínimo em 10,3 horas coincide com o final da nova etapa de crescimento celular, que apresentou uma velocidade específica de crescimento de 0,34 h-1, um pouco inferior àquela observada para o crescimento celular na primeira etapa (0,41h-1).

7,3 7,2 7,1 7,0 6,9 6,8 6,7 6,6 100

pH

A

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Abs (600 nm)

D

OD (%)

X (g/L)

80 60 40 20 0 50

B

E

Eh (mV)

0

ln(abs)

-50 -100 -150 0

C
2 4 6 8 10 12 14

F
y = a.x +b a = 0,41 b = -3,69 r = 0,995 0 2 4 6 8

-2 -4

y = a.x +b a = 0,34 b = -3,26 r = 0,966 10 12 14

Tempo (h)

Tempo (h)

Figura 5.8. Resultados do crescimento de células de C. necator DSM 545 meio caldo nutriente, em biorreator, com alimentação a 8 horas de cultivo, a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração 0,125 vvm sem controle de pH. Na Figura 5.9 estão apresentados os resultados de uma cultura que teve uma perturbação indesejada no sistema. No início da fermentação houve a formação de muita espuma e óleo de oliva foi adicionado como anti-espumante. O óleo de oliva parece ter afetado a velocidade específica de crescimento, uma vez que foi obtido um valor de 0,17 h-1 para a velocidade específica de crescimento (Figura 5.9F), o qual é

90

CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

muito inferior àqueles obtidos nos outros ensaios. Contudo, os valores de Eh (Figura 5.9C) conseguiram sinalizar o final da fase de desaceleração após 13 horas de cultivo. Observado que o sinal de potencial redox do meio de cultura varia durante o crescimento celular, uma correlação entre os valores obtidos para a absorbância e para o potencial redox é apresentada na Figura 5.10. Embora não seja possível dizer claramente quais os compostos estão reduzindo ou oxidando em um meio de cultivo de células, a correlação linear obtida é muito boa (r = 0,97). A equação linear obtida para a correlação talvez possa ser utilizada para definir a concentração de biomassa no meio de cultura pela simples leitura do sinal redox em substituição à medida espectrofotométrica tradicionalmente realizada.

7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 100

pH

A

1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 1,0

Abs (600 nm)

D

OD (%)

X (g/L)

80 60 40 20 0 50 0 -50 -100 -150 -200 -250 -300 -350 0

0,8 0,6 0,4 0,2 1,0

B

E

Eh (mV)

ln(Abs)

0,5 0,0 -0,5 -1,0 0 2 4 6 8

C
2 4 6 8 10 12 14 16

F
Tempo (h)

y = a.x + b a = 0,17 b =-1,42 r = 0,991

10

12

14

Tempo (h)

Figura 5.9. Resultados do crescimento de células de C. necator DSM 545 em meio caldo nutriente, em biorreator, a temperatura de 30 oC sob agitação de 300 rpm e aeração 0,125 vvm sem controle de pH.

91

CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

2,0

Absorbância (600 nm)

1,5

1,0

0,5

y = a.x + b a = 1,25 b = -0,008 r = 0,97

0,0 -100 -50 0 50 100 150

Eh (mV)

Figura 5.10. Correlação entre os valores de potencial redox e absorbância, obtidos em cultivo de C. necator em meio caldo nutriente. Ensaios de separação de células de C. necator, utilizando módulo de fibras ocas, foram realizados em triplicata para verificar a correlação existente entre a concentração de massa celular e o potencial redox. Na Figura 5.11 é possível verificar que nos primeiros 20 minutos de microfiltração há uma diminuição na concentração celular. Isto pode ser explicado pela aderência das células à membrana de fibra oca. A diminuição da concentração de massa celular do meio é acompanhada com a diminuição dos valores de redox (Figura 5.12); contudo, quando começa a haver a concentração celular o potencial redox sinaliza com o aumente de seus valores. Os perfis obtidos para as correlações entre os valores do potencial redox e da concentração de massa celular para os ensaios estão apresentados na Figura 5.13. É possível observar que a correlação não é linear desde o início do processo devido às propriedades da membrana que apresenta porosidade e permite que as células de C. necator sejam adsorvidas.

92

X (g/L) 0.9 0.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 1.8 0.13.necator durante a do potencial redox do concentrado durante a microfiltração.8 Eh (mV) X (g/L) 0. 0.75 0.65 0. Perfis da concentração das Figura 5.50 0.0 0.50 0.65 microfiltração.60 0.70 0. necator concentradas por microfiltração.65 Eh (mV) X (g/L) Tempo (min) Tempo (min) Figura 5.75 0.60 0.35 0 20 40 60 80 100 120 Eh (mV) X (g/L) Eh (mV) 0.60 0.6 0.0 0.55 0.5 0.50 0.70 -170 -172 -174 -176 -178 -180 -182 -90 -100 -110 -120 -130 -140 -150 -160 -110 -120 -130 -140 -150 -160 -170 -180 -190 -200 0 20 40 60 80 100 120 X (g/L) 0.75 0.40 X (g/L) 0.9 0.45 0.45 0.7 0.11.70 0.45 0.75 0.55 0. 93 .55 0.12. Correlação entre os valores de potencial redox e a concentração de células de C.65 0.6 0.45 0.35 -200 -190 -180 -170 -160 -150 -140 -130 -120 -110 -160 -150 -140 -130 -120 -110 -100 -90 Eh (mV) 1.7 0.4 -184 -182 -180 -178 -176 -174 -172 -170 Eh (mV) Figura 5.5 0.70 0.40 0.60 0.55 0. Perfis da variação do sinal células de C.4 0.50 0.

Journal of Bacteriology..A. ANDREEVA. apresenta uma velocidade específica de crescimento de até 0. v. L. Este valor é maior do que aqueles obtidos para cultivos de células em meios contendo como fontes de carbono a glicose (0. 780-785.54 h-1) (AMPE e LINDLEY.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 5.47 h-1 nos ensaios realizados. Isso é importante para estratégias de alimentação do cultivo celular a fim de obter maior concentração de células de C. F. o Eh mostrou-se eficaz em caracterizar os estágios de crescimento da cultura. 1996). 94 . 1974... frutose (0. 5. n. E.42 h-1) (SONNLEITNER et al. 1993).2 h-1). LORET.5.4. como no caso da necessidade de adição de antiespumante..M. F. Conclusões Cupriavidus necator DSM 545. Microbiology. AMPE. 1996.. “Flux limitations in the ortho pathway of benzoate degradation of Alcaligenes eutrophus: metabolite overflow and induction of meta pathway. “The redox potential in microbiological media”. pp. Referências bibliográficas AMPE. V. Mikrobiologiya. “Acetate utilization in inhibited by benzoate in Alcaligenes eutrophus: evidence for transcriptional control of the expression of acoE coding for acety coenzyme A synthase”. v. 1979) e inferior aos obtidos para benzoato (0. Além disso...3 h-1) (AMPE e LINDLEY. mesmo quando há perturbações indesejadas no sistema. acetato (0.16 h-1) (MULCHANDANI et al.M. D. pp. at high substrate concentrations”. 1995). Os valores obtidos para Eh auxiliam na determinação do instante em que se inicia a fase estacionária da curva de crescimento. 1989. 1974. “Physiological and biochemical rearrangements of the yeast Candida utilis as a function of the redox potential”. 177.. semelhante aos obtidos para ácido lático (0. BALAKIREVA. cultivada em meio caldo nutriente (NB). RABOTNOVA. 5826-5833. 142. D. Biotechnology and Bioengineering Symposium.. 43. LINDLEY. pp. I. é possível verificar que a correlação entre a concentração de massa de células de C. LINDLEY.. necator o que pode refletir em aumento da produção de polihidroxialcanoatos. necator e os valores do potencial redox do concentrado podem ser utilizados para monitorar um sistema de microfiltração. 769-780. Além disso. 1807-1817. pp. v. KANTERE. 1995. 4.L.

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. 66. RIONDET. LAFFERTY. W. “Electrochemistry bioassay system. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. C. 97 . B.CAPÍTULO 5 – Monitoramento do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono RADJAL. FUJIMORI. CACHON. FIECHTER.. v. 2000. T. SMITH. “Determination of cell concentration and characterization of cells”. Y. v.. M. K. G. “The effect of aeration and redox potential of the medium on biosynthesis of levorin A and B”... 620-626. B. p. 37.N. DIVIES.. 1992. A. Mikrobiologiya. M.. pp. Biotechnology. “Impacts of automated bioprocess systems on modern biological research”. 7.. 14. v. R. 1984. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology.H. 1979. 144-148. S. T.I. 155-187. v. “Fed-batch cultures of recombinant E. V. 1991.. ALCARAZ.. V. ODAWARA.F. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. p.T. Y. pp. NISHIMURA. Journal of Fermentation Technology. “New concepts for quantitative bioprocess research and development”. FUKUZONO. n.. G..P. Biotechnology & Bioengineering Symposium. “Extracellular oxidoreduction potential modifies carbon and electron flow in Escherichia coli”.. v. “Optimization of amino acid production by automatic self-tuning digital control of redox potential”.5. D. N. SILVA. PIERSON. WACHÉ.. CADMAN. 657-679.. M. v.. pp. N.. SONNLEITNER. 187191.D. 54. pp... WONG. R.. 4.K. v. 981-985. 143-159. YAKOVLEVA. In: Measuring. Redox responses of Escherichia coli cultures to environmental stresses”.. VCH. J. 1995. K. v. B. “Effect of reducing agents on oxidationreduction potential and the outgrowth of Clostridium botulinum Type E spores”.. 179-223. coli with inhibitory substances concentration monitoring”..V. R. REARDON.. pp. SUKHAREVICH. HATCH. SONNLEITNER. n..978-984. 1979. Germany. Europeum Journal of Applied Microbiology and Biotechnology. 182. Modeling and Controlling. 1970.L.A.J.37. SHVEZOVA.. SCHEPER. v. Jounal of Bacteriology.. 39.W. “Formal kinetics of poly-b-hydroxybutiric acid (PHB) production in Alcaligenes eutrophus H16 and Mycoplana rubra R14 with respect to the dissolved oxygen tension in ammonium-limited batch cultures”.M. 46. E... pp. 1988. SONNLEITNER. TSYGANOV. pp. pp. 1996. Applied and Environmental Microbiology. SHIMIZU. HEINZLE. M.. N. 1-10. BRAUNEGG.

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......... Testes de sedimentação ……………………………………...1...... 6....5.... pH ...3....... Avaliação do crescimento celular …………………………............2...3...... Preparo do inóculo …………………………………….................. Uso do sulfato de alumínio como agente floculante …………..... Referências bibliográficas ................ Densidade média dos flocos ………………………………....4....2...3.......CAPÍTULO 6 Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Sumário 6...... 6.. 6.........2...…………..........2............................. Condições de cultivo ……………………………………....2.....2...6..2... Resultados e discussão …………………………………………......... necator DSM 545 sob a influência dos agentes floculantes.....1..........7...5............ 6....... 6...………...6...............…….……...7.......... 6.... 6...………......... 105 105 105 105 106 106 110 115 117 118 ..... Análise da concentração de células nos ensaios de avaliação do crescimento celular …………………………….....7................. Conclusões ....2...2. 6. Procedimentos Analíticos ………………………………………..1.............…………........7.......... 6............................2...1..……....2...4.... Testes de floculação ………………………………………….......1.. Produção de massa celular …………………………….…..….................... 6.3....2..2.... 6. Diâmetro médio dos flocos e fração volumétrica de fluido …….....7.....3.. 6.............2................…........... Uso do tanino como agente floculante ……………………….…………..2............... 6....... 6..2.......... Avaliação do crescimento celular de C....... 6.…………………..................................1.......……....... Análise da concentração de células nos testes de 104 100 101 101 101 101 101 101 101 102 103 103 103 103 104 floculação/sedimentação . 6......4.……........3... 6...….3.…………......7........... 6..3....... Introdução .................……...5.………………..... 6..2...................... Microrganismo …………………………...2.........2........ Cálculo da capacidade operacional de um sedimentador contínuo ........2........2........... 6.3...….........………....... Caracterização dos flocos ……………………………………...... Distribuição de tamanhos de partículas …………………......... 6... Meios de cultura …………………………………………............ 6...............2.3..... …………………………....2..6. Experimental .. 6.... 6............…….......3..........

respectivamente. desencadear o processo de biossíntese de PHAs. Brasil) e sulfato de alumínio (Al2(SO4)3) para a concentração das células de Cupriavidus necator DSM 545 para. Tanac S.1. determinar a capacidade operacional de um sedimentador contínuo a partir de testes de sedimentação em batelada e verificar a viabilidade celular na concentração ótima de floculação. (2000) utilizaram sais à base de ferro e de alumínio na sedimentação da massa celular para concentração e posterior extração do biopolímero. a partir disso. sulfato de ferro.. cloreto de polialumínio). utiliza-se normalmente uma seqüência definida de operações. diferentes estratégias de cultivo são adotadas. 2001). caracterizar o sistema floculento em termos da densidade e diâmetro médio dos flocos. usadas para a produção de etanol. alginato de sódio. sob limitação de algum nutriente no meio de cultivo. 100 . posteriormente. Os resultados mostram a viabilidade do método empregado para a obtenção de concentrados de células de Cupriavidus necator DSM 545. como no tratamento de efluentes e em operações downstream em processos fermentativos (SALEHIZADEH e SHOJAOSADATI. Os resultados de concentração ótima de tanino obtidos pelos autores ficaram em torno de 140 ppm. RYU et al. A presente etapa do trabalho tem por objetivo empregar tanino (Tanfloc SG.A. Na produção de PHAs. tanino) (SALEHIZADEH e SHOJAOSADATI. auxiliaram na economia de energia na etapa de centrifugação e não deixaram resíduos no biofilme confeccionado. usadas para a produção de boinseticida. No caso específico da Cupriavidus necator DSM 545.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 6. LUNA et al. floculantes orgânicos sintéticos de cadeia polimérica longa (derivados de poliacrilamida) e floculantes naturais (quitosana. (2003) e PUGET et al. Os autores verificaram que os agentes floculantes não interferiram na etapa de extração. (2000) utilizaram tanino como agente floculante natural para concentração de células de Bacillus sphaericus. e de Zymomonas mobilis. Os floculantes podem ser classificados em três grupos: floculantes inorgânicos (sulfato de alumínio. Introdução A separação de microrganismos por floculação/sedimentação é empregada em muitos processos biotecnológicos. 2001). Primeiramente há a necessidade de ser obtida uma elevada concentração de biomassa para.

3. Meios de cultura Os meios de cultura utilizados foram: a.1.3.2. obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). 5. em meio NB.A.3.0. A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC. 101 . Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto à VETEC exceto o floculante Tanfloc SG que foi adquirido junto à TANAC S. II) meio NB foi inoculado a 1% (v/v) com células obtidas nos ensaios de floculação/sedimentação na condição ótima. 15.0) a 4 oC..2. Neste último ensaio. b. Peptona de carne. sob agitação de 60 rpm durante 24 horas. Preparo do inóculo: O inóculo foi obtido a partir da ressuspensão de duas alçadas de células. Brasil. a 30 oC.3.0 .2. 6. Avaliação do crescimento celular: O crescimento celular de Cupriavidus necator DSM 545 foi avaliado a partir da observação da variação dos valores de absorbância do meio de cultura em três situações: I) meio NB foi inoculado a 1% (v/v). 6.1. Agar. Meio de produção de massa celular: As células foram cultivadas em meio Caldo Nutriente (NB. Condições de cultivo 6.2.2. Produção de massa celular: Os ensaios foram realizados em frascos Erlenmeyer.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 6.3. Peptona de carne. 6.0). 6. g/L: Extrato de carne. O meio NB foi incubado por 24 horas a 160 rpm e 30 oC.2.2. 3. 6. Meio de manutenção: As células foram mantidas em meio Agar Nutriente (NA. 5. que estavam mantidas sob refrigeração em NA.2. 3. o objetivo foi verificar a influência dos floculantes na concentração ótima na cinética de crescimento celular.2. Microrganismo Foi utilizada a bactéria Cupriavidus necator DSM545. g/L: Extrato de carne.0 .

Com o término do teste de jarros. onde CT é a concentração inicial de células na suspensão e CS a concentração de células no sobrenadante. A forma como foram realizadas as amostragens está exemplificada na Figura 6. A amostragem para o cálculo de CT foi realizada na metade da etapa de mistura do floculante e para o cálculo de CS após uma hora de sedimentação. Brasil) e sulfato de alumínio (Al2(SO4)3). Testes de floculação Os ensaios de floculação foram realizados no equipamento Jar Test (marca Digimed. O volume utilizado foi de 250 mL em Beckeres de 500 mL. Tanac S. necator para o cálculo da eficiência de recuperação.4.1 para a adição de sulfato de alumínio. A massa seca foi determinada a partir da filtração da amostra em membrana Millipore 0. a mistura foi agitada a 40 rpm durante 10 min para a adequada formação dos flocos. para observação visual da melhor condição de sedimentação dos flocos e de clarificação do meio.1. As amostragens foram realizadas nos primeiros 5 minutos de agitação da suspensão e após o término do período de repouso (60 minutos). A suspensão foi submetida a uma agitação de 90 rpm durante 5 min para a completa mistura do floculante. em seguida. a suspensão foi mantida em repouso durante uma hora..2. Forma de amostrar a suspensão durante a formação dos flocos pela adição de sulfato de alumínio (A) e do sobrenadante (B) obtido após a sedimentação dos flocos de células de C. modelo MF 01) utilizando os floculantes tanino (Tanfloc SG. 102 .2 μm previamente tarada e mantida em estufa a 85oC até alcançar massa constante.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 6.A. A B Figura 6. O percentual de recuperação de massa celular (R%) foi calculado pela Equação 6.1. Os experimentos foram realizados em duplicata.

calculada pela Equação 6.2. diâmetro de 5. Densidade média dos flocos: A densidade média dos flocos (ρfl) foi avaliada através da técnica de centrifugação (FRANÇA. A amostragem do sobrenadante foi realizada após 300 minutos de sedimentação.2.3) e β é um parâmetro que depende da porosidade para sistemas particulados expandidos. A eficiência de recuperação foi determinada através da Equação 1. Diâmetro médio dos flocos e fração volumétrica de fluido: O diâmetro médio dos flocos (Dfl) foi determinado de acordo com a metodologia descrita por MASSARANI (2002). 2000).1) 6. A seleção do valor da rotação e do tempo de centrifugação foi realizada visualmente. de forma a se obter um sedimento não compactado.4 e 6.2.3: k (ε f ) = μ fν s (1 − ε f )( ρ fl − ρ f ) g (6. a diferentes concentrações das suspensões floculentas.5: 103 .5. Os testes foram repetidos sete vezes.2 cm.2. Estes foram realizados em proveta de 500 mL de capacidade. 6.2.6.0 cm e altura de 35. Testes de sedimentação A metodologia de KYNCH (1952) foi utilizada para os testes de sedimentação em batelada.6. a partir da Equação 6.6. calculado através das Equações 6.2: k = k (ε f ) = D fl ε f 2 3 36 β (1 − ε f ) 2 (6. 6. As velocidades de sedimentação foram calculadas através do coeficiente angular obtido para a seção linear de cada curva de sedimentação.2) onde k é a permeabilidade do meio. Caracterização dos flocos 6.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono ⎛ CT − CS R(%) = ⎜ ⎜ C T ⎝ ⎞ ⎟ ⎟ × 100 ⎠ (6. A velocidade de rotação estabelecida foi de 250 rpm durante 25 min.1.

60 (ε − 1 .7) onde MMf é a massa da membrana final (g). 104 . e em seguida as membranas foram colocadas em estufa a 85°C por 24 horas. Procedimentos Analíticos 6.1. Um volume de 10 mL da suspensão foi filtrado através de membranas Millipore de poliamida pré-pesadas (poro de 0. 94 f f ) 1−ε . 0. νs a velocidade de sedimentação calculada à taxa constante.2.5) onde μf é a viscosidade do fluido.8ε f − 3.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono β = 0 .4) β= 1 εf2 2(1 − ε f )( 4. MMi é a massa da membrana inicial (g) e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (10 mL). ρf a densidade do fluido e g a aceleração da gravidade. Calcula-se a concentração de massa celular (X) na forma: X ( g / L) = ( MM f − MM i ) × 1000 VA (6. 0.9 < εf < (6. Análise da concentração de células nos testes de floculação/sedimentação A concentração celular nos testes de floculação/sedimentação foi determinada por gravimetria.2 μm). 6.9 (6.7.8) . ρfl a densidade do floco. A determinação da fração volumétrica de fluido (εf) foi realizada durante os testes de sedimentação através da Equação 6.6) onde Hsob é a altura de fluido sobrenadante e Ht é a altura total de suspensão na proveta de ensaio (30 cm).2.5 < εf ≤ 0.7.6: εf = H sob Ht (6.

com o objetivo de simular a concentração de alimentação no sedimentador. modelo MP220.4. Distribuição de tamanhos de partículas A distribuição de tamanhos de partículas foi determinada utilizando-se o equipamento Mastersizer Micro Plus/Malvern.8. Análise da concentração de células nos ensaios de avaliação do crescimento celular A concentração celular nos testes de avaliação do crescimento foi avaliada por espectrofotometria.8) onde F é a vazão volumétrica da suspensão na alimentação.0 até 0.9): 105 . De acordo com KYNCH (1952). Z0 é a altura da coluna de suspensão e t* é o tempo transcorrido no ensaio em proveta para que a posição da interface clarificada seja dada por Z* (Equação 6.2. pH As medidas do pH foram realizadas por potenciometria. 6.7.2.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 6.7.7. A é a área da seção transversal do sedimentador. são feitas diluições para manter a linearidade. a capacidade de projeto de um sedimentador contínuo (F/A) pode ser expressa pela Equação 6.3. a faixa de absorbância utilizada é de 0. equipado com eletrodo Ag/AgCl com termopar para ajuste de temperatura.2. utilizando um potenciômetro Metler Toledo. A partir deste valor.2. modelo MAF 5001.8: F Z0 = A t* (6. F/A é a capacidade operacional do sedimentador.2.7. medindo-se a densidade ótica no comprimento de onda de 600nm contra um branco de água.5. Os ensaios foram conduzidos com a suspensão celular após 21 horas de cultivo e com amostras floculadas com sulfato de alumínio. 6. Cálculo da capacidade operacional de um sedimentador contínuo Foi realizado utilizando-se os resultados da curva de sedimentação para os dois floculantes com concentração celular próxima à concentração de final de fermentação (1. em um espectrofotômetro Spectronic 20D+. Para manter uma precisão adequada (região linear). 6.0 g/L).

2: Efeito da adição de tanino sobre a recuperação de células de C. A concentração ótima de tanino foi de 2800 mg/L.1. 106 . 6.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono C Z * = Z0 × a Cl (6. que mostra o aumento da clarificação do sobrenadante até a concentração de 2800 mg/L de tanino. Resultados e discussão 6.3. atingindo uma recuperação de massa celular de 94%.9) onde Ca é a concentração de sólidos na alimentação e Cl é a concentração de sólidos na lama.2 são apresentados os resultados obtidos para os testes de floculação.3. Tal resultado fica bem visível na Figura 6. Uso do tanino como agente floculante Na Figura 6. 100 90 Recuperação de massa celular (%) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 Tanino (ppm) Figura 6.3.necator DSM 545.

necator DSM 545.1800 mg/L 2000 mg/L 2200 mg/L 2400 mg/L 2600 mg/L 2800 mg/L 1000 mg/L 1200 mg/L 1400 mg/L 1600 mg/L 2000 mg/L 2200 mg/L 200 mg/L 400 mg/L 600 mg/L 800 mg/L 1000 mg/L 1200 mg/L CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Figura 6. e a clarificação do sobrenadante após 1 hora de sedimentação. Efeito da variação da concentração de tanino sobre a recuperação das células de C. cultivadas em meio Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono caldo nutriente.3. 107 .

CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

A Figura 6.4 mostra as curvas de sedimentação dos flocos para diferentes valores de concentração celular. Após cerca de 100 minutos, todas as suspensões já haviam atingido a região de compactação. Dessa forma, os resultados indicam uma diminuição da velocidade de sedimentação com o aumento da concentração de células em suspensão. Os resultados de velocidade de sedimentação e de recuperação da massa celular são apresentados na Figura 6.5, onde se observa que, para concentrações celulares variando entre 0,7 e 2,2 g/L, ocorre uma diminuição da velocidade de sedimentação dos flocos de 2,3 cm/min para 0,5 cm/min, respectivamente. Além disso, foi observado um aumento no percentual de recuperação de células de 83% com 0,7 g/L de células para 91% com 2,7 g/L de células.

30

25

20

0,7g/L 1,0g/L 1,6g/L 1,8g/L 2,2g/L

Altura (cm)

15

10

5

0 0 50 100 150 200 250 300 350

Tempo (min)

Figura 6.4. Curvas de sedimentação de células de C. necator DSM 545 em presença de 2800 mg/L tanino.

108

CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

3.0

92

Velocidade de sedimentação (cm/min)

90

2.0 88 1.5 86 1.0 84

0.5

Velocidade de sedimentação Recuperação celular
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 82

Concentração de massa celular (g/L)

Figura 6.5. Velocidades de sedimentação e percentual de recuperação de massa celular de C.necator DSM 545 em função da concentração celular em presença de 2800 mg/L de tanino.

A Figura 6.6 mostra a curva de capacidade do sedimentador contínuo operando com a suspensão floculenta de C. necator DSM 545 a 1,0 g/L, utilizando tanino como agente floculante. Os resultados indicam um decréscimo na capacidade operacional com o aumento da razão de concentração da suspensão. Para concentrar a suspensão de 2 a 9 vezes, os valores de capacidade diminuem de 2,0 a 0,16 cm/min neste intervalo. Os resultados de caracterização dos flocos de C. necator DSM 545 em presença de 2.800ppm de tanino para densidade e diâmetro apresentaram valores iguais a 1,03g/mL ± 0,01g/mL e 158μm ± 19μm, respectivamente.

Recuperação de massa celular (%)

2.5

109

CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação

Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono
2,5

2,0

F/A (cm/min)

1,5

1,0

0,5

0,0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Cl/Ca

Figura 6.6. Curva de capacidade do sedimentador contínuo operando com suspensão de flocos de C.necator DSM 545 a 1,0 g/L formados pela adição de tanino a 2800 mg/L.

6.3.2. Uso do sulfato de alumínio como agente floculante. Os resultados de recuperação de massa celular a partir da massa celular seca (Figura 6.7) mostram que há uma faixa ótima de concentração de sulfato de alumínio (600 a 1000 mg/L) que possibilita uma eficiência de recuperação superior a 95%.

100

Recuperação de massa celular (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Al2(SO4)3 (mg/L)

Figura 6.7. Recuperação de células de C.necator DSM 545 pela adição de sulfato de alumínio na floculação. 110

800 mg/L 1000 mg/L 2000 mg/L 3000 mg/L 4000 mg/L A 800 mg/L 1000 mg/L 2000 mg/L 3000 mg/L 4000 mg/L B 100 mg/L 200 mg/L 400 mg/L 600 mg/L CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação C Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Figura 6. Efeito da variação da concentração de sulfato de alumínio (100 a 4000 mg/L) sobre a recuperação das células de C.8. e a clarificação do sobrenadante. (A: 2 minutos de sedimentação. B e C: 60 minutos de sedimentação) 111 . cultivadas em meio caldo nutriente. necator DSM 545.

Após cerca de 80 minutos.8 mostra a clarificação do sobrenadante obtida após sedimentação das células de C. 112 . a recuperação das células já havia sido alcançada.8C mostram que a melhor clarificação e conseqüente recuperação das células de C. todas as suspensões já haviam atingido a região de compactação. As Figuras 6. 30 25 20 Altura (cm) 0. necator DSM 545 em presença de 800 mg/L de sulfato de alumínio.8B e 6. os tempos de 2 minutos e 60 minutos do período de sedimentação dos flocos.91 g/L 1.8A e 6.89 g/L 0. na condição ótima de floculação de 800 mg/L de Al2(SO4)3. necator pela adição do agente floculante sulfato de alumínio em diferentes concentrações.57 g/L 0. As Figuras 6. respectivamente.9. Os resultados indicam que há diminuição da velocidade de sedimentação com o aumento da concentração de células em suspensão.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono A Figura 6. No tempo de 2 minutos é mostrado que.8B representam.9 mostra as curvas de sedimentação dos flocos de acordo com a concentração celular. A Figura 6. necator fica na faixa de 600 mg/L a 1000 mg/L de sulfato de alumínio. para a concentração de 1000 mg/L de sulfato de alumínio. mostrando assim um processo rápido para recuperação das células para extração de PHA ou adensamento celular com vistas a biodegradação de ácido acrílico e/ou produção do biopolímero.02 g/L 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Tempo (min) Figura 6. Curvas de sedimentação de células de C.

45 cm/min para 0. há uma diminuição da velocidade de sedimentação dos flocos de 1.5 96 94 1.8 0. A Figura 6.11 mostra a curva de capacidade do sedimentador contínuo operando com a suspensão floculenta de C.0 Concentração de massa celular (g/L) Figura 6. 2.0 100 98 1.necator DSM 545 em função da concentração celular em presença de 800 mg/L de sulfato de alumínio.85 cm/min.6 0.5 0.10.0 g/L. observa-se um aumento no percentual de recuperação de células de 87 a 99% com o aumento da concentração celular. Assim como no caso da suspensão com tanino. Além disso. utilizando sulfato de alumínio como agente floculante.0 1.1 Velocidade de sedimentação (cm/min) Velocidade de sedimentação Recuperação celular 0.10. a capacidade operacional diminui com o aumento da razão de concentração da suspensão. necator DSM 545 em presença de 800 ppm de sulfato de alumínio para densidade e diâmetro apresentaram valores iguais a 1. Recuperação de massa celular (%) 113 .CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Os resultados de velocidade de sedimentação e de recuperação da massa celular são apresentados na Figura 6. sendo obtidos menores valores (variando de 1. respectivamente.05 g/mL ± 0. onde se observa que.57 e 1.18 a 0.9 1.5 88 86 84 0.7 0.02 g/L. Velocidades de sedimentação e percentual de recuperação de massa celular de C. necator DSM 545 a 1. respectivamente. para concentrações celulares variando entre 0.15 cm/min) para uma razão de concentração de 2 a 5 vezes.0 92 90 0. Os resultados de caracterização dos flocos de C.01 g/mL e 146 μm ± 14 μm.

Na Figura 6.4 1. é possível observar que.8 0. necator DSM 545 cultivadas em meio NB.0 F/A (cm/min) 0. necator (Figuras 6.12 estão representadas as distribuições de tamanhos das células de C.6 0.0 1 2 3 4 5 6 Cl/Ca Figura 6.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 1.11. observa-se um maior percentual de células não floculadas. Também apresentam duas populações distintas as distribuições obtidas quando sulfato de alumínio é adicionado ao meio cultivado com células C. Tal fato pode significar o limiar de concentração de floculante para remover as células do meio. para a concentração de 1000 mg/L (Figura 6. Curva de capacidade do sedimentador contínuo operando com suspensão de flocos de C.2 1. 114 .91 μm e a segunda com 4.12C e 6.2 μm.12D).12B. Além disso.2 0. os flocos apresentam um diâmetro de partícula maior do que é observado para as outras condições.necator DSM 545 a 1. bem como dos flocos formados pela adição de sulfato de alumínio na melhor faixa de recuperação (600. 6. Sem a presença de sulfato de alumínio (Figura 6.0 g/L formados pela adição de sulfato de alumínio a 800 mg/L.12A) as células apresentaram duas populações distintas.4 0.12D). Contudo. 800 e 1000 mg/L). sendo a primeira com um maior percentual de células com diâmetro de 0.

41 h-1 (Figura 6. Na Figura 6.12.3. O perfil do pH (Figura 6. necator DSM 545 na ausência de agente floculante.3. sendo mais expressiva a variação após atingir a condição estacionária do crescimento.13A).13C) apresenta um aumento de seus valores durante o cultivo. Curva de distribuição de tamanhos de C.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 60 14 A Volume (%) 50 40 30 20 10 0 0 8 2 4 6 B Volume (%) 12 10 8 6 4 2 0 0 mg/L 600 mg/L 8 0 18 16 14 12 2 4 6 8 10 12 14 16 C 6 Diâmetro da partícula (μm) D Volume (%) Diâmetro da partícula (μm) 800 mg/L 1000 mg/L Volume (%) 10 8 6 4 2 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Diâmetro da partícula (μm) Diâmetro da partícula (μm) Figura 6.13 estão apresentados os perfis da variação da absorbância e do pH durante o cultivo de C. e uma condição estacionária após este intervalo. Avaliação do crescimento celular de C. A fase exponencial apresenta uma velocidade específica de crescimento igual a 0. 6. A partir desses valores é possível que seja observado um comportamento exponencial de crescimento até 10 horas de cultivo. necator DSM 545 sob a influência dos agentes floculantes. 115 . 800 e 1000 mg/L) (B. C e D). necator DSM 545 cultivada em meio NB (A) e sob a influência do agente floculante sulfato de alumínio na melhor faixa de recuperação (600.

14C e 6. respectivamente. Nas Figuras 6.0 8.15B).41 * x .15A) apresentam uma variação ascendente durante o cultivo.13.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tempo (h) Figura 6. as velocidades específicas de crescimento observadas foram de 0.5 2.3. O crescimento celular ocorre até 15 horas de cultivo para as células submetidas à ação do tanino e 11 horas para as células submetidas à ação do sulfato de alumínio.2 7. pH (C) e ln (abs) (μ) (A) em meio caldo nutriente sob agitação de 160 rpm e 30 oC.8 7.0 y = 0. Perfis de crescimento de C.14 h-1 (Figura 6.15C estão apresentados os perfis da variação da absorbância durante o cultivo de células de C. 2800 ppm e 800 ppm.0 7. o que representou uma considerável influência do tanino sobre a viabilidade celular e um menor efeito do sulfato de alumínio.0 1. Assim como observado no ensaio sem presença de floculante. necator que sofreram a ação do tanino e do sulfato de alumínio nas concentrações ótimas de recuperação. os perfis obtidos para a variação dos valores de pH (Figura 6.5 1. necator DSM 545 (B). 116 .57 Absorbância (600 nm) pH 2.0 0. sem influência anterior de agente floculante sobre as células.4 7.5 0.6 B C 7.14B) e 0.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 2 1 A ln (abs) 0 -1 -2 -3 -4 3.14A e Figura 6. Nessa mesma ordem de análise.31 h-1 (Figura 6.

0 1 0 -1 -2 B y = a.996 Absorbância (600nm) 1. Os flocos com tanino apresentaram um diâmetro correspondente a 158μm ± 19μm e densidade de 1.15. A partir de testes de sedimentação em batelada.8 6. Teste de viabilidade de células de C.4 6.0 A pH 7. Teste de viabilidade de células de C. Figura 6.0 1 A pH ln (abs) 7.14 b = -1.8 0.01g/mL.986 ln (abs) 0 -1 -2 -3 B y = a. respectivamente.0 0 2 Absorbância (600 nm) 1.61 r = 0. 6.01 g/mL e 146 μm ± 14 μm.0 0.2 6.x + b a = 0. 117 .2 0. necator DSM 545 cultivadas por 21 horas em meio NB apresentaram um maior percentual de células com 0.x + b a = 0. necator floculadas com o tanino na concentração ótima de 2800 mg/L.4 0.91 μm de diâmetro.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 C 4 6 8 10 12 14 16 18 20 C Tempo (h) Tempo (h) Figura 6.6 0.31 b = -2.4 1.2 6.6 7.14.2 0.05 g/mL ± 0.13 r = 0.0 7.4 6.4 0. necator floculadas com o sulfato de alumínio na concentração ótima de 800 mg/L.8 0. As células de C. enquanto os resultados de caracterização dos flocos com sulfato de alumínio para densidade e diâmetro apresentaram valores iguais a 1.4.CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 8.6 8. Conclusões Os resultados de floculação de C. necator DSM 545 demonstraram que a eficiência de recuperação das células foi de 94% quando uma concentração de 2800 mg/L de tanino foi utilizada e assumiu valores acima de 95% para a faixa de 600 a 1000 mg/L de sulfato de alumínio.03g/mL ± 0.8 6.2 1. foi possível obter as curvas de capacidade operacional de um sedimentador contínuo operando com as suspensões floculentas a uma concentração celular de 1 g/L.

p. MASSARANI. nas concentrações ótimas de floculação. H. Biotechnology Progress. F. (2000) “Influence of the flocculating agent in sedimentation and performance of a non flocculent strain of Zymomonas mobilis in the ethanol production process”. S. G.Sc. p. 371-385. LEE.A. Bioprocess and Biosystems Engineering. .L.necator DSM 545 do ponto de vista de minimizar os custos com gastos com energia na utilização de centrífugas. 19. p 210.. pois há uma diminuição acentuada da velocidade específica de crescimento.C. G.T. (2002) Fluidodinâmica em Sistemas Particulados.M. p..CAPÍTULO 6 – Concentração de células de Cupriavidus necator DSM 545 por floculação/sedimentação Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono Os estudos de crescimento celular mostraram que a presença dos agentes floculantes tanino e sulfato de alumínio. LUNA. P. vol.. Assim. LOPES. H. respectivamente.5. 2 ed. a utilização dos agentes floculantes tanino e sulfato de alumínio são boas alternativas para a remoção das células de C. MASSARANI. 119-124.W. vol. 25. C. p. Biotechnology Advances. p. (2000) Equações Constitutivas para a Sedimentação de Suspensões Floculentas. 213-216. ALVES.. SHOJAOSADATI. Bioseparation. (2000) “Recovery of poly(3hydroxybutyrate) from coagulated Ralstonia eutropha using a chemical digestion method”.S. G. L.. Transaction Faraday Society. T. MASSARANI. (2003) “Recovery of Bacillus sphaericus 2362 spores from growth medium by flocculation/sedimentation”.G. p. S. 676-679. CHO K.. PUGET. G. afetaram. E. vol. a reutilização das células floculadas com tanino não é viável.J.R. Contudo. RYU.166-176. 9.K. CHANG. (1952) “A theory of sedimentation”. (2001) “Extracellular biopolymeric flocculants: recent trends and biotechnological importance”. 16. SALEHIZADEH.. 118 . Referências bibliográficas FRANÇA. HALASZ. 48. vol. vol. com maior e menor intensidade a cinética de crescimento..A. KYNCH. Tese de D. COPPE/UFRJ. 101. 6. Rio de Janeiro: E-papers. Y. C. M.

............. 7................ 120 120 122 122 122 122 125 125 125 126 126 126 126 126 126 127 128 129 135 135 ............................................. Introdução ................................................3........ 7.........3.......................1............... Espectrofotometria ............1....4....2... 7....................... Análise da concentração de polihidroxialcanoatos ...3......3............................................. 7......... 7.............................. Meios de Cultura ...3................................5................................ Gravimetria ...3.... Crescimento em meio caldo nutriente .....CAPÍTULO 7 Utilizando um biorreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando a produção de polihidroxialcanoatos.............5................................................ Conclusões ........3...........5..3........3....................3...............2.3............... 7....................................3........................................5... Biorreatores assistidos por membrana de diálise ....................... Análise da concentração de ácido acrílico .......... Procedimentos Analíticos .............3. Referências bibliográficas .......1................ 7..3.... Análise da concentração celular ...................5.... Preparo do inoculo .....................3................1.... 7..................................................................1.... Microrganismo ...3........2............................................ 7..................... 7. Bioreator coluna de bolhas (BCB) ............ Medida do pH .................................... 7.............4...........5.................. Índice 7.............. 7........................... 7......2.3......................................................... 7.... 7.....................4................... Resultados e discussão ................................ 7..........................4...............................5...................3..5........................................ Medida do potencial redox ................5................... 7.......... Experimental ..3....................6..5...................................................... Condições de Cultivo ..... 7....2........ 7..............4........................

1985). Assim. GALLUP e GERHARDT (1963) desenvolveram um sistema de fermentação em saco de diálise para crescimento de Serratia marcescens e posterior concentração das células por desidratação osmótica.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 7.1. e o baixo custo de operação. concluindo que o processo pode operar de forma contínua. pode ocorrer uma indesejada diminuição do fluxo de fluido. 7. de suspensões de células de mamíferos. Biorreatores assistidos por membrana de diálise METCHNIKOFF. 120 . 1989. os autores não conseguiram prevenir o crescimento associado de Lactobacillus arabinosus 17-5 e Streptococcus faecalis R. além de ser usada em propagações simbióticas (GERHARDT e GALLUP. 1963). na produção de cerveja e vinagre (SMITH e GREENSHIELDS. Introdução Entre os biorreatores não convencionais está o reator do tipo coluna de bolhas. ROUX e SALIMBENI (1896) foram os primeiros a empregar membranas semipermeáveis para o crescimento de Vibrio cholera em sacos de diálise. NURMIKKO (1952) observou que moléculas pequenas (metabólitos) produzidas pelas bactérias podem ser facilmente dialisadas por uma membrana de celofane. devido a sua construção simples. 1974). A cultura assistida por membrana de diálise tem sido aplicada em algumas áreas como na produção de bactéria fastidiosa. no tratamento de efluentes (VERHAAGEN. 1978). como na produção de leveduras.2. em processos de ultra e microfiltração. A necessidade de promover fluxos hidráulicos elevados através da membrana. 1973). Contudo. especialmente quando a densidade celular é alta (BELFORT. no cultivo de fungo (MORRIS et al. de exotoxinas bacterianas e de esporos. Esses reatores são versáteis e apresentam vantagens econômicas como o baixo custo de investimento. VINET e FREDETTE (1951) desenvolveram um sistema de cultivo com membranas que utiliza tubos de celofane para produção de células e produtos bacterianos. devido ao baixo requerimento de energia necessário para manter as fases dispersas na mistura (MOO-YOUNG.. podem causar o fouling da membrana e o conseqüente bloqueio dos poros. esses reatores são utilizados em diferentes processos. Por isso. A desidratação era feita por contato direto do saco de diálise com um colóide hidrofílico (polietilenoglicol ou dextrana).

* não há diluição do meio de cultura durante a alimentação.. pois permite remover os metabólitos do meio de cultura por difusão. (1993) obtiveram uma concentração celular de E. MÄRKL et al. Com um sistema de dupla câmara. coli. cultivo semi-contínuo (144 g/L) (LANDWALL e HOLME. normalmente observadas em um sistema de cultivo em batelada alimentada convencional. Essa concentração foi maior que as concentrações obtidas em cultivo com controle da taxa específica de crescimento (110 g/L) (RIESENBERG et al. evitando que as células bloqueiem dos caminhos por onde escoa o material em solução (FUCHS et al. (1993) desenvolveram um biorreator cilíndrico com duas câmaras de diálise para obter alta concentração de células de E. 2002) Um módulo externo de diálise já foi usado em cultivos do tipo batelada alimentada com reciclo de células de Escherichia coli para reduzir a concentração de metabólitos inibidores de crescimento presentes no caldo de fermentação (LANDWALL e HOLME. Algumas características foram observadas nos ensaios: * contínua disponibilidade de nutrientes. 1999). O uso de membrana de diálise é uma alternativa à filtração.. Isso pode ocasionar grandes perdas de substrato no efluente da câmara de alimentação.. 121 . o que evita o estresse fisiológico das células. 1977). 1977) e em cultivo com reciclo de células utilizando membranas (145 g/L) (LEE e CHANG. ou seja. * os produtos inibidores de crescimento podem ser removidos sem a necessidade de bombeamento do caldo nutriente através de unidade externa de diálise. cultivo em batelada alimentada com controle da concentração de oxigênio dissolvido (125 g/L) (MORI et al. o fluxo de material é controlado pelo gradiente de concentração sobre a membrana. 1979). separadas por membrana de diálise. MÄRKL et al. Uma desvantagem do cultivo em biorreator assistido por membrana de diálise é que o meio na câmara de alimentação é continuamente alterado. sendo necessário manter a concentração de substrato relativamente alta. 1990). coli de 174 g/L. 1991).CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono SCHIRALDI et al.. * eliminação das oscilações das concentrações de substrato e oxigênio dissolvido.

superior (cabeça) e inferior (difusor de ar). 7. dentre as diferentes técnicas de cultivo assistido por membrana parece promissora. 7.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono A separação de produtos de baixo massa molar.1. 3. 122 .3. removíveis. 5. Um biorreator tipo coluna de bolhas com membrana de diálise (Figura 7.1.1 cm de diâmetro e 34 cm de comprimento com um valor de cut-off de 12000.3.3.0 . Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados foram: a. 15. Peptona de carne. Peptona de carne. b.0. com 2.0.0 . Caldo Nutriente (NB) (g/L): Extrato de carne. Experimental Os reagentes utilizados para os experimentos foram adquiridos junto a VETEC exceto o padrão de poli-3-hidroxibutirato que foi adquirido junto a SIGMA-ALDRICH e o solvente ácido acrílico que foi fornecido pela empresa RHODIA-Brasil. Microrganismo Foi utilizada a bactéria Cupriavidus necator DSM545.3. O conjunto todo pode ser autoclavado. obtida junto ao Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ). A aplicação da diálise. 7. por diálise. a fim de permitir a inserção da membrana de diálise no interior do bioreator. que isola os microrganismos da fonte de alimentação contendo o substrato de interesse. Estudos são estimulados pela simplicidade e a pela existência de uma base teórica para sua aplicação a culturas bacterianas (SCHULTZ e GERHARDT.2) foi construído em vidro com as partes. representa uma etapa de purificação que pode tornar o processo ainda mais eficiente. A biorreação ocorre no interior da membrana de celulose para diálise (SIGMA).3. 5. 1969). Agar.2. Agar Nutriente (NA) (g/L): Extrato de carne. 3. 7. Biorreator coluna de bolhas (BCB) O sistema para operação do biorreator coluna de bolhas está apresentado na Figura 7. A cultura foi mantida em meio agar nutriente (NA) a 10 oC ou armazenada em glicerol (20 %) a -20oC.0 .

4) Bomba. 5) Umidificador de ar. que é uma função da atividade dos microrganismos. 3) Bioreator Coluna de Bolhas (BCB).CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono O substrato passa através da membrana em função da variação do gradiente de concentração no meio de cultura. 2) Bomba Peristáltica.1. 3 6 1 2 4 5 7 Figura 7. 123 . 6) Rotâmetro e 7) Banho termostatizado. Foto do sistema para operação do biorreator coluna de bolhas (BCB) composto por: 1) Frasco de alimentação.

Entrada de ar 2. Desenho esquemático do biorreator não convencional assistido por membrana de diálise construído no laboratório. Camisa termostatizada 4. Zona de dispersão das bolhas 8. Entrada para eletrodo 10. Membrana de diálise 6. Entrada para solução de ácido/base 9.2.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 9 8 9 10 7 Partes do biorreator coluna de bolhas: 1. Difusor de ar (placa porosa) 3. Zona de alimentação 5. 124 . Zona de bioreação 7. Entrada para condensador 6 5 4 3 2 1 Figura 7.

4.2. onde foi mantido sob agitação pelo borbulhamento de ar a 36 mL/min a temperatura de 30 oC. A zona de alimentação foi preenchida com meio NB com auxílio de uma bomba peristáltica (Marca Gilson. a 180 rpm e 30 oC por 24h. ** Cultivo para consumo de ácido acrílico em biorreator coluna de bolhas.1. ** Cultivo para consumo de ácido acrílico em sistema “washed cells”. inoculado e mantido em agitação pelo borbulhamento de ar a uma vazão de 36 ml/min à temperatura de 30 oC. O concentrado celular foi transferido para a zona de biorreação no BCB.3.3. Em seguida. A fim de obter alta concentração de células.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 7.3.0). Em seguida a concentração foi realizada por centrifugação. foi transferido assepticamente para o biorreator projetado no laboratório (Figura 1). Preparo do inóculo. modelo M312) quando foi indicada. * Preparo do inóculo Um volume de meio NB correspondente a 1% (v/v) do volume de meio (300 mL) no biorreator BCB foi cultivado em frasco Erlenmeyer (150 mL) a 160 rpm e 30oC por 24 horas.4. Crescimento em meio caldo nutriente. ** Cultivo para obtenção de massa celular A zona de biorreação foi preenchida com o meio NB. o início da fase de desaceleração de crescimento das células de Cupriavidus necator DSM 545. por duas vezes.2. necator em meio caldo nutriente (NB).85% (v/v) e posterior ressuspensão em meio 125 . A obtenção de concentrado celular foi realizada conforme descrito no Capítulo 5. O inóculo foi preparado a partir do crescimento das células de C. seguindo a lavagem.4.4. Em seguida a zona de alimentação foi preenchida com a solução de ácido acrílico (40 g/L e pH 6. pelo sinal redox. em solução salina 0. Secão 5. Condições de Cultivo 7. 7. foi realizado um cultivo em meio NB. cujas condições de trabalho são definidas de acordo com o ensaio em andamento.

3. Capítulo 3) sem a presença de fonte de nitrogênio ou em água destilada sem suplementação dos nutrientes que compõem o meio mineral.1.2. lava-se duas vezes o material retido na membrana com HCl 0. utilizando um potenciômetro MS Tecnopon.3. III.3. separa-se um volume conhecido do meio de cultura. 7. são feitas diluições para manter a linearidade. Análise da concentração celular A concentração celular é determinada por dois métodos: por espectrofotometria (durante o cultivo) e por gravimetria.1. Espectrofotometria Analisa-se a concentração de biomassa do material coletado em um espectrofotômetro Spectronic 20D+.8.5.0 até 0.3.2.5.3. Gravimetria A medida do peso seco celular compreende as seguintes etapas: I. modelo mPA 210.3.2 μm). utilizando um potenciômetro Metler Toledo. medindo-se a densidade ótica no comprimento de onda de 600 nm contra um branco de água. Medida do potencial redox O monitoramento do potencial redox (Eh) foi realizado por potenciometria.5. a faixa de absorbância utilizada é de 0.3. para remover íons e sais presentes na biomassa. equipado com eletrodo redox (Analion.2. modelo MP220. entre 1 mL e 10 mL.3. 7. 7. Para manter uma precisão adequada (região linear).4. filtra-se o meio através de membranas Millipore de poliamida pré-pesadas (poro de 0. A partir deste valor. II.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono mineral (descrição na Seção 3.3.5.5. 7. Procedimentos Analíticos 7.5. equipado com eletrodo Ag/AgCL com termopar para ajuste de temperatura. 7.01M. 126 . Medida do pH O monitoramento do pH foi realizado por potenciometria. modelo ROX 673 – C/S8) com termopar para ajuste de temperatura.

centrifuga-se um volume de meio de cultura.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono IV.1 μL.3. calcula-se a concentração de ácido acrílico (AA) no meio na forma: ⎡⎛ A3 ⎞ ⎤ AA( g / L) = ⎢⎜ ⎟ × a⎥ + b ⎣⎝ A4 ⎠ ⎦ (7.1) onde MMf é a massa da membrana final (g). 7.5. Análise da concentração de ácido acrílico: I. descongela-se a amostra e agita-se vigorosamente. seca-se a membrana com a biomassa em estufa a 85°C até peso constante.4. A curva de calibração de biomassa em função da absorbância (600 nm) (Anexo 2) serve para estimar a concentração de células durante a fase de crescimento da cultura. IV. V. II separa-se o sobrenadante do material celular precipitado por centrifugação a 5000 x g por 20 min. II. que é então injetado na coluna.2) 127 . com injeção direta do sobrenadante. Preparo da amostra: I. III. III.. Análise da concentração de ácido acrílico A quantificação da concentração de ácido acrílico foi realizada por cromatografia gasosa. calcula-se a concentração de massa celular (X) na forma: ( MM f − MM i ) × 1000 VA X ( g / L) = (7. MMi é a massa da membrana inicial (g) e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL). armazena-se o material amostrado a -20oC para análise posterior. coleta-se com seringa micrograduada um volume de 0. misturam-se 180 μL do sobrenadante a 20 μL de solução de ácido acético 5 g/L.

. ressuspende-se o precipitado em 2 mL de metanol acidificado (H2SO4 15%). IV. respectivamente. marca RESTEK. contendo ácido benzóico 0. respectivamente. IV. com as modificações propostas por BRANDL et al. com a concentração variando entre 1 g/L e 4 g/L. o coeficiente angular e o coeficiente linear. A coluna utilizada para dosagem do ácido acrílico apresenta a fase de Crossbond – Carbowax PEQ (∅0. O gás de arraste utilizado é o hélio a 5.32mm X 30m) modelo STABILWAX.000 rpm por 5 minutos. centrifuga-se a amostra a 15. A curva padrão de ácido acrílico (Anexo 1) foi feita utilizando o ácido acético como padrão interno.3. aquece-se a mistura a 100°C durante 140 minutos em tubos fechados.5 e 2 mL. III. sendo que após 60 minutos de aquecimento a mistura é agitada durante alguns segundos e devolvida ao aquecimento. II. A4 é a área obtida para a concentração do padrão interno ácido acético e "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão. detector e coluna são iguais. 128 . coleta-se um volume de amostra do meio de cultura compreendido entre 1. adiciona-se 1mL de água destilada. O cromatógrafo é um Chrompak. Metodologia: I. lava-se o precipitado duas vezes com água destilada. conforme o método de metanólise baseado em BRAUNEGG et al. Preparo da amostra: I.0 mL/min e as temperaturas do injetor.4 g/L como padrão interno. (1988). equipado com um detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio). II. III. resfria-se a mistura até a temperatura ambiente. 250 °C e 120 °C. armazena-se o precipitado a -20oC para que todas amostras sejam analisadas ao mesmo tempo. modelo CP 9000. adiciona-se um volume de 2 mL de clorofórmio.5 4. Análise da concentração de polihidroxialcanoatos (PHAs) A quantificação da concentração de PHAs foi realizada por cromatografia gasosa. 7. a 250 °C. (1978).5. V.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono onde A3 é a área obtida para a concentração de ácido acrílico.

VII. detector e coluna são iguais. A2 é a área obtida para o padrão interno ácido benzóico. Submetem-se os padrões à mesma metanólise que as amostras. "a" e "b" são as constantes obtidas na curva padrão.32mm X 30m) modelo STABILWAX. respectivamente. para posterior análise em cromatografia gasosa. agitam-se as amostras durante 30 segundos. Nessa etapa do 129 . estão apresentados na Figura 7. O gás de arraste utilizado é o hélio a 5. 250 °C e 120 °C. como padrão externo. retira-se a fase orgânica (inferior) com uma pipeta Pasteur. A coluna utilizada para dosagem do ácido acrílico apresenta a fase de Crossbond – Carbowax .4.1 μL.PEQ (∅0. A massa de células de Cupriavidus necator DSM 545 foi obtida a partir do crescimento das células em meio caldo nutriente à temperatura de 30 oC sob agitação de ar a 36 mL/min e sem controle de pH. usando o sinal do potencial redox como indicador do momento de alimentação. Resultados e discussão Os resultados do ensaio realizado no biorreator coluna de bolhas para obtenção de altas concentrações de massa celular a partir da alimentação externa de fonte de carbono..3 horas. Inicialmente as células foram cultivadas na Zona de Biorreação. o coeficiente angular e o coeficiente linear. e VA é o volume da amostra do meio de cultivo (mL). O volume injetado é de 0. deixando separar as fases. 7.3) onde A1 é a área obtida para o P(3HB). armazena-se a fase aquosa em geladeira. marca RESTEK. A curva padrão (Anexo 3) é feita utilizando-se o poli-3-hidroxibutirato (Sigma ou Biopol).0010 g e 0. quando o sinal redox estabilizou-se em torno de –125 mV. VIII. equipado com um detector de ionização de chama (DIC arhidrogênio).CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono VI. instante esse que coincide com a desaceleração de crescimento observado na Figura 7. A Zona de Alimentação foi mantida vazia até 6.3A. respectivamente. com massa variando entre 0.0 mL/min e as temperaturas do injetor. O cromatógrafo é um Chrompak. O cálculo da concentração de P(3HB) é realizado conforme a seguinte equação: ⎡⎛ ⎛ A1 ⎞ ⎞ ⎤ ⎢⎜ ⎟ + b⎥ × 1000 ⎜ ⎜ A2 ⎟ × a ⎟ ⎠ ⎠ ⎦ ⎝⎝ ⎣ P(3HB)( g / L) = VA (7.3. modelo CP 9000.0100 g. a 250 °C.

CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células

de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos
Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

crescimento a velocidade específica foi de 0,61 h-1 (Figura 7.4), valor maior que o valor de 0,47 h-1 observado para o crescimento de C. necator em biorreator agitado mecanicamente (Figura 5.7). A bomba peristáltica foi então acionada para encher a Zona de Alimentação com meio caldo nutriente (NB). Os valores de potencial redox sofrem uma pequena alteração no sentido positivo, mas imediatamente começam a diminuir, confirmando a relação com o aumento da massa celular até 8 horas de cultivo, quando novamente os valores se estabilizam em -170 mV, indicando mais uma vez a desaceleração da etapa de crescimento celular, que apresentou uma velocidade específica de 0,48 h-1. A bomba peristáltica foi acionada novamente, adicionando mais caldo nutriente, e os valores do potencial redox apresentaram o mesmo comportamento da alimentação anterior, estabilizando-se ao redor de -225 mV. Nesse momento foi acionada novamente a bomba peristáltica para reposição de nutrientes. Nestas duas últimas etapas os valores obtidos para a velocidade específica de crescimento foram respectivamente 0,27 h-1 e 0,18 h-1 (Figura 7.4). A redução dos valores de velocidade específica de crescimento provavelmente é devida à diluição da solução de alimentação, uma vez que após cada acionamento da bomba peristáltica a solução contida na Zona de Alimentação foi retornada ao frasco de alimentação contendo a solução com o meio caldo nutriente (NB). Ao final de 10,2 horas foi obtida uma concentração de células de C. necator igual a 3,0 g/L. A utilização da sonda redox para sinalizar o instante em que a solução de caldo NB na Zona de Alimentação deveria ser substituída foi eficaz e o sistema de coluna de bolhas assistido por membrana de diálise mostrou-se eficiente para obter células de C. necator em alta densidade. Comprovada a eficiência de alimentação do sistema de coluna de bolhas, através da membrana de diálise, um novo ensaio foi realizado para suprir as células de C. necator com ácido acrílico para biodegradação. O concentrado de células de C. necator foi obtido conforme descrito na Seção 6.2.4 do Capítulo 6, com o uso de sulfato de alumínio como agente floculante. O concentrado celular (7 g/L) foi transferido para a Zona de Biorreação do biorreator BCB. Através da Zona de Alimentação foi realizada a circulação de água por um intervalo de 1 hora, a fim de remover nutrientes presentes na suspensão de células. A água foi removida da Zona de Alimentação e uma solução de ácido acrílico (40 g/L, pH 7,0) foi bombeada.

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de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos
Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

4 3

X (g/L)

A

2 1 0 0 100 50 0 -50 -100 -150 -200 -250 0 2 4 6 8 10 12 2 4 6 8 10 12

B

Eh (mV)

Tempo (h)
Figura 7.3. Resultados do crescimento de células de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator coluna de bolha assistido por membrana de diálise a temperatura de 30 oC sob agitação de ar a 36 mL/min sem controle de pH.
2 1

ln (abs)

-1 -2 -3 0 2
μ = 0,61 h
-1

4

6

μ = 0,48 h

8

μ = 0,27 h

μ = 0,18 h

0

-1

-1

-1

10

12

Tempo (h)
Figura 7.4. Linearização dos resultados do crescimento de células de Cupriavidus necator DSM 545 em meio caldo nutriente em biorreator coluna de bolha assistido por membrana de diálise a temperatura de 30 oC sob agitação de ar a 36 mL/min sem controle de pH.

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Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono

7,2 7,0 6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 250 200

pH Eh (mV) Ácido Acrílico (g/L)

150 100 50 0 4

2

0 0 2 4 6

Tempo (h)
Figura 7.5. Resultados da biorreação para consumo de ácido acrílico por células de Cupriavidus necator DSM 545 em biorreator coluna de bolhas assistido por membrana de diálise a temperatura de 30 oC, sob agitação de ar a 36 mL/min e sem controle de pH.

Na Figura 7.5 pode ser observado que, após o preenchimento da Zona de Alimentação, a concentração de ácido acrílico na Zona de Biorreação alcançou um valor de 2,1 g/L. A solução de ácido acrílico foi circulada continuamente pela zona de alimentação por 1 hora e então observado que os valores de pH e de Eh diminuíram, mas que a concentração de ácido acrílico aumentou para 3,9 g/L. Após esse intervalo de tempo a circulação foi cessada por 20 minutos e foi observado que a concentração de ácido acrílico diminui de 3,9 g/L para 3,4 g/L. Acionada novamente a bomba peristáltica, por mais uma hora, para circulação da fonte de carbono, foi observado um

132

a concentração de ácido acrílico diminuiu para 0. É 133 .0009 0.0012 0. Nas Figuras 7.6 e 7. contudo não sinalizaram o início da etapa de desaceleração do crescimento celular.0010 0.05 horas de cultivo os valores de pH e Eh continuaram diminuindo.4 7. Resultados do cultivo de Cupriavidus necator DSM 545 em meio mineral (MM) com adição de fonte de nutriente. A fim de verificar se o suprimento direto de alta concentração de ácido acrílico favoreceria a biossíntese de P(3HB) novos ensaios foram realizados em Erlenmeyers (150 mL) com e sem a adição de macro e micronutrientes.0013 0.0011 0.3 horas. a partir de uma solução concentrada (40 g/L).7 são apresentados. com e sem adição de nutrientes. Durante as 6. os ensaios em condição “washed cell” com uma concentração de células de C. 7. Interrompida novamente a circulação da solução de ácido acrílico por 1.3 horas. a temperatura de 30 oC sob agitação de 160 rpm sem controle de pH.3 7.2 g/L de ácido acrílico na Zona de Biorreação.57 g/L.6. a concentração de ácido acrílico na Zona de Biorreação atingiu 4.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono aumento de 0.0 6. Além disso. O suprimento indireto de ácido acrílico ao meio de cultura. necator de 17 g/L obtida por floculação/sedimentação utilizando o sulfato de alumínio como o agente floculante. respectivamente. análises realizadas de P(3HB) mostraram não haver a presença deste produto nas células no final do processo. não levou à biossíntese do biopolímero.15 g/L na Zona de Biorreação.0008 0 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 P(3HB) (g/L) Tempo (h) 3 4 5 6 7 Tempo (h) Figura 7.1 7. em Erlenmeyer (150 mL).9 0 0. Retomada a circulação por mais 2.2 pH 7.

Resultados do cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 em água destilada sem adição de nutrientes.0 1. Uma repetição do ensaio sem o fornecimento de nutrientes à cultura apresentou apenas depolimerização de P(3HB). 8 7 pH 6 5 4 0 2. é observada a biossíntese de P(3HB).7).CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono possível observar que em ambos casos há a depolimerização do PHB.0 durante o ensaio.5 1. 8 7 pH 6 5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 P(3HB) (mg/L) 2.0 durante o ensaio.5 0. a temperatura de 30 oC sob agitação de 160 rpm com ajuste de pH a 7.5 1.5 0. a temperatura de 30 oC sob agitação de 160 rpm com ajuste de pH a 7. quando há correção dos valores de pH.0 0 1 2 3 Tempo (h) 4 5 6 7 8 Tempo (h) Figura 7. Entretanto.0 0.8. no meio sem a adição de nutrientes (Figura 7.8).7. em Erlenmeyer (150 mL).0 2 4 6 8 10 12 Tempo (h) P(3HB) (mg/L) 1.0 0. mesmo quando são corrigidos os valores de pH (Figura 7. em Erlenmeyer (150 mL). Resultados do cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 em água destilada sem adição de nutrientes. nos tempos de 3 horas e 6 horas de cultivo. 134 .0 0 2 4 6 8 10 12 Tempo (h) Figura 7.

pp.. v. pp. 36. 93. “Dialysis flasck for concentrated culture of microorganisms”. não significa que a síntese de P(3HB) não ocorre. EISBRENNER.. Journal of General Microbiology. “Dialysis fermentor systems for concentrated culture of microorganisms”. em reator coluna de bolhas assistido por membrana de diálise.M. LEE. 345-352. 330-337. foi 6 vezes maior que a concentração metabolizada no sistema “washed cells” (Figura 4.5. Referências bibliográficas BELFORT.. GERHARDT.7B). WIEBUSCH. 1989. 919-929. D. K. D. 11. O fato é que as células podem já estar reguladas para uma outra situação. GALLUP. pp. H. D. “Removal of inhibitors of bacterial growth by dialysis culture”. 103. KÖSTER.. GERHARDT. Journal of Bacteriology. T. “High cell density culture of a recombinant E. Journal of Biotechnology.6).M. 86. Conclusões O sistema de obtenção de concentrado de células de Cupriavidus necator DSM 545 em um biorreator coluna de bolhas assistido por membrana de diálise é eficiente e a substituição da solução com a fonte de carbono na Zona de Alimenttação para disponibilizar nutrientes ao crescimento das células na Zona de Bioreação pode ser sinalizada com eficiência pela sonda de potencial redox.K... A concentração de ácido acrílico metabolizada pelas células de C. “Membrane and bioreactors: a technical challenge in biotechnology”. v.. LANDWALL. P. MÄRKL... 7.. 243-251. Ainda assim. GALLUP. MAHR. Y. 1990.... Applied Microbiology. pp. v.N. Biotechnology and Bioengineering. v. 1977. “Scale-up of dialysis fermentation for high cell density cultivation of Escherichia coli”. 33. coli producing penicillin acylase in a membrane cell recycle fermentor”. G.6. C. P.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 7. H. v.. pp. S. 506-512. pp. pois antes da reação elas são submetidas à condições experimentais diferentes. 1963. FUCHS. 2002. Biotechnology and Bioengineering. P. não foi verificada a biossíntese de polihidroxialcanoato. v. 1047-1066. 135 . provavelmente na condição estacionária. HOLME. necator em condição de não crescimentos.. Igualmente ao observado no sistema “washed cells” (Figura 4. CHANG. G. 1963.

. v. Journal of Biotechnology. Bateriology Reviews. “Toxine et antitoxine cholérique”. ROUX. pp. V.N. pp. v. GREENSHIELDS. MORI.M. ‘Tower fermentation systems and their application to aerobic processes”.C. GERGARDT. 1963. Journal of Bacteriology.H.. D. theory and results”. 199-204. The Chemical Engineering. 48-52. DE ROSA. “Cultivation of Escherichia coli to high cell densities in a dialysis reactor”... Applications and Regulations of Biotechnology in Industry. “Chemical factors affecting associations of lactic acid bacteria”.D. 1985. 136 . v. SCHULTZ. D... ZENNECK. MOO-YOUNG. 1993. pp. pp..N. SALIMBENI. 1969.. E. “Dialysis flask for concentrated culture of microorganisms”. YANO. 12. J. OGBONNA. Preprints. Vol. F. v.. SMITH. 312-319. E. pp.. KOBAYASHI. T. MARULLI. 6. E. Inst.. METCHNIKOFF. 1-47. A. coli at controlled specific growth rate”. W.S... Applied Microbiology and Biotechnology. 1978. NURMIKKO... 3.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono MÄRKL.. v.C.. 632p... J. “High cell density cultivation of E. I. H. SMITH. P.A. R. pp. GREENSHIELDS. “A microfiltration bioreactor to achieve high cell density in Sulfolobus solfataricus fermentation”. 33. ROSS. C. Ann. M.. Agriculture and Medicine. pp. Pasteur. 1991. 1258-1264. H. 919-929.L. pp. “Dialysis culture of microorganisms: design. Journal of Chemical Engineering Japan. 20.. pp. C. H. A. M. G.. KNORRE.G. v. J. DI LERNIA. MORRIS. Pergamon Press:Oxford. pp. E. 1952. LWPR Specialized Conference on aeration. T. A. 39.L. Comprehensive biotechnology. 17-28. T.. 150-157. 1922 Sept. D. 1999.. 2.. Extremophiles. SCHIRALDI. 561-573. January. Biotechnology and Bioengineering Symposium.1896. KORZ.. “Aeration in tower fermenters containing microorganisms”. v. MARTINO. GALLUP.. 535-545. 1974. SCHULZ. DECKWER. 12.. v.A. P. pp... DUBACH. VERHAAGEN. In: GERHARDT. RIESENBERG.. Acta Chemica Scandinavica. 28-34. 86. 1973. POHL.K. SANDERS. 1979. 4.. V. Amsterdam.. W. R.. “High density cultivation of biomass in fed-batch system with DO-stat”.. The principles.. v. E.

. pp.CAPÍTULO 7 – Utilizando um bioreator não convencional para cultivo de células de Cupriavidus necator DSM 545 e consumo de ácido acrílico visando à produção de polihidroxialcanoatos Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono VINET. 114. Science. 549-550. G. “Apparatus for the culture of bacteria in cellophane tubes”. 137 . FREDETTE. V.. v. 1951.

............................. Conclusões .. 140 ....................... Sugestões ..................................................... 139 8..CAPÍTULO 8 Conclusões e sugestões Índice 8..............1.............................................2..............................................

A estratégia de cultivo em batelada.33 g/L ácido acrílico) para evitar inibição da multiplicação das células. Um concentrado de células de C. O monitoramento dos cultivos de C. pode ser implementada uma técnica de sucessivas alimentações do meio de cultivo para obtenção de massa celular. A maior velocidade específica de crescimento (0. Foi verificada maior atividade celular quando as células foram concentradas com a adição de sulfato de alumínio. necator apresentaram ao serem inoculadas após 139 . necator. Diversas áreas foram exploradas e bons resultados foram alcançados. onde as condições de aeração podem ser controladas. 3.33 g/L em meio mínimo em frascos agitados. necator em meio NB utilizando uma sonda de potencial redox permite sinalizar o final da fase de crescimento das células. em frascos agitados. Abaixo são apresentadas as principais conclusões obtidas e algumas sugestões para atividades futuras. 4.33 g/L de ácido acrílico. de 0.5 g/L em meio caldo nutriente em biorreator.CAPÍTULO 8 – Conclusões e Sugestões Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono 8. Assim. 2. com posterior sedimentação. utilizando meio mínimo sem a presença de fonte de nitrogênio.1. 5. A fonte de carbono ácido acrílico é assimilada em meio mínimo pela cultura de C. A viabilidade celular foi definida a partir da resposta que as células de C. como o tanino e sulfato de alumínio. Conclusões Neste trabalho foi desenvolvido um processo para biodegradação de ácido acrílico e simultânea produção de polihidroxialcanoatos. necator pode ser obtido a partir da utilização de agentes floculantes. para 0. pode ser usada para a biossíntese de P(3HB) a partir da assimilação de ácido acrílico pelas células de C. necator. No entanto o processo é muito demorado por causa da limitação da concentração de ácido acrílico que pode ser adicionada no meio de cultura (0. Os resultados mostraram que essa estratégia permite aumentar a concentração de ácido acrílico no meio. A estratégia de controlar os valores de pH do meio de cultura (NB) pela incorporação de uma solução de ácido acrílico permite aumentar a taxa de biodegradação desse composto.035 h-1) é obtida para uma concentração de 0. 1.

necator e para alimentação com ácido acrílico e conseqüente biodegradação. é eficaz para obtenção de alta densidade de células de C. Estruturar um plano de experimentos para alimentar com ácido acrílico a Zona de Biorreação no bioreator coluna de bolhas visando a otimização da produção de polihidroxialcanoatos. 6. Sugestões 1. O biorreator coluna de bolhas. Desenvolver uma estratégia de controle de alimentação de nutrientes. Em ambos os casos foi observado o decréscimo da velocidade específica de crescimento celular. 2. 140 . a partir do potencial redox. assistido por membrana de diálise. 8. ao meio de cultivo no bioreator coluna de bolhas para obtenção de alta densidade celular.2.CAPÍTULO 8 – Conclusões e Sugestões Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono concentração da suspensão em meio caldo nutriente.

ANEXOS .

0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 A 3 /A 4 FIGURA 1.5 2 .5 1 .0 1 . A equação da reta obtida foi: y = ax +b a = 0.5 3 . Curva de calibração da razão entre as áreas de ácido acrílico e ácido acético (A3/A4) vs.ANEXOS Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono ANEXO 1 Á c id o A c r ílic o ( g / L ) 4 .5 0 .995 142 .0 2 .0 0 .3649 b=0 r = 0. concentração de ácido acrílico obtida por cromatografia gasosa.0 3 .

9895 143 .5 A b s o r b â n c ia ( 6 0 0 n m ) FIGURA 2.3866 b=0 r = 0. A equação da reta obtida foi: y = ax +b a = 0. obtida pelo método de gravimetria a partir de células de Ralstonia eutropha DSM 545 cultivadas em meio caldo nutriente em biorreator.6 B io m a s s a ( g /L ) 1 . concentração de biomassa.0 1 .2 1 .0 3 .5 3 .ANEXOS Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono ANEXO 2 1 .6 0 .4 1 .8 0 . Curva de calibração da absorbância (600 nm) vs.5 1 .0 0 .0 2 .2 0 .5 2 .4 0 .0 0 .0 0 .

0 0 2 0 .0 2 . concentração de P(3HB) obtida por cromatografia gasosa.5 A 1 /A 2 FIGURA 3. A equação da reta obtida foi: y = ax +b a = 0.0 0 4 0 .5 2 .5 3 .0 0 . Curva de calibração da razão entre as áreas de P(3HB) e ácido benzóico (A1/A2) vs.0 1 .0 1 0 P (3 H B ) (g ) 0 .0 1 2 0 .5 1 .0 0 0 0 .ANEXOS Produção de polihidroxialcanoatos por Cupriavidus necator usando ácido acrílico como fonte de carbono ANEXO 3 0 .00316 b=0 r = 0.9994 144 .0 0 6 0 .0 3 .0 0 8 0 .