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XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental Cancún, México, 27 al 31 de octubre, 2002

BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS CON DERIVADOS DE HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS BACTERIANAS AUTÓCTONAS
Ismenia Araujo Vílchez (*) Centro de Investigación del Agua (CIA). Coord. del Laboratorio de Microbiología Industrial del CIA de la Universidad del Zulia (LUZ). Secretaria Ejecutiva de la Fundación para el desarrollo de la Ciencia y la Tecnología. Asesora de los Proyectos sobre Microbiología de Petróleo en Convenio INTEVEP-LUZ, INPELUZ, y del Proyecto Lagunas de Estabilización, Convenio Fundación Polar-LUZ. Coordinadora de la Maestría en Microbiología. Gustavo Romero Estudiante Carmen Cárdenas Centro de Investigación del Agua Nancy Angulo Centro de Investigación del Agua Gustavo Morillo Centro de Investigación del Agua Judith Navarro Centro de Investigación del Agua María Méndez Centro de Investigación del Agua (*): Av. 21, Calle 67, Edificio Manatara, Apartamento 3B, Sector Indio Mara – Maracaibo - Estado Zulia Código Postal : 4005 -Venezuela. Telf.: 02617519022-02617597189 - FAX: 02617597181 - e-mail: ismenia_araujo@hotmail.com. RESUMEN Se tomaron muestras de agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitán Chico, Edo. Zulia y se lograron aislar 16 cepas bacterianas, las cuales fueron probadas en su capacidad para degradar hidrocarburos, mediante un ensayo de factibilidad utilizando gasoil como única fuente de carbono. Se seleccionaron 07 de las cepas que lograron degradar entre 50 a 70% de los hidrocarburos presentes en el gasoil y se realizaron pruebas de identificación con el propósito de conocer algunas de sus características bioquímicas. Posteriormente, se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se evaluó su capacidad para degradar hidrocarburos a través de un estudio de biotratabilidad en tanques plásticos de 25 L conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inóculo), un aceite lubricante en una concentración de 7000 mg/L y agua potable hasta un obtener un volumen de 20 L. En 04 de los tanques se instalaron sistemas de aireación inducidos desde el fondo y adicionalmente, se evaluó la incidencia del nitrógeno y fósforo (fertilización). Se determinaron mensualmente los contajes bacterianos, los hidrocarburos totales y el contenido de nitrógeno y fósforo total y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y al final del ensayo. Los resultados indicaron que en los tanques inoculados, fertilizados y aireados se lograron las mayores remociones, hasta un 89 % de los hidrocarburos totales y la transformación de todas las fracciones presentes en el aceite, demostrando la eficiencia del cultivo bacteriano en la biorremediación de agua contaminada con hidrocarburos. Palabras Claves: cepas bacterianas, hidrocarburos, biorremediación.

en Venezuela. se tomaron muestras de cada fiola para la determinación de contajes bacterianos siguiendo la técnica de contaje en placa vertida. 2000. mayor será la capacidad de digerirlo y menor será el tiempo de permanencia en el ambiente. donde se realizó el aislamiento de las cepas bacterianas presentes en las muestras de agua. La transformación es tal. 2000). han adquirido bastante gravedad. En el caso de aguas superficiales la adición de nutrientes se realiza sin menor complicación en el área a tratar con el objeto de aumentar la población nativa para acelerar el proceso de biodegradación. 1ml de gas oil y 5 ml inóculo. en la mayoría de los casos. que ocurrió una biotransformación (Eweis et al. 1997). Al inicio y al final del ensayo. Seeley & Vandemark. con el propósito de ampliar su versatilidad metabólica para la degradación de contaminantes específicos principalmente los provenientes de las actividades petroleras. los cuales pueden ser o no menos tóxicos. Zulia. 1993). 1970). Todas las fiolas fueron incubadas a 37ºC y 120 rpm de agitación en un Incubator Shaker. proceso que se denomina mineralización (Scherer. Una vez aisladas las colonias. que hay un completo rompimiento de las moléculas orgánicas en sustancias inorgánicas como dióxido de carbono y agua. La primera fase permitió aislar y seleccionar las cepas autóctonas de agua contaminada con hidrocarburos más eficientes en la utilización del gasoil como única fuente de carbono. Estos procesos utilizan principalmente bacterias que se encuentran en el mismo ambiente que se pretenda remediar. Si ocurre sólo una degradación parcial de compuestos secundarios. ya que cuanto más específica sea su capacidad degradativa ante los distintos tipos de desechos. Edo. modelo 625. En tal sentido. 1999 y Levin & Gealt. 1996). A las cepas seleccionadas . 1983).INTRODUCCIÓN A comienzos de los años 90. utilizándose la técnica de siembra en placa por estría (Kerr. y la adición de oxígeno muchas veces no es necesaria a menos que sea agua estancada sin movimiento pues el oleaje y el viento se encargan de proporcionar las condiciones óptimas para que el oxígeno atmosférico penetre en el reservorio (Metcalf & Hedí. importantes investigaciones han sido dirigidas al estudio de los microorganismos y sus actividades. El objetivo fundamental de esta investigación fue determinar la eficiencia de cepas bacterianas provenientes de aguas contaminadas con hidrocarburos en la degradación de los mismos. 9215-B (APHA. METODOLOGÍA El estudio del proceso de biorremediación en esta investigación se realizó en dos fases. tales como bacterias y hongos. infusión cerebro-corazón y se incubaron a 37 ºC hasta alcanzar un crecimiento superior a 1x108 UFC/ml. 1996). Los ensayos de factibilidad en el laboratorio se prepararon para cada cepa. modificación del propuesto por Jobson et al en 1975. utilizando medio mínimo mineral. durante 60 días. Las cepas aisladas preservadas. además se adicionan los macro y micro nutrientes necesarios para el mantenimiento de las cepas bacterianas. La descarga de petróleo y sus productos derivados a las corrientes naturales de aguas superficiales y subterráneas ha planteado un problema que. se activaron por transferencia a un medio nutritivo fresco. 2000). Venezuela. Sector capitán Chico. Este ensayo permitió seleccionar las cepas más eficientes en la degradación del gasoil. 1973 y Pareja. A partir de estos cultivos se prepararon los inóculos para el ensayo (APHA. 1972 ). para transformar compuestos químicos con la finalidad de disminuir o eliminar su condición de peligrosidad (Cook & Westlake. con la adición de nutrientes y aireación. Maracaibo. La biorremediación o saneamiento biológico es una tecnología basada en procesos naturales que utiliza la capacidad de algunos microorganismos. se han desarrollado tecnologías fundamentadas en los procesos biológicos como alternativas viables en la eliminación parcial o total de diferentes compuestos orgánicos. 1970. En la segunda fase se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se probó su eficiencia en la degradación de aceites lubricantes a escala piloto. La etapa de selección de las cepas bacterianas es muy importante. Cada dos semanas durante dos meses. se dice entonces. Los envases fueron trasladados al Laboratorio. se realizó la determinación de hidrocarburos totales en todas las fiolas según el método 5520-F (APHA. ESTUDIO DE FACTIBILIDAD El agua contaminada con hidrocarburo utilizada en este estudio fue obtenida de la ribera del Lago de Maracaibo. se registraron sus características morfológicas y cada una de las cepas fue guardada por duplicado en refrigeración en tubos con agar inclinado cerebro corazón (Finegold & Martin. Kerr.

Así quedó seleccionado el sustrato utilizado como única fuente de carbono. 1970. evitando así la formación de volúmenes muertos (sin movimiento). acerca del producto que se vertía con mayor frecuencia y cantidad en la zona seleccionada. con el propósito de comparar la eficiencia en la biodegradación del sustrato hidrocarbonado. Catalasa. se evaluó el proceso de biodegradación con la adición de nutrientes y la inyección de aire. 4500-NH3. Todos los orificios fueron colocados en el fondo ya que la profundidad mejora el tiempo de contacto (Cookson. 1973 y Pareja. El aire se suministró mediante un sistema de inyección en espiral de aire forzado.3 m y la altura de 0. Dentro de los tratamientos. Capone & Bauer. lo que permitió evaluar y comparar su efecto sobre el crecimiento bacteriano y la degradación del aceite. El diámetro fue de 0. La selección del hidrocarburo que se utilizó en el ensayo se realizó consultando a las empresas marítimas de la zona objeto de estudio. Para preparar el cultivo mixto se agregaron al tanque con la mezcla estudio (agua contaminada con aceite) fracciones equivalentes de cada cepa. Para los parámetros microbiológicos se utilizó el contaje de Heterótrofos Mesófilos por la técnica de placa vertida (9215-B). formado por una tubería plástica acoplada a un compresor que tuvo como función bombear el aire a través de toda la tubería. 1988). hasta alcanzar una concentración de cultivo de 10%. Nitrógeno Total. Tabla 1.75 y 1 gr/L de difosfato diamónico. 1995. 1993). El sistema en espiral con espaciamiento calculado de los puntos de inyección de aire en el fondo. 2000 y Finegold & Martin. el fosfato diamónico. Con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de biorremediación se adicionó un fertilizante compuesto. se incubaron a 37 ºC hasta obtener una concentración superior a 1x108 UFC/ml. Para este estudio se utilizaron tanques cilíndricos plásticos con una capacidad de 25 L cada uno.se les realizó una serie de pruebas bioquímicas a saber: Tinción de Gram. 4500-C Ácido Ascórbico (APHA. Anaerobiosis. Hidrocarburos Totales. Se seleccionaron las siete cepas más eficientes en la degradación de gasoil para conformar el cultivo mixto.36 m. Fósforo Total. transferida a caldo cerebro-corazón. Compresor Tubería Plástica Puntos de Inyección de aire (Orificios) Figura 1. ESTUDIO DE TRATABILIDAD Se realizó un estudio a escala piloto el cual consistió en diferentes tratamientos que permitieron evaluar la eficiencia del cultivo mixto conformado por las cepas previamente aisladas y seleccionadas por su eficiencia en la degradación de gasoil bajo distintos parámetros. Seeley & Vandemark. permitió crear zonas alternas de transferencia y mezclado. Las concentraciones utilizadas fueron: 0. La mayoría coincidió que se trataba del aceite de motor empleado como lubricante en las embarcaciones. Corte transversal de un tanque con sistema de aireación. Citrato. 5520-F-Gravimétrico. . Los parámetros fisicoquímicos fueron realizados utilizando los métodos: SARA (ASTM D2007-75 Gravimétrico). Ureasa. Motilidad y Triple Azúcar Hierro (Kerr. Cada cepa seleccionada fue activada y posteriormente. Baker. adición de aire entre otras) y sus respectivos controles. Se trabajó con tres concentraciones diferentes de nutrientes. Se prepararon tanques con las condiciones objeto de estudio (cultivo.5. La mezcla estudio se preparó agregando al agua la cantidad de aceite equivalente al 35% p/v por cada litro de agua en cada tanque. El estudio piloto de tratabilidad tuvo una duración de cinco meses y cada mes se tomó una muestra de cada tanque para la realización de los análisis microbiológicos y fisicoquímicos. 1987. Oxidasa. 1983). 0.

con los valores de hidrocarburos. cocos. agrupados o en pares.500 UFC/ml. (1. aislados y en pares. MI 8. Kerr. Cada una de las cepas bacterianas aisladas fue probada en su eficiencia para degradar hidrocarburos en un medio mínimo mineral. 1999 y Flathman et al. sin gas ni H2S N: No Mótil M: Mótil . Tabla 2. MI 10 y MI 11. sin gas . Las características macromorfológicas de las cepas fueron registradas según la descripción propuesta por Thomas J. CULTIVO NUTRIENTES MIXTO 0. Unidades Experimentales. Los resultados obtenidos en la determinación de los Hidrocarburos Totales. 71. mostraron que al final del ensayo. aislados. bacilos delgados.069 y 850x106 UFC/ml y al final entre 0.Tabla 1. Los primeros 15 días de incubación. MI 11 Y MI 15. Pruebas Bioquímicas de las Cepas Bacterianas CEPA MI 5 MI 7 MI 8 MI 9 MI 10 MI 11 MI 15 UREASA CITRATO + + + + + + CATALASA + + + + + + + OXIDASA MOTILIDAD TSI ANAEROBIO M K/K + M A/A + N K/K + M K/K + N A/A + N A/A + M K/K + -: Reacción Negativa +: Reacción Positiva K/K: Alcalino/Alcalino. ni H2S A/A: Ácido/Ácido. MI 10.75 1 (g/L) TANQUE Control 1 Control 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ACEITE x x x x x x x x x x AIREACIÓN x x x x x x x x x x x x x x x x x x x RESULTADOS Y DISCUSIÓN El aislamiento microbiológico permitió la obtención de 18 tipos de colonias a partir de las muestras de agua contaminada con hidrocarburos. las densidades poblacionales de la mayoría de las cepas disminuyeron y estuvieron por debajo de las obtenidas al inicio del ensayo.78% respectivamente. a los 60 días de tratamiento. MI 9. 1995). Todas las cepas seleccionadas presentaron reacción de Gram negativa. MI 8 y MI 15. Las pruebas bioquímicas aplicadas a las cepas bacterianas seleccionadas se presentan en la Tabla 2. Las cepas MI 9 y MI 15 fueron las más eficientes en la remoción del hidrocarburo. se pudo seleccionar las cepas que fueron utilizadas para integrar cultivos mixtos en el ensayo a escala piloto: MI 5. es decir. 1995). Al comparar los resultados de crecimiento bacteriano en el medio con gasoil como fuente de carbono. El crecimiento bacteriano de las cepas bacterianas aisladas mostró diferentes patrones a lo largo del tiempo. MI 7.5 0. con gasoil como única fuente de carbono (Pareja. Para que un microorganismo sea recomendable de utilizar en procesos de biorremediación es necesario que sea capaz de degradar al sustrato con un eficiencia de 30-40% durante 4 a 6 semanas (Eweis et al. los valores fueron inferiores a los valores obtenidos inicialmente.01 y 4. MI 7. MI 9. 1993 y Young & Gerniglia.2% y 65.981) Los valores de crecimiento de las cepas bacterianas al inicio del ensayo estuvieron entre 0. La micromorfología de las 07 cepas bacterianas seleccionadas se obtuvo por microscopía de frotis con Tinción de Gram y éstas presentaron las características que se enuncian: MI 5. todas las cepas fueron capaces de degradar el gasoil.

1993). demostraron que el suministro de nutrientes y oxígeno estimuló el metabolismo de los organismos . A final del estudio los valores de hidrocarburos totales remanentes (HCT) provenientes de los tanques inoculados resultaron muy por debajo a los obtenidos en los controles no inoculados. 1999). fósforo presentaron los valores más altos de densidad poblacional (>1x109 UFC/ml). Los primeros 30 días de estudio.E + 0 7 3 4 5 6 UFC/ml 1 . Aggarwal et al (1991) encontraron que concentraciones muy altas de nitrógeno y fósforo pueden inhibir la actividad metabólica de los microorganismos.Los microorganismos alcanzaron densidades poblacionales durante los cinco meses del ensayo con diferentes tendencias. utilizó un cultivo mixto conformado por cepas degradadoras de hidrocarburos y probaron su eficiencia en la degradación de crudo liviano en medio acuático. En la Figura 3. fracción fácilmente degradable. A partir de los 30 días.E + 1 0 1 1 . 9 y 10) con valores de hidrocarburos remanentes finales de 330.E + 0 6 1 . lo que explica el comportamiento obtenido en estos tratamientos. El crecimiento de microorganismos aerobios y el desarrollo de sus actividades metabólicas específicas dependen principalmente de la disponibilidad de oxígeno molecular (Levin y Gealt.7 y 490. Las densidades poblacionales iniciales presentaron títulos de 1x106 UFC/ml. la densidad poblacional del control aireado fue ligeramente superior que en el control no aireado y esa diferencia se mantuvo durante todo el estudio. los cuales no presentaron cambios representativos durante todo el estudio. y la segunda. 1994 y Westlake. Mesa y Lugo (2000) realizaron un estudio de Biorremediación de suelos y encontraron una disminución rápida de los hidrocarburos presentes durante las primeras nueve semanas. logrando valores de crecimiento hasta de 108 UFC/ml.5.12 mg/L respectivamente. En los tratamientos control. el oxígeno estimuló las reacciones metabólicas de los organismos presentes (Martin.0. 1994).E + 0 5 1 . por ello. cuando las concentraciones apropiadas de nitrógeno y fósforo no están presentes. los tratamientos con aireación y fertilizados con nitrógeno. Wrenn (1993) utilizó el nitrógeno en forma de amoníaco y de nitrato y descubrieron que el proceso de biodegradación se aceleraba cuando el nitrógeno era suplido en forma de amonio. y luego una disminución lenta de las concentraciones en las nueve semanas siguientes.5 g/L). mientras que los controles fueron de 1x102 UFC/ml. tal como ocurrió en estos tratamientos. lo que indicó que el tratamiento aplicado en estos tanques fue eficiente para la remoción del aceite.E + 0 9 2 1 . 1997). 935. 0. Curvas de crecimiento para tratamientos inoculados y controles no inoculados. La bioestimulación con fertilizantes se ha utilizado con éxito en la recuperación de sitios contaminados con petróleo (Eweis et al. A los 150 días de tratamiento. Las curvas de pendientes más pronunciadas correspondieron a los tanques inoculados aireados y fertilizados (8.E + 0 4 1 . Wrenn (1993).75 y 0.E + 0 2 0 30 60 90 120 150 7 8 9 10 T IE M P O (D ÍA S ) Figura 2 . todos los títulos de crecimiento fueron superiores a los títulos iniciales. Las curvas de crecimiento para los tanques fertilizados con fosfato diamónico (1. es importante determinar las concentraciones de estos compuestos que sean más apropiadas para estimular la actividad microbiana. Jamison y Hudson (1975). los microorganismos aumentaron su densidad en todos los tratamientos al igual que los controles. La concentración de los hidrocarburos disminuyó rápidamente durante los primeros 60 días de tratamiento en los tanques inoculados con el cultivo mixto y luego el proceso de degradación disminuyó progresivamente en los mismos tanques hasta el final del estudio como se observa en la Figura 3.E + 0 3 1 . la adición de estos estimula el crecimiento microbiano facilitando la degradación de los sustratos carbonados (Martin. se puede distinguir que el proceso presentó dos fases durante la degradación: la primera probablemente correspondió a la degradación de la fracción lábil. a la degradación de una fracción más resistente al ataque microbiano y que por consiguiente fue más lenta. no inoculados.E + 0 8 1 . 1 .

00 60. en los cuales lograron remover el 60 % de los hidrocarburos presentes. La Tabla 3 presenta los resultados de las fracciones de hidrocarburos remanentes.00 80.00 20.incrementando la degradación de tal manera que se logró la eliminación de hasta 1000 barriles de gasolina mediante la actividad microbiana estimulada.00 10. en los tratamientos fertilizados y aireados se encontraron los valores más altos. 76. nitrógeno y fósforo.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T A N QU E Figura 4. 8000 7000 6000 HTC (mg/L) 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 30 60 90 120 150 TIEMPO (DÍAS) TANQUES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 3. Los altos porcentajes de remoción de aceite logrados en este estudio concuerdan con lo reportado por LaDausse et al (1987) quienes demostraron la importante mejora que se producía en la biodegradación de crudo en recipientes fertilizados. Los tanques 8.00 70.00 40. estos investigadores suministraron oxígeno a algunos recipientes y obtuvieron un incremento en la remoción superior al 70 % en el medio fertilizado.00 50. Con respecto a los aromáticos y asfaltenos la mayor remoción se observó en los tratamientos fertilizados y aireados. Baker (1987). Adicionalmente.00 30. .00 0. En todos los tratamientos se observó la remoción de hidrocarburos saturados y resinas. la biotratabilidad de hidrocarburos debe contar con la adición de oxígeno. Concentración de los HCT durante el estudio para cada tanque. demostró que niveles bajos de oxígeno limitaban la degradación de compuestos carbonados saturados. Porcentajes de remoción de los hidrocarburos totales.75 % respectivamente.24 y 82. 9 y 10 que fueron inoculados. aromáticos y resinas.09. 90. fertilizados y aireados mostraron los porcentajes más altos de remoción de 85. La remoción de aceite en cada tratamiento se muestra en la Figura 4.

5 26. CONCLUSIONES • El cultivo mixto de las cepas bacterianas seleccionadas logró una remoción eficiente de los hidrocarburos presentes en el aceite en todos los tratamientos.3 17.1 88.2 17. Resinas y Asfaltenos al inicio y al final del estudio.9 18.9 3.4 Aromáticos II (mg/L) 26.1 94. En todos los tratamientos la adición de nitrógeno y fósforo contribuyó a la reducción de las fracciones de resinas.4 17.2 26 49 26.3 94.9 94.8 92.3 12.4 23.1 132. tanto en los tratamientos fertilizados como en los no fertilizados.2 12.1 26. disminuyendo de manera secuencial pero en menor grado hasta el final del ensayo.1 15.4 93.4 Durante todo el estudio se observó una disminución de la concentración de nitrógeno y fósforo en cada tanque. asfaltenos y principalmente los saturados y las resinas.7 84. La concentración de nitrógeno va disminuyendo en mayor proporción que la del fósforo durante los tratamientos.3 26 13.4 17.4 20. lo que se tradujo en una disminución de todas las fracciones de hidrocarburos aromáticos.6 42. La aireación incrementó la remoción del aceite notablemente.3 28.5 26.4 24.4 14.5 94. Los primeros 60 días se lograron las mayores disminuciones en los tanques aireados.8 21. La aplicación de fertilizante con aireación produjo valores más altos de remoción de los hidrocarburos que sin aireación. saturados y aromáticos I. lo que concuerda con los resultados de Venosa (1990) quien reportó que las mayores disminuciones de nitrógeno y de fósforo en medios acuáticos contaminados con hidrocarburos tenían lugar en las primeras semanas de estudio. El proceso fue optimizado al controlar las variables de aireación y fertilización.Tabla 3.2 17.5 92.6 26.7 32.7 96.5 26. Tanques 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tiempo (Días) 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 Saturados (mg/L) 6057 6030 6074 5447 6083 3254 6083 604 6134 1173 6083 1250 5997 995 6096 104 5997 589 6057 222 Aromáticos I (mg/L) 93.1 10. debido a que los microorganismos.8 41. asfaltenos.8 16.1 26.3 24.1 4. lográndose de esta manera la duplicación de la remoción.9 16.4 93. Fracciones de los hidrocarburos Saturados. lo que se tradujo en una mayor disminución de todas las fracciones de hidrocarburos.4 36. Aromáticos I y II.5 Resinas (mg/L) 905 816 907 814 909 675 909 675 916 785 909 660 896 572 910 180 896 288 905 220 Asfaltenos (mg/L) 17.2 17.1 3.1 15. necesitan una proporción 10:1 de estos componentes para la asimilación y la síntesis del nuevo material celular (Metcalf & Hedí. la cual alcanzó hasta un 85% en cinco meses de tratamiento. 1996).1 14.2 2.9 12 17.1 22. • • • .4 94.

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