Aislamiento, separación y purificación de proteínas

Trabajo para concurso de oposición C.CNI.a.001.10

Tania Et el Cuadra !elaya " de #unio de "010

Contenido
Contenido................................................................................................................ " Aislamiento, separación y purificación de proteínas...............................................$ Introducción.........................................................................................................$ 1. %btención del e&tracto proteico.......................................................................' 1.1 Naturale(a y almacenamiento del material de inicio..................................' 1." E&tracción de proteínas..............................................................................) ". *urificación de la proteína..............................................................................1" ".1 *urificación no cromato+r,fica de proteínas............................................1) "." *urificación cromato+r,fica de proteínas.................................................1$. Consideraciones finales................................................................................."" .iblio+rafía......................................................................................................... "$

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En un importante n<mero de casos. Pichia pastorii. disperso entre otras sustancias similares 6contaminantes8.sico no solo para el entendimiento de las c/lulas y or+anismos. la producción de proteínas representa un mercado de productos de 9alto 0alor: bajo 0olumen. es 0alioso poder purificar y estudiar una proteína aislada. componentes cla0e de la ma2uinaria 2ue determina 2ue +enes se e&presan y si los A3N4s son traducidos a proteínas. Saccharomyces cerevisiae. c/lulas animales.. En los or+anismos. c/lulas de insectos. Entre los or+anismos de producción com<nmente usados est. sino tambi/n para un apro0ec amiento adecuado de ellas en los procesos biotecnoló+icos. las proteínas sir0en como catali(adores de los procesos metabólicos. En el caso de los procesos biotecnoló+icos. al+unos bacilos. no ay sistemas de transporte celular 2ue secreten el producto desde la c/lula productora al ambiente de fermentación.reas principalesA la obtención del $ .Aislamiento. etc. separación y purificación de proteínas Tania Ethel Cuadra Zelaya Introducción El estudio de las proteínas y sus funciones es b. componentes de rutas de se1ali(ación. receptoras y con0ertidoras de información. usualmente son producidos por un +rupo de or+anismos +en/ticamente modificados bastante conocidos.n in0olucradas en el flujo de la información +en/tica. separación y purificación de proteínas@ di0idiendo el contenido en dos . elementos estructurales. separación y purificación acti0idades de e&trema importancia 6=eser y Ajenjo 1>>'8.n la Escherichia coli. en +eneral est. ?ediante este trabajo se pretende presentar una 0isión +eneral de todas las tareas necesarias para el adecuado aislamiento. ya 2ue de esta forma puede ser estudiada separada de otras proteínas y sus funciones pueden ser e0aluadas en detalle 63oe 7. Consecuentemente las c/lulas deben romperse y el producto blanco 2uedar. "0018. 5adas estas importantes funciones. Esta situación ace de la recuperación.

=as proteínas son producto de la acti0idad ribosomal y por lo tanto est. 7e debe tener. Consecuentemente. y en el caso de estar si+uiendo las instrucciones de una publicación científica. y el ori+en de esta acti0idad es a menudo de poca importancia.s simple dado 2ue el ni0el de contaminantes proteicos es reducido en comparación al de proteínas ' . el inter/s se enfoca en una acti0idad bioló+ica en particular. En principio.sico.n asociadas al metabolismo celular. y tambi/n tratando de producción a +ran escala. por lo tanto. sin importar la fuente.1 Naturaleza y almacenamiento del material de inicio. cuando sea apropiado. un +ran cuidado en la selección de la fuente adecuada de esta en(ima@ ya 2ue puede aber considerables 0ariaciones respecto a la concentración y estabilidad de /sta. =as proteínas locali(adas dentro de la c/lula incluyen cuerpos de inclusión insolubles. 7in embar+o. En la mayoría de los casos. opciones para el material de inicio. Bna fermentación 2ue a sido pre0iamente re0isar las optimi(ada para producir una +ran cantidad de una en(ima en particular es un ejemplo cl. la disponibilidad y costos de la materia prima. 7e puede tener poca influencia en la elección del material de inicio para la purificación de una proteína. y dificultades en el manejo de materias primas en particular 6#anson y 3yd/n 1>>D8. o secretadas fuera de ella. en(imas solubles o proteínas estructurales 2ue forman parte de una estructura celular tal como la membrana. con el objeti0o de su estudio a ni0el de laboratorio. no asumir 2ue el material utili(ado en la referencia sea necesariamente el mejor para usar en la in0esti+ación a reali(ar. formando parte de su estructura. lec e. El material para purificar una proteína puede 0enir de una +ran 0ariedad de fuentes C tejidos animales. tal como una en(ima. materiales de plantas.smico tambi/n pueden pro0eer un proceso de purificación m. =as proteínas 2ue son secretadas por las c/lulas o locali(adas en el espacio peripl. acer una apro&imación a la compleja selección de acti0idades necesarias para su 1. se aconseja.e&tracto proteico y la purificación de la proteína de inter/s. las proteínas se locali(an ya sea dentro de la c/lula. Obtención del extracto proteico 1. la presencia de acti0idades y proteínas interferentes. san+re. y productos de culti0os microbianos como se mencionó antes 63oe "0018.

7in embar+o.2 Extracción de proteína Con el fin de aislar las proteínas intracelulares. *or lo tanto a menos 2ue la purificación inicie a oras de la obtención del material de inicio.nicas como 2uímicas 6Tabla 1.s.intracelulares. es necesario considerar 2ue durante el con+elamiento ciertos cambios pueden suceder en el material de inicio. 7e encuentran disponibles 0arias t/cnicas de rompimiento celular. si no son 0erificados. Cuando la proteína es e&tracelular al material celular. En la si+uiente sección se detallan todos los cuidados a tomar en cuenta durante obtención del e&tracto proteico y las precauciones a tomar para su mantenimiento óptimo antes y durante la purificación de la proteína deseada.A 7in partículas8 del material de inicio tan pronto sea posible a tra0/s de rompimiento celular.pidamente y resultan en reducción de los ni0eles de proteína blanco y un material de inicio no representati0o.s robustas ya 2ue tienen 2ue operar en ambientes ad0ersos. Cuando las proteínas est. se re2uiere una separación inicial 2ue permita retirar las c/lulas y dejar un sobrenadante claro 2ue conten+a la proteína blanco. pueden reducir subsecuentemente la eficiencia de la purificación 63oe "0018. solubili(ación de la proteína blanco en un amorti+uador apropiado y eliminación de las celular y debris celular a tra0/s de filtración o centrifu+ación. =a frescura del material de inicio es muy importante dados los procesos de de+radación natural y la contaminación por microor+anismos 2ue ocurren r.n asociadas con material celular. es recomendable +enerar e&tractos clarificados 6Ej. las proteínas e&tracelulares 6como la liso(ima y la amilasa son +eneralmente m. se debe reali(ar la ruptura celular. los cuales. A partir de entonces. Adem. 1. =as proteínas intracelulares son +eneralmente menos estables y presentan un mayor reto para los científicos purificadores debido a su mayor labilidad y presencia de otras proteínas contaminantes. tanto mec. 7e debe desarrollar un protocolo de ruptura celular eficiente para liberar la proteína en forma soluble desde su ) .18. o mediante con+elamiento a :-0 EC por días. a ) EC por un período de unas pocas oras. la preparación clara puede utili(arse inmediatamente para la purificación o se pueden con+elar alícuotas para uso futuro 63oe "0018. la de+radación debe ser reducida a tra0/s de reducción de la temperatura.

s sua0e como sea posible para la proteína. =os in0esti+adores necesitan tener una respuesta antes de la e&tracción para al+unas pre+untas frecuentesA FCómo se utili(ar. de la proteína de la blanco. tales como la elección de buffers. *ero si se pretende la in0esti+ación de las propiedades y acti0idades bioló+icas de las proteínas.acterias Jram positi0as Jlóbulos rojos Tejido de í+ado K ) min 10:1) min ):10 min ):10 min 10:"0 min Tejido muscular. tipo celular. la presencia de in ibidores proteasas. tejido de plantas . son adecuados unos pocos micro+ramos de proteínas desnaturali(adas en +el de poliacrilamida o en membrana de difluoruro de poli0inildeno 6*H5I8. Bna buena parte de estrate+ia y e0aluación se re2uieren para la selección de las condiciones adecuadas para la e&tracción.1 Varias técnicas de lisis celular Técnica 5i+estión en(im. se debe tener el cuidado de mantener la proteína de inter/s en forma estable y acti0a. lo cual las lle0a al rompimiento de la membrana celular C/lulas +randes se rompen mediante acción de corte =as paredes celulares se rompen debido a superficies ru+osas microscópicas =as paredes celulares se rompen por la 0ibración r. la proteínaG F7e utili(ar. 5isrupción osmótica de la membrana celular =as c/lulas son for(adas a tra0/s de un espacio estrec o.acterias M . de la naturale(a del Principio 5i+estión de la pared celular lle0ando a la disrupción osmótica de la membrana celular.tica =isis por c o2ue osmótico Lomo+eni(ación manual Lomo+eni(ador de cuc illas ?olienda con alumbre o arena ?olienda con perlas de 0idrio =a condición y constitución del tampón de e&tracción depender. y su aplicación pre0ista 6A med "00)8.compartimiento intracelular. El /&ito de la ruptura celular depende de una serie de 0ariables. Tabla 1. dado 2ue la etapa de e&tracción es el punto de partida para todos procedimientos posteriores. y la osmolaridad del buffer de resuspensión. El protocolo de disrupción debe ser lo m. tejido animal.acterias . la proteína para la secuenciación de p/ptidos con el objeto de lle0ar a cabo la clonación y secuenciación del c5NAG F7e re2uiere la proteína para la in0esti+ación de sus propiedades y acti0idades bioló+icasG *ara la secuenciación de p/ptidos.pida del 0idrio Tiempo de lisis 1):$0 min Ejemplo .

permeabilidad a tra0/s de membranas bioló+icas. +el *recipita en presencia de - e"tracciones. diferentes amorti+uadores dentro del mismo ran+o de pL pueden ser e&aminados para un efecto amorti+uador específico. no específicos. se aconseja empe(ar con una serie de amorti+uadores relacionados 2ue abarcan un amplio ran+o de pL. =as fuer(as cortantes desbaratan las c/lulas =a disrupción celular se reali(a debido a las fuer(as cortantes y ca0itación causada por ondas sónicas de alta presión 10:$0 min . 7us propiedades pueden ser afectadas se0eramente por pe2ue1os cambios en la concentración de iones un pL estable del ambiente proteico. *ara determinar el pL óptimo. de tal forma 2ue es necesario Tabla1. absorción BH. 7e consideran 0arios factores durante la elección de un amorti+uador 6Tabla 1. #imitaciones de amorti!uadores com$nmente usados para Ventaja Compatible cromato+rafía permeación %es&entaja con 5/bil capacidad amorti+uadora de dentro del ran+o de pL de D:11.acterias y c/lulas de plantas . una debe considerar determinar el pL óptimo de la acti0idad de la proteína con el objeto de ele+ir el mejor amorti+uador. Cuando se estudia las propiedades de una proteína.licos8."8. Amorti!uador Iosfato en .*rensa francesa 7onicación =as c/lulas son for(adas a pasar a tra0/s de un orificio pe2ue1o a una presión muy alta. Estos factores son el pNa y los efectos de la temperatura. compatibilidad con diferentes t/cnicas de purificación. .1 Amorti!uadores para e"tracción de proteínas =as proteínas son macromol/culas bioló+icas e&tremadamente etero+/neas. Bna 0e( 2ue se a ele+ido el tampón apropiado. 1>D08. Amorti+uadores a concentraciones de )0 m? son normalmente no tó&icos para las c/lulas 6Ier+uson y col. y costos. interacciones con otros componentes 6tales como en(imas y iones met. Bna 0e( 2ue el pL óptimo a sido determinado. es mejor trabajar a la mínima concentración ra(onable 6alrededor de )0 m?8 para e0adir efectos de 9fuer(a iónica.acterias ):10 min 1. idró+eno.

Iorma complejos con los moti0os de ribosa de los . LE*E78 .orato Citrato Carbonato .arato .nicos tienen al+unos efectos secundarios.arato. efectos secundarios. y des idro+enasa 6.licos 7olubilidad limitada.uffers 3elati0amente libres de 6#edA ?E7. Caros. ureasa. y otros mono y oli+osacaridos 7e une a al+una proteínas y forma complejos met. 2uinasa. ?%*7. =os buffers de fosfato muestran in ibición de muc as en(imas incluyendo la carbo&ipeptidasa. *I*E7. . 5ado 2ue el carbonato est. incluyendo las 2uinasas.6cromato+rafía de e&clusión8 e intercambio catiónico. en e2uilibrio con el C%". *asa a tra0/s de membranas bioló+icas Contiene una amina primaria reacti0a y por lo tanto forma aductos de bases de 7c iff con alde ídos e in ibe la conju+ación por entrecru(amiento basado en aminas.arato .. In ibe una amplia 0ariedad de en(imas. buffers aniónicos tales como fosfato8 se prefieren.lanc ard 1>D'8. los buffers catiónicos tales como el Tris 6y para la cromato+rafía de intercambio catiónico. No adecuado para cromato+rafía de intercambio aniónico Amorti+uador pobre debajo de pL -. fosfatasas y des idro+enasas. en la cromato+rafía de permeación en +el. los estudios deben ser lle0ados a cabo en sistemas cerrados =a mayoría de los amorti+uadores Jood 6LE*E7. *or ejemplo.cidos nucleicos. 7in embar+o estos amorti+uadores inor+. *ero para la cromato+rafía de intercambio aniónico.8 forman radicales bajo 0arias condiciones y por lo tanto no son adecuados cuando se estudian procesos redo&. etc. casi cual2uier amorti+uador adecuado para la proteína de inter/s puede ser ele+ido.arato Jood . Tris Adecuado para la cromato+rafía de e&clusión y cromato+rafía de intercambio aniónico. =a selección de buffer tambi/n depende de los m/todos de separación empleados. . Tris y otros buffers de aminas primarias D . Compatible con la mayoría de reacti0os para entrecru(amiento.aja absorbancia a la lu( BH Efectos mínimos de la temperatura y de la fuer(a iónica cationes poli0alentes.arato .

y otros mono y oli+osac. =os deter+entes son una clase de compuestos caracteri(ada por su estructura anfifilica 6Tanto idrofóbica como idrofílica8.ridos. A diferencia de los buffers inor+.cidos nucleicos. si se utili(an para in ibidores de proteasa acidia. =a > an lo+rado las condiciones para mantener la proteína deseada en una forma estable. 1. Es un serio problema por2ue. se pueden usar in ibidores . adicionalmente a la completa inacti0ación de la proteína deseada. la proteólisis podría +enerar proteínas de+radadas. El uso de aprotinina es incompatible con los buffers de e&tracción 2ue contienen una +ran cantidad de a+entes reductores. 7in embar+o.licos 6como el Cu"O8. los amorti+uadores Jood tambi/n son <tiles respecto a la baja capacidad de uniones met.licas. *I*E7 y ?%*7 a mostrado estar relati0amente libres de efectos secundarios. =os deter+entes son a+re+ados +eneralmente al buffer de e&tracción y purificación de proteínas de membrana. las cuales usualmente son insolubles en amorti+uadores acuosos. se oponen a la utili(ación simult.nicos. Bna me(cla de ben(amida y ben(amidina podría sustituir la aprotinina. reteniendo la mayoría de los metales esenciales para la acti0idad en(im. Bna 0e( se selecti0os de proteasas 6A med "00)8. reteniendo parcialmente la acti0idad bioló+ica. los amorti+uadores Jood 6desarrollados por Jood y col 1>MM8 tales como ?E7.pueden formas aductos de bases de 7c iff con alde ídos y cetonas e in ibir la conju+ación de proteínas mediante fijadores basados en aminas. =os buffer de borato pueden formar complejos co0alente con los moti0os de ribosa de los . Es aconsejable usar una me(cla de in ibidores cuando se trabaje con un nue0o e&tracto de proteínas. Tienen baja absorbancia al BH y son afectados mínimamente por la temperatura o la fuer(a iónica. 'so de in(ibidores de proteasas y deter!entes para la e"tracción =a proteólisis puede ser un problema mayor despu/s de la e&tracción y en cual2uier etapa de la purificación de la proteína deseada. =os in0esti+adores deben tener en mente 2ue los iones met.nea de 2uelantes 6tales como E5TA y EJTA8 2ue son re2ueridos para in ibir metaloproteasas. . =a aprotinina contiene tres enlaces disulfuro y por lo tanto el a+ente reductor podría inacti0ar la aprotinina.tica. debido a 2ue la me(cla es tan acti0a como la aprotinina.

mientras 2ue la cabe(a di0ersas estructuras 2uímicas. de la mol/cula de deter+ente es idrofóbica. =os m/todos de lisis 2uímica minimi(an la desnaturali(ación y e&ponen la membrana citopl. y usualmente consiste de un idrofílica puede tener idrocarburo ramificado o lineal. son a menudo utili(ados para solubili(ar proteínas de membrana.ticos como el Tritón P:100 y el Tritón P:11' tienen una absorbancia ultra0ioleta sustancial a "D0 nm. 7i las proteínas 0an a separarse de acuerdo al tama1o por medio de cromato+rafía de filtración en +el. =as sales biliares y sus deri0ados incluyendo CLA*7 y CLA*7% no tienen tal interferencia. las J6:8 contienen una membrana e&terna compuesta de lipopolisacaridos. la pared celular de las bacterias J6:8 aparece del+ada. =os deter+entes iónicos interfieren con los procedimientos relacionados con car+a tales como la cromato+rafía de intercambio iónico y el isoelectroenfo2ue. por2ue diferencias en tama1o entre micelas 2ue contienen proteínas y micelas 2ue no las contienen son mayores 6A med "00)8. fosfolípidos. =os deter+entes con +rupos arom. los deter+entes iónicos deben ser e0itados si las t/cnicas de separación basadas en diferencia de car+as 0an a ser empleadas. se deben ele+ir los deter+entes con menor n<mero de tama1o de a+re+ación micelar 6K$08. conteniendo dos o tres capas de peptido+licano 610:"0R de la pared celular8. .) #isis *uímica y mec+nica para la e"tracción de proteínas =a lisis 2uímica incluye el tratamiento de las c/lulas con .s importante en la elección de un deter+ente apropiado es la propiedad no desnaturali(ante. *or lo tanto. especialmente cuando la purificación de la proteína de membrana se reali(a a tra0/s de cromato+rafía de columna y se desea el monitoreo BH de la fracción deseada. 7e deben considerar tambi/n las propiedades espectrales de los deter+entes. Adicionalmente.smica interna mediante la de+radación de la pared celular de peptido+licanos de las bacterias. y contiene 0arias capas interconectadas de peptido+licano 6M0:>0R de la pared celular8. Estos deter+entes dan mejor resolución. en(ima o deter+ente. En contraste. y lipoproteínas. tales como el CLA*7. =a liso(ima es una en(ima ampliamente usada para lisar c/lulas J6O8 en presencia de E5TA y deter+ente 10 . =a consideración m. tales como el Tritón P:100 y octyl+lucosido y deter+entes (Qitterionicos. =os deter+entes no iónicos. =a pared celular de bacterias J6O8 es +ruesa. 1.lcali.9cola.

o molino de perlas.nica produce calor.s com<n. =a lisis mec. presión celular.nica son económicos y preferibles para preparaciones a +ran escala por2ue no re2uieren la adición de 2uímicos. idroli(a los enlaces N:acetilmuramicos produciendo la de+radación de la pared celular. tiempo de lisis y temperatura.nica si+nifica disrupción de las c/lulas utili(ando sonicación. la lisis celular se puede lo+rar mediante c o2ue osmótico cuando las c/lulas se suspenden en una solución ipotónica 6Ej. reteniendo las perlas dentro de la c. concentración celular. =as operaciones de alta presión ele0an la temperatura. y m/todos de corte en lí2uido. =a lisis de rompimiento en lí2uido reali(ada mediante prensa francesa o prensa de ?anton:Jaulin es el m/todo de lisis mec.A de una menor fuer(a iónica 2ue la membrana citopl. En contraste.mara. =a a+itación con abrasi0os es com<nmente reali(ada en molinos de perlas 6tales como el 5ynomill8. el cual necesita ser controlado.tica e&itosa.rij )D. a pesar de todo. concentración y di.mara.n prote+idas por pared celular son sensibles al c o2ue osmótico.metro de las perlas de 0idrio. =os +lóbulos rojos son un ejemplo de este tipo. depende de la 0elocidad de a+itación. las cuales rompen las c/lulas durante la rotación de las perlas. y se debe tener cuidado de controlarlo. de tal forma 2ue la membrana e&terna necesita ser permeabili(ada para e&poner la capa de peptido+licano para una lisis en(im. para pre0enir la desnaturali(ación de la superficie y la o&idación. =a suspensión de c/lulas rotas sale de la c. Adicionalmente a la lisis 2uímica.smica8. 7u c. =os m/todos de lisis mec.mara se llena con perlas de 0idrio para moler. =as c/lulas 2ue no est. la sonicación 11 . las bacterias J6:8 son menos susceptibles a la liso(ima y deter+entes debido a la presencia de una bicapa lipídica asim/trica. =as c/lulas son lisadas mediante alta presión 6M000 a 10000 psi8 se+uidas por una s<bita liberación de presión. omo+eni(ador. =a eficiencia del la lisis celular. =a membrana e&terna de peptido+licano act<a como una barrera permeable a las mol/culas +randes.pido de presión ace 2ue las c/lulas estallen.nica m. 7e debe tener cuidado de e0itar la formación de espuma. =os m/todos de lisis mec. *ara el lisado de pe2ue1as cantidades de c/lulas.nica son de dos tiposA a+itación.. Este cambio r. 7in embar+o la lisis mec.

especialmente de la proteína de inter/s. producen calor. los m/todos de lisis mec. etc. Bn paso de purificación 2ue pueda desnaturali(ar la proteína no es adecuado para estudios de sus propiedades bioló+icas. Bsualmente. con pausas por unos pocos minutos en ielo. tama1o de subunidad. car+a. =isa las c/lulas por medio de rompimiento con lí2uido y por ca0itación. =a elección de los m/todos de purificación tambi/n est. 1" . =os m/todos de enfriados a ' EC.ficos y no cromato+r. es importante adoptar procedimientos 2ue no causen su desnaturali(ación.n influenciados por factores tales como la forma en 2ue se utili(ar. !uri"icación de la proteína En la purificación de proteínas.nica liberan .n disponibles 6Her tabla ". cerebro. omo+eni(ación usualmente ielo procedimientos comunes y simples para romper tejidos sua0es como cora(ón. . la proteína en estudios. =a omo+eni(ación en licuadora o en omo+eni(ador de cristal son í+ado. *ara controlar el calentamiento durante la sonicación. idrofobicidad.cidos nucleicos 2ue deben ser eliminados del e&tracto por medio de partición de fases o por tratamiento con 3NAsas o 5NAsas. El costo de los li+andos utili(ados para la inmo0ili(ación de matrices y para elución de una proteína unida en cromato+rafía de afinidad pueden ser factores limitantes para purificaciones a +ran escala.si+ue siendo una t/cnica con0eniente.ficos 6electroforesis.8 2ue pueden ser e&plotadas para purificar o aislar una proteína de una me(cla.ndose en estas propiedades. la cantidad de proteína purificada necesaria. pero puede ser adecuado para la determinación de su estructura primaria. Lay 0arias propiedades 6tales como peso molecular. =os protocolos de purificación para obtener un ni0el en micro+ramos de proteína purificada 6para una secuencia parcial de p/ptido con el objeto de construir una sonda +en/tica8 pueden ser diferentes de a2uellos 2ue produ(can +randes cantidades de proteína purificada. por lo 2ue la licuadora y los contenedores asociados deben ser omo+eni(ación debe ser reali(ada en cuarto frio o en 2. precipitación. y los costo de materiales y reacti0os utili(ados en la purificación. etc. filtración por membrana8 est. 0arios procedimientos cromato+r. se reali(an pulsos de $0 a '0 se+undos. y m<sculos. =a 6A med "00)8.18.as.

filtración en +el. pro0ee información acerca del peso molecular de la proteína Capacidad de unión de proteína usualmente alta =a resolución 0aría de acuerdo al tama1o del +el.Bna proteína puede ser purificada en un paso simple 6*or ejemplo. la cromato+rafía de intercambio catiónico es la mejor elección.1 Varias técnicas para la purificación de proteínas Propiedad re*uerida Tama1o molecular . Com<nmente utili(ada para la separación de p/ptidos Al final del purificación proceso de Lidrofóbica Lidrofobicida d Al principio del proceso de purificación Btili(ada para la separación de p/ptidos. intercambio iónico. pero antes de la cromato+rafía de 1$ .8. y otras aplicaciones. *articularmente <til para concentrar +randes 0ol<menes de medio de culti0o. cromato+rafía de afinidad8 o por una combinación de 0arios pasos 6por ejemplo. fraccionamiento con sales.sica. Tabla Técnica . la cromato+rafía de intercambio aniónico se emplea para la purificación de proteínas . proteínas purificadas di+eridas. 7imilarmente. Cuando la p/rdida de la acti0idad bioló+ica de la proteína no es una preocupación. para la purificación de una proteína b. 5espu/s del fraccionamiento por sulfato de amonio.bser&aciones Tanto para el fraccionamiento como para la concentración de la muestra. *erdida de proteínas por adsorción no específica Com<nmente usad para fraccionamiento celular =as proteínas precipitan en la c. forma y densidad *unto isoel/ctrico 6pI8 Car+a *eso molecular Intercambio iónico Iase re0ersa Car+a Lidrofobicida d Bsualmente tiene baja resolución. etc. Al principio del procedimiento de purificación. =a cromato+rafía de fase re0ersa es adecuada para una familia de proteínas acti0as de car+a similar 6A med "00)8.cidas. Iiltración por membrana Centrifu+ación Isoelectroenfo 2ue preparati0o Electroforesis preparati0a E&clusión por tama1o Tama1o molecular.mara de rotofor Cuando usar -recomendaciones de aplicación. En +eneral.

=a tabla ".. Jrado de concentración es el ran+o de acti0idad específica de una fracción en relación con el e&tracto crudo. e&presada como títuloTm+ de proteínaTm=. =os in0esti+adores deben desarrollar un ensayo para la determinación de la acti0idad de la proteína a ser purificada para monitorear la purificación.D Acti&ida d total 2ecuperac ión -3. Cara de escalar =imitada a las proteínas 2ue contienen tioles Al inicio del procedimiento de purificación Co0alente Isoelectroenfo 2ue Jrupos tiólicos Car+a. Paso Proteí na total 1. =a acti0idad específica se define como la acti0idad total por mili+ramo de proteína por mililitro en una fracción.intercambio iónico. pI *ara proteínas 2ue contienen tioles Stil para separar isoformas con puntos isoel/ctricos muy cercanos.$ Intercambio aniónico en celulosa:5EAE Cromato+rafía de 0." muestra un ejemplo de una tabla típica de purificación de proteínas 6A med "00)8. Bna fracción con alta acti0idad específica y alta concentración de proteína indica el /&ito de la fase de purificación.1" D00 >M 1" 1. =imitada por la disponibilidad de li+ando inmo0ili(ado. Título es el recíproco de la mayor dilución de lectinas mostrando a+lutinación 0isible.M 0. 1' . Lidro&iapatita Afinidad Car+a Bnión li+ando a 7eparación usualmente específica. =os pasos de purificación di0iden el total de proteínas en el e&tracto crudo en 0arias fracciones. E&tracto crudo D0' 100 1 Cromato+rafía -'" >" 1.$$$ filtración en +el con Bltro+el AcA '' NotaA la acti0idad específica est.> '"$D' 'D -1" afinidad en sefarosa:. Purificació n -&eces.7? Cromato+rafía de 0.$'0 de >"D Acti&idad específic a 0. Btili(ar despu/s de la cromato+rafía de afinidad. Tabla . cada una de las cuales en e0aluada en cuanto a la acti0idad y contenido de proteína. Purificación de una lectina unida a +cido si+lico procedente de placenta (umana -A(med y /abius 1010.

$. 'ltrafiltración por membrana =a ultrafiltración del e&tracto crudo a tra0/s de una membrana con un peso específico de corte 6?UC%8 es una forma alternati0a de 1) molecular .s el sobrenadante del D0R 6A med "00)8. Tener siempre en mente los objeti0os C alta producción. . M. pipetas. $0:M0R y M0:D0R de saturación de sulfato de amonio.s económica puede ser i+ual de <til. Btili(ar t/cnicas y aparatos confiables. Adoptar una apro&imación por pasos C y optimi(ar cada paso en el camino. ?antener notas completas de rendimientos y acti0idad. ?antener la purificación simple C minimi(ar el n<mero de pasos y e0itar manipulaciones difíciles 2ue no se reproducir. escala final de la operación. El fraccionamiento de las proteínas mediante precipitación con sulfato de amonio es el m/todo m. Escribir los m/todos antes de iniciar y re+istrar lo 2ue se ace con precisión. D.s com<nmente usado para enri2uecer una proteína particular. 10. 7e e0al<a la acti0idad de las proteínas precipitadas de cada etapa m.A1os de trabajo pr. =as proteínas de alto peso molecular usualmente precipitan debajo de ")R de saturación de sulfato de amonio.n. reproducibilidad. -. >. ". =os e&tractos crudos pueden ser sujetos a fraccionamiento en tres etapasA 0:$0R. 2. Ase+urar 2ue los ensayos se reali(an de tal forma 2ue se pueda monitorear la purificación.cilmente la proteína deseada. =a 0elocidad es importante C e0itar retrasos y e2uipo lento. Jastar dinero en pie(as y accesorios pe2ue1os C Ej.1 !uri"icación no cromato#r$"ica de proteína *re0io a las t/cnicas cromato+r.ficas ay 0arios procedimientos de separación disponibles 2ue permiten concentrar f. etc. uso económico de reacti0osTaparatos.ctico de científicos de separación an deri0ado ciertas re+las para ayudar a minimi(ar problemas en la purificación de proteínas 63oe "0018A 1. etc. '. con0eniencia.1 4raccionamiento. rendimiento.1.1.A tubos de ensayo. ). . ?antenerla barata C e0itar t/cnicas costosas cuando una t/cnica m.

=as propiedades de retención de las membranas son normalmente e&presadas como un ?UC% 2ue rec a(a apro&imadamente el >0R de una proteína +lobular de un determinado peso molecular. los solutos son for(ados a tra0/s de una membrana. 7olutos pe2ue1os pueden pasar a tra0/s de los poros de la membrana. 5ependiendo de la naturale(a de los estudios de proteínas purificadas un *AJE nati0o o 757:*AJE se reali(a. omo+eni(ado de . y la proteína es e&traída por difusión simple en un amorti+uador apropiado mediante electroelusión 6A med "00)8. 7i la ultrafiltración se reali(a primero con el propósito de ya sea concentrar o desalar la proteína purificada. y así sucesi0amente.s tiempo y m. se utili(a un peine especial preparati0o 2ue contiene un solo po(o amplio y un po(o an+osto de referencia para la proteína est.5 Electroforesis preparati&a =a electroforesis preparati0a es una poderosa t/cnica. No se utili(a aire.s +randes.s densas. *ara la electroforesis preparati0a. poco fuer(a de aceleración8 sedimentar.s densas presentes. para e0itar la o&idación de la proteína. en la cual las proteínas son primero separadas por electroforesis y subsecuentemente eluidas del +el de poliacrilamida. 7i se centrifu+a en condiciones sua0es 6poco tiempo. entonces es importante reali(ar e&perimentos piloto para 0erificar la capacidad de retención de la membrana pre0io al uso 6A med "00)8.enri2uecimiento de una proteína deseada sin una p/rdida si+nificati0a de acti0idad bioló+ica. usualmente mediante presión de nitró+eno. En esta t/cnica. 5espu/s de la electroforesis. Cuando el sobrenadante de la primera centrifu+ación es centrifu+ado de nue0o en condiciones de m.ndar de referencia. dejando retenidas las mol/culas m. .n las partículas mayores yTo m. se corta una porción del +el 2ue contiene una banda proteica.) Centrifu!ación diferencial El principio de separación por medio de centrifu+ación diferencial se basa en las propiedades de tama1o molecular.1.s fuer(a de aceleración.1. Esta t/cnica es ampliamente usada para el fraccionamiento subcelular de un tejidos 6A med "00)8. forma y densidad de las diferentes proteínas. sedimentan de nue0o las partículas m. 1M .

E2uilibrio de =í2uido =í2uido 1- .6 8edios de la fase estacionaria y fase mó&il para la mayoría de cromato!rafías.1. =a mayoría de sistemas cromato+r.ficas de proteínas se basan en un e2uilibrio lo+rado entre la fase estacionaria y la fase mó0il. 5urante la mi+ración a tra0/s del +radiente de pL. de mo0erse.. bomba perist.bser&aciones E2uilibrio de intercambio iónico.ficos consisten en dos fasesA =a fase estacionaria y la fase mó0il 67copes 1>>$8. la car+a neta y mo0ilidad disminuir.lisis. Cuando la proteína se coloca en un medio con pL 0ariable y en un campo el/ctrico. y en su pI la proteína dejar. acia el electrodo con la car+a opuesta. A pesar de 2ue el isoelectroenfo2ue se utili(a ampliamente como un procedimiento de an.. los a0ances recientes en aparatos de electroforesis an permitido utili(ar esta t/cnica para purificar las proteínas a +ran escala 6A med "00)8. +raficador.ltica. Tabla 5.6 7soelectroenfo*ue preparati&o El principio de isoelectroenfo2ue es 2ue las mol/culas anfóteras se separan mientras mi+ran a tra0/s de un +radiente de pL. mientras 2ue la fase mó0il puede ser lí2uida o +aseosa y fluye a tra0/s de la fase estacionaria. tubería. =a tabla ". Todas las purificaciones cromato+r.2 !uri"icación cromato#r$"ica de proteína Todos los sistemas cromato+r. columna. un +el. 2.$ muestra el medio de la fase estacionaria y la fase mó0il para la mayoría de las cromato+rafías. la proteína reco+er. Cromato!rafí a Iiltración en +el Cromato: enfo2ue de intercambio iónico Iase re0ersa 4ase estacionaria =í2uido embebido perlas de +el 7ólido en 4ase mó&il =í2uido =í2uido . un lí2uido o una me(cla de solido y lí2uido. =a fase estacionaria puede ser un sólido. protones.ficos re2uieren cierto e2uipo en com<n. y colector de fracciones 6A med "00)8. o perder. Este esA reser0orio para amorti+uador. detector BH. inicialmente se mo0er. ?ientras esto pasa.

Adem. *rincipio. En la cromato+rafía de intercambio iónico. las proteínas son fraccionadas bas.s de utili(arse para purificación. Cromato!rafía de intercambio iónico =a cromato+rafía de intercambio iónico es ampliamente usada al principio de un es2uema de purificación y est. la cromato+rafía de permeación en +el tambi/n se utili(a para determinar el peso molecular de la proteína y para eliminar impure(as de bajo peso molecular 6desalación8.roQniano tanto a sus diferentes acia dentro como fuera del las partículas del +el.pido a tra0/s de los espacios intersticiales de las partículas de +el 6A med "00)8. cromato+rafía de e&clusión por tama1o.ndose en su tama1o relati0o. En la filtración en +el. en e2uilibrio con una fase mó0il. =as mol/culas de soluto 6proteínas8 se difunden por medio de un mo0imiento . . todas las proteínas pasan a tra0/s de la columna. dise1ada para la separación de compuestos iónicos o ioni(ables en la fase mó0il mediante el colector de iones 2ue se encuentra del lado opuesto de la fase estacionaria 6empa2ue de la columna8. los +rupos funcionales ioni(ables se unen co0alentemente a la fase estacionaria 6matri(8.Lidrofóbica Afinidad co0alente 7ólido =i+ando inmo0ili(ado =í2uido =í2uido partición E2uilibrio adsorción de . y cromato+rafía de tami(ado molecular. . el lí2uido dentro de las partículas de +el 6fase estacionaria8 est. =as mol/culas muy +randes no pueden entrar en los poros de las partículas de +el y así 0iajan muy r. por2ue a diferencia de cual2uier procedimiento de filtración. .. es al+o en+a1oso. El t/rmino 9filtración. y no ay nin+una fracción 9retenida. en !el En la filtración en +el. =a cromato+rafía de filtración en +el tambi/n es reconocida como la cromato+rafía de permeación en +el. =as mol/culas son separadas debido abilidades de entrar a los poros de las partículas de +el. 1D .1 Cromato!rafía de filtración -e"clusión por tama9o.

7imilarmente. El polibuffer. =a cromato+rafía de intercambio iónico se nombre en base al si+no de las car+as despla(ables. en la cromato+rafía de intercambio aniónico las car+as fijas 6fase estacionaria8 son positi0as. =as proteínas unidas pueden entonces ser eluídas o despla(adas de de la fase estacionaria por un nue0o ión 6Bsualmente NaCl8 con una mayor afinidad por las car+as fijas de la fase estacionaria 2ue la proteína. =a ioni(ación de tales +rupos es dependiente del pL. A un pL mayor 2ue el pI.mico producen car+as ne+ati0as.cido aspartico y +lut.En este procedimiento. produce un +radiente de pL. las proteínas de car+a similar 6ya sea positi0a o ne+ati0a8 interact<an con car+as opuestas en la fase estacionaria. en la cromato+rafía de intercambio catiónico. y 7oderber+ y col 1>D"8. las car+as fijas son ne+ati0as y las car+as despla(ables son positi0as 6A med "00)8. y por lo tanto la car+a neta de una proteína ser. y las car+as despla(ables 6proteínas8 en la fase mó0il son ne+ati0as. =a ioni(ación de los residuos de lisina y ar+inina producen car+as positi0as. la proteína est. car+ada positi0amente. 1> . . . las proteínas se unen al lec o de intercambio iónico en un buffer e2uilibrado de baja fuer(a iónica y eluídas con un polibuffer a un pL menor 2ue el del amorti+uador de inicio. *roteínas con pI con diferencia tan pe2ue1as como de 0. el cual es utili(ado para eluir las proteínas unidas de la resina de intercambio iónico en el orden de sus puntos isoel/ctricos. conteniendo especies amorti+uadoras catiónicas y anfot/ricas. y a un pL menor 2ue el pI. 5urante la cromato+rafía. la proteína est.*rincipio. Así. A un pL id/ntico al pI de la proteína.) Cromatoenfo*ue El cromatoenfo2ue 6isoelectroenfo2ue mediante cromato+rafía de intercambio iónico8 es un procedimiento en el cual las biomol/culas se separan de acuerdo a sus puntos isoel/ctricos en una columna de intercambio iónico 6* armacia Iine C emicals 1>D0. contienen tanto car+as positi0as como ne+ati0as. mientras 2ue la ioni(ación de residuos de .0) unidades de pL pueden ser resueltas mediante cromatoenfo2ue. =as proteínas son anfot/ricas@ esto es. car+ada ne+ati0amente. función del pL del amorti+uador. la car+a neta de una proteína es cero. liberando otras proteínas de car+a id/ntica a las car+as de la fase estacionaria.

r: V N%$: V Cl%': V I: V 7CN: y para cationes son NL 'O V 3bO V NO V NaO V CsO V =iO V ?+"O V Ca"O V . el salado de los iones se mantiene a una concentración alta para disminuir la disponibilidad de mol/culas de a+ua.cido. Como en la cromato+rafía de intercambio iónico con0encional. un +radiente de pL se +enera en la columna mediante un flujo continuo de un polibuffer . *rincipio. En cromatoenfo2ue. las proteínas con una car+a neta opuesta a a2uella de la columna permanecen unidas en el buffer e2uilibrante. 5ado 2ue la 0elocidad del flujo del buffer eluyente es mayor 2ue la formación del +radiente de pL.a"O 6AraWaQa y Timas eff 1>D'8. una me(cla de proteínas se car+a en una columna de intercambio iónico 2ue se e2uilibra con un pL alcalino o un pL li+eramente arriba del supuesto pN de la proteína blanco. En este proceso. En esta cromato+rafía. . empie(a a desorberse de la columna. En la pr. "0 . El sulfato de amonio 60. En el buffer de e2uilibración. *rincipio. =os aniones 2ue fa0orecen las idrofóbicas son *%'$: V 7%'": V CL$C%%: V Cl: V . lo cual en cambio incrementa las interacciones idrofóbicas.5 Cromato!rafía de interacción (idrofóbica En la cromato+rafía de interacción idrofóbica 6LIC8.s .El cromatoenfo2ue es <til para separar las isoformas con pIs muy pró&imos entre sí despu/s de una cromato+rafía de afinidad. las proteínas son idrofóbicas con separadas en base a las fuer(as 0ariables de sus interacciones una fase sólida conteniendo +rupos idrofóbicos sin car+a. pero las proteínas de car+a similar son la0adas.ctica. las proteínas y p/ptidos interact<an con las superficies idrofóbicas de la matri( por adsorción en un amorti+uador acuoso. =a resina de intercambio iónico 2ue contiene las proteínas li+adas es entonces titulada con un polibuffer de un pL m. . cuando el pL del +radiente se apro&ima al pI de la proteína blanco.cido.D :1 ?8 es a menudo utili(ado como el buffer de e2uilibración para incrementar la interacción interacciones idrofóbica de las proteínas. una proteína con una pI particular se desorbe a tra0/s de la lon+itud de la columna y eluye como un pico sencillo 6A med "00)8.

.6 Cromato!rafía de fase re&ersa En la cromato+rafía de fase re0ersa 63*C8.: Cromato!rafía de afinidad El procedimiento m. la matri( es sílica 2ue a sido sustituida con cadenas n:al2uilicas. . la sílica deri0ati(ada con CD o C1D.s. En el sistema de fase re0ersa. El nombre 9fase re0ersa. usualmente C'.. en la cual la matri( es sílica y la fase mó0il es un sol0ente no polar como el e&ano.lisis 6A med "00)8. 3*C raramente se usa para las purificación de mol/culas proteicas bioló+icamente acti0as. . esta cromato+rafía es ampliamente utili(ada para separar p/ptidos obtenidos a partir de proteínas purificadas y 2ue an sido di+eridas mediante m/todos 2uímicos o en(im. tirosina. =a LIC puede ser con0enientemente desarrollada despu/s de fraccionamiento con sulfato de amonio.s polar 2ue la fase estacionaria. leucina.cidos idrofóbicas pueden ser utili(adas para separar biomol/culas son el triptófano. En la cromato+rafía de idrofobicidad las proteínas son usualmente adsorbidas en soportes fenil: o octil:inmo0ili(ados en presencia de altas concentraciones de sal. en orden decreciente de idrofobicidad. la proteína purificada se obtiene en una forma bioló+ica acti0a. el a+ua presente en la fase mó0il es m.s poderoso para la purificación de proteínas es la cromato+rafía de afinidad. En las proteínas los amino. . pero antes de la cromato+rafía de intercambio iónico. 7in embar+o. el eluido puede entonces 2uedar listo para someterse una cromato+rafía de intercambio iónico sin la necesidad de un paso de di. =as +licoproteínas de membrana se unen a la bicapa lipídica de las membranas bioló+icas mediante interacciones =as interacciones 2ue poseen moti0os idrofóbicos. 0alina. 5ado 2ue la proteína blanco se eluye en un buffer bajo en sales.ajo condiciones ideales la proteína blanco puede ser purificada en un solo paso. CD y C1D. y para otras aplicaciones donde la perdida de la acti0idad bioló+ica de la proteína no es un preocupación 6A med "00)8. =a fase mó0il es usualmente una me(cla de a+ua y un sol0ente or+. idrofóbicos polar.ticos. . Adem. se introdujo para distin+uirla de la cromato+rafía de 9fase normal. metionina y alanina.nico menos polar. como la purificación se basa en sus interacciones "1 . Ej.A a+ua 6Nennedy 1>>08.=a idrofobicidad es la repulsión entre un compuesto no polar y un medio idrofóbicas.

para poder e0aluar las fuentes de proteínas ser.bioespecíficas con un li+ando inmo0ili(ado. Con ideracione "inale Bn paso de primordial cuidado para la purificación e&itosa de una proteína consiste en la obtención y preser0ación de la fuente de proteína. En la cromato+rafía de afinidad. =as proteínas en el e&tracto 2ue ten+an un sitio de unión complementario al li+ando permanecen unidas a la matri(. %. es decir lo m. las proteínas no li+adas se eliminan de la columna. la proteína li+ada es despla(ada mediante la incorporación del li+ando libre 2ue compite por sitios de unión de la proteína. Iinalmente. *rincipio. las proteínas se unen específicamente a un li+ando inmo0ili(ado. mientras 2ue los componentes 2ue no se unan son separados mediante la0ado de la matri( con un amorti+uador. 5ado 2ue no todas las purificaciones son i+uales. El procedimiento in0olucra la adsorción de un e&tracto de proteína cruda en un soporte sólido con un li+ando conju+ado 6com<nmente llamado matri(8. en el caso de las proteínas de unión a metales. =a proteína unida es eluida con un buffer de elución. =a metodolo+ía de detección de la proteína de inter/s debería cumplir con dos criterios principalesA ser e&perimentalmente con0eniente. tales como el E5TA o EJTA 6A med "00)8. imprescindible contar un con una metodolo+ía adecuada para la determinación cuantitati0a de la presencia de esta. Cuando el e&tracto crudo pasa a tra0/s de la columna. esta fuente debe permitir obtener la proteína deseada en suficiente cantidad y calidad para estudios posteriores. mediante adición de un 2uelante de metales. 7in embar+o. Alternati0amente. ser específica para la acti0idad de inter/s 6 ttp 18. Al la0ar la columna. y el científico de separaciones se enfrenta con una +ran 0ariedad de t/cnicas disponibles para lo+rar su meta. el despla(amiento de la proteína unida puede ser lo+rado mediante cambio del pL o incrementando la fuer(a iónica del amorti+uador o. la mayoría de purificaciones pretenden lo+rar los mismos resultadosA • =iberación de la proteína blanco desde el material de inicio "" .s sencilla de reali(ar@ pero sobretodo.

10'A '0'. *ara ayudar a cumplir esta tarea el uso de t/cnicas computacionales contempor. sino 2ue tambi/n estos pasos deben estar enla(ados en una secuencia 2ue permita 2ue el producto de un paso alimente al si+uiente con ajuste mínimos. .  Jood NE y col. and c aracteri(ation.ioc emistry. U.#.ioc em. 1>D0. =a utili(ación de una apro&imación racional basada en la e&plotación de las propiedades fisico2uímicas fundamentales de las mol/culas proteicas lle0ar. C em. Anal .  A med L. &iblio#ra"ía  A med L X Jabius L#. *rinciples and reactions of protein e&traction. purification. "M'A1DM-$.. 1>D'. 1>MM. C3C press. #. "00). "$ . "$A)>1". .uffers for en(ymes.iol. *urification and properties of a Ca"O:independent sialic acid:bindin+ lectin from uman placenta Qit preferential affinity to %: acetylsialic acids. . a decisiones co erentes y optimi(adas. 1>D'. . Estados Bnidos  AraWaQa T.neas apoyadas por la computación simbólica a probado ser una erramienta e&tremadamente <til. ?et ods En(ymol. Esto es particularmente importante cuando un proceso 0a a ser escalado 63oe "0018. =eser y Ajenjo 61>>'8 se1alan 2ue el complejo problema de seleccionar una secuencia óptima para el proceso de purificación de proteínas a partir de me(clas complejas puede ser simplificado.  . Lydro+en ion buffers for biolo+ical researc . X Timas eff 7N. 1>D>. pero tambi/n para encontrar es2uemas de separación simples y óptimos en el laboratorio de in0esti+ación.ioc emistry. )A'M-. Estas t/cnicas son desarrolladas para la consecución de soluciones optimi(adas para aplicaciones de producción a +ran escala.lanc ard #7. ?ec anism of protein saltin+ in and saltin+ out by di0alent cation saltsA balance betQeen ydration and salt bindin+.  Ier+uson. Lydro+en ion buffers for biolo+ical researc .• • • • Eliminación de sólidos para dejar la proteína en un sobrenadante Eliminación de a+ua para concentrar la proteína Eliminación de contaminantes para lo+rar la pure(a deseada Estabili(ación de la proteína blanco Bn proceso de purificación bien dise1ado no debe solamente tener pasos optimi(ados para lo+rar los objeti0os mencionados. y col.. Ilorida. 10'A$00.

and applications. 7Qeden.eduTYjaQa+neTproteinsZXZpurification. in *rotein *urificationA *rinciples and practice. 3io de #aneiro. =aas T X =oQ 5. 1>>0. Lydrop obic c romato+rap y. tml[T e 0alue of protein purification. #o n Uiley X sons.E. NeQ \orW. *rotein purification tec ni2uesA A practical approac . Bppsala. "' . 1>D".  #anson #:C y 3yd/n =. C romatofocusin+A A neQ i+ resolution met od for protein fractionation. 1>>D.  Nennedy 3?. 1D"A$$>.  =eser E y Ajenjo A. Cornell Bni0ersity.iol..  * armacia Iine C emicals. 1>>'. 7prin+er: Herla+. separation and purification. *rotides .  7copes 3N. D>618A>>:10>. 7election of optimal tec ni2ues usin+ an e&pert system. *rotein reco0ery.  7oderber+ =. ttp1. Mem inst Oswaldo Cruz. ">A>)). Jreat . in C romatofocusin+ Qit *olybuffer and *. re0isada "0T0)T"010 ttpATTQQQ: users.med. "nd edition.  3oe 7. 7tudyin+ proteins and protein purification. "nd ed. Iluids.1>>$. Estados Bnidos de America. "001. 1>D0. %&ford Bni0ersity *ress. i+ resolution met ods.cornell.ritain. *rotein purificationA *rinciples. ?et ods En(ymol.