INTRODUCCIN.

La peroxidasa es una hemoproteina altamente especfica para el aceptor de hidrogeno,

que es el perxido de hidrogeno, pero es muy inespecfica en cuanto al substracto
donador que utiliza, que puede ser una de muchas sustancias, por ejemplo: fenoles,
aminofenoles, diaminas, indofenoles, leucocolorantes, ascorbato, e incluso ciertos
aminocidos como la tirosina.
La reaccin se puede describir de la siguiente manera:
Donador reducido + H202

peroxidasa

Donador oxidado + 2 H20

Esta enzima se encuentra en la mayora de las plantas y en ciertos microorganismos, pero

es escasa en tejidos animales. Se observa la actividad de peroxidasa en la leche
(lactoperoxidasa), en los leucocitos (leucoperoxidasa, o mieloperoxidasa), en la placenta.
Una de las formas ms activas es la peroxidasa del rbano.
El mecanismo de accin es sumamente parecido al que se propone para la catalasa, a
travs de la formacin de un complejo. Ms aun, en este caso son diversos los complejos
que se forman entre la enzima y el perxido del hidrogeno antes de que sea capaz de
reaccionar con el donador reducido.
La peroxidasa (E.C.1.11.1.7) que se obtiene del rbano tiene un peso molecular de 40,000,
mientras que la que se obtiene de la leche, tiene un peso molecular de 80,000.
La polifenol oxidasa, (EC.1.14.18.1), recibe muchos nombres debido a la gran diversidad
de substractos que emplea. Tcnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su
reaccin se puede describir de la siguiente manera:
2 o- Difenol + O2

polifenol oxidasa

2 o-quinona + 2 H20

Esta enzima puede llevar al cabo de la oxidacin directa aerobia de compuestos mono y
difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3,4-dimetilfenol, 4-t-butilfenol). De ah que reciba
tambin lo nombres de tirosinasa, fenolasa, cresolasa, etc. Tambin puede atacar a odifenoles y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular 120,000, con un centro de
cobre.
La polifenol oxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos de orden de mayor a
menor actividad: Acido clorognico, catecol, quercitina, pirogalol, cido cafeico, 3,4dihidroxifenilalanina, p-cresol, tirosina, esculetina, rutina, acido p-cumarico. Las quinonas
resultantes de la reaccin de polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y
polimerizndose, para dar compuestos finales que son muy complejos y son coloridos.
Esta es una de las enzimas responsables del oscurecimiento de ciertos alimentos como la
papa, la manzana, el aguacate, etc., al contacto con el oxgeno atmosfrico. En el caso de

la tirosina como substracto, el complejo resultante es la melanina o pigmento oscuro de la

piel y el cabello. En ese caso, la tirosina se oxida primero a dihidroxifenilalanina (DOPA),
que luego se cicliza y se oxida a Indol-5,6-quinona. Esta ltima polimeriza a melanina.
Es difcil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que
ambas pueden atacar a los mismos substractos. Sin embargo utilizando papa como fuente
de las enzimas, la accin de la peroxidasa es mucho ms rpida, cosa que puede permitir
la observacin de las dos acciones.

OBJETIVO.
Demostrar las dos actividades enzimticas, peroxidasa y polifenol oxidasa, a partir de un
extracto de papa.

MATERIALES Y MTODOS.

15 tubos de ensaye 13x100

2 vasos de precipitado de 250ml
4 pipetas de 5ml
3 pipetas de 1ml
Pinza para tubo de ensaye.
Gradilla.
Mortero.
Cuba.
Agitador de vidrio.
Mechero.
Tripie.
Tela de asbesto.
Una papa chica.
Una navaja o cuchillo.
Hielo.

Catecol al 1%
Pirogalol al 1%
Tirosina al 1%
Perxido de Hidrogeno al 3%
Cianuro de Sodio al 5%

1. Lo indicado en este punto debe hacerse lo ms rpidamente posible. Lave y pele

una papa chica. Crtela en pedacitos lo ms pequeos posibles y mulalos en un
mortero. (Puede en vez de moler, rayar la papa y obtener la pulpa). El mortero

debe estar sobre hielo, o la pulpa del rayador, recogerla sobre el mortero en hielo,
por lo dicho en el fundamento.
2. Coloque la papa molida o la pulpa molida rayada en un vaso de precipitado que
contenga 100ml de agua destilada y que haya estado varios minutos sumergido en
hielo. Deje reposar por 10 minutos, agitando ocasionalmente.
3. Filtre la mezcla a travs de un pauelo o tela de queso o gaza doble, a un vaso de
precipitado que este sumergido en hielo. Exprima el pauelo y descarte la pulpa al
cesto de basura.
4. Deje reposar el filtrado unos cinco minutos para que el almidn se asiente en el
fondo. Descarte el lquido para desechar el almidn y regrese el lquido al bao de
hielo. Este lquido filtrado es lo que llamaremos extracto de papa. Debe obtener
por lo menos 50ml.
5. En su gradilla prepare una serie de 13 tubos, numerados del 1 al 13.
6. Pipetee 0.5 ml de Catecol al 1% a los tubos 1, 2, 3, 4 y 11.
7. Pipetee 0.5 ml de pirogalol al 1% a los tubos 5, 6, 7, 8 y 12.
8. Pipetee 2.0 ml de Tirosina al 1% a los tubos 9 y 10.
9. Pipetee 0.5 ml de H202 al 3% a los tubos 2, 4, 6, 8, 10, 11 y 12.
10. Agregue 4 gotas de Cianuro de Sodio al 5% a los tubos 7 y 8.
11. Pipetee 5 ml de extracto de papa a dos tubos de ensaye extra y calintelos por 5
minutos en bao de agua hirviendo. El extracto resultante agrguelo a los tubos 3
y 4, despus de enfriarlos con agua corriente a la llave.
12. Pipetee 5 ml de agua destilada a los tubos 11 y 12.
13. Pipetee 5 ml del extracto de papa a los tubos 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 13
14. Mezcle el contenido de los tubos, djelos reposar a temperatura ambiente, y
observe los cambios de color a los 2, 5, 10 y 15 minutos.
15. Anote sus observaciones.

RESULTADOS.
2 min.

5 min.

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3
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5
6
7
8
9
10
11
12
13

Turbio con aro caf en lo alto.

Color caf muy oscuro.
Turbio claro viscoso.
Turbio claro viscoso.
Amarillo.
Caf.
Amarillo un poco oscuro.
Caf oscuro.
Color meln muy claro.
Color meln claro.
Incoloro.
Poca coloracin amarillenta-incolora.
Turbio blanquizco.

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2
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13

1
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6
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9
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11
12
13

10 min.
El anillo se fue asentando.
Caf muy oscuro-rojo.
Formacin de precipitado viscoso.
Formacin de precipitado viscoso.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Se form un precipitado blanco.
Se form un precipitado blanco.
Sin cambio.
Sin cambio.
Se form un pequeo precipitado.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Sin cambio.
Oscureci ms.
Lo turbio precipito.
Lo turbio precipito.
Sin cambio.
Aclaro un poco ms.
Se oscureci un poco ms.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.

15 min.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.
Sin cambio.

CONCLUSIONES.
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CUESTIONARIO.
1. Cules son los productos de la reaccin de la Peroxidasa dado que el substracto
fuera un Polifenol?
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2. Qu diferencia hay entre las enzimas Peroxidasa y Polifenol Oxidasa?
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3. Supuesto que los dos pueden venir en la misma fuente, Cmo podemos
distinguirlas?
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4. Cul es la razn de la diferencia de color con los diferentes substractos?
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5. Para qu se aade Perxido de Hidrogeno al vaso de reaccin?
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6. Qu efecto tiene en el hgado la accin conjunta de Peroxidasa y Catalasa, y qu
diferencia hay entre las dos enzimas?
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7. Por qu las manipulaciones para la preparacin del extracto de enzima se llaman

al cabo a bajas temperaturas?
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8. Por qu al estar trabajando con una enzima hay que evitar la formacin de
espuma, y como puede evitarse?
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INVESTIGACIN.
1. Qu son los peroxisomas?
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2. Qu es la peroxidacin lipdica y en qu nivel celular se realiza?
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3. Mencione cuales son las enzimas ms importantes que forman parte del sistema
antioxidante del humano y sobre que compuestos actan.
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4. Mencione al menos tres enfermedades asociadas al estrs oxidativo.
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5. Mencione qu importancia tiene la determinacin de la fosfatasa alcalina.
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BIBLIOGRAFA.
http://www.informacionconsumidor.com/Opinioacuten/ArticuloOpinion/tabid/72/ItemID/28/Def
ault.aspx
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003470.htm