ECOLOGIA MICROBIANA

- Estudio de los microorganismos en su ambiente natural -Ambiente es todo aquello que rodea a un organismo vivo. - Por ejemplo los factores qumicos, fsicos y biolgicos. - Los microorganismos (MOs) son parte de comunidades organizadas llamadas ecosistemas. - Los MOs interactan con el entorno y pueden cambiar en forma marcada las caractersticas del mismo. Desempean papeles importantes en la sntesis y degradacin de distintos compuestos.

MOs autotrficos: generan materia orgnica a partir de CO2 MOs organotrficos: participan en la biodegradacin y reciclado de materia orgnica. Se puede definir un ciclo biogeoqumico para los elementos clave (C, N, S, Fe) en el cual los mismos sufren distintos estados de xido reduccin a medida que se mueven a travs de un ecosistema. Los MOs participan en las reacciones biogeoqumicas. Para muchos elementos son los nicos capaces de generar los compuestos clave capaces de ser utilizados por otros organismos.

Biodiversidad de los MOs Eclogo microbiolgico Actividades metablicas y como interaccionan

Conocer aspectos cuali y cuantitativos de la microbiologa de un ecosistema

Da una idea del potencial biogeoqumico en un ecosistema

Conocer las actividades de los MOs en su ambiente natural - La existencia de MOs no implica que los mismos sean activos -Solo los MOs activos tienen impacto ecolgico. -Medir la existencia de una determinada transformacin bioqumica especfica implica que un grupo especfico de bacterias existe y que es metablicamente activo.

Clulas individuales

poblaciones

gremios

comunidades

Distintas poblaciones relacionadas metablicamente forman agrupaciones llamadas guilds o gremios. La interaccin de los gremios que llevan a cabo procesos fisiolgicos complementarios da lugar a la formacin de una comunidad bacteriana Las comunidades microbianas interactan con comunidades de macroorganismos para definir el ecosistema entero.

Luz Compuestos orgnicos Sustancias inorgnicas Luz organismos fototrficos, sntesis de materia orgnica que contiene C, N, S, P, Fe Muerte de los MOs y liberacin de energa de sus constituyentes qumicos orgnicos Materia orgnica organismos quimioorganotrficos (usan compuestos orgnicos como fuente de energa)
Sustancias inorgnicas reducidas

Energa

Ecosistema

organismos quimiolitotrficos
(organismos que obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos)

Comunidad microbiana en un ecosistema lacustre

En el lago tenemos tres comunidades microbianas

organismos fototrficos organismos quimioorganotrficos (aerobios y aerobios facultativos) organismos anaerobios

La ciencia de la microbiologa ecolgica tiene 2 objetivos: 1ro) el estudio de la biodiversidad de los MOs en la naturaleza y de cmo los diferentes gremios interactan en las comunidades microbianas. 2do) medir las actividades de los MOs en la naturaleza y monitorear sus efectos sobre los ecosistemas.

Hay muchos MOs que no se han descubierto an. La medicin de las actividades microbianas en la naturaleza permite conocer el funcionamiento metablico de las comunidades microbianas an si conocemos poco a cerca de los organismos que las componen

LOS MICROORGANISMOS EN LA NATURALEZA - Cualquier hbitat adecuado para el crecimiento de organismos superiores puede tambin soportar el crecimiento de MOs. La inversa no es vlida. -Los MOs pueden habitar la superficie de animales superiores y en algunos casos pueden vivir dentro de plantas y animales. En tales hbitat alcanzan grandes nmeros y pueden ser beneficiosos para las plantas o animales o ser patgenos de sus respectivos hospedadores. LOS MICROORGANISMOS Y EL MEDIO AMBIENTE El crecimiento de los MOs en la naturaleza depende de Los recursos nutricionales Las condiciones de crecimiento

- El nicho de un organismo en particular est definido por los recursos nutricionales, la cantidad de los mismos, el pH, la temperatura, la disponibilidad de agua, luz y oxgeno de su hbitat.

-Cada organismo tiene un nicho primario o principal en el cual dicho organismo es el mas exitoso. - En la tierra existe un nmero innumerable de nichos microbianos siendo stos en parte los responsables de la gran diversidad metablica y de la biodiversidad de los MOs que tenemos en la actualidad. - El hbitat de un MO es pequeo (est en relacin al tamao de los MOs), pero pueden existir gradientes qumicos y fsicos en dicho hbitat que afecten a los MOs.

MICROAMBIENTE Es donde el MO vive y metaboliza dentro de un hbitat. Perfil de las concentraciones de O2 en una partcula de suelo
En una partcula de suelo de 6 mm pueden existir varios microambientes diferentes, tanto fsicos como qumicos y pueden coexistir distintos tipos fisiolgicos de MOs. Los MOs anaerobios podran ser activos en el centro de la partcula de tierra, los microaerfilos podran ser activos mas afuera y los aerobios obligados podran metabolizar en los 0,2 a 0,3 mm externos de la partcula Las condiciones fisicoqumicas en el microambiente pueden cambiar rpidamente en funcin del tiempo y del espacio. La respiracin de los MOs o el incremento de agua en el suelo pueden cambiar drsticamente el gradiente de O2 a travs del micro medioambiente.

Conclusiones: Los microambientes son

heterogneos. Las condiciones pueden cambiar drsticamente. Una gran diversidad microbiana puede existir en un rea fsica relativamente pequea.

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NIVELES DE NUTRICIN Y VELOCIDAD DE CRECIMIENTO

- Los nutrientes entran al ecosistema en forma intermitente. A perodos de gran abundancia le siguen perodos de escasez. - Los MOs han diseado mecanismos de defensa que les permiten acumular y almacenar materiales de reserva en forma de polmeros. Por ej. Poli-betahidroxibutirato, alcanoatos, polisacridos (glucgeno), polifosfatos, azufre elemental, etc. - La velocidad de crecimiento de los MOs en la naturaleza no es la ptima o la velocidad mxima que se da en el laboratorio. Las bacterias del suelo tienen una velocidad de crecimiento de aproximadamente 1% de la velocidad mxima de crecimiento obtenida en el laboratorio. Hbitat Escherichia coli en el intestino en el laboratorio Tiempo de duplicacin 12 horas 20 minutos

La disminucin de la velocidad de crecimiento en la naturaleza se debe a: a) Baja disponibilidad de nutrientes b) Distribucin no uniforme de los nutrientes en el hbitat c) Efectos competitivos con otros MOs.

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SUSTANCIAS DE RESERVA
(a) Estructura qumica del poli--hidroxibutirato (PHB); (b) Microfotografa electrnica del bacilo fototrfico Rhodospirillum sodomense.

Microfotografa de campo claro del bacilo prpura del azufre Chromatium buderi.

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COMPETENCIA Y COOPERACIN MICROBIANA

La competencia por los recursos disponibles en la naturaleza es muy intensa y el resultado depende de: a) La tasa de incorporacin de los nutrientes b) Las tasas metablicas inherentes a cada MO c) La velocidad de crecimiento - En algunos casos de competencia microbiana, un MO puede inhibir el crecimiento de otros, por ej. con la produccin de antibiticos o de productos txicos (Ej. el cido producido por la fermentacin de azcares). - En algunos casos los MOs colaboran para llevar a cabo una transformacin determinada que ninguno de ellos puede llevar a cabo por si solos. Esto se llama sintrofa. Los organismos que participan deben convivir en un mismo microambiente ya que el producto del metabolismo de uno de ellos debe ser de fcil acceso para el otro. Estas interacciones son cruciales para el xito competitivo de algunas bacterias anaerbicas. Otro ejemplo de relaciones cooperativas son por ej. el metabolismo complementario entre las bacterias nitrosificantes y las nitrificantes para oxidar el amonaco a nitrato. Otro ej. son las bacterias reductoras de sulfato y oxidantes de sulfuro.

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Sintrofa: proceso por el cual dos o mas MOs cooperan en la degradacin de una sustancia que no pueden degradar por s solos. En la mayora de los casos, en la reaccin sintrfica interviene el H2, que es producido por un miembro de la relacin sintrfica y consumido por el otro. Por este motivo la sintrofa es conocida tambin como transferencia interespecfica de H2. El organismo que consume el H2 puede ser por ej. bacterias sulfato reductoras, homoacetgenos, metangenos, bacterias desnitrificantes, etc. Las reacciones sintrficas son caractersticas de transformaciones anaerbicas y se dan en hbitat anxicos.

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Fermentacin de etanol a metano y acetato por la accin sintrfica de una bacteria que oxida el etanol y una bacteria que consume el H2 producido por la primera.

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SUPERFICIES Y BIOFILMS -Las superficies absorben nutrientes -Son hbitats microbianos importantes -La concentracin de los nutrientes es muy superior en las superficies respecto a la del medio que la rodea -La tasa metablica y de crecimiento de los MOs aumenta mucho en las superficies -La concentracin de MOs que crecen en las superficies suelen ser mucho mayores que las que se encuentran en el medio lquido

Existen tcnicas sencillas de tincin de poblaciones microbianas adheridas a una superficie slida para medir la velocidad de crecimiento de MOs, por ej. La tincin con naranja de acridina y posterior observacin por microfotografa fluorescente La superficie de adherencia puede ser tambin un nutriente o materia orgnica o inorgnica que los MOs adheridos catabolizan directamente de la superficie de la partcula

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SUPERFICIES Y BIOFILMS MOSTRANDO MICROCOLONIAS BACTERIANAS

Microfotografa fluorescente de una comunidad microbiana natural colonizando races de plantas en el suelo. Obsrvese el desarrollo de la microcolonia. La preparacin se ha teido con naranja de acridina Microcolonias bacterianas desarrollndose sobre un portaobjetos inmerso en agua de un arroyo. Las partculas brillantes son materia mineral. Las clulas cortas de forma bacilar miden unos 3 m de largo.

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COLONIZACIN -La mayor parte de los MOs crecen sobre superficies adheridos por medio de polisacridos bacterianos, secretados por las mismas bacterias. -Los biofilms atrapan nutrientes y en medios fluidos impiden que los MOs se desprendan -Los biofilms tienen importancia en medicina y en las industrias -Las bacterias contenidas en biofilms pueden escapar al ataque del sistema inmunitario de los organismos -Los implantes mdicos pueden convertirse en el lugar de desarrollo de biofilms que pueden contener MOs patgenos -La placa dental es un biofilm tpico que contiene bacterias productoras de cido lctico que es el causante de las caries dentales -En las industrias los biofilms pueden causar el entorpecimiento del flujo de agua o de petrleo en los oleoductos -Los biofilms pueden contribuir a la degradacin de objetos sumergidos, plataformas petroleras, barcos, instalaciones en la costa, etc.

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LOS DIENTES Y LA PLACA DENTAL

-El diente est compuesto por una matriz de cristales de fosfato de calcio (esmalte) y tejido vivo del diente (dentina y pulpa) -El diente influye en la naturaleza de la flora microbiana (microbiota) -En el 1er ao de vida predominan en la boca las bacterias anaerbicas aerotolerantes as como estreptococos y lactobacilos. -Al aparecer los dientes hay un cambio marcado de la microflora hacia los MOs anaerbicos. Aparecen bacterias adaptadas especficamente al crecimiento sobre las superficies y hendiduras de los dientes

Colonizacin bacteriana
1-Formacin de una pelcula fina de glicoprotenas cidas de la saliva sobre el diente 2-Anclaje firme de clulas bacterianas. La colonizacin de sta pelcula por crecimiento en forma de microcolonias es muy especfica y se llama placa dental.

Caries dentales
Es el resultado del aumento de la placa dental y de la formacin de productos cidos, como el cido lctico producido por la fermentacin de los azcares, que provoca la descalcificacin del diente.

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Una vez que ha comenzado la rotura del tejido duro, tiene lugar la protelisis de la matriz del esmalte dentario bajo la accin de las enzimas proteolticas liberadas por las bacterias. El flor en la matriz del cristal de fosfato de calcio hace que la matriz sea mas resistente a la descalcificacin por el cido. Se han implicado dos MOs en las caries dentales. Streptococus sobrinus y Streptococus mutants. Ambas bacteria son productoras de cido lctico. S. sobrinus tiene una gran afinidad especfica por las glicoprotenas de la saliva y se adhiere firmemente a las superficies lisas del diente colonizndolo. S. mutants se encuentra principalmente en la hendiduras y fisuras pequeas y su capacidad para fijarse a ambas superficies es el resultado de la produccin de un polisacrido de dextrano que es extraordinariamente adhesivo. S mutants produce dextrano nicamente cuando existe sacarosa, mediante la enzima dextransacaridasa. n sacarosa (glucosa)n + n fructosa dextrano Distribucin de la placa dentaria utilizando un agente de revelado en un diente cepillado (arriba) y sin cepillar (abajo). Los nmeros expresan el rea total de la placa dentaria al da 1 (1436 mm2) y al da 10 (22522 mm2).

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Microcolonias bacterianas que crecen sobre una superficie dentaria artificial insertada en una boca durante (a) 6 hs ; (b) a mayor aumento la misma preparacin que se muestra en (a).

Obsrvese la diferencia morfolgica de los organismos presentes y el material viscoso, indicado con flechas, que sujetan a los microorganismos.

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METODOS EN ECOLOGIA MICROBIANA Interesan dos aspectos en la ecologa microbiana 1) La biodiversidad, es decir qu MOs y en qu nmero se encuentran en un determinado hbitat. 2) La actividad microbiolgica, o sea como afecta la presencia de un determinado MO al ecosistema. Esto se puede llevar a cabo realizando las siguientes actividades: Anlisis de las comunidades microbianas dependientes de cultivos. Anlisis molecular de las comunidades microbianas. Medicin de las actividades microbianas en la naturaleza.

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Anlisis dependientes de cultivos: enriquecimiento y aislamiento. - En la naturaleza los microbios existen en cultivos mezclados llamados comunidades microbianas. - Para aislar y estudiar un organismo particular los microbilogos utilizan tcnicas de enriquecimiento. - Se usan medios y condiciones de incubacin que seleccionan a un organismo particular y contra-seleccionan a los organismos no deseados.
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Ejemplo: el mtodo de Beijerinck Martinus (microbilogo holands) a quien se deben las primeras tcnicas de cultivo de enriquecimiento para aislar la bacteria fijadora de nitrgeno Azotobacter.
Azotobacter puede crecer rpidamente fijando N2 del aire, los medios de enriquecimiento carentes de amonaco u otras formas de nitrgeno fijado son muy selectivos para este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrgeno o las bacterias fijadoras de nitrgeno anaerbicas son contra-seleccionadas con este mtodo.

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Aislamiento de Azotobacter

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ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO. La columna de Winogradsky: . Se usa para aislar y enriquecer en bacterias fototrficas prpuras y verdes, bacterias reductoras de sulfato, y muchos otros anaerbios. . Es un sistema anxico en miniatura. . Se prepara llenando aproximadamente por la mitad un cilindro de vidrio grande con un lodo rico en materia orgnica. . El lodo es cubierto con agua de un lago, embalse o acequia y se tapa. . Se coloca cerca de una ventana donde recibe luz solar atenuada y se deja varias semanas.

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Columna de Winogradsky
Agua de pozo o lago

Lodo suplementado con nutrientes orgnicos y sulfato de calcio y carbonato de calcio

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Se desarrolla una mezcla de organismos - Cianobacterias y algas en el tope (zona oxignica). - Proceso de descomposicin en el lodo o sedimento produce productos adecuados como cidos orgnicos, alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias reductoras de sulfato. - El sulfuro producido a partir del sulfato gatilla el desarrollo de las bacterias verdes o prpuras del azufre. Se toman muestras de la columna a profundidad para obtener muestras de cultivos anaerbicos. - La columna de Winogradsky se ha usado para enriquecer diversos procariotas, tanto aerobios como anaerobios. Una vez que se ha establecido un enriquecimiento, se puede intentar obtener cultivos axnicos.

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SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO En el laboratorio, el organismo que est mejor adaptado a las condiciones in vivo podra crecer mas rpido y convertirse en el organismo dominante. Tpicamente, el organismo ms apto in vivo es solo un componente minoritario del ecosistema. La solucin es la dilucin del inculo. Se cree que la dilucin elimina aquellas poblaciones minoritarias, pero de crecimiento rpido dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad que tienen tiempos de duplicacin mayores. La dilucin del inculo es una prctica comn en el cultivo de enriquecimiento en la microbiologa actual.

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AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS O AXNICOS.

Los cultivos axnicos se pueden obtener a partir de cultivos de enriquecimiento de varias maneras; los mtodos ms frecuentes son: a) la siembra por estra en superficie (caja de Petri), b) la siembra en profundidad (agar shake) y c) la dilucin en lquido. -Siembra por estra en superficie. Para aquellos MOs que crecen bien en medio slido, este es el mtodo de eleccin. A partir de una poblacin mixta se obtienen al estriarla en superficie de agar colonias aisladas. Repitiendo con cada una de las colonias aisladas este procedimiento se consigue un cultivo axnico que puede ser transferido a un medio lquido. -Siembra en profundidad o agar-shake La dilucin de un cultivo mixto en agar fundido da lugar a colonias embebidas en el agar. Este mtodo es til para purificar anaerbios. Se hacen diluciones sucesivas seriadas para obtener cultivos puros.

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Mtodos de cultivo axnico

Jarra anxica. Una reaccin qumica producida por el contenido del sobre en el interior de la jarra genera H2 + CO2. El H2 reacciona con el O2 presente en la jarra sobre la superficie de un catalizador de paladio para formar H2O2. La atmsfera final contiene N2, H2 y CO2.

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AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS. El nmero ms probable. - Dilucin serial de un inculo en medio lquido hasta que el tubo final en la serie no muestre crecimiento. - Conocida como la tcnica del nmero ms probable (NMP). -Se usa para estimar el nmero de microorganismos en alimentos, aguas residuales y otro tipo de muestras donde el nmero necesita ser asignado en forma rutinaria.
Utilizando diluciones seriadas de 10 en 10, el ltimo tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 clulas o menos. Si se repite este proceso varias veces se obtiene cultivos puros. Se pueden usan medios altamente selectivos y condiciones de incubacin dirigidos a uno o a un pequeo grupo de organismos, como por ej. un determinado patgeno, o medios complejos para obtener una estimacin del nmero total de clulas.

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Procedimiento de enriquecimiento por dilucin de extincin o anlisis del nmero mas probable NMP

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- El ltimo tubo que muestra crecimiento (en el ej. Es la dilucin 10-5) debe haberse desarrollado a partir de 10 clulas o menos. - Para obtener cultivos axnicos se utiliza como inculo la mayor dilucin que muestra crecimiento y se repite el procedimiento. - Para una estimacin del nmero de un tipo determinado de bacteria en una muestra, el NMP se define como la dilucin ms elevada que muestra crecimiento. Si el medio utilizado fuera muy selectivo, por ejemplo para bacterias reductoras de sulfato, se podra concluir que para el caso mostrado en la figura hay entre 105 y 106 clulas recuperables de ese organismo por gramo de muestra. Se hacen rplicas para mayor exactitud y un blanco de dilucin.

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CULTIVOS AXNICOS DE ALTA TECNOLOGA: Las pinzas lser - Las pinzas de lser consisten de un microscopio ptico invertido equipado con un lser infrarrojo enfocado con precisin y un instrumento de micromanipulacin. - Una clula individual del campo de visin es atrapada por el haz de rayos lser y separada del resto de los microorganismos contaminantes. - Es un mtodo til para aislar bacterias de crecimiento lento que pueden ser superadas por el crecimiento rpido de otras poblaciones en los cultivos de enriquecimiento tpicos o para organismos presentes en bajo nmero.

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Pinzas de lser para el aislamiento de bacterias.

(a) Principio de las pinzas pticas. Un haz de rayos lser fuertemente enfocado sobre un objeto tan pequeo como una clula bacteriana, crea fuerzas de radiacin descendentes (Fa, Fb) sobre la clula, que permiten su desplazamiento en cualquier direccin mientras est sometida a la fuerza del haz de rayos lser. (b) Aislamiento. El haz de rayos lser puede enfocarse sobre una clula individual presente en la mezcla de un tubo capilar, atraparla ptimamente y separarla. Una vez separada lo suficiente de las otras, el capilar se corta, se desconecta el lser y la clula se coloca en un medio de cultivo estril.

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ANLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS. Viabilidad y cuantificacin mediante tcnicas de tincin. - El colorante fluorescente DAPI (4,6-diamido-2fenilindol) se usa con frecuencia para teir microorganismos en hbitat opacos. - Clulas teidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fciles de ver y contar. - Tincin con DAPI es ampliamente usada para la enumeracin de microorganismos en el ambiente, en alimentos y en muestras clnicas. - Para muestras acuticas las clulas pueden ser teidas sobre la superficie de un filtro, despus que la muestra lquida ha sido pasada a travs del mismo.

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Clulas de Escherichia coli despus de haber sido teidas con DAPI (4,6-diamido-2-fenilindol)

DAPI es un colorante fluorescente inespecfico que tie cidos nucleicos y no suele reaccionar con la materia inerte. DAPI es una forma razonable de estimar el nmero de clulas presentes en una muestra. Ventaja: es una tcnica sencilla, no es especfica (tie todos los MOs de una muestra. Desventaja: No diferencia entre clulas vivas y muertas, ni permite el rastreo de organismos especficos en el ambiente.

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TINCIN DE VIABLES - Hay mtodos de tincin fluorescentes que permiten distinguir entre clulas vivas y muertas. - Basadas sobre la integridad de la membrana citoplasmtica (MC). A la muestra se aaden dos colorantes (verde y rojo). - El colorante verde penetra todas las clulas. - El colorante rojo penetra en las clulas donde la MC no est intacta (por ejemplo clulas muertas). - Mtodo no adecuado para examinar microscpicamente muestras naturales debido al teido inespecfico de los materiales inertes. Se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio (muestras clnicas, del ambiente y de alimentos).

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Tincin de clulas viables

Clulas vivas (verdes) y clulas muertas (rojas) de Micrococcus luteus (cocos) y Bacillus cereus (bacilos) teidas por el mtodo de tincin Live/Dead (vivas/muertas) Bac Light TM de viabilidad bacteriana. El colorante verde penetra en todas las clulas, viables o no, mientras que el rojo, penetra solo en aquellas clulas cuya membrana est daada (clulas muertas). Este mtodo da una evaluacin instantnea de la viabilidad. Se utiliza en cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el examen de muestras naturales debido a problemas de tincin inespecfica con los materiales inertes

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ANTICUERPOS FLUORESCENTES - Explota la especificidad de anticuerpos contra los constituyentes de superficie de un organismo particular. - Se usa para la identificacin o seguimiento de organismos en hbitat complejos con muchos microorganismos, tales como suelos o muestras clnicas que contengan una mezcla de muchos organismos. - Requiere de la preparacin de anticuerpos especficos contra el microorganismo de inters lo cual es largo y laborioso. - Anticuerpos relevantes clnicamente son disponibles comercialmente.

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Anticuerpos fluorescentes.

Mediante la tcnica de anticuerpos fluorescentes se observan microcolonias bacterianas (las clulas aparecen como puntos verde-amarillentos) y la arquea hipertermfila Sulfolobus acidocaldarius en la superficie de partculas del suelo de una solfatara. Las clulas miden alrededor de 1m de dimetro.

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Mtodos de utilizacin de anticuerpos florescentes para detectar antgenos de la superficie microbiana

(a) Preparacin de anticuerpo fluorescente por acoplamiento del colorante fluorescente, el isotiocianato de fluorescena, con una molcula de anticuerpo (Ac).

(b) Reacciones con anticuerpos fluorescentes. Clulas de Clostridium septicum con un Ac conjugado con isotiocianato de fluorescena que da fluorescencia amarilla verdosa y clulas de Clostridium chauvei teidas con Ac conjugado con rodamina B, que da fluorescencia roja.

Parte superior del panel: Mtodo de tincin directa Parte inferior del panel: Mtodo de tincin indirecta

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Protena fluorescente verde para el etiquetado celular

Las clulas bacterianas pueden ser alteradas mediante tcnicas de ingeniera gentica para volverlas fluorescentes. Se puede insertar en su genoma el gen que codifica por la protena verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein). Al expresarse, las clulas que contienen la GFP aparecen color verde cuando se observan con un microscopio de luz ultravioleta. Las clulas etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las races de las plantas, y seguir con el microscopio la clula etiquetada. Aunque ste mtodo no resulta til para medir poblaciones naturales, las clulas etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las races de las plantas. Con ste mtodo, los eclogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida, o evaluar el efecto de la perturbacin en el ambiente. La GFP tambin se puede utilizar como un gen indicador reporter fusionado a un opern para estudiar la regulacin de la transcripcin de distintos promotores por medicin de la fluorescencia.

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Clulas modificadas por ingeniera gentica que expresan la GFP (green fluorescent protein).
Clulas de Pseudomonas fluorescens modificadas por ingeniera gentica con la GFP observadas por microscopa lser confocal. Las clulas estn adheridas a races de cebada y presentan fluorescencia de color verde. Las clulas teidas de azul son parte de la biota normal de las races de cebada y se han teido con el colorante inespecfico DAPI.

El uso de GFP permite rastrear las clulas introducidas en el ambiente.

Este mtodo no es un mtodo de tincin sino que es un mtodo de etiquetado molecular.

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Limitaciones de la microscopa

La microscopa es una tcnica importante para la enumeracin e identificacin de MOs en muestras naturales pero no es suficiente para el estudio de los mismos. Procariotas pequeos pasan inadvertidos si la muestra natural contiene mucha materia orgnica o elevados nmeros de clulas grandes. Es difcil diferenciar entre clulas vivas y muertas y la materia inerte. Imposibilidad de evaluar la diversidad gentica de los MOs en un hbitat natural. Clulas muy similares morfolgicamente pueden ser genticamente muy distintas y por lo tanto desempear funciones diferentes en un ecosistema. Los estudios de microscopa en el rea de la ecologa microbiana deben complementarse con mtodos de cultivo o moleculares, preferiblemente de ambos si se quiere entender bien la ecologia de un ecosistema microbiano.

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Morfologa y diversidad gentica

Dos fotos de un mismo campo de clulas. a) microscopa de contraste de fases. b) tincin filogentica. Aunque las clulas ovaladas grandes tienen una morfologa y tamao poco corrientes en procariotas (2,25 um de dimetro), y parecen similares por microscopa de contraste de fases, la tincin filogtica revela que son dos tipos distintos genticamente.

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TINCIONES GENTICAS - La sonda de cido nucleico es un oligonucletido de DNA o RNA complementario a un gen diana. -Las sondas de cidos nucleicos son un instrumento poderoso para identificar y cuantificar microorganismos en la naturaleza. -La tcnica de hibridizacin florescente in situ (FISH, fluorescent in situ hybridization) usa sondas de DNA o RNA fluorescentes para identificar organismos que contienen una secuencia de cido nucleico que es complementaria a la sonda. - La tcnica de FISH es una herramienta muy comn en ecologa microbiana y permite la identificacin rpida de organismos patgenos especficos en la industria alimenticia y en el diagnstico clnico.

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Tincin filogentica con FISH

- Los colorantes filogenticos son oligonucletidos
fluorescentes complementarios en la secuencia de bases a las secuencias signatura en el rRNA 16S (en procariotas) o 18S (en eucariotas). -Los colorantes filogenticos penetran en la clula, donde hibridan con el RNA ribosmico directamente en los ribosomas. -Se han identificado sondas filogenticas signatura para especies microbianas individuales, as como para dominios enteros de organismos. -El grado de especificidad de un colorante filogentico puede controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada al colorante. FISH permite identificar o rastrear un organismo particular , o un grupo de organismos relacionados, dependiendo de la especificidad de la sonda.

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Identificacin de microorganismos en ambientes naturales por mtodos de sonda de cidos nucleicos

(a) Microfotografas de clulas hibridizadas con sondas complementarias a secuencias especficas en el 16S rRNA de Bacteria (izquierda) y de el 18S rRNA de Eukarya (derecha)

(b)

Sondas de RNA ribosomal marcadas fluorescentemente. Izquierda: microfotografa de contraste de fases de B. megaterium y la levadura Saccharomyces cerevisiae (no hay probes presentes. Centro: el mismo campo, clulas teidas con la probe de rRNA universal. Derecha: el mismo campo, clulas teidas con la sonda para eukarya (slo las clulas de S. cereviciae reaccionan).

(c)

Diferenciacin de bacterias Gram-negativas estrechamente relacionadas. Izquierda: microfotografa de una mezcla de Proteus vulgaris y de una bacteria relacionada aislada de avispas. Centro: el mismo campo con una sonda bacterial. Derecha: probe especfica para las bacterias aisladas de avispa.

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Estudio de muestras naturales mediante sondas filogenticas multiples por FISH

a) Bacterias nitrificantes en muestra de aguas residuales. En rojo bacterias oxidadoras de amonaco, en verde bacterias oxidadoras de nitritos. b) Micrografa laser confocal de rastreo de una muestra de fango de aguas residuales. La muestra fue tratada con tres sondas filogenticas distintas.

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TINCIONES GENTICAS Tcnicas de FISH: a) Tincin de cromosomas: - Comienza con el marcado fluorescente de una sonda de oligonucletidos o del gen completo, de un conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido, para obtener sondas pequeas. - Las sondas se utilizan para averiguar qu organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o los genes presentes en la sonda(s). - La tincin de cromosomas es til para identificar bacterias que contienen genes especficos, como los que codifican para la nitrogenasa, responsable de la fijacin de N2, los componentes del centro de reaccin fotosinttico, o vas autotrficas especficas. - Los nmeros de clulas fluorescentes en cada caso darn una estimacin de las bacterias fijadoras de N2, fottrofas o auttrofas, respectivamente, en una muestra natural.
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b) Transcripcin inversa in situ (in situ reverse transcription, FISH-ISRT). - Usada para determinar si un organismo est expresando un gen o genes particulares en la naturaleza, a un tiempo dado. - Involucra el uso de una sonda que hibridiza con un mRNA. - Permite a los cientficos explorar los factores que controlan la expresin del gen en poblaciones naturales.

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Tcnicas de fluorescencia que emplean tincin de cromosomas bacterianos y transcripcin inversa in situ.

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PCR: relacionando genes especficos con organismos especficos.

Muchos estudios en ecologa no necesitan aislar los organismos, ni siquiera identificarlos por microscopa con tinciones especficas. A menudo el objetivo del estudio es evaluar la biodiversidad de un hbitat sin emplear tcnicas de cultivo, ni observar clulas. Con este objetivo se han aislado y caracterizado genes especficos como medida de la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes especficos estn ligados frecuentemente a organismos especficos, la deteccin del gen implica la presencia del organismo. Las principales tcnicas en este tipo de anlisis de comunidades microbianas son la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE), la clonacin molecular y la secuenciacin y el anlisis del DNA.

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PCR. La reaccin en cadena de la polimerasa llamada PCR puede multiplicar molculas de DNA hasta miles de millones de veces proporcionando grandes cantidades de genes para su clonacin, secuenciacin o mutagnesis. La tcnica de PCR hace uso de la DNA polimerasa. Se requiere que se conozca la secuencia nucleotdica de una regin del gen deseado para poder disear oligonucletidos iniciadores cortos o primers, complementarios de secuencias presentes en el gen o genes de inters. Las etapas de amplificacin son las siguientes: 1- En un sintetizador de nucletidos se fabrican los dos oligonucletidos iniciadores que flanquean al gen diana, y se aaden en un gran exceso al gen diana desnaturalizado por calor. 2- Cuando se ha enfriado la mezcla, el exceso de iniciadores relativos al DNA diana asegura que la mayor parte de las cadenas diana hibriden con iniciadores y no entre s. 3- La DNA polimerasa alarga los iniciadores usando las bandas diana como moldes. 4- Despus de un perodo de incubacin adecuado, se calienta de nuevo la mezcla para separar las cadenas. Luego se enfra la mezcla para permitir que los iniciadores se hibriden con las regiones complementarias del DNA recin sintetizado, y se repite el proceso.

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Anlisis de la comunidad microbiana.

Para el anlisis de comunidades microbianas un gen diana que se amplifica frecuentemente es el que codifica el RNA ribosmico 16S (rRNA 16S). De esta manera, el anlisis de la secuencia de genes de rRNA 16S amplificados a partir de una comunidad microbiana puede ofrecer una imagen filogentica de esa comunidad. Alternativamente tambin se pueden usar como dianas los genes metablicos que codifican protenas particulares del metabolismo de un organismo especfico (o de un grupo de organismos relacionados). El imprescindible que el diseo de los cebadores tenga una especificidad elevada. Si la fuente de DNA es una muestra natural , el diseo de los cebadores es crtico para que los resultados no sean ambiguos y difciles de interpretar. Se dispone de reactivos comerciales (kits) para obtener el DNA puro, sin restos de sustancias que pueden interferir con la PCR. El DNA obtenido es una mezcla del DNA genmico de todos los microorganismos presentes originalmente en el hbitat. La tarea de la PCR es capturar el o los genes diana que interesan en la mezcla y hacer las copias suficientes para anlisis posteriores. El producto de la PCR es corrido en un gel donde se obtienen bandas de los genes diana amplificados

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Pasos en el anlisis de una comunidad microbiana mediante sondas filogenticas.

(a) Se utiliza el DNA total de la comunidad

para amplificar los genes del rRNA 16S utilizando cebadores (primers) universales conservados para los microorganismos del dominio Bacteria. Las bandas producidas por la PCR se cortan y los diferentes genes rRNA 16S se separan o por clonacin o por DGGE (electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) y se secuencian. A partir de las secuencias obtenidas se construye un rbol filogentico.

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Anlisis por PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y DGGE (electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente) coordinados.
Por la divergencia evolutiva del gen diana elegido en las diferentes especies, la banda obtenida en el gel (a) puede estar compuesta de varios genes diana, los cuales difieren en la secuencia de nucletidos entre los lugares de unin de los cebadores escogidos. Para el anlisis filogentico de las secuencias de los genes amplificados , se necesita un paso extra para distinguir las diferentes formas del gen antes de iniciar la secuenciacin. Un mtodo es mediante la clonacin molecular y la otra posibilidad es la electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (b). La DGGE es un mtodo de electroforesis que separa los genes del mismo tamao que difieren en la secuencia de bases. La tcnica utiliza un gradiente de urea y formamida que desnaturaliza el DNA. Un fragmento de DNA bicatenario se desplaza por el gel y cuando llega a una determinada concentracin desnaturalizante las cadenas de DNA se separan y el desplazamiento se interrumpe.

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Las bandas individuales obtenidas por DGGE se pueden cortar y secuenciar. Usando como gen diana el rRNA 16S, el anlisis por DGGE proporciona una visin detallada del nmero de filotipos (genes rRNA 16S distintivos) presentes en el hbitat. Secuenciando estas bandas , es posible determinar las especies presentes en la comunidad por comparacin con las secuencias de las especies conocidas disponibles a partir de bases de datos apropiadas. Con otros genes (por ejemplo, genes metablicos) se obtiene informacin acerca del nmero de tipos diferentes de organismos presentes en la comunidad que contiene el gen especfico. El anlisis por DGGE revela la biocomplejidad de un hbitat con respecto a un gen especifico. El anlisis filogentico por PCR de las comunidades microbianas ha dado resultados sorprendentes. Con el rRNA 16S como diana, se ha comprobado que la mayora de las comunidades microbianas contienen varios organismos filogenticamente distintos, cuyas secuencias de RNA ribosmico no se emparejan con ninguno de los cultivos de laboratorio. Hay que sealar que en muchos casos los miembros ms abundantes de las comunidades microbianas son especies que hasta ahora no han podido ser cultivadas en el laboratorio. Este problema indica que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir de los cultivos de enriquecimiento es todava muy incompleto y que el enriquecimiento presenta sesgos, lo cual supone un serio problema para los estudios de biodiversidad.

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Medicin de la actividad microbiana en la naturaleza

La actividad microbiana in situ se puede medir mediante la utilizacin de: (1) Radioistopos (2) Microelectrodos (3) Istopos estables Los anlisis usando radioistopos son: Muy sensibles y muy especficos para medir procesos qumicos Usan tiempos cortos de incubacin Las mediciones obtenidas son mas representativas de las muestras como existen en la naturaleza Hay que hacer control con clulas muertas para verificar que ocurre un proceso bioqumico y no una transformacin qumica

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Medida de la actividad microbiana en la naturaleza a) Anlisis qumico para lactato y H2S durante la reduccin de sulfato. b) Uso de radioistopos: fotosntesis medida en un ambiente natural de agua de mar con 14CO2 c) Reduccin de sulfato en un lodo medido con 35SO42d) Produccin de 14CO2 de 14C-glucosa.

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Esquema de un microelectrodo de oxgeno

MICROELECTRODOS - Electrodos de vidrio muy finos que miden pH, oxgeno, N2O, CO2, H2 o H2S. - Usado para el estudio de transformaciones qumicas y fotosntesis en tapetes microbianos. - Los tapetes microbianos son comunidades microbianas estratificadas conteniendo usualmente cianobacteria en las capas superiores, bacterias fototrficas anoxignicas en las capas subsiguientes y bacterias quemoorganotrofas en las capas inferiores. - Los tapetes microbianos son encontrados a menudo en las zonas intermareales y junto a fuentes termales.

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Tapetes microbianos y el uso de microelectrodos para su estudio. b) microperfiles de pH, sulfhdrico y oxgeno en un tapete microbiano de una fuente termal.

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ISTOPOS ESTABLES Muchos elementos qumicos tienen diferentes istopos, que difieren en el nmero de neutrones. Algunos son inestables y se degradan liberando radioactividad y otros son estables. - Los istopos estables no son radioactivos y se utilizan para el estudio de diversas transformaciones microbianas en la naturaleza. - Los elementos mas comnmente usados para estudios con istopos estables en la ecologa microbiana son el carbono y el azufre. - En la naturaleza, el carbono se encuentra principalmente como 12C, y en pequea cantidad (alrededor del 5%) como 13C. Lo mismo sucede con el azufre, cuya forma principal es el 32S, pero que tambin se encuentra en menor cantidad como 34S. - Las reacciones bioqumicas tienden a favorecer el istopo ms liviano, los mas pesados son discriminados negativamente.

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ISTOPOS ESTABLES -Fraccionamiento isotpico: las molcula producidas bioqumicamente son mas livianas que los compuestos producidos geoqumicamente. - Cuando el CO2 es atrapado por un organismo fototrfico, el carbono celular se enriquece en 12C y se empobrece en 13C. -El sulfuro producido por la reduccin bacteriana del sulfato es mas ligero que el de origen geoqumico. -Este fenmeno se conoce como fraccionamiento isotpico. -El fraccionamiento es el resultado de la actividad de algunas enzimas que discriminan la forma ms pesada de un elemento cuando se unen a sus sustratos.

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Medicin de la actividad microbiana por el uso de istopos estables Los istopos estables pesados 13C, 18O, 34S tienen un nmero distinto de neutrones que la forma isotpica principal. Los geoqumicos y los microbilogos forman equipos para el estudio de las transferencias biogeoqumicas usando istopos estables. La mayora de los procesos bioqumicos favorecen el istopo mas liviano discriminando el ms pesado. Esto es particularmente cierto para las enzimas que fijan CO2 o que metabolizan SO4=. Los organismos fototrficos utilizan el CO2 de composicin isotpica conocida como alimento y las enzimas fijadoras de CO2 lo hacen preferentemente con el istopo mas ligero (12C). De esta manera , el carbono fijado como carbono celular aumenta la cantidad de 12C y disminuye la de 13C en relacin con el sustrato inicial. El grado de disminucin de 13C se acumula como un fraccionamiento isotpico. El tamao de las flechas indican la abundancia relativa de cada istopo del carbono.

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Fraccionamiento isotpico en ecologa microbiana

La composicin isotpica de una muestra contiene un registro de su actividad biolgica pasada. El anlisis isotpico del carbono permite distinguir entre la materia orgnica biognica de la abiognica. Se pueden hacer registros evolutivos
a) Composicin isotpica de carbono de varias sustancias. Los valores estn dados en partes por mil y fueron calculados usando la frmula (13C/12C muestra)-(13C/12C estndar) x 1000 13C/12C estndar El estndar del C es el belemnite de la formacin rocosa PeeDee. Ntese que el C fijado por los organismos autotrficos est enriquecido en 12C. b) Resumen de la geoqumica isotpica del azufre con indicacin del margen de valores para 34S y 32S en varias sustancias que contienen azufre. Los valores se dan en partes por mil y se calculan mediante la frmula (34S/32S muestra)-(34S/32S estndar) x 1000 34S/32S estndar El estndar del S es el SFe procedente del meteorito Canyon Diablo. El sulfuro y azufre de origen biognico tienden a tener menos 34S.

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EL USO DEL FRACCIONAMIENTO ISOTPICO EN ECOLOGA MICROBIANA. - La composicin isotpica de una muestra contiene un record de su actividad biolgica pasada. -El anlisis del istopo de carbono en las rocas tiene prevista la existencia de vida sobre la tierra 3.500 millones de aos atrs. -El anlisis del oxgeno (18O/16O) de rocas se usa para determinar la transicin de la Tierra de un ambiente anxico a un ambiente xico (fotosntes oxignica de las cianobacterias). -El anlisis del istopo de azufre tambin ha sido usado como evidencia de la carencia de vida sobre la luna. -La composicin isotpica de un organismo animal superior tiende a aproximarse a la composicin isotpica de su principal alimento. Esto permite rastrear el flujo de C a travs de un ecosistema.

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FIN

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ECOSISTEMAS MICROBIANOS

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HBITAT MICROBIANOS TERRESTRES Y DE AGUA DULCE Los suelos y las aguas varan en su estructura fsica, composicin de nutrientes, temperatura y potencial de agua. Todos estos factores se combinan para influir en los tipos y nmero de microorganismos presentes en cada caso.

Ambientes terrestres
material original Interaccin compleja (roca, arena, sedimentos) topologa del terreno clima seres vivos La interaccin involucra procesos fsicos, qumicos y biolgicos. formacin del suelo

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Formacin del suelo. Los suelos pueden clasificarse en dos grandes grupos: suelos
minerales y suelos orgnicos segn procedan inicialmente de la fragmentacin de rocas y otros materiales inorgnicos , o de la sedimentacin de turberas y marismas. roca expuesta a la intemperie humedad Se desarrollan MOs fototrficos Producen materia orgnica que permite el crecimiento de bacterias quimioorganotrficas y hongos

algas

lquenes musgo

El nmero de bacterias quimioorganotrficas aumenta en forma proporcional a la extensin de la cubierta vegetal de la roca. El CO2 que producen los organotrofos durante la respiracin se convierte en cido carbnico, que es un agente importante en la disolucin de rocas, especialmente en las que son calizas. Muchos quimioorganotrofos secretan adems cidos orgnicos que disuelven la roca en partculas de menor tamao. Heladas y deshielos grietas en las rocas formacin del suelo primitivo

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Hendidura de roca

formacin de suelo primitivo desarrollo de plantas superiores

Las races de las plantas van penetrando por las hendiduras y aumentan la fragmentacin de la roca y sus excreciones causan el desarrollo de una rizosfera. Planta muere suelo nutriente para un desarrollo microbiano mas extenso

Los minerales se solubilizan an ms y el agua al filtrarse arrastra los mismos hacia capas mas profundas. A medida que avanza el proceso de meteorizacin del suelo, ste se hace mas profundo y permite el desarrollo de plantas y rboles de mayor tamao. Los animales se estabilizan y desempean un papel importante en el mantenimiento de la aireacin y mezcla de las capas superiores del suelo. Finalmente, el movimiento de materiales hacia el interior origina la formacin de distintas capas y aparece un perfil de suelo tpico, cuya velocidad de formacin depende del clima, de otros factores. Es un proceso lento que puede llevar cientos de aos. Horizonte O : capa de materia vegetal sin descomponer Horizonte A: suelo superficial (rico en materia orgnica), alta actividad microbiana. Horizonte B: subsuelo (se acumulan minerales, humus, etc), pobre en materia orgnica, actividad microbiolgica pobre. Horizonte C: suelo base, actividad microbiana muy baja. Roca slida

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Ambiente terrestre: formacin del suelo

Agregado de suelo

Microscopa electrnica de barrido Microorganismos sobre una partcula de suelo

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EL SUELO COMO HBITAT MICROBIANO -El crecimiento mas importante se da en la rizosfera (suelo que rodea las races). -Un pequeo agregado de suelo contiene microambientes muy diferentes y diferentes tipos de MOs. Partcula de suelo tincin fluorescente naranja de acridina observacin de distintos MOs microscopio MOs especficos microscopio de fluorescencia microscopio electrnico de barrido MOs sobre superficies opacas (suelos) (morfologa, recuento de viables) -La actividad microbiana depende de la disponibilidad del agua, que es variable y depende de: (a) la composicin del suelo, (b) la lluvia, (c) el drenaje, (d) la cubierta vegetal. - El agua permanece en el suelo : (a) adsorvida sobre superficies, (b) libre formando lminas o pelculas entre las partculas del suelo.

tincin con anticuerpos fluorescentes

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Solucin del suelo: es el agua del suelo con diversos materiales disueltos En terrenos bien drenados el aire penetra con facilidad y la concentracin de O2 es alta. En suelos encharcados, el O2 disponible es el disuelto en el agua y es pronto consumido por los MOs. Este tipo de suelo se vuelve pronto anxico, por lo que experimenta profundos cambios en sus actividades biolgicas. El estado nutricional ( los recursos) es otro factor importante que afecta a la actividad microbiana, la mayor parte de la cual se lleva a cabo en las capas superiores ricas en materia orgnica (rizosfera). El nmero de MOs del suelo y su actividad dependen del equilibrio entre los nutrientes presentes (orgnicos e inorgnicos). La disponibilidad de agua es lo que ms influye en la actividad microbiolgica que tiene lugar en la superficie del suelo, mientras que en el interior del suelo la disponibilidad de nutrientes es el factor principal.

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MICROBIOLOGA DE LA SUBSUPERFICIE PROFUNDA

metangenos MOs anaerobicos estricto Suelos profundos MOs aerobios facultativos MOs anaerobios facultativos homoacetgenos bacterias SO4= reductoras

En muestras tomadas a 300 m se han aislado una gran variedad de microorganismos. Tienen actividades metablicas bajas, inferiores a las que tienen en sus hbitat naturales Comparado con los MOs de las capas superiores del suelo, la importancia biogeoqumica de los MOs de ambientes profundos puede ser mnima. No obstante pueden causar la mineralizacin de compuestos orgnicos y liberar productos a las aguas subterrneas. El potencial que representan estas bacterias para la Biorremediacin in situ de las sustancias txicas que alcanzan las aguas subterrneas por lixiviacin (por ej. bencenos y productos qumicos utilizados en agricultura) tiene un gran inters en la actualidad.

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Vida microbiana en las profundidades de la Tierra

Los microbilogos han hallado procariotas viables a varios metros de profundidad bajo la superficie En algunas formaciones de basalto de hasta 1500 m de profundidad se han encontrado una gran cantidad de bacterias anaerbicas quemolitotrficas que son sulfato reductores, metangenos y homoacetgenos. Estos anaerobios estrictos comparten una gran apetencia por el H2. El anlisis del istopo estable del carbono del CH4 presente en las rocas y aguas circundantes indica una gran abundancia del istopo ms ligero (12C), lo que es tpico de la metanognesis biolgica demostrando que estos organismos son metablicamente activos. El H2 del basalto parece originarse de la interaccin , estrictamente qumica, del agua con los minerales de hierro de las rocas y es el que permitira el crecimiento de las poblaciones de procariotas anaerbicos encontrados en las profundidades. Estos quimiolittrofos subterrneos son independientes de la produccin primaria fotosinttica la cual genera O2 y/o materia orgnica sugiriendo que pueden ser agentes biogeoqumicos importantes en estos ambientes.

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Ambientes de agua dulce

Lagos Estanques Ros Manantiales Distintos hbitat acuticos. Difieren en sus propiedades fisicoqumicas y consecuentemente en la composicin de las especies microbianas que viven en ellos, que predominantemente son los organismos fototrficos.

Zona xica Cianobacterias algas que flotan (fitoplancton) que se adhieren al fondo o a los lados (bnticas) Zona anxica E Luz organismo fototrfico bacterias fototrficas anoxignicas materia orgnica productor primario

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Los organismos fottrofos oxignicos producen nuevo material orgnico y O2. Cuando la actividad quimioorganotrfica es muy elevada, la materia orgnica lleva al agotamiento de O2 y a condiciones anxicas. -La actividad biolgica de un ecosistema acutico depende de la tasa de produccin primaria que llevan a cabo los organismos fototrficos. -Los recursos y las condiciones ambientales afectan la actividad de los productores primarios. Hay mayores tasas en los ros y manantiales. -En los mares abiertos hay baja concentracin de nutrientes para el fitoplancton y por lo tanto baja productividad. -Las zonas mas frtiles son las cercanas a la costa por los aportes de nutrientes de los ros y de las aguas continentales contaminadas. -Las zonas costeras tienen alta produccin primaria y son los mejores lugares para el crecimiento y recoleccin de pescados y mariscos.

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Relaciones con el oxgeno en lagos y ros

-Concentracin de O2 en el aire 21%, su solubilidad en el agua es limitada -El intercambio entre el O2 disuelto y el O2 atmosfrico en las grandes masas de agua es lento. -La produccin fotosinttica significativa de O2 en mares y lagos se lleva a cabo slo en las capas superficiales, donde hay luz disponible. -La materia orgnica que no se consume en estos estratos superiores va a parar al fondo, donde se descompone por la accin de MOs facultativos, que utilizan el O2 disuelto en el agua. -En los lagos, cuando se ha consumido el O2 disuelto, las capas mas profundas se vuelven anxicas donde slo pueden crecer bacterias anaerbicas y organismos microaeroflicos. Se produce un cambio del metabolismo respiratorio al fermentativo y al metanognico. Metanognesis 4H2 +CO2 CH4 + 2H2O
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Mar

capas mas

O2 luz organismos materia biosintticos orgnica

consumida quimioorganotrofos

Lago superficiales

no consumida excedente al fondo organismos facultativos que utilizan el O2 disuelto En lagos Cambio del metabolismo del respiratorio al fermentativo y al metanognico capas mas profundas anxicas bacterias anaerbicas y organismos microaeroflicos no plantas superiores ni animales

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Que una masa de agua quede o no desprovista de O2 depende de muchos factores.

Hay O2 en la masa de agua: (a) si la materia orgnica es escasa (lagos poco productivos o mar abierto) (b) si no hay suficiente materia orgnica disponible para que los organismo quimioorganotrficos consuman todo el O2, (c) si la velocidad de intercambio del agua entre las capas profundas y la superficie es alta (corrientes, turbulencias, etc) que mezclan bien y el O2 puede alcanzar las capas profundas. En muchos lagos de climas templados la masa de agua permanece estratificada durante el verano con capas superficiales menos densas y mayores temperaturas llamadas epilimnion y separadas de capas inferiores mas pesadas y fras llamadas hipolimnion. Cuando se produce la estratificacin, normalmente a principios del verano, las capas inferiores se vuelven anxicas. Al final del otoo o al principio del invierno, las capas superiores se enfran y se vuelven mas densas que las capas inferiores, producindose un intercambio que causa la aireacin del fondo. Por ello la mayora de los lagos de zonas templadas muestran un ciclo anual en el que las capas inferiores pasan de xicas a anxicas y de nuevo a xicas. Estos cambios y especialmente tambin la temperatura afectan la actividad microbiana.

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Interrrelaciones del oxgeno en lagos y ros

O2 temperatura Epilimnion Termoclina Hipolimnion SH2

Desarrollo de condiciones anxicas en las profundidades de un lago de clima templado, como resultado de la estratificacin estival. Las aguas mas fras del fondo son mas densas y contienen SH2 procedente de la reduccin del sulfato. La zona que presenta un cambio brusco de la temperatura se denomina termoclina. A medida que las aguas superficiales se enfran en otoo y en invierno, la densidad de las mismas aumenta y, al hundirse, desplazan a las del fondo, dando lugar a la mezcla del lago.

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Ros
El O2 es un factor importante, especialmente en los ros que reciben mucha materia orgnica procedente de aguas residuales y de contaminacin industrial. Si hay mucha materia orgnica, se produce un dficit de O2 debido a la respiracin bacteriana. A medida que el agua se aleja del lugar donde se produce la descarga de residuos, la materia orgnica es consumida gradualmente y la concentracin de O2 se acerca a la normalidad. En condiciones de anoxia, aunque sean temporales, los animales se mueren y adems empiezan a crecer bacterias anaerbicas que producen compuestos con olor fuerte (SH2, mercaptanos, ac. grasos) Efecto de la incorporacin de aguas residuales o de materia orgnica a los ros O2 bacterias, C orgnico y DBO (demanda biolgica de O2) algas y cianobacterias O2

Aporte de aguas residuales

NO3-

NH4+ y PO43-

Distancia corriente abajo

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Demanda biolgica de O2 (DBO) Es la capacidad de consumir O2 que tienen los MOs en una masa de agua determinada.

Muestra de agua se airea bien

se coloca en botella precintada

incubacin 5 das a 20oC

se mide el O2 residual

La DBO es una medida indirecta de la cantidad de materia orgnica del agua que puede ser oxidada por los MOs. Cuando un ro se recupera de la contaminacin producida por compuestos orgnicos, hay una disminucin de la DBO que se acompaa con un aumento de la concentracin de O2 disuelta en el agua. En una masa de agua, los ciclos de C y O se encuentran interrelacionados y la concentracin de cada uno de los elementos suele ser inversamente proporcional a la del otro. Esto se hace especialmente evidente en los ambientes anxicos, donde hay abundancia de C.

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Microbiologa de las profundidades marinas

-Los ocanos ocupan partes de la superficie terrestre de all la importancia de la microbiologa marina. -Las zonas alejadas a las costas son pobres en nutrientes y la actividad microbiana no es intensa. -Los MOs marinos son interesantes porque: crecen a concentraciones de nutrientes crecen a Mar Animales y MOs quimioorganotrficos 1000 m mas abajo zona biolgicamente inactiva profundidades marinas 75% del volumen del agua de mar La presin atmosfrica 1 atm cada 10m de profundidad. A 5000 m tenemos 500 atm. 300 m luz solar zona ftica crecen a temperaturas presiones

intensa actividad biolgica

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Distribucin de Archaea/Bacteria en mar abierto

El nmero de procariotas en mar abierto disminuye con la profundidad. En la superficie el promedio es de 105-106 clulas/ml. Por debajo de los 1000 metros el nmero desciende a 103105 clulas/ml. Las tinciones filogenticas han revelado que en general las especies de Bacteria predominan en las aguas superiores (<1000 metros), mientras que los nmeros son iguales o muestran un ligero predominio de Archeae en las aguas profundas. Extrapolando los datos de la figura se ha estimado que en el conjunto de los ocanos de todo el mundo existen 1,3 x 1028 y 3,1 x 1028 clulas de Archeae y Bacteria, respectivamente. Esto indica que los ocanos contienen la mayor cantidad de biomasa microbiana que existe en toda la superficie de la Tierra.

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Bacterias barotolerantes y baroflicas

Bacterias barotolerantes son aquellas que toleran altas presiones. Bacterias baroflicas son aquellas que necesitan altas presiones para crecer. La distribucin de ambos tipos de bacterias dependen bsicamente de la profundidad. Las bacterias barotolerantes no crecen a presiones superiores a las 500 atm (pero pueden crecer tambin a 1 atm). Los organismos aislados a mas de 500 atm son baroflicos, con un crecimiento ptimo a 400 atm. A ms de 10.000 m de profundidad se obtienen los barfilos extremos o estrictos (necesitan mas de 400 atm para crecer). En general la temperatura ptima es de aproximadamente 2oC. Por enzima de 10 oC disminuye su viabilidad. La presin puede afectar la expresin de genes en las bacterias baroflicas. Las protenas de la pared celular y las estructuras relacionadas con la pared celular, as como los transportadores parecen ser los componentes con mayor variabilidad. La presin acta de manera selectiva para regular la transcripcin de genes especficos que codifican las protenas necesarias para el crecimiento a alta presin.

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Crecimiento de bacterias barotolerantes, baroflicas y baroflicas extremas

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FIN

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