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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE HONDURAS

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGA

LABORATORIO DE GENTICA PARA MICROBIOLOGA


(MB-640)
ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLEICOS EN GEL DE AGAROSA.

PRCTICA # 2

GRUPO # 7
INTEGRANTES: Abner Obed Cortez 20081006955
Lessi Sarah Morales - 20101005925

INSTRUCTOR: Brayan Diddey Montoya

SECCIN: Lunes de 4 7 PM (1601)

CIUDAD UNIVERSITARIA, TEGUCIGALPA, FRANCISCO MORAZAN


HONDURAS
24/2/2014

OBJETIVOS
1. Describir el fundamento de la tcnica de electroforesis de ADN en gel de
agarosa.
2. Identificar un mtodo de electroforesis en gel para la separacin y
purificacin de molculas de ADN.
3. Calcular el peso molecular de un ADN presente en una preparacin,
comparndolo con marcadores de tamao o concentracin conocida.

INTRODUCCIN GRUPAL
A continuacin se presenta una prctica realizada de electroforesis en gel de agarosa, en
la cual hablaremos ms adelante sobre su fundamento, usos de sus reactivos en el
proceso y cuales fueron los fines en nuestro laboratorio.
Luego se proceder a observar las muestras de ADN puestas en el, a travs de luz ultra
violeta en el transiluminador, se deben de usar guantes y gafas dentro del el, ya que las
ondas pueden afectar nuestra piel; se observara la iluminacin dada por el revelador de
bromuro de etidio presente en la muestra y su debido corrido por el gel.

INTRODUCCIN
Electroforesis en Gel de Agarosa
La electroforesis en gel es un mtodo que se emplea para separar macromolculas
en funcin del tamao, la carga elctrica y otras propiedades fsicas. El trmino
electroforesis describe la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de
un campo elctrico. Electro se refiere a la electricidad y foresis, del griego
phoros, significa trasladar. As pues, la electroforesis en gel es una tcnica
consistente en aplicar corriente elctrica a las molculas para que atraviesen una
placa de gel. Muchas macromolculas biolgicas importantes poseen grupos
ionizables y, a un pH determinado, existen en solucin como especies cargadas
elctricamente, sean cationes (+) o aniones (-), segn la naturaleza de la carga neta,
las partculas cargadas migrarn hacia el ctodo o hacia el nodo.
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo normalizado que se utiliza para
separar, identificar y purificar fragmentos de ADN, por otro lado el ADN puede
localizarse en el gel tiendo con una concentracin baja de bromuro de etidio, que
es un agente intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.
Principios fsicos de la electroforesis en gel de agarosa
La separacin de las macromolculas depende de dos variables: carga y masa,
cuando una muestra biolgica, como por ejemplo el ADN, se mezcla en una
solucin tampn y se aplica a un gel, esas dos variables actan conjuntamente.
La fuerza de friccin del material de gel acta como tamiz molecular, separando
las molculas en funcin de su tamao.
Durante la electroforesis, las macromolculas son empujadas a travs de los poros,
dependiendo su tasa de migracin por el campo elctrico de los siguientes factores:
Fuerza del campo
Tamao y forma de las molculas
Hidrofobicidad relativa de las muestras
Fuerza inica y temperatura del tampn en que se desplazan las molculas.
Para tener una idea cabal del proceso de separacin de las partculas cargadas en la
electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a esta
tcnica: E = V/d, F = Eq, v = E*q / f, M = v / E, M = q / f, R = V / I, W = I^2*R.
Dando como resultado que:
E: Cuando se aplica tensin a los electrodos se genera un gradiente de potencial.
V: medida en voltios, es la tensin aplicada.
d: a distancia en cm entre los electrodos.
F: Al aplicarse el gradiente de potencial, se genera una fuerza en una molcula cargada.
q: corresponde a la carga en culombios que lleva la molcula, medida en newtons.
v: La velocidad de una molcula cargada en un campo elctrico depende del gradiente
de potencial.
M: La movilidad electrofortica de un in.
f: coeficiente de friccin.
I: Intensidad
R: Resistencia
W: Potencia.
Existe asimismo una resistencia de friccin que ralentiza el desplazamiento de las
molculas cargadas. Esta fuerza de friccin es funcin de los siguientes factores:
Tamao hidrodinmico de la molcula
Forma de la molcula
Tamao de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis
Viscosidad del tampn.

La movilidad electrofortica es un parmetro significativo y caracterstico de las


molculas o partculas cargadas y depende del valor de pK del grupo cargado y del
tamao de la molcula o partcula. El ADN bicatenario lineal migra por las matrices de
gel a velocidades inversamente proporcionales al log10 del nmero de pares de bases.
Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electrofortico se disipa
en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:
Aumento de la tasa de difusin de los iones de la muestra y del tampn, con el
consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas
Formacin de corrientes de conveccin, con la consiguiente mezcla de las
muestras separadas.
Inestabilidad trmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por
ejemplo, desnaturalizacin del ADN)
Disminucin de la viscosidad del tampn y, por ende, reduccin de la resistencia
del medio.
Componentes de la electroforesis en gel de agarosa
Agarosa: galactosa y 3,6-anhidrogalactosa, en los geles horizontales, la agarosa se
emplea por lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %.
Tampn de electroforesis: Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato
(TBE) o trisfosfato (TPE) a una concentracin de aproximadamente 50 mM (pH 7,5
7,8).
ADN marcador: ADN de tamao conocido en los extremos del gel.
Tampn de Carga: por lo general contiene agua, sacarosa y un colorante, la cantidad
mxima de ADN que puede cargarse depende del nmero de fragmentos, la cantidad
mnima de ADN que puede detectarse mediante fotografa de los geles teidos con
bromuro de etidio (Cancerigeno, manejar siempre con proteccin), es de
aproximadamente 2 ng en una banda de 0,5 cm de ancho.
El tampn de carga se emplea con tres fines:
aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan
uniformemente en el pocillo.
aadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga
incorporar un colorante a la muestra que, en un campo elctrico, se desplace
hacia el nodo a una velocidad previsible. (3)

MATERIALES Y EQUIPOS
1. Tanque electrofortico para geles. Se utiliza un tanque horizontal para gel
sumergidos, tipo mini-gel qu permite separar muestras en un mnimo tiempo de
2 horas
2. Generador de electricidad con capacidad de 500V.
3. Iluminacin u.v de transiluminador para visualizar el ADN en los geles teidos
con bromuro de etidio. Use lentes y guantes protectores.
4. Bandeja plstica formadora de gel con su respectivo peine. Gel de agarosa al
1.5% en TBE 0.5x. TBE buffer, 10X.
Tris 108g.
cido brico 55g.
EDTA 0.5M, pH 8.0 40 mL.
A 1 L con agua destilada y guardar a temperatura ambiente.
5. Bromuro de etidio, 10 mg/mL. Solucin Stock (solucin madre). Guardar en
frascos mbar a 4 C.
6. Buffer de cargada del gel, 6x.
0.25% de azul de bromofenol.
0.25x Xylene cyanol.
30% glicerol en agua destilada.
Guardar a 4 C.
7. Marcadores de peso molecular: Escalera 50Pb(no s us)
8. Muestra de E. coli extradas. (6)

DISCUSIN
Mediante un proceso de calentamiento y dilucin de la agarosa ya preparada
previamente por el laboratorio anterior se da inicio a la prctica, esta agarosa ya
contenida con el bromuro de etidio para teir las bandas de ADN por unin dando
fluorescencia, tiene la importancia de que los geles de ella poseen grandes poros y se
emplean fundamentalmente para separar las molculas grandes con un peso molecular
de ms de 200 kDa, a permiten una electroforesis rpida, pero con una resolucin
limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas
y a esparcirse, una vez totalmente diluida la agarosa se procede a trasvasar a la bandeja
formadora de geles y se le coloca su respectivo peine y, procedemos a esperar su
enfriamiento. Una vez endurecido se le remueve el peine y la cinta aislante, se procede a
ver los pocillos de colocacin de muestra, se utiliza una micropipeta para colocar las
muestras de ADN dentro de ellos, ya colocados todas ellas procedemos a llevar el gel a
agarosa al tanque electrofortico el cual tiene un nodo y un ctodo, migrando al 1ero el
ADN por su carga negativa dada por el grupo fosfato de su molcula, le vertimos el
tampn de TBE Contienen EDTA, tris-borato (TBE) la movilidad electrofortica del
ADN se ve afectada por la composicin y la fuerza inica de este tampn, lo que nos
permite un excelente corrido de la muestra por la fase estacionaria, ya que sin iones la
conductancia es mnima o nula y no se da el corrido; hasta que lo cubra al menos 1mm,
luego conectamos los electrodos de manera de migracin al nodo, aplique voltaje de al
menos 120 voltios por 30 minutos, pasado este tiempo sacarlo y quitarlo de su bandeja,
y se proceder a introducirlo a una solucin de tampn ms azul de bromofenol como
tampn de carga y para marcar el avance de la muestra dentro de la fase estacionaria,
luego se lleva en agua destilada sumergido por 10 minutos, pasado este tiempo se lleva
al transiluminador de UV y se procede a observar con lentes y guantes los corridos del
ADN por el gel de agarosa, teniendo una coloracin fluorescente frente a esta luz.(3)(2)
(1)

CUESTIONARIO
1. Investigue otros protocolos de electroforesis.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los mtodos ms utilizados
para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas. La tcnica permite
separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete
a la accin de un campo elctrico. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte
inerte, generalmente sobre geles de poliacrilamida (PAGE). En la electroforesis
desnaturalizante (SDS-PAGE), como su propio nombre indica, se utilizan agentes
desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos
(p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualizacin de
las protenas se utilizan diferentes mtodos de tincin, siendo el ms habitual el azul
de coomassie. En la SDS-PAGE, la separacin es funcin del tamao (masa
molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las protenas. Para ello
se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la protena de peso molecular
desconocido con el de protenas de referencia de peso molecular conocido. (8)
2. Qu otras aplicaciones puede tener la electroforesis?
Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:
De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la
disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera
con el disolvente.
Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a
travs de un disolvente, utilizando adems un medio que soporta a ste. En este caso
no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los
componentes de la muestra.
Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra
continuamente a lo largo del proceso. (9)
3. Explique la funcin del gel de agarosa en la electroforesis.
R// Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma; as, molculas de DNA de diferente
tamao, van a emigrar de forma distinta en el gel de electroforesis. (3)
4. Para que se utiliza la solucin tampn de TBE?
R// Los Tampones TBE tienen una capacidad de amortiguacin ms fuerte durante
ms tiempo o ms altos voltajes en la corrida electrofortica. (3)
5. Investigar cada uno de los reactivos usados.

TBE

Disolucin tampn formada por Tris, borato y EDTA, de uso frecuente


en electroforesis, en especial en gel de agarosa para separar cidos nucleicos.

El Tris es la molcula responsable del tamponamiento (regulacin del pH).


El borato contribuye a ajustar el pH deseado e igualmente a mantenerlo.
El EDTA es un quelante de cationes divalentes cuya funcin es secuestrar el
2+
Mg , con lo que se evita que las posibles nucleasas presentes degraden los cidos
nucleicos de la muestra (la mayora de las nucleasas requieren Mg+2 como
coenzima). (7)

AGAROSA

La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacrido lineal (con un
peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repeticin de la unidad bsica, la
agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La
agarosa es muy frgil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de
agarosa poseen grandes poros y se emplean fundamentalmente para separar las
molculas grandes con un peso molecular de ms de 200 kDa. (3)

BROMURO DE ETIDIO

El bromuro de etidio es una pequea molcula fluorescente poliaromtico y


intercalador de cido nucleico usado ampliamente como una mancha en el ADN y
electroforesis de ARN. Tras la intercalacin en la regin hidrfoba entre pares de
bases de cidos nucleicos, las molculas de agua para saciar la fluorescencia
asociados a la estructura de bromuro de etidio se desplazan y el bromuro de etidio
unido entonces emite fluorescencia muy fuerte en comparacin con el libre bromuro
de etidio (~ 25 veces ms en dsDNA). La intercalacin distorsiona la estructura del
cido ribonucleico e impide las interacciones de ADN naturales, presentando un
efecto mutgeno potente asociado con bromuro de etidio. Esta imposicin de la
estructura del ADN tambin hace que el bromuro de etidio sea un inhibidor de la
ADN polimerasa. (5)

AZUL DE BROMOFENOL

Azul de bromofenol es til como un colorante de seguimiento en la electroforesis,


un colorante industrial, un indicador cido-base de laboratorio y una mancha
biolgica. En la electroforesis en gel que puede ser utilizado como un marcador de
color y como una mancha biolgica que puede ser utilizado para teir las protenas
y cidos nucleicos. Azul de bromofenol es un intermedio y se utiliza como un
indicador a base de cido en el intervalo de pH de 3 a 4,6, donde los cambios de
color de amarillo a azul. (4)

CONCLUSIONES

Al dialectizar y esquematizar anteriormente la tcnica de electroforesis en gel de


agarosa se logra comprender mejor su fundamento.

Se logra conocer uno de los muchos mtodos para la separacin y purificacin


de ADN, electroforesis en gel de agarosa, separando por cargas y masa.

No se logra concluir con este objetivo basado en el peso molecular, ya que no se


contaba con el marcador de tamao conocido.

BIBLIOGRAFIAS
1. C. Padilla, J. Dapena, E. Martnez, J. Brcena, C. Alfonso, Electroforesis de
cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin
electrofortica de DNA plasmdico, Departamento de Bioqumica y Biologa
Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071Crdoba.
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS
%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA.pdf.
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laboratorios.inc.
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http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6205.pdf.
3. M. Somma, M. Querci, Electroforesis en gel de agarosa, sesin 5, Anlisis de la
Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de
Alimentos, JCR European Comission.
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http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi
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Consultado: 22/2/2014 Hora 15:24
http://www.scbt.com/es/datasheet-24971-bromophenol-blue.html.
5. Santa Cruz Biotechnology, Bromuro de Etidio, 2007-2014.
Consultado: 22/2/2014 Hora 15:33
http://www.scbt.com/es/datasheet-203735-ethidium-bromide.html.
6. A. Ferrera, G. Fontecha, I. Rodriguez, MB-640, Manual de Laboratorio de
Gentica, Edicin 2012, Escuela de Microbiologa, U.N.A.H., Honduras, 2012.
7. MO BIO Laboratories, TBE Buffer, 10X (Tris-borate-EDTA), versin
12192013.
Consultado: 22/2/2014 Hora 15:55
http://www.mobio.com/images/custom/file/protocol/15002.pdf.
8. A. Maldonado, J. Jorrn, Electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida. Anlisis de protenas de hojas de Arabidopsis thaliana,
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de
Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba.
Consultado: 22/2/2014 Hora 16:33
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS
%20GELES%20PAA.pdf.
9. Electroforesis de cidos nucleicos y protenas, prctica universitaria
Consultado: 23/2/2014 Hora 8:22

http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm.