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NUEVAS FORMAS FARMACUTICAS LIPO-POLIMRICAS

PARA LA LIBERACIN DE GENES TERAPUTICOS



Leire Garca, Sonsoles Dez, Conchita Tros de Ilarduya

Departamento de Farmacia y Tecnologa Farmacutica. Facultad de Farmacia. Universidad
de Navarra. 31080 Pamplona.


Introduccin y Objetivos

La terapia gnica es una modalidad de
tratamiento que puede definirse como la
transferencia de cidos nucleicos a las
clulas de un individuo con fines
teraputicos, es decir, el tratamiento de la
enfermedad mediante la transferencia de
material gentico a las clulas especficas
del paciente, en vez de recurrir al uso de
frmacos convencionales. Para ello, se
necesita del desarrollo de sistemas de
entrega de cidos nucleicos a las clulas
que permitan que estos lleguen a su destino
en las mejores condiciones y puedan ejercer
su funcin teraputica. Por esta razn, uno
de los desafos bsicos de la terapia gnica
consiste en el desarrollo de formas
farmacuticas que permitan la transferencia
de material gentico teraputico a las
clulas de inters de una manera que sea lo
ms eficiente, especfica y segura posible.

La tecnologa farmacutica ha ganado
experiencia en relacin con los sistemas
avanzados de administracin de frmacos.
En concreto, el desarrollo de sistemas
sintticos para la liberacin controlada y la
vectorizacin ofrecen un fundamento al
desarrollo de la terapia gnica con nuevas
formas farmacuticas. Estos sistemas
incluyen: los lpidos catinicos, los
liposomas, agentes condensantes de
diversa naturaleza y vectores polimricos
como nanopartculas y micropartculas de
polmeros biodegradables, como es el caso
de PLGA. As, el objetivo fundamental de



este trabajo es la preparacin, optimizacin,
caracterizacin y evaluacin de nuevas
formas farmacuticas lipo-polimricas
(lipopoliplejos, micro y nanopartculas de
DNA y polmeros biodegradables)
destinadas a la liberacin de genes
teraputicos, y de aplicacin en terapia
antitumoral de cncer de hgado.
Material y Mtodos
El DNA plasmdico utilizado en los estudios,
que contiene el gen de la luciferasa bajo el
promotor del citomegalovirus (pCMVLuc), se
obtuvo tras el crecimiento de bacterias E.
coli (que contienen el plsmido de
luciferasa), en placas de cultivo de agar-
agar y kanamicina, y posterior lisado de
bacterias y purificacin del DNA plasmdico
mediante Qiagen endotoxin-free plasmid
purification (Francia). Los lpidos catinicos
1,2-dioleil-3-(trimetilamonio) propano
(DOTAP) y colesterol (CHOL) fueron
obtenidos de Avanti Polar Lipids (Alabaster,
AL, EE.UU.). Se utilizaron PEI ramificada de
800 kDa (Fluka, Steinheim, Alemania) y 25
kDa (Aldrich) y PEI lineal de 22 kDa,
tambin llamada ExGen500 (Quimigranel,
Madrid). En la elaboracin de las partculas
se utilizaron los copolmeros de cido lctico
y gliclico (PLGA) Resomer

RG 502H
(12 000 Da) y RG 503 (34 000 Da
(Boehringer Ingelheim KG, Alemania). La
lnea celular utilizada en el estudio es
HepG2 (clulas hepticas tumorales),



obtenida de American Type culture
Collection, la cual fue mantenida en el
medio de cultivo Dulbecco`s modified
Eagles medium-high glucose (DMEM)
enriquecido con un 10% (v/v) de suero fetal
bovino inactivado (FBS), penicilina,
estreptomicina y L-glutamina (Gibco BRL
Life Technologies, Barcelona) a 37 C en
presencia de un 5% de CO2.

La formulacin de los sistemas se llev a
cabo mediante la asociacin de los
polmeros y DNA con cantidades crecientes
de lpido (DOTAP y colesterol),
obtenindose de esta manera
lipopoliplejos de relacin molar 2,3, 5,3 y
17,5. Los lipopoliplejos se formularon
mediante 5 protocolos diferentes de
preparacin y mediante el uso de la PEI de
diferentes pesos moleculares (800, 25 y 22
kDa). Las micropartculas fueron preparadas
por el mtodo de evaporacin del disolvente
tras la formacin de una emulsin mltiple
A/O/A. El tamao de partcula y el potencial
de membrana de los diferentes complejos
formulados se determin por difractometra
lser utilizando un analizador de partculas
denominado Zetasizer Nano Series
(Malvern Instruments, Reino Unido).

La proteccin del pDNA de los complejos,
frente a las nucleasas, se analiz mediante
electroforesis en gel de agarosa. Para los
estudios in vitro se utilizaron clulas de
hepatocarcinoma humano (HepG2). Cuando
el grado de confluencia fue del 80% se
procedi a la transfeccin con los vectores
diseados objeto de estudio, utilizando el
gen reportero de la luciferasa. Para ello, se
platearon 3x10
5
clulas suspendidas en
DME-10 en placas (Iwaki Microplate de 48
pocillos, J apn), y tras 24 horas de
incubacin se procedi a la transfeccin.
Los resultados se expresaron en ng
luciferasa/mg protena.

Resultados y Discusin

En los distintos experimentos se observa
cmo el mtodo de formulacin y la relacin
molar utilizada no influye en el tamao de
partcula, porque no se observaron
diferencias significativas entre los valores.
En cuanto al potencial de membrana,
tampoco observamos diferencias relevantes
al utilizar uno u otro mtodo de formulacin.
Sin embargo, al aumentar la relacin molar
lpido:DNA (DOTAP/colesterol:pDNA) de los
lipopoliplejos elaborados con cualquiera de
los mtodos de formulacin, aumenta
progresivamente el potencial Zeta de stos.
Asmismo, se observ que exista influencia
en el tamao de partcula obtenido de los
lipopoliplejos, en funcin del peso molecular
de la PEI utilizada. As, los lipopoliplejos
elaborados con PEI ramificada de alto peso
molecular (800 kDa), son de tamao
superior a los formados con PEI ramificada
de menor peso molecular (25 kDa). No se
observan diferencias significativas en este
parmetro cuando se comparan las
formulaciones preparadas con PEI lineal de
similar peso molecular. En lo que se refiere
al potencial zeta tampoco se encontraron
diferencias significativas entre los diferentes
lipopoliplejos formados con los distintos
tipos de PEI (lineal o ramificada y de alto o
bajo peso molecular).

La actividad de transfeccin in vitro de los
complejos formulados con PEI lineal de 22
kDa es notablemente superior a la de los
complejos en presencia de PEIs ramificadas
(800 y 25 kDa). Tambin la actividad de
transfeccin in vitro de lipopoliplejos
formulados con la PEI ramificada de bajo
peso molecular (25 kDa) es superior a la
transfeccin obtenida con su anloga
ramificada de alto peso molecular (800
kDa). Por otra parte, la eficacia de
transfeccin de las formulaciones en
presencia del polimero biodegradable PLGA
se vi tambin incrementada.

Conclusiones

El mtodo de preparacin de la
formulacin no influye en el tamao ni
en la carga superficial de los sistemas.
Por otra parte, la cantidad de lpido
presente no influye en el tamao, pero
s en el potencial de membrana.





El peso molecular del polmero
determina el tamao, en cuanto que al
aumentar ste, el tamao se ve tambin
incrementado, no ejerciendo sin
embargo efecto sobre el potencial. El
tipo de polmero (lineal o ramificado) no
tiene influencia ni en el tamao ni en la
carga superficial de los complejos.

El plsmido formulado en lipopoliplejos
o en microparticulas en presencia del
polimero bioegradable PLGA, est
totalmente protegido frente a la accin
degradadora de las DNAsas presentes
en suero, lo que hace pensar que estos
vectores pueden tener actividad in
vivo.

En cuanto a las eficacias de
transfeccion gnica tumoral, los nuevos
vectores ternarios han conseguido
superar la eficacia de los vectores ms
tradicionales compuestos slo por
lpidos (lipoplejos) o por polmeros
(poliplejos).

En resumen, se han conseguido
formulaciones lipopolimricas, que han
demostrado su eficacia in vitro en clulas
de cncer de hgado, lo cual puede suponer
una prometedora alternativa a los vectores
virales, en el desarrollo de la terapia
antitumoral del cncer de hgado.