Laporan Praktikum Struktur Fungsi Subseluler

Hari/tanggal Waktu PJP Asisten

: Senin/ 10 Maret 2014 : 08.00-11.00 WIB : Syaefudin, SSi, MSi : Nazula Rahma S Dwi Ayu Setyaningrum M Maftuchin S

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

Kelompok 21 Yanti Fajarwati Arifa Nurahmaputri Listia Vidyawati M M G84120054 G84120024 G84120086

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

PENDAHULUAN Protein merupakan suatu komponen selular utama yang menyusun tubuh manusia, dan berperan penting dalam struktur, fungsi, dan reproduksi manusia. Protein terdapat di dalam semua sistem kehidupan, dan pada manusia, protein banyak tersimpan di jaringan otot dan beberapa organ tubuh lainnya, sedangkan sisanya terdapat di dalam darah. Istilah protein pertama kali dikemukakan oleh pakar kima Belanda, G.J Mulde pada tahun 1939, berasal dari bahasa Yunani proteios yang mempunyai arti yang pertama atau yang paling utama. Protein tersusun atas asam-asam alfa amino yang susunannya mengandung unsurunsur seperti karbon, oksigen, hidrogen, dan nitrogen (Sumardjo 2008). Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan berbagai metode, diantaranya dengan metode Bradford, metode Lowry, dan metode biuret. Metode yang digunakan dalam percobaan kali ini ini adalah metode Bradford. Metode Bradford adalah metode untuk mengukur konsentrasi protein total secara kolorimetri dalam suatu larutan. Metode ini menggunakan pewarna Coomasie Briliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang bersifat asam, sehingga memberikan warna (kebiruan). Karena menghasilkan warna, sehingga secara kolorimetri dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada panjang gelombang 465-595 nm (cahaya tampak). (Bardford 1976). Larutan Bovine Serum Albumin (BSA) digunakan sebagai larutan standar dalam penentuan kadar protein dengan metode Bradford. Percobaan ini dilakukan dengan menambahkan sejumlah NaCl pada larutan BSA, yang berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Penambahan NaCl ini, akan menyebabkan nilai absorbansinya menurun atau semakin kecil, karena pengompleksan protein dan zat warna CBB dalam reagen Bradford akan semakin sedikit. Dengan semakin kecilnya nilai absorban, menunjukkan bahwa protein yang larut semakin banyak (Khopkar 2007). Praktikum ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar absorbansi.

METODE PRAKTIKUM Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Pendidikan 1 Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Waktu praktikum yaitu hari Senin, tanggal 10 Maret 2014 pukul 08.00 11.00 WIB. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah gelas piala, tabung reaksi, bulp, pipet Mohr 0,1 mL, kertas alumunium foil, spektrofotometri UV-Vis. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) 0,1 mg/ml, reagen Bradford, larutan NaCl 0,9% Prosedur Percobaan Pembuatan kurva standar. Telah disiapkan 12 tabung reaksi yang bersih dan kering. Rangkaian larutan campuran NaCl dan larutan standar BSA dibuat dengan proporsi yang berbeda. Tabung 1 berisi 0 L BSA dan 100 L NaCl, tabung 2 berisi 10 L BSA dan 90 mL NaCL, tabung 3 BSA sebanyak 20 L dan 80 L NaCl, tabung 4 BSA sebanyak 30 L dan NaCl 70 L, kemudian tabung 5 berisi 50 L BSA dan 50 L NaCl, terakhir tabung 6 berisi 100 L BSA dan 0 L NaCl. Lalu reagen Bradford ditambahkan sebanyak 5,0 mL ke dalam masingmasing tabung. Tabung kemudian ditutup dengan alumunium foil dan dikocok isinya dengan membalikkan tabung perlahan-lahan beberapa kali. Biarkan selama 5 menit. Kemudian tabung 1 diisi sebagai blanko. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm untuk setiap tabung lainnya. Kurva standar dibuat antara absorbans 595 nm rata-rata terhadap konsentrasi protein. Penentuan konsentrasi protein sampel. Dibuat larutan stok dengan mencampurkan 500 L sampel protein dengan 4500 L aquades. Kemudian ambil 50 L larutan stok tersebut dan tambahkan 2,5 mL reagen Bradford ke dalam tabung reaksi. Langkah selanjutnya sama dengan pekerjaan pembuatan kurva standar. Absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi sampel kemudian ditentukan dengan menarik garis absorban rata-rata pada kurva standar yang telah dibuat, dan perhatikan faktor pengencerannya.

HASIL DAN PEMBAHASAN Penentuan kadar protein sangat diperlukan untuk mengetahui jumlah protein yang terdapat dalam suatu bahan. Hal ini dilakukan, karena peran protein yang sangat penting bagi tubuh manusia. Analisis kadar protein, dapat menggunakan berbagai macam metode, akan tetapi pada praktikum kali ini, metode yang digunakan adalah metode Bradford dengan penetapan kurva standar. Hasil percobaan tertera pada tabel 1 dan tabel 2 dibawah ini. Tabel 1 Absorbansi kurva standar BSA
Tabung 1 2 3 4 5 6 Absorbansi terukur 0,694 0,816 0,864 0,925 1,059 2,230 Absorbansi terkoreksi 0 0,122 0,170 0,231 0,365 1,536 [BSA] mg/ml 0 0,1 0,2 0,3 0,5 1

Contoh Perhitungan : Konsentrasi BSA tabung 2 V1 . M1 = V2 . M2 0,01 mL. 1 mg/ml = 0,1 mL . M2 M2 =

1.2 Absorbansi Terkoreksi 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.5 1 1.5 2 y = 0.612x + 0.1027 R = 0.9209

= 0,1

[BSA] mg/ml

Tabel 2 Analisis kadar protein

Sampel 1 2 Absorbansi terukur 0,751 0,744 Absorbansi terkoreksi 0,057 0,05 Protein mg/ml 0,1193 0,1147

Contoh Perhitungan : Faktor pengenceran = Kadar protein sampel 1 Y = a + bx Y = -0,1226 + 1,5047 x 0,057 = -0,1226 + 1,5047 x 0,1796 = 1,5047 x X = 0,1193 Hasil percobaan kurva standar menunjukkan bahwa nilai absorbansi semakin meningkat seiring dengan penambahan volume BSA pada setiap tabung. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa semakin banyak volume NaCl atau semakin sedikit jumlah larutan BSA, jumlah protein yang terlarut akan semakin banyak, sehingga nilai absorbansinya semakin kecil. Data yang diperoleh, tabung 1 berisi 0 L BSA dan 100 L NaCl nilai absorbansi terukurnya 0, tabung 2 berisi 10 L BSA dan 90 mL NaCL, nilai absorbansi terkoreksinya 0,122 , tabung 3 BSA sebanyak 20 L dan 80 L NaCl dengan nilai absorbansi terukur 0,170 kemudian tabung 4 BSA sebanyak 30 L dan NaCl 70 L nilai absorbansi yang diperoleh 0,231 lalu tabung 5 berisi 50 L BSA dan 50 L NaCl nilai absorbansi terukurnya 0,365 dan terakhir tabung 6 berisi 100 L BSA dan 0 L NaCl nilai absorbansi terukurnya 1,536. Hasil percobaan sesuai dengan teori, bahwa semakin banyaknya volume NaCl, protein yang terlarut akan semakin banyak, sehingga nilai absorbansinya kecil. Dari grafik, diperoleh persamaan regresinya y = 0.612x + 0.102 dengan ketepatan R = 0.920 . Kemudian hasil percobaan analisis kadar protein suatu sampel, didapatkan pada ulangan pertama sebanyak 0,1193 mg/ml, dan pada ulangan kedua 0,1147 mg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa dalam sampel tersebut, kadar proteinnya sangat sedikit. Larutan Bradford yang digunakan pada praktikum kali ini, dibuat dengan cara melarutkan 25 mg Coomaise Brilliant Blue G-250 dalam 12,5 ml etanol 95% (v/v), dan ditambahkan dengan 25 ml asam fosfat 85% (w/v). Larutan yang didapat kemudian diencerkan dengan aquades sampai 250 ml (Awwalurrizki 2009). Prinsip metode Bradford adalah pengikatan warna Coomaise Brilliant Blue =

oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Setelah pengikatan tersebut, protein akan berwarna biru sehingga nilai absorbansinya bisa diukur dengan metode spektrofotometri. Jumlah CBB yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Wilson dan Walker 2000). Penambahan NaCl 0,9% pada larutan BSA berfungsi sebagai pelarut protein yang akan diukur. Jika NaCl yang ditambahkan semakin banyak, protein yang akan terlarut pun akan semakin banyak, sehingga pengompleksan antara protein dan zat warna Coomasie Briliant Blue (CBB) pada reagen Bradford semakin sedikit terjadi (Khopkar 2007). Metode lain yang dapat digunakan untuk menganalisis kadar protein selain metode Bradford adalah metode Lowry dan metode biuret. Metode Lowry-Folin dilakukan untuk menganalisis protein terlarut dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 590 nm (Sumardji dalam Rahayu 2005). Sedangkan metode biuret menggunakan panjang gelombang 520 nm dengan larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA) dalam berbagai variasi konsentrasi. Kelemahan metode Bradford adalah reagen khususnya dapat

mengakibatkan perbedaan respon tes untuk jenis protein yang berbeda. Hal tersebut membuat kita harus teliti dalam memilih protein yang akan diujikan. Sebaiknya, protein yang diuji adalah protein yang memberikan nilai absorbansi mendekati konsentrasi sampel yang akan diujikan. Metode ini kurang akurat untuk asam protein dasar. Selain itu, kelemahan lainnya adalah, kurangnya sensitivitas terhadap sampel yang hanya memilliki sedikit kandungan protein (Bradford 1976). SIMPULAN Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh manusia, karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dan sebagai zat pembangun serta pengatur. Olehkarena itu, dilakukan percobaan analisis kadar protein pada suatu sampel, untuk mengetahui berapa banyak jumlah protein yang terdapat pada sampel tersebut. Metode analisis yang dilakukan ada beberapa macam, diantaranya metode Bradford, metode Lowry, dan metode biuret. Tetapi

pada praktikum kali ini digunakan metode Bradford, dengan analisis kurva standar spektrofotometri. DAFTAR PUSTAKA Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis sukrosa dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan Zymomonas mobilis [skripsi]. Surabaya (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh November. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bending. Analitical Biochemistry. 72 :248-254. Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Pr. Rahayu A, Suranto, Purwoko T. 2005. Analisis karbohidrat, protein, dan lemak pada pembuatan kecap lamtoro gung (Leucaena leucocephala) terfermentasi Aspergillus oryzae. Bioteknologi. 2(1): 14-20. Sumardjo, D. 2008. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta (ID) : EGC. Wilson K, J Walker. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry 5th edition. Cambridge : Cambridge University Press.