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XV Escola de Vero em Qumica Farmacutica e Medicinal

Curso III Farmacologia Clnica


Gen
Gen

tica toxicol
tica toxicol

gica
gica
Dr. Izabel Vianna Villela
Garantia da Qualidade
Laboratrio GENOTOX-ROYAL
Muta
Muta

es e agentes mutagnicos
es e agentes mutagnicos
O DNA
* Cada molcula de DNA composta por uma seqncia de
nucleotdeosligados um atrs do outro.
fosfato
acar
Nucleotdeo
base
* Cada nucleotdeo
consiste de 3 partes:
grupo fosfato,
uma desoxirribose
(acar) e
uma base
nitrogenada.
Pirimidinas Purinas
timina
citosina
adenina
guanina
Estes nucleotdeos podem ser de 4 tipos:
# Em cada fita simples de DNA, o
grupo fosfato de um nucleotdeo se
liga ao acar do outro nucleotdeo
formando uma fita contnua.
# As 2 fitas de nucleotdeos so enroladas
entre si formando uma dupla-hlice.
# Elas so ligadas por pontes de hidrognio
(que mantm a estrutura estvel) entre as
bases complementares (A-T) e (C-G).
# Cada cromossomo composto por
uma molcula dupla-fita de DNA.
= exposio das bases
O DNA de um organismo nouma
molcula esttica.
Modificaes na estrutura
ou composio qumica
transcrio
replicao
Quando essas modificaes
no so corrigidas pelo
Sistema de Reparo de DNA,
os erros ficam permanentes e
so chamados de
MUTAES
Duas classes de mutaes, segundo
o tipo de clulaem que ocorrem e
seus efeitos:
mutaes somticas
mutaes germinativas
Mutao
Mutao
gnica
um alelo de um gene
muda, tornando-se um
alelo diferente
Elas podem envolver
substituio, adio ou
perda de uma nica base
Mutao
cromossmica
as modificaes so
maiores, alterando os
cromossomos
mutaes
estruturais
mutaes
numricas
modificam a
estrutura dos
cromossomos
alteram o nmero
de cromossomos
1) substituio
MUTAES GNICAS
2) deleo 3) insero
MUTAES CROMOSSMICAS
A mutao cromossmica o processo de
mudana que resulta em alteraes
partes
rearranjadas do
cromossomo
nmeros
anormais de
cromossomos
individuais
nmeros
anormais de
conjuntos
cromossmicos
estruturais numricas
se a mutao cromossmica envolver quebra de
cromossomos, a quebra pode ocorrer no meio de um
gene, perturbando assim o seu funcionamento.
Muitas mutaes cromossmicas levam a anomalias de
funcionamento da clula e do organismo.
podem resultar em nmero ou posio anormal
de genes
Todos os organismos sofrem um certo nmero de mutaes como
resultado de funes celulares normais ou interaes com o meio
ambiente.
A taxa em que ocorrem =
NVEL BASAL
MUTAES
ESPONTNEAS
A ocorrncia das mutaes pode aumentar com a presena de
determinados compostos = Agentes mutagnicos
MUTAES
INDUZIDAS
o efeito de um agente mutagnico
medido pelo grau em que ele a taxa
de mutao acima do nvel basal
So classificados 4 principais grupos de mutgenos qumicos, com base em
suas reaes com o DNA:
1- Agentes alquilantesinteragem com os centros nucleoflicos do DNA,
adicionando grupos alquila.
Podem produzir
pareamentos errados,
levando a transies
2- Anlogos de baseso molculas cuja estrutura muito parecida com a de
uma base estrutural e que s vezes so incorporadas no DNA em seu lugar,
mas que tm propriedades de pareamento diferentes.
Podem levar a mutao por substituio de base
5-Bromouracila: Anlogo da
timina
Normal- pareia com a adenina
Ionizado- pareia com a guanina
2-aminopurina (2-AP): anlogo
de base da adenina
Normal- pareia com a timina
Protonada- pareia com a
citosina
3- Agentes desaminantesreagem com as bases que possuem
grupo amino (adenina, guanina e citosina), causando desaminao.
Provocam transiesCG TA, em ambas a direes
4- Agentes intercalantesso compostos que se intercalam no DNA,
entre a bases nitrogenadas.
Podem causar inseres ou delees
Podem intercalar em fita simples
Ponte intracadeia
Ponte intercadeias
Monoadio
Mutgenos qumicos
Componentes de alimentos
EX. - derivadas de plantas;
- Dos 5000 a 10000 pesticidas naturais,
63 tm sido estudados, e destes, 35
produziram cnceres em roedores
- O cozimento de comida freqentemente
produz material queimado, alguns dos
quais tambm podem ser carcinognicos
para roedores
- Caftorrado contm cerca 1000
qumicos diferentes e dos 28 testados,
19 so carcinognicos para roedores
- aflatoxina B
1
causam cncer de fgado em humanos
Formao de
stios apricos
leva a
mutaes
Drogas teraputicas - previnem a diviso celular, sendo a fase de
replicao do DNA seu principal alvo.
EX. - Mitomicina C usada no tratamento de carcinomas
gastrintestinais e cncer de bexiga: causa cross-linking no DNA
- Mostarda nitrogenada: agente alquilante antineoplsico
- Bleomicina usada em carcinoma testicular, cnceres de
cabea e pescoo: causa a remoo de bases e quebras no DNA
- Inibidores de topoisomerases: As drogas podem inibir a
habilidade das topoisomerases, deixando fitas de DNA quebradas, com
eventual morte das clulas afetadas
Mutgenos fsicos
Radiaes ionizantes
Utilizados para diagnsticos mdicos porque penetram em tecidos vivos
por considerveis distncias.
causa a quebra das ligaes acar-fosfato do DNA, o que pode levar a
aberraes cromossmicas estruturais.
Muitos tipos diferentes
de oxignio reativos
so produzidos
Radiaes Ionizantes X Terapia Anticncer
- clulas tumorais esto mais freqentemente em mitose em
relao aos tecidos normais
aumenta a freqncia de quebras cromossmicas
letalidade em clulas que esto em mitose
mais freqentemente morrem
as clulas tumorais
Radiao no-ionizante
embora a luz ultravioleta (UV) no tenha energia suficiente para induzir
ionizaes, carrega energia suficiente para causar mutaes na molcula.
- A UV absorvida por muitas molculas orgnicas como purinas e
pirimidinas no DNA, que ficam mais reativas.
Formao de um fotodmero de
ciclobutano
Interferem no pareamento
normal de bases.
Gera transies, transverses,
mudana na matriz de leitura,
duplicaes e delees.
Tipos de danos no DNA
Gene, 250:15-30, 2000
Stio apurnico
Intercalaes
Stio apirimidnico
Dmeros de pirimidina
Quebras duplas
Ponte intercadeia
Quebras simples
Ponte DNA-protena
Alquilao
Danos de base
Ponte intracadeia
Adutos tipo bulky
Formao de radical
Gen
Gen

tica Toxicol
tica Toxicol

gica
gica
Gen
Gen

tica Toxicol
tica Toxicol

gica
gica
Disciplina cientfica que identifica e analisa a ao de um grupo de
agentes txicos que so capazes de interagir com o material
gentico dos organismos (agentes genotxicos).
Cincia Multidisciplinar
Estabelecer a correlao existente entre a exposio a agentes
xenobiticos e a induo de alteraes genticas tanto nas
clulas germinativas como nas somticas, definindo qual o efeito
que as toxinas ambientaisproduzem sobre a integridade gentica
dos seres vivos.
Agentes genot
Agentes genot

xicos e a indu
xicos e a indu

o de dano gen
o de dano gen

tico
tico
Agente genotxico
Agente direto Agente indireto
Interao com o DNA
Reparao
Eficiente
DNA no alterado
Ineficiente
Dano gentico
Clula
somtica
Clula
germinativa
Mecanismo b
Mecanismo b

sico de repara
sico de repara

o de DNA
o de DNA
Reparao
Livre de erro Sujeita a erro
Eliminao do
aducto
Fixao das
mutaes
Dano
gentico
Fidelidade
Gentica
Metabolismo de Agentes Xenobi
Metabolismo de Agentes Xenobi

ticos
ticos
Xenobitico
Biotransformao
Biodegrada
Biodegrada

o
o
Nucleoflico
Bioativa
Bioativa

o
o
Eletroflico
Detoxificao
Eliminao
Danos a
tecidos
Reaes
imunolgicas

cidos
cidos
Nucl
Nucl

icos
icos
CROSBY; 1998
Biotransformao do
B[a]P
Fgado
parada de
ciclo celular
Apoptose
Inibio da
transcrio
Induo
gnica
Estabilizao
de p53
Bloqueio na
replicao
* Mutaes pontuais
* SCE
* Translocaes
* Recombinao
* Rearranjos no
genoma
Envelhecimento
e doenas
degenerativas
Sndromes
genticas
Cncer
Genotoxinas
Radicais livres
Respostas celulares a danos no DNA
Respostas celulares a danos no DNA
Reparo de DNA
Reparo de DNA
Mutagnese X Carcinognese
A maioria dos produtos carcinognicos so tambm
mutagnicos;
Tumores no so o resultado de um evento gentico
isolado, mas de mltiplos eventos. Diversas mutaes
podem ocorrer em uma mesma clula iniciando uma
neoplasia.
Por este motivo to importante testar a
atividade mutagnica de novas drogas.
Carcinognese
Carcinognese
Produtosou processos que influenciam a iniciao, promoo ou
expanso do tumor (neoplasia).
Neoplasiacrescimento novo e fora de controle
de clulas do prprio organismo.
Decorre de falha no sistema de controle
gentico, no necessariamente mutao.
Mas
Por apresentarem uma atividade similar quanto a dose e eficincia
de induzir neoplasia pode-se inferir que um produto mutagnico
potencialmente carcinognico.
Exemplo resumido do processo de carcinogenese
Exemplo resumido do processo de carcinogenese
Clula normal
Aducto
Clula iniciada
Clula promovida
Clula tumoral
Neoplasia
Invaso de
outros tecidos
Inicia
Inicia

o
o
Promo
Promo

o
o
Progresso
Progresso
Met
Met

stase
stase
Carcin
Carcin

geno direto
geno direto
Pr
Pr

mut
mut

geno
geno
metab
metab

lito reativo
lito reativo
Latncia
Latncia
Cocarcin
Cocarcin

geno
geno
Prolifera
Prolifera

o celular
o celular
autnoma
autnoma
Importncia de estudos de mutagnese
Mutao: se no mata a clula ela pode se proliferar no corpo
em crescimento (mutao somtica) ou ser transmitida para
as prximas geraes (mutao germinal).
Estima-se que as muraes somticas e germinais so
responsveis por:
50% das mortes fetais,
30% dos problemas de aprendizagem,
20% dos defeitos congnitos, e
2% da infertilidade masculina.
A leso que parece pior a curto prazo nem
sempre a pior a longo prazo.
Por este motivo que a avaliao de baixas
doses to importante.
Nenhum teste isolado capaz de detectar todos os tipos de
mutao induzida.
Baterias de bioensaios genticos foram desenvolvidas para
identificas os trs maiores alvos de danos genticos:
Murao gnica (mutao gnica)
Clastognese (aberraes cromossmicas estruturais)
Aneugnese (aberraes cromossmicas numricas)
Bioensaios gen
Bioensaios gen

ticos
ticos
In vitro In vivo
Assays for Gene Mutations
Salmonella typhimuriumreverse mutation assay (Ames test,
bactria)
X
Escherichia coli reverse mutation assay (bacteria) X
Gene mutation in mammalian cells in culture X
Drosophila sex-linked recessive lethal assay (fruit fly) X
Gene mutation in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X
Mouse Spot test X

Assays for Chromosomal and Genomic Mutations
In vitro cytogenetic assay (CHO/SHE/Human lymphocyte) X
In vivo cytogenetic assay X
Micronucleus test X
Dominant lethal assay X
Herutable translocation assay X
Mammalian germ cell cytogenetic assay X

Assays for DNA Effects
DNA damage and repair: unscheduled DNA synthesis in vitro X
Mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae (yeast) X
In vitro sister chromatid exchange(SCE) assay X

Principais ensaios genot
Principais ensaios genot

xicos
xicos
Bateria de testes de genotoxicidade (de acordo com o ICH*) usada
no registro de novas drogas:
Um teste de mutao gnica em bactria.
Um teste in vitro para avaliao citogentica de dano
cromossomal com clulas de mamfero ou o teste in vitro
mouse lymphoma TK.
Um teste in vivo para dano cromossmico com clulas
hematopoeticas de roedores.
International Conference on Harmonization of technical requirements for
registration of pharmaceuticals for human use.
Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for
Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1).
Boas Prticas de Laboratrio (BPL)
... Assegurar a gerao de resultados de alta qualidade e
confiabilidade...
Aplicao dos principios de BPL em estudos de curta durao:
1. Organizao do pessoal e da Instalao Teste.
2. Programa de Garantia da Qualidade.
3. Equipamentos, Materiais e Reagentes.
4. Sistema Teste.
5. Substncia teste e referncia.
6. Procedimentos Operacionais Padro.
7. Conduo do Estudo.
8. Relatando o Resultado.
Os ensaios devem ser realizados de acordo com guidelines
internacionais, como OECD, EPA, ICH, etc.
TESTE DE AMES
TESTE DE AMES
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: HealthEffects. Bacterial Reverse
Mutation Teste: No. 471
Esquema do funcionamento do sistema regulatrio SOS
Nas linhagens de Salmonella typhimurium utilizadas no teste
Salmonella/Microssoma, a resposta SOS otimizada pela presena
do plasmdio pKM101, carregando os genes mucAB, alelos de
umuCDde bactrias, envolvidos na reparao sujeita a erro. Ao se
transformar em co-protease, RecA, alm de desreprimir o sistema
SOS, tambm cliva UmuD, gerando uma forma ativada, UmuD, que
se complexa com UmuC. Este complexo se liga a sub unidade da
DNA polimerase I, permitindo que esta realize a sntese transleso,
levando portanto a mutagnese
Resultado negativo:
N revertentes/placa do ensaio similar ao n de
revertentes/placa espontneos
Indcio de mutagenicidade:
Quando um dos requisitos no for significativo
Resultado positivo:
ndice Mutagnico > ou = a 2 (> ou = 3 para a linhagem
1535)
IM= n revertentes placa ensaio/ n revertentes placa
c-
Curva dose resposta significativa (valor de p)
Diferena significativa entre as mdias dos
revertentes/placa das diferentes doses (Anova)
Resultado Txico:
ndice Mutagnico < 0,6
Em resultados positivos:
Teste de revertentes verdadeiros.
Ativao Metablica (S9):
Aroclor 1254
S9
S9mix
Linhagens
Linhagens
Strain Type of Mutation
S. typhimuriumTA97a frameshift
S. typhimuriumTA98 frameshift
S. typhimuriumTA100 base-pair substitution
S. typhimuriumTA1535 base-pair substitution
S. typhimuriumTA102 base-pair substitution
E. coli WP2 base-pair substitution
Linhagens:
TA98- Erro no quadro de leitura
his
D3052
- CGCGCGCG -
- GCGCGCGC -
TA100 - Substituio em pares de bases
his
G46
de prolina - GGG - por leucina - GAG -
- CCC - - CTC -
Mutao rfa- aumento da permeabilidade
Mutao uvrB- inativao do sistema de reparo por exciso do DNA
Plasmdeo pkM101 - aumento do sistema de reparo sujeito a erro e
confere resistncia a ampicilina
Linhagens
TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535
Gene Mutado hisD6610
his01242
hisD3052 hisG46 hisG428 hisG46
Aminocido
requerido
Histidina
Biotina
Histidina
Biotina
Histidina
Biotina
Histidina Histidina
Biotina
Mutao rfa rfa rfa rfa rfa
Caracterstica PBL* PBL PBL PBL PBL
Mutao uvrB uvrB uvrB - uvrB
Caracterstica Sensibilidade luz
uvrB
Sensibilidade luz
uvrB
Sensibilidade luz
uvrB
Resistncia luz
uvrA e uvrB
Sensibilidade luz
uvrB
Plasmdeo pKM101 pKM101 pKM101 pKM101
pAQ1
-
Caracterstica Resistncia
ampicilina
Resistncia
ampicilina
Resistncia
ampicilina
Resistncia
ampicilina e
tetraciclina
Sensibilidade
ampicilina e
tetraciclina
Taxa de mutao
espontnea
90 - 180 30 - 50 120 - 200 240 - 320 5 - 30
Tipo de mutao
detectada
Deslocamento do
quadro de leitura
Deslocamento do
quadro de leitura
Substituio de
pares de bases
Substituio de
pares de bases
Substituio de
pares de bases
* PBL: perda parcial da barreira de lipopolisacardeos, aumentando a permeabilidade
da membrana a molculas grandes, que normalmente no passariam pela mesma.
Caracter Caracter sticas genot sticas genot picas das linhagens de picas das linhagens de S. typhimurium S. typhimuriumutilizadas no Teste de Ames utilizadas no Teste de Ames
Controles
Controles
Qumico Soluo
estoque (g/ml)
Concentrao
final
(g/plate)
Linhagem
S-9
Azida Sdica (NaN) 100 10 TA100
-
TA1535
-
4-Nitroquinolina
1-oxide (NQO)**
10 0.5 TA97a
-
TA98
-
TA102
-
WP2 -
Aflotoxina B
1
(AFB
1
) 100 10 Todas as
linhagens +
Strains S9 n Mean n
Spontaneous
S.D. Range
Revertants Lower Upper
TA97a - 167 112,96 27,94 42 195
TA97a + 156 121,47 36,15 55 346
TA98 - 180 19,30 11,07 5 69
TA98 + 180 26,12 26,20 8 77
TA100 - 151 139,41 32,10 89 274
TA100 + 151 131,13 32,76 73 264
TA102 - 155 251,76 54,34 95 479
TA102 + 137 292,24 64,23 180 497
TA1535 - 128 8,71 6,88 1 39
TA1535 + 121 8,85 5,20 1 25
WP2 - 18 130.44 64.76 80 336
WP2 + 18 128.66 40.49 99 240
Hist
Hist

rico de muta
rico de muta

o espontnea
o espontnea
g/placa Revertentes HIS+/placa Mdia S.D. IM
0
a
200 183 196 193,00 8,89 -
4 181 195 171 182,33 12,06 0,94
20 181 178 220 193,00 23,43 1,00
100 121 118 141 126,67 12,50 0,65
500 107 130 134 123,67 14,57 0,64
2500 125 135 124 128,00 6,08 0,66
1 (NaN
3
)
b
608 640 644 630,67 36,00 3,26
Freqncia de mutao reversa HIS+ em S. typhimuriumTA100 aps
tratamento com x no teste de pr-incubao sem metabolizao.
Teste de Ames
Variaes de mtodo:
-Incorporao em placas: cultura bacteriana, amostra (volume mximo
200 l) e S9 so misturados em tubo com gar de superfcie e
plaqueados imediatamente em meio mnimo.
- Pr-Incubao: cultura bacteriana, amostra (volume mximo 200 l)
e S9 so misturados em tubo e pr-incubados (20 a 30 min) antes de
receber gar de superfcie e serem plaqueados em meio mnimo.
-Microssuspenso (Kado): cultura bacteriana prconcentrada (5 a
10 vezes), amostra (volumes pequenos: 5 a 10 l) e S9 (50 l) so
misturados em tubo e pr-incubados (90 min) antes de receber gar
de superfcie e serem plaqueados em meio mnimo. Indicado para
volumes pequenos de amostra e tem sensibilidade de 5 a 10 vezes
maior que o teste convencional.
- Mtodo Direto: aumento do volume mximo da amostra (2000 l).
Recomendado para amostras lquidas pouco concentradas ou
quando existe suspeita da existncia de presena de compostos
genotoxxicos que podem no ser recuperados pelos mtodos
tradicionais de extrao orgnica.
Baseia-se na idia de que quebras nas fitas de DNA ou fibras
rompidas do fuso acromtico permitem a um cromossomo inteiro
ou cromossomos formar ncleos de tamanho menor aps uma
rodada de diviso celular (Ji, Q. et al,. 1999);
Adiciona bastante velocidade e robustez estatstica anlise;
Validado internacionalmente;
Aberraes numricas e cromossmicas;
Fcil execuo e anlise
TESTE DE MICRON
TESTE DE MICRON

CLEOS (MN)
CLEOS (MN)
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: HealthEffects. Erythrocytes
Micronucleus Test: No. 474
Maturao
Agentes
Genotxicos
Quebra
Dano no
fuso
Fragmento
cromossmico
Cromossomo
inteiro
Prfase Metfase Anfase Telfase
Clulas
comMN
Tratamento in vivo de 5 animais
de cada sexo em cada dose.
Mnimo 3 doses.
Trs dias de tratamento.
Abate no quarto dia
Anlise dos microncleos em
eritrcitos de medula ssea.
Preparao de lminas com
esfregao da medula ssea de
ambos os fmures de cada animal.
Anlise em microscpio de 500 clulas avaliando a proporo
de PCE e NCE Pode indicar toxicidade, quando o nmero de clulas
jovens decai em relao ao nmero de clulas antigas.
Anlise de 1000 PCE por lmina avaliando a presena de
microncleos Indica a induo de dano ao DNA.
PCE Eritrcito Policromtico.
Clula mais jovem, com maior
quantidade de RNA no citoplasma
e apresentando colorao roxa.
NCE Eritrcito Normocromtico.
Clula mais antiga, que jperdeu
o RNA do citoplasma e apresenta
colorao laranja.
Dose diria (mg/kg) Mortalidade (%)
3 X 187,5 Zero
3 X 375 16,67
3 X 750 33,33
Ensaio de toxicidade. Percentagem de sistemas teste mortos em
cada grupo teste tratado com substncia teste.
Grupo Sexo Nmero de EPC em1000 eritrcitos
(mg/kg) Individual Por sexo
Mdia dp
Por grupo
Mdia dp
C- M 650 720 611 587 626 638,8 50,8 630,2 59,8
F 671 643 680 614 500 621,6 72,7
D1 M 594 694 727 683 742 688,0 57,7 702,3 49,4
3 X 87,5 F 755 651 708 740 729 716,6 40,5
D2 M 570 770 558 652 661 642,2 85,3 665,0 63,5
3 X 175 F 700 694 648 701 696 687,8 22,4
D3 M 675 772 797 776 678 739,6 58,4 693,3 80,8
3 X 350 F 550 651 740 594 700 647,0 76,9
C+ M 621 668 646 580 625 628,0 32,7 657,9 43,6
2 X 25 F 706 663 650 726 694 687,8 31,1*
Ensaio de Microncleos. Nmero de Eritrcitos Policromatfilos (EPC)
em 1000 eritrcitos, mdia e desvio padro por sexo e por grupo.
* P<0,05
Grupo Sexo mEPC em 2000 EPC
(mg/kg) Individual Por sexo
Mdia dp
Por Grupo
Mdia dp
C- M 4 4 1 3 5 3,4 1,5 3,4 1,5
F 3 5 1 5 3 3,4 1,7
D1 M 1 2 1 0 1 1,0 0,7 1,5 1,1
3 X 87,5 F 3 0 3 2 2 2,0 1,2
D2 M 5 2 0 3 1 2,2 1,9 2,8 1,5
3 X 175 F 4 4 4 3 2 3,4 0,9
D3 M 1 1 2 3 0 1,4 1,1 2,0 1,6
3 X 350 F 1 1 5 2 4 2,6 1,8
C+ M 27 11 12 27 45 24,4 13,9 25,3 9,6*
2 X 25 F 22 29 29 29 22 26,2 3,6
Ensaio de Microncleos. Nmero de Eritrcitos Policromatfilos com
microncleos (mEPC) em 1000 eritrcitos, mdia e desvio padro por sexo
e por grupo.
*P<0.0001 (teste t-Student)
Aplicao desde o incio do sculo 20;
Necessidade de anlise criteriosa e demorada;
, portanto, ainda, o mtodo mais confivel para avaliar danos
ao material gentico;
Baseia-se na observao em microscpio da morfologia de
preparaes cromossmicas do material biolgico de interesse.
TESTE DE ABERRA
TESTE DE ABERRA

ES CROMOSSMICAS (AC)
ES CROMOSSMICAS (AC)
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals / Section 4: HealthEffects. In VitroMammalian
Chromosome Aberration Test: No. 473
48 h incubao
4 h tratamento
Cultura
celular
70 h
Colchicina (2 h)
Tratamento hipotnico
(20 min)
Fixao
Analise Cromossmica
Colorao
AB. NUM. ABERRAES CROMATDICAS ABERRAES CROMOSSMICAS Aberr.
Endo Poli GAP Del. Trocas Frag. Min. GAP Del. Trocas Frag. Min.
Mult.
redu. ploid. intra inter Dic Tri Anel
Mais de 7
aberraes

Anlise de 2000 clulas por lmina avaliando o
ndice Mittico.
Anlise de 200 clulas por dose avaliando
Aberraes Cromossmicas.
Aberraes Cromossmicas
em linfcitos humanos
Cromossomos normais de
linfcitos humanos
ndice Mittico (%)
1
Cultura
n
Substncia
Teste
Concentrao
Mdia D.P.
3
Sobrevivncia
2
(% do controle)
1 DMSO 0,5 % (v/v)
8,58 1,58
100
2 x 0,8 g/mL
8,68 1,66 101,08
3 x 4 g/mL
8,14 1,66 94,82
4 x 20 g/mL
8,88 2,93 103,49
5 x 100 g/mL
8,55 2,42 99,59
6 x 500 g/mL
18,48 1,73 215,26
Concentraes da substncia teste e os ndices Mitticos obtidos no
ensaio de Avaliao de Toxicidade.
nd. Mittico
1
Sobrev.
2
Nmero de clulas aberrantes
Substncia
Teste1
Tratament
o
Mdi
a
D.P.
3
%
Total
(por cultura)
Mdia D.P.
3
Nde
clulas
aberr /
Nde
clulas
DMSO 0,5 % (v/v) 3,70 1,51 100 14 (6, 2, 4, 2) 3,50 1,91 0,070
Etoposideo
4
1 g/mL 1,39 0,67 37,50 139
(44, 46,16,33)
34,75*
*
13,74 0,808
x 100 g/mL 9,79 4,51 264,53 7 (0, 4, 2, 1) 1,75 1,71 0,035
x 200 g/mL 12,16 1,88 328,61 5 (1, 1, 3, 0) 1,25 1,26 0,025
x 300 g/mL 15,24 2,38 411,82 2 (2, 0, 0, 0) 0,50 1,00 0,010
x 400 g/mL 16,05 1,72 433,78 2 (0, 1, 0, 1) 0,50 0,58 0,010
x 500 g/mL 15,32 3,19 414,19 8 (1, 2, 3, 2) 2,00 0,82 0,040
Concentraes da substncia teste, ndices Mitticos e resultados das anlises de aberraes
cromossmicas obtidos no ensaio de Avaliao de Mutagenicidade na ausncia de
metabolizao e com 4 horas de tratamento.
1
Contagem de oito lminas, 1000 clulas por lmina;
2
Sobrevivncia baseada no ndice mittico do
controle negativo;
3
desvio padro;
4
172 metfases analisadas; **P < 0,01, Dunnetts Multiple
Comparison Test.
Aberr.
Numricas
Aberraes Estruturais
Aberraes Cromatdicas Aberraes Cromosmicas Substncia
Teste
Tratamen
to
End. Polip.
GA
P
Del. Intra
.
Inter
.
Fra
g.
Min. GA
P
Del.
Dic
Tri. Anel Frag
.
Min Ab.
Ml.
DMSO 0,5 %
00 00 02 07 00 00 08 00 01 01 00 00 00 04 00 00
Etoposideo
1
1 g/mL
00 00 31 11
8
00 06 14 02 04 07 00 00 00 57 01 81
x
100g/mL
00 00 00 06 00 00 02 00 00 01 00 00 00 00 00 00
x
200g/mL
01 00 00 08 00 00 00 00 00 00 00 00 00 01 00 00
x
300g/mL
02 00 01 01 00 00 00 00 00 00 00 00 00 01 00 00
x
400g/mL
01 00 00 04 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00
x
500g/mL
00 00 00 09 00 00 01 00 00 02 00 00 00 00 00 00
Nmero e tipo de aberraes cromossmicas encontradas no ensaio de Avaliao de
Mutagenicidade em ausncia de ativao metablica e com quatro horas de tratamento.
Quando um produto apresenta um resultado positivo
Um resultado positivo in vitro no o final do processo de
anlise.
>25% das drogas no mercado tm ao menos um
resutado positivo na avaliaes de Gentica Toxicolgica.
Nem todos os resultados positivos so relevantes para
humanos, que frequentemente esto expostos a compostos
em baixas concentraes.
Resultados positivos in vivo so mais problemticos do que
resultados positivos in vitro.
A escolha do teste e a qualidade com que feito o desenho
experimental so muito importantes.
Reviso dos resultados de todos os ensaios (S2 R1):
A resposta preenche todos os requisitos para ser
considerada um resultado positivo?
A resposta dose - resposta?
A resposta reprodutvel?
A resposta ocorre em doses inferiores as condies de
cultura aceitveis, ex. pH, osmolaridade, ou nveis de
precipitados?
Para clulas de mamferos o efeito observado somente
em nveis extremamente baixos de sobrevivncia?
A resposta positiva pode ser atribuda a contaminantes?
Os resultados obtidos para um alvo genotxico especfico
so consistentes com os resultados obtidos para
outros compostos da mesma classe qumica?
Resultado positivo in vitro
Resultado positivo in vitro pode requeres uma demonstrao de
biodisponibilidade in vivo.
essencial demonstrar biodisponibilidade em altas doses.
Resultado positivo in vitro e resultado negativo in vivo (medula
ssea) pode requerer um segundo teste in vivo para a obteno de
informaes adicionais.
Este segundo ensaio deveutilisar:
uma espcie diferente,
um rgo alvo diferente,
um diferente mode de ao.
Resultado positivo in vivo
Resultados de testes de genotoxicidade in vivo, principalmente
teste de citogentica em medula ssea, desempenha um papel
vital na avaliao de risco. Aumento em clulas de medula
ssea micronucleadas tem alto poder regulatrio, indicando
que o composto teste um carcingeno genotxico potencial.
No entanto, existem novas evidncias de que distrbio
fisiolgicos (alteraes na temperatura corporal, aumento na
eritropoese, inibio da sntese protica) induzidos por
compostos qumicos em roedores usados nestes testes podem
ocasionar aumento em clulas de medula ssea
micronucleadas que no esto relacionadas ao potencial
genotxico do composto em teste.
Tweats et al. 2007a and b
Tweats et al. 2007
A avaliao do potencial genotxico de um composto
deve tomar em considerao todos os resultados e
reconhecer o valor intrinseco e as limitaes de teste
in vitro e in vivo.
ICH S2
Outros testes de genotoxicidade
Outros testes de genotoxicidade
comumente utilizados
comumente utilizados
Clulas de linfoma de camundongo L5178Y
tk+/-
3.7.2C
Heterozigotas no lcus da timidina kinaseTk1 no cromossomo 11.
Mamferos normalmente tm duas cpias de cada gene, no entanto esta
linhagens possui apenas uma cpia, sendo referida como TK+/TK-.
-Timidina kinase uma enzima no essencial que permite a uma clula
utilizar uma rota metablica alternada por incorporar timidina no DNA.
- Trifluorotimidina (TFT) uma anlogo txico da timina que quando
incorporado ao DNA no lugar da timidina, interfere no metabolismo do DNA
matando a clula.
-No entanto se a cpia funcional do gene TK perdida por uma mutao, o
TFT no metabolizado e no txico, permitindo o
-crescimento das colnias.
MOUSE LYMPHOMA ASSAY
MOUSE LYMPHOMA ASSAY
Teste de muta
Teste de muta

o gnica em c
o gnica em c

lulas de mam
lulas de mam

feros
feros
Plaqueamento para sobrevivncia
O plaqueamento de sobrevivncia deve ser realizado para o
mtodo de micropoos e para tratamento de 24hs.
A concentrao celular ajustada e as culturas so incubadas por 1
2 semanas, sendo o nmero de clones viveis avaliado.
A dose mais alta a ser utilizadas deve reduzir a sobrevivncia para
80 90% ou para substncias no txicas deve ser adotado o limite
da solubilidade, sendo o limite mximo 5mg/ml.
Perodo de expresso
As clulas tratadas so lavadas e crescidas para a fixao da
mutao por 48hs (perodo para expresso e fixao da mutao da
mutao). Quando efeito txico observado pode ser aplicado um
perodo de expresso maior para permitir a recuperao de clula.
Plaqueamento para viabilidade
Existem dois mtodos: plaqueamento em agar e em placas de 96
poos.
Mtodo Agar
Aps o perodo de expresso, a densidade celular ajustada em
meio seletivo contendo agar e TFT. Uma segunda bateria de
placas preparada na ausncia de TFT para avaliar a viabilidade
das clulas aps o tratamento.
As culturas so incubadas por 10 - 14 dias a 37
0
C.
O teste normalmente realizado duas vezes para assegurar
reprodutibilidade.
As colnias so contadas como no teste em bactrias, a freqncia
de mutaes calculada em termos de nmero de colnias
mutantes em 10
6
clulas viveis.
Mtodo de micropoos
Aps o perodo de expresso, as clulas so diludas at a
densidade padro meio seletivo TFT na ausncia de agar.
As clulas so dispensadas em placas de 96 poos, sendo
incubadas por 13 dias. Uma segunda bateria de clulas diluda em
meio na ausncia de TFT para medir a viabilidade celular.
No final do perodo as placas so examinadas para avaliar o nmero
de poos com colnias.
A freqncia de mutao expressa como a eficincia clonognica
em meio seletivo dividido pela eficincia clonognica em meio no
seletivo.
Neste mtodo colnias so acmulos de crescimento nos poos.
Colnias grande e pequenas
Quando o gene TK perdido por mutao, as clulas crescem
relativamente bem e formam colnias grande normais. Quando o gene
TK perdido por uma grande injria gentica como uma quebra
cromossmica, outros genes tambm so negativamente afetados e as
clulas iro crescer com dificuldades resultando em colnias pequenas
anormais.
Embora praticamente todos os agentes mutagnicos produzam uma
mistura dos dois tipos de colnias, em teoria a proporo de colnias
grande e pequenas podem indicar o modo de ao do composto.
Critrios para aceitao dos ensaios
-A freqncia de mutantes no controle negativo deve estar dentro
da taxa normal (60 mutantes em 10
6
clulas viveis no mais do
que trs vezes este valor).
- Uma dose do controle positivo deve induzir claro aumento na
freqncia de mutantes.
- A eficincia de plaqueamento do controle negativo do
experimento de mutagnese deve estar entre 60 - 140% no dia 0
e entre 70 130% no dia 2.
Avaliao do resultado
A relevncia biolgica dos resultados deve ser considerada a
questo crtica, no entanto a anlise estatstica pode ajudar na
interpretao.
Critrios para umteste ser considerado positivo:
-O ensaio deve ser vlido
- A freqncia de mutantes em uma ou mais doses deve ser
significativamente diferente do controle negativo.
- Deve apresentar uma correlao dose-resposta.
ENSAIO COMETA
ENSAIO COMETA
Eletroforese em gel em c
Eletroforese em gel em c

lula
lula

nica
nica
Desenvolvido por Singh e cols. (1988) para detectar o dano
primrio ao DNA
bastante sensvel, detectando quebras simples e duplas e
stios alcalilbeis nas molculas de DNA;
Microeletroforese de clulas suspensas em uma fina
camada de agarose disposta sobre uma lmina e lisadas
por detergentes e alta concentrao de sais.
Teste indicativo
Simples, sensvel e rpido
Danos em clulas individuais
Pequeno nmero de clulas
Pode ser realizado em qualquer clula nucleada
Dano e reparo no DNA
Muito usado em estudos de gentica toxicolgica
Aps a eletroforese as clulas (nucleides) adquirem uma morfologia
semelhante a de um cometa;
Cabea representa o arcabouo de DNA intacto e a cauda, fragmentos
provenientes de leses no DNA.
25 m
Villela et al., 2006
Uma das manifestaes do dano a o DNA so os eventos de
recombinao (crossing-over) mittica;
Utilizando-se tcnicas apropriadas possvel identificar a
composio das cromtides na metfase;
Cromossomos Arlequim.
Troca de Crom
Troca de Crom

tides Irms (SCE)


tides Irms (SCE)
Novas tendncias em toxicologia
Novos m
Novos m

todos para avalia


todos para avalia

o toxicol
o toxicol

gica
gica
Genotoxicidade
Genotoxicidade
Mutagnese
Mutagnese
DNA
DNA
RNA
RNA
transcriptom
a
Prote
Prote

na
na
proteoma
Solu
Solu

o de problemas
o de problemas
-
-
Susceptibilidade
Susceptibilidade
-
-
Tempo
Tempo
-
-
Exposi
Exposi

o
o
m
m

ltipla
ltipla
Biomarcadores,
Biomarcadores,
An
An

lise toxicogenmica
lise toxicogenmica
Expresso gnica
Expresso gnica
(microarranjos)
(microarranjos)
Expresso prot
Expresso prot

ica
ica
(
(
chip
chip
de prote
de prote

nas)
nas)
Projetos p
Projetos p

s
s
-
-
genmicos
genmicos
metiloma
RLGS
Contato
Dr. Izabel Vianna Villela
izabel_genotox@institutoroyal.com.br