Colinesterasa.

La acetilcolinesterasa: también llamada colinesterasa del glóbulo rojo, colinesterasa eritrocitica,o colinesterasa verdadera, se encuentra principalmente en sangre y sinapsis nerviosa. La butirilcolinesterasa: también conocida como colinesterasa sérica o pseudocolinesterasa, se encuentra principalmente en el hígado, se haya disuelta en el plasma sanguíneo, el corazón, musculo liso, líquido cefalorraquídeo y en los tejidos pancreáticos y nerviosos.

Ambos compuestos catalizan la hidrolisis del neurotransmisor acetilcolina sobrante en el espacio sináptico en colina y ácido acético, reacción necesaria para permitir que la neurona colinérgica retorne a su estado de reposo después de la activación evitando así una transmisión excesiva de acetilcolina, que produciría una sobre estimulación del efector y como consecuencia, debilidad y cansancio. La diferencia entre los dos tipos de colinestersa está en sus respectivas preferencias por sustratos: la primera hidroliza acetilcolina más rápido; la segunda hidroliza butirilcolina colinesterasa más rápido. Cuando los niveles de colinesterasa son bajos por la excesiva inhibición, el sistema nervioso puede funcionar mal, lo cual puede conducir a la muerte. Ciertas familias de pesticidas, como los organofosforados y carbamatos interfieren o inhiben la colinesterasa. Estos productos se utilizan principalmente para controlar plagas de artrópodos. A pesar de que los productos inhibidores de colinesterasa están destinados para control de plagas éstos, en algunas situaciones, pueden ser venenosos o tóxicos para los seres humanos. Las personas pueden entrar en contacto con los químicos inhibidores de colinesterasa a través de la inhalación, ingestión, o contacto por los ojos o piel durante la fabricación, mezcla, o aplicación de estos pesticidas.

INHIBIDORES DE LA COLINESTERASA Dentro de los plaguicidas inhibidores de la colinesterasa se encuentran los organofosforados y carbamatos, que ocasionan el 80% de las intoxicaciones por pesticidas en el mundo. Los organofosforados: Son sustancias clasificadas químicamente como esteres, derivados del ácido fosfórico y ácido fosfonico utilizadas como plaguicidas para el control de insectos; son biodegradables, poco solubles en agua y muy

es un transmisor primario neuro-humoral del sistema nervioso. También son inhibidores enzimáticos.La acetilcolina es el sustrato natural de la enzima acetil colinesterasa. respiratoria u oral a estos plaguicidas. Carbamatos: Estos compuestos son derivados del ácido carbamico. Manifestaciones clínicas: Los signos y síntomas de este tipo de intoxicación pueden presentarse dentro de pocos minutos hasta 1 a 2 horas posteriores a la exposición. En relación al tratamiento. broncorrea. Ambos causan perdida de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa necesaria en el organismo para la hidrolisis de la acetilcolina. bronco espasmo. La transmisión normal de un impulso por la acetilcolina es seguida por una rápida hidrólisis del neurotransmisor (acetilcolina) por parte de la enzima acetilcolinesterasa. diarrea. . lo que la hace reversible. bradicardia. permitiendo la acumulación de acetilcolina en la hendidura sináptica y estimulando excesivamente el SNC. traducido clínicamente en un síndrome colinérgico. El cuadro clínico toxico es similar al estudiado en los organofosforados. los receptores muscarinicos de las células efectoras parasimpáticas. Se presenta un deterioro progresivo estableciéndose el cuadro de un síndrome colinérgico agudo cuyas manifestaciones agudas pueden ser de tres tipos: muscarinicas. Mecanismo de acción: Los fosforados orgánicos y carbamatos tienen como acción principal la inhibición de la enzima acetil-colinesterasa. los receptores nicotínicos presentes en la placa neuromuscular y en los ganglios autónomos. miosis.liposolubles. Los síntomas nicotínicos tienden a ser los primeros en aparecer. sialorrea. dolor abdominal tipo cólico. diaforesis. disuria. su presentación más frecuente es en forma líquida. lagrimeo. es básicamente igual a los organofosforados. pues van a formar compuestos carbamilados que pueden potenciar los efectos del inhibidor. La intoxicación aguda por organofosforados ocurre después de exposición dérmica. mientras que los carbamatos actúan por carbamilacion de la enzima y esa unión es más débil e inestable. vomito. falla respiratoria.  SíndromeMuscarinico:visión borrosa. nicotínicas o de sistema nervioso central según los receptores colinérgicos correspondientes. con la salvedad de no utilizar oximas reactivadoras en varios de ellos. lo cual limita la duración e intensidad de los estímulos. Los organofosforados actúan por fosforilizacion enzimática originando una unión muy estable que se considera “irreversible”. disnea. tanto la colinesterasa eritrocitica o verdadera como la plasmática o pseudolinesterasa.

  Síndrome Neurológico: ansiedad. fasciculaciones musculares. confusión mental. el requerimiento de equipo es mínimo y la posibilidad de realizar un número grande de determinaciones en un tiempo relativamente corto. colapso.La visión borrosa se presenta en el paciente con inhibición paulatina de las colinesterasas. ataxia. Método espectrofotométrico enzimático de Harlyn y Ross. llegando a generalizarse y persistir aun después de la muerte durante unos minutos debido a la acumulación de acetilcolina en las placas neuromusculares. pero puede presentarse inicialmente midriasis en la fase primaria de la intoxicación. Métodos para la determinación de colinesterasa. convulsiones. debidas a la acción nicotínica. Esta técnica se basa en la medida del ácido acético producido por la acción de la acetilcolinesterasa sobre la acetilcolina. La cantidad de ácido es medida en términos de cambio de pH producido por la actividad enzimática en una solución tampón estándar en un período de tiempo definido. calambres.    Método potenciometrico de Michel.Las fasciculaciones musculares. ocasionada por contactos continuados con el toxico. Método de Ellman. se evidencian con frecuencia en los grupos musculares de la región palpebral. La lectura del pH puede hacerse fácilmente en un tiempo de un minuto por cada muestra. Por lo tanto es posible hacer una serie grande de determinaciones en pocas horas agregando el substrato a las muestras en intervalos de un minuto. Síndrome Nicotínico:Midriasis inicial. depresión cardio-respiratoria central. coma. Se utiliza la técnica cuantitativa de Michel & Aldrige para la determinación de la actividad de la acetilcolinesterasa en glóbulos rojos y plasma. . ocasionada por una liberación de adrenalina endógena. músculos faciales y de los dedos. Determinación de la enzima acetilcolinesterasa en sangre humana Método potenciometrico: Se realiza la determinación de la actividad de la colinesterasa como biomarcador de efecto. mialgias.La miosis es un signo característico en intoxicaciones por organofosforados o carbamatos. o en la fase final de la intoxicación por acción nicotínica o parálisis muscular la cual es premonitoria de muerte. Dentro de las ventajas de este método se encuentra su simplicidad de ejecución.

Patrón de organofosforados Estándar trazable de algún compuesto organofosforado. También puede utilizarse una mezcla de dos productos para obtener un efecto aditivo. La acetilcolina es altamente higroscópica y fotolábil. debe ser manipulada con mascarilla apropiada y protección para los ojos y piel.237 g de barbital sódico. 0. 2 y 3 respectivamente) b) 3 tubos de ensayo como control negativo. Debe ser pesada rápidamente y envasada en un recipiente ámbar inmediatamente después de su preparación.5 g de cloruro de acetilcolina en suficiente agua destilada y desionizada para completar 100 ml en un matraz volumétrico. Muestra de sangre problema Sangre total en tubo con heparina o EDTA.54 g de cloruro de sodio en suficiente agua recién destilada y desionizada para completar 1000 ml en un matraz volumétrico. en matraz volumétrico.Reactivos Solución buffer pH 8 Disuelva 1. (1.02 g% Disuelva 0. por triplicado.02 g de saponina en suficiente agua destilada y desionizada para 100 ml.5 g% Disuelva 1. Procedimiento Rotular: a) 3 tubos de ensayo como blanco. (1. La saponina es una sustancia hemolítica. no expuesta a inhibidores de las ChEs. 2 y 3 respectivamente) . Ajuste a pH 8 utilizando una solución acuosa de HCl 1M y midiendo con el potenciómetro. por triplicado. Solución de acetilcolina 1. b) Control positivo: Adicione a una alícuota de la sangre negativa un volumen prudencial de patrón de organofosforado y homogenice. Solución de saponina 0. Muestra de sangre control a) Control negativo: Sangre total en tubo con heparina o EDTA.136 g de fosfato monobásico de potasio y 17. puede ser un producto comercial. proveniente de una persona sana.

c) 3 tubos de ensayo como control positivo. (1. Preparación de los Controles y muestras: 1. por triplicado. 2. Medir el pH inicial de la solución y registre. Repetir lo anterior con los otros tubos de ensayo restantes Espere aproximadamente un minuto entre la lectura de una muestra y la preparación de la siguiente. con la siguiente ecuación: ([pH1 – pH2]/t) *100 Donde: pH1: pH inicial. expresada como pH/hora. t: período de incubación expresada en horas. 4. Adicionar 100 μL de control/muestra y agitar. 2 y 3 respectivamente) Calibrar el potenciómetro utilizando soluciones de referencia pH 4 y pH 7. 5 ml de saponina y 1 ml de cloruro de acetilcolina y agitar. Adicionar al primer tubo de ensayo 5 ml de solución buffer. Medir el pH inicial de la solución y registre. . Adicionar al tubo de ensayo respectivo 5 ml de solución buffer y 5 ml de saponina. pH2: pH final. Segunda lectura de pH: Medir el pH de cada blanco/muestra/control después de 60 minutos de la primera lectura. Asegure que las soluciones buffer de referencia y las muestras se encuentren a la misma temperatura Preparación de los Blancos: 1. 3. Repetir lo anterior con los otros 2 tubos de ensayo restantes. Cálculo: Calcule la actividad de la actividad de la colinesterasa en sangre. 2.

. el efecto inhibitorio es reversible. se forma 5tionitrobenzoato que presenta un fuerte máximo de absorción a 412nm. los trabajadores no deben regresar al lugar de trabajo cuando los valores de colinesterasa se observan reducidos al menos en un 75% de lo normal. La tasa de formación de color es proporcional a la cantidad de acetilcolinesterasa o butirilcolinesterasa. En casos de intoxicación por carbamatos. En casos de intoxicación leve los niveles de la acetilcolinesterasa se ven generalmente disminuidos entre un 20% y 50% de los niveles normales. La acetilcolina o butirilcolina es hidrolizada por la AchE o PchE respectivamente produciendo ácido carboxílico y tiocolina que reaccionan con el reactivo de Ellam (DTNB. La Colinesterasa plasmática regenera a una tasa del 25% entre 7 y 10 días y vuelve a la línea de base en 4 a 6 semanas. ácido ditionitrobenzoico) para formar una coloración amarilla que es medido espectrofotométricamente a 450nm. Los valores menores a 91 unidades de pH/hora indican una inhibición de las AChEs. pero cuando se trata de intoxicaciones por organofosforados la inhabilitación de la enzima es definitiva. La Colinesterasa eritrocitaria se regenera a una tasa del 1% por día. mientras que el efecto de una intoxicación severa es una depresión a un nivel menor del 10% de lo normal. Método de Ellam: Consiste en una determinación colorimétrica sencilla y rápida utiliza acetil colina como sustrato y valora la tiocolina liberada por la intensidad del color amarillo aparecido al reaccionar esta sustancia con la ditiobinitrobenzoato. En la exposición industrial.Interpretación de resultados:    El valor de referencia es entre 91 pH/hora y 164 pH/hora. en una intoxicación moderada la depresión resulta del 10% al 20% de lo normal.

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