Manual Microbiologia FINAL

Instituto Tecnolgico de Mrida
Manual de Prcticas de Microbiologia
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I. Objetivo general del manual

Proporcionar al alumno las tcnicas y entrenamiento para adquirir la capacidad para el manejo y control de los microorganismos, que permita su uso en procesos sustentables.
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II. Nmero, Nombre y Objetivos especficos de cada prctica

Prctica 1. Clasificacin, preparacin, esterilizacin y manejo del material utilizando en el laboratorio. Diferenciar y aplicar los mtodos de esterilizacin adecuada para los diferentes materiales, usando los diferentes equipos del laboratorio.
Prctica 2. Diferenciacin. Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo. Aplicar la metodologa de preparacin y esterilizacin de diferentes medios de cultivo.
Prctica 3. Determinacin de los parmetros de letalidad trmica: valores D-Z. Aplicar las tcnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.
Prctica
4. Obtencin de cultivos puros, utilizando las diversas tcnicas de
aislamiento. Aplicar las tcnicas de varilla acodada y estra cruzada para la purificacin de cultivos bacterianos.
Prctica 5. Observacin colonial y microscpica de cultivos bacterianos. Obtendr cultivos bacterianos puros y describir su morfologa colonial y aplicar las tcnicas de tincin para su observacin de la morfologa microscpica.
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Prctica 6. Aplicacin de los mtodos de preservacin de microorganismos y diseo de un cepario. Aplicar diferentes tcnicas para la conservacin de cepas microbianas.
Prctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis. Aplicar las tcnicas de cultivos anaerobios.
Prctica 8. Identificacin de bioqumica de enterobacterias. Aplicar las tcnicas y medios de cultivo para la identificacin a travs de pruebas bioqumicas del grupo de enterobacterias.
Prctica 9. Aislamiento, cultivo y observacin colonial y microscpica de hongos filamentosos y levaduriformes. Aplicar las tcnicas de aislamiento y purificacin de hongos y levaduras para su observacin de la morfologa colonial y tinciones para la observacin de su morfologa microscpica.
Prctica 10. Produccin de cidos orgnicos por hongos. Aplicar tcnicas de cultivo sumergido para la produccin de cidos orgnicos y evaluar su rendimiento.
Prctica 11. Pruebas de identificacin para levaduras. Aplicar las tcnicas de observacin microscpica y pruebas bioqumicas para la identificacin de levaduras.
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Instituto Tecnolgico de Mrida Prctica 12. Recuento en placa.
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Aplicar las tcnicas de diluciones decimales y tcnicas de cultivo para el recuento en placa.
Prctica 13. Tcnica del nmero ms probable (NMP). Aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP), y evaluar con sus resultados aplicando las tablas aceptadas por la NOM.
Prctica 14. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido. Aplicar tcnicas de cultivo sumergido y conteo microbiano, durante el desarrollo poblacional para observar el modelo de crecimiento.
Prctica 15. Efecto de los agentes fsicos y qumicos sobre el crecimiento microbiano. Probar el efecto de diferentes agentes fsicos y agentes qumicos a diferentes grupos microbianos, evaluar el efecto de los agentes sobre el crecimiento microbiano.
Prctica 16. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Utilizar la tcnica de PCR para la amplificacin de molculas de ADN, y evaluar el resultado de la amplificacin.
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III. Prcticas de Microbiologa Prctica 1. Clasificacin, preparacin, esterilizacin y manejo del material utilizado en el laboratorio.
1. OBJETIVO Diferenciar y aplicar los mtodos de esterilizacin adecuada para los diversos materiales, usando los equipos del laboratorio.
2. INTRODUCCION El conocimiento de las reas, materiales, equipos, as como el entrenamiento del uso de los mismos en un laboratorio de microbiologa permite aplicarlos en cualquier mbito de trabajo como son el industrial, alimentario, ambiental, investigacin, etc. Los procesos que permiten el manejo seguro de reas libres de microorganismos y poder transferir microorganismos ubicados de un ambiente natural a condiciones controlables de un ambiente artificial, sin contaminacin ha permitido el avance de la microbiologa como ciencia. La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismos y que asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras que la desinfeccin es un proceso que solo elimina formas vegetativas de los microorganismos, los procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a un medio dejndolo libre de contaminacin o asepsia permite manipularlos. Los procedimientos de mayor utilizacin en los laboratorios de microbiologa para la esterilizacin son los mtodos de calor seco, calor hmedo y filtracin. La esterilizacin por calor seco produce la destruccin de los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. ste es un proceso menos eficiente que la esterilizacin por calor hmedo, porque los microorganismos mueren con mayor
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rapidez cuando se encuentran en presencia de agua, ya que ste permite que se altere con mayor facilidad la configuracin de sus protenas y proporciona un medio para distribuir el calor uniformemente en toda la cmara interna del equipo de esterilizacin. Por esta razn, para lograr la esterilizacin del material empleando el calor seco, se deben aplicar temperaturas ms altas durante mayor tiempo, como son desde 150 a 180C, en un horno durante 2 horas. Para esterilizar medios de cultivo, soluciones y cultivos bacterianos, el ms recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a presin de 1 atmosfera, para alcanzar la temperatura de 121C, el material se deja a esta temperatura por 15 minutos para asegurarse de la destruccin de endosporas, que son las estructuras bacterianas ms resistentes al calor. Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como las
soluciones de vitaminas, aminocidos, etc., se esterilizan por filtracin de membranas estriles de 0.2 micras de dimetro y para el caso de materiales de plstico es recomendable el uso de gases con oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con radiaciones u.v o compuestos qumicos en forma lquida como: fenoles, compuestos cuaternarios de amonio (alquil dimetil bencilamonio), formaldehdo, alcoholes, halgenos y detergentes.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas. Subtema. Esterilizacin y asepsia. El manejo de las reas estriles en forma asptica para la aplicacin de tcnicas microbiolgicas demanda que el material y los medios de cultivo empleados estn estriles, esto se logra con la seleccin y aplicacin de la tcnica de esterilizacin como son: esterilizacin con calor seco, con calor hmedo, filtracin, etc.
Instituto Tecnolgico de Mrida 4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Tubos de ensaye de 18 x 150 mm Cajas de petri Pipetas de 1 ml Pipeta de 10 ml Probeta de 50 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Vaso de precipitados de 250 ml
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Cantidad 10 10 10 1 1 1 1 1 1
Equipo Autoclave Estufa incubadora Horno Mechero Fisher Campana de flujo laminar
Pinza de diseccin de acero inoxidable de 18 cm Gradilla Tijera
Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva y cinta testigo.
5. METODOLOGIA Preparacin del material de vidrio 1.-Lavar perfectamente las cajas de petri, pipetas con escobilln y detergente. 2.- Enjuagar con abundante agua corriente. 3.-Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una pizeta, por las paredes interiores. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningn otro medio.
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4.-Una vez seco el material, se proceder a envolver las cajas de petri y pipetas con papel estraza. Para los tubos y matraces se elaboraran tapones de algodn y gasa procurando que ajuste con holgura, sobre los que finalmente se les colocara un gorro de papel. Elaboracin de gorros Para tener una base para la elaboracin de gorros, se toma como medida, aproximadamente, el tamao carta; es adecuada para el gorro de un matraz de 500ml. 1.-Se corta papel dextrasa en forma de rectngulo, del tamao segn se necesita. 2.-Se dobla el papel a la mitad con respecto a la parte larga del mismo. 3.- se doblan las puntas superiores, unindolas en el centro. 4.-De la parte inferior se dobla hacia arriba al borde de la hoja que queda encima, hasta la altura de las puntas unidas en el paso tres. 5.-Se le da la media vuelta al papel. 6.-Se doblan las puntas de los lados, hasta la altura de donde sobresale el doblez del paso nmero cuatro. 7.-De la parte interior se dobla hacia arriba, el borde interior sobresaliente de la hoja hasta el doblez anterior. 8.- Se le da la media vuelta al pape obtenindose de esta manera el gorro. Elaboracin de tapones de algodn En la elaboracin de tapones de algodn, como en el caso de los gorros es
importante tener idea del tamao del algodn a utilizar para obtener un tapn adecuado a las necesidades requeridas. Estos tapones son utilizados en los diferentes tamaos de tubos y matraces.
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Una base para la elaboracin: con una tira de algodn de 15-20cm de largo, 3cm de ancho y un grosor de 0.5 cm, y con una gasa de 10x10cm, se obtiene un tapn adecuado para un matraz de 500ml. 1.- Se corta una tira de algodn, de largo adecuado a las necesidades. 2.-Con una pinza de diseccin se prensa uno de los extremos del algodn. 3.-Se enrolla el algodn en la pinza de manera que quede firme el enrollado. 4.-Seguidamente se corta el cuadro de gasa adecuado a tamao requerido y se coloca en la boca del matraz, procurando centrarlo. 5.- Con la pinza y el algodn enrollado en ella, la gasa se presiona hasta adentro del matraz, de manera que entre uniformemente por todos lados a la boca de este, dejando a flote la punta superior del algodn. La pinza es sacada del algodn dando una vuelta en sentido contrario al enrollado para a que afloje, y jalando hacia arriba presionando el algodn, con la mano, para que no salga de la boca del matraz. 6.-Hasta este paso deben quedar las cuatro puntas de la gasa colgando de los lados de la boca del, matraz: dos de las puntas que se encuentran opuestamente, se amarran entre si formando un lazo. 7.-Luego se amarran las otras dos puntas restantes, obtenindose de este modo el tapn de algodn. Cuando se esterilizan los matraces o tubos, estos deben contener lquido, para evitar que se deterioren por resecamiento del vidrio al calentarse a temperaturas muy elevadas. Si se utilizan tubos con tapas de rosca, cuando se esterilizan lquidos, estos debern estar solo semicerrados. Preparacin y envoltura de pipetas La preparacin de las pipetas para su esterilizacin es muy sencilla, se lavan perfectamente con agua y jabn y se secan por 1 minuto en la estufa a 100C.
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Con un clip se le introduce en la boquilla de succin un filtro de algodn, de tal forma que el algodn entre suavemente y sin romperse sin la presin de la punta del clip, este tapn tiene una doble funcin; una es para evitar que en un descuido de succin forzosa, por obstruccin de la pipeta, se ingiera el producto succionado al des taparse bruscamente; y la segunda razn es para evitar que por la boquilla de succin entren microorganismos que alteren los resultados del trabajo realizado. 1.-Se corta una tira de papel aproximadamente 5 cm de ancho y 30cm de largo. 2.-Se doble el extremo interior de aproximadamente 2cm. 3.- Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior, y con un ngulo de aproximadamente 20-30 grados de inclinacin con respecto a la posicin del papel estraza. 4.-Se hace un segundo doblez, tapando la punta de la pipeta con la porcin del papel que sobresale a la punta de la pipeta. 5.- Se le hace un tercer doblez a la punta del papel que queda en el ngulo de inclinacin, de manera que cubra completamente la punta de la pipeta. 6.- Se da vuelta a la pipeta procurando que el papel vaya envolvindola en forma de espiral, hasta cubrirla por completo y doblar el papel sobrante dejando este paralelo a la pipeta. 7.-Verificar que el enrollado no quede flojo, en caso de estarlo, reafirmar el papel con respecto a la forma de la pipeta. 8.-Cubrir con cinta adhesiva el ltimo doblez. Preparacin y envoltura de cajas de petri Al utilizar cajas petri en los cultivos microbianos tienen que ser esterilizados para poder vaciar dichos medios de cultivo que servirn de nutriente a los microorganismos tratados. Estas cajas se pueden esterilizar por calor hmedo o
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calor seco, siendo ms recomendable el calor seco, por ser ms confiable su efectividad. Es necesario envolver las cajas petri antes de esterilizarlas para evitar que al trmino de la esterilizacin estn expuestas al medio ambiente y se contaminen de nuevo. Para esterilizarlas se puede utilizar un recipiente cilndrico de metal o envolvindola en papel estraza. 1.- Se corta papel estraza del tamao adecuado para el nmero de cajas que se desee envolver y se colocan las cajas en el centro del papel. 2.-Los bordes de los costados se unen al centro cubriendo las cajas que se envuelven. 3.-En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unin se dobla a la mitad, creando una cierre plegado. 4.-Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de las cajas envueltas en el papel. 5.-Se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas del centro. 6.-Las puntas salientes del papel en los lados de las cajas se doblan hacia arriba y al centro de las cajas y se les asegura con cinta adhesiva. Esterilizacin por aire caliente La esterilizacin por calor seco se puede realizar por varios mtodos: Aire caliente Flama directa Incineracin
Aire caliente.- El aire caliente es uno de los mtodos de esterilizacin por calor seco ms utilizados. Este proceso se lleva a cabo en hornos especiales que permiten la distribucin uniforme del calor en su interior, donde el material se expone a temperaturas de aproximadamente 170C durante 2 horas. El tiempo de
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esterilizacin se debe determinar para cada tipo de material, por ejemplo en el caso de materiales muy resistentes al calor, se pueden usar temperaturas ms altas por tiempos ms cortos. Entre las ventajas de este mtodo de esterilizacin estn que no deja residuos, y es un mtodo rpido y econmico. Adems permite la esterilizacin de materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Su principal desventaja es que slo debe emplearse para esterilizar materiales termoestables. Para controlar este proceso de esterilizacin se utilizan indicadores fsicos tales como los termmetros, los cuales permiten medir la uniformidad de la temperatura de la cmara interna del horno, indicadores qumicos como las cintas testigo. El material de vidrio moderno permite la carga y descarga en caliente sin que se rompa, pero hay siempre un ligero riesgo de que el aire no estril puede ser succionado hasta el interior de las cajas petri no envueltas mientras se enfran. Cuando se cargan debe dejarse espacio entre cada artculo, puesto que la carga excesiva impide la circulacin de aire y determina puntos calientes y fros. La esterilizacin por aire caliente se utiliza principalmente para el material de vidrio como son: Cajas petri, tubos de ensaye, pipetas, sin lquidos en su interior, material de vidrio, instrumentos quirrgicos, material y utensilios de metal. Flama directa.- Consiste en colocar el material directamente al fuego hasta que ste se ponga al rojo vivo. De esta forma se queman los contaminantes hasta reducirlos a cenizas. Su eficacia depende de la calidad de la llama. Es un procedimiento muy sencillo que se realiza de rutina en los laboratorios de microbiologa para esterilizar el asa o el filamento con la llama del mechero. Cuando se realiza este procedimiento se debe evitar la formacin de aerosoles (pequeas gotas liberadas al aire) que podran contaminar el ambiente.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de las condiciones de asepsia y su relacin con el control de contaminacin microbiana en el
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laboratorio y generar criterios de seleccin de los mtodos ms adecuado para los distintos tipos de materiales que se manejen en el laboratorio. 2. Vincular los resultados obtenidos mediante experimentos de esterilizacin de diferentes materiales y medios de cultivo en el laboratorio con los conocimientos tericos y su experiencia con el entorno a travs de la discusin en grupo.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias entre esterilizacin y asepsia. 2. Escriba la finalidad de manejar un rea estril si el material a usar y los medios fueron esterilizados previamente. 3. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados: Descripcin del Mtodo material
Pipeta
de Indicador esterilizacin
de Resultado
Observaciones
esterilizacin
Mtodo y parmetros de control
etc
4. Compare sus resultados con los resultados de sus compaeros y presente un resumen. 5. Escriba sus conclusiones.
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 13
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3. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill. 4. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html
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Prctica 2. Diferenciacin, preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
1. OBJETIVO Aplicar la metodologa de preparacin y esterilizacin de diferentes medios de cultivo.
2. INTRODUCCION
La ubicuidad de los microorganismos se relaciona con las capacidades de cada uno de estos y sus especificidades en adaptarse a las condiciones medioambientales con sus mecanismos enzimticos y sus relaciones poblacionales en un ecosistema. Para crecer, los microorganismos deben tomar del ambiente todas las sustancias necesarias para la sntesis de sus componentes celulares y para la generacin de energa. Estas sustancias se denominan nutrientes. Un medio de cultivo artificial deber contener todos los nutrientes y las cantidades necesarias a los requerimientos especficos para el microorganismo que quiere ser aislado. La formulacin de un medio de cultivo est basada en los principios de la nutricin y la composicin qumica de las clulas, como ejemplo el agua es el componente principal que se encuentra entre un 80 y 90% del peso total de la clula, por lo cual es el componente y nutriente principal y esencial, en trminos cuantitativos. Los componentes slidos en la clula son constituidos hasta en un 95% por las sustancias en las cuales sus componentes elementales son el carbono, nitrgeno, fsforo y azufre, ordenados en forma decreciente con relacin a su abundancia. El carbono es el componente principal del peso seco de una clula, participando comnmente con un 50%, los microorganismos fotosintticos toman esencialmente del CO2 su fuente de carbono y toman de los compuestos inorgnicos oxidndolos y
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de la luz su energa. Todos los dems organismos toman su fuente de carbono de sustancias orgnicas adems de utilizarla como principal fuente de energa. Los microorganismos son extraordinariamente diversos tanto a la clase como al nmero de compuestos orgnicos que pueden usar como fuente principal de carbono y energa. Esta diversidad se manifiesta en el hecho de que no hay en la naturaleza ningn compuesto orgnico que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energa por algn microorganismo, por lo que algunos muestran una gran versatilidad y otros extremadamente especializados en el uso de la fuente de carbono orgnico, estas caractersticas permiten disear diferentes tipos de medios de cultivo como son: Por su contenido de agua el medio lquido, semislido y slido; Por su composicin cualitativa y cuantitativa de su componentes, medio complejo, semisinttico y sinttico; Por su capacidad de soportar microorganismos, medio general, selectivo; diferenciales, ricos, etc. En la actualidad los medios de cultivo comnmente empleados, se encuentran en el comercio bajo la forma de productos deshidratados, presentado ventajas como son: estabilidad, fciles de usar, una pequea cantidad del polvo basta para preparar una cantidad de medio de cultivo, necesitan poco espacio para almacenarse y de alguna manera son econmicos.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas. Subtema. Medios de cultivo. El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes semejantes de donde fue extrado.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Caldo nutritivo (g/l) Cajas petri
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Cantidad 23 8 10 10
Equipo Autoclave Estufa incubadora Horno Mechero Fisher
Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml matraz Erlenmeyer de 500 ml gradilla Asa de nicromo Asa varilla de vidrio
1 1 1 1 1 1
Campana de flujo laminar Potencimetro
Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, muestra de tierra y agua fresca.
5. METODOLOGIA Preparacin: 1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (Caldo nutritivo 0.8 g para 100 ml y agar nutritivo 4.6 g para 200 ml). 2. Disolver al inicio en una cantidad de la fraccin del volumen total de agua. 3. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente. 4. Calentar suavemente entre 50 y 60C, agitando constante el recipiente hasta su incorporacin del medio al agua o clarificar, en caso de un medio contenga agar,
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espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullicin. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullicin es suficiente). 5. Revise el valor indicado en la etiqueta del pH y de ser necesario ajstelo utilizando soluciones cidas o bases con concentraciones de 0.1 M. 6. Antes de su esterilizacin vierta en cada tubo 9 ml de caldo nutritivo y cierre suavemente el tubo con el tapn de rosca. 7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri debern esterilizarse previamente por separado. 8. Los medios deshidratados son altamente higroscpicos, por lo que es necesario mantenerlos convenientemente cerrados los frascos despus de utilizarlos y mantenerlos en un lugar fresco, seco y protegidos de la luz. 9. La esterilizacin, en todos los casos es conveniente seguir las instrucciones indicadas en las etiquetas de los frascos y nunca deber exceder la temperatura de esterilizacin. (Caldo y agar nutritivo se esteriliza a 121C a 1 atm de presin manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote). 10. Los tubos con el caldo nutritivo se cierran despus de su esterilizacin y que estos estn a una temperatura entre 50 y 60C. 11. El agar nutritivo estril se vaca a las cajas petri cuando ste alcance una temperatura entre 45 y 50C. 12. Los medios preparados es recomendable utilizarlos el mismo da de su preparacin, sin embargo es posible mantenerlos por varios das en refrigeracin, debindose llevar a temperatura ambiente antes de usarse. 13. Inocule el caldo nutritivo y el agar nutritivo con las muestras de los distintas fuentes de microorganismos. 14. Incube las cajas y tubos inoculados en la estufa de incubacin a 35C. 15. Observe el desarrollo de su crecimiento a las 24 y 48 horas de incubadas.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de el tipo de medio de cultivo y la muestra.
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2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados: Medio cultivo
Lquido Lquido Slidor Slidor
de Fuente
del Forma Crecimiento
de Resultado
Observaciones
microorganismo
Muestra slida Muestra lquida Muestra slida Muestra lquida
8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El ma nual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill. 4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar. 5. www.danival.org/notasmicro/medioscult/madre_medios.html.
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Prctica 3. Determinacin de los parmetros de letalidad trmica: valores D-Z.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas para determinar los valores de D y Z de los microorganismos.
2. INTRODUCCION La tecnologa microbiana y alimentaria requiere que sus procesos sean operados sin contaminacin biolgica. En general se necesita un alto grado de limpieza y se procura que las operaciones sean aspticas. Para mantener un proceso en condiciones aspticas sera necesario contar con un mtodo cuantitativo seguro y confiable de medir la concentracin de contaminantes que entran al proceso, adems que cada contaminante en particular varia su efecto potencial sobre el proceso. Dentro de los mtodos utilizados por la industria para esterilizar sus procesos el ms empleado es la destruccin por calor, en el cual el concepto bsico es la mortalidad trmica, la cual intenta explicar el mecanismo de inactivacin trmica de los microorganismos, en lo particular en nuestro caso solo se tratar el aspecto cintico. La destruccin de los microorganismos depende de muchas variables: pH de medio, estado vegetativo o esporular de las clulas, iones metlicos, etc. La destruccin de los microorganismos sigue una reaccin de primer orden, es decir la tasa de mortalidad en cualquier tiempo es proporcional al nmero de clulas vivas a una temperatura especfica. dN/dt = -k N En donde N es el nmero de clulas vivas en cualquier tiempo y k la constante de velocidad de muerte. La relacin de estas variables se comporta lineal entre el
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logaritmo del nmero de clulas vivas y el tiempo de esterilizacin, esta relacin se conoce como la Ley logartmica de mortalidad. Dentro de las expresiones para la taza de esterilizacin, se tienen las siguientes: PMT.- Punto de muerte trmica es la temperatura mnima requerida para destruir la totalidad de los microorganismos. TMT.- Tiempo de muerte trmica es el tiempo requerido para destruir todas las clulas a una temperatura determinada. Mtodo del porcentaje.- Porcentaje de clulas sobrevivientes a la exposicin al calor por unidad de tiempo. TRD.- Tiempo de reduccin al dcimo es el tiempo que tarda un nmero de clulas en reducirse al 10% y su valor es D. Z.- Son los grados de temperatura necesarios para reducir el tiempo de destruccin trmica diez veces. Ln 10 = kt t = D = 2.3/k
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Instituto Tecnolgico de Mrida 3. CORRELACION CON EL
Manual de Prcticas de Microbiologia PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA
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BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas. Subtema. Muerte trmica y valores D y Z. Los tratamientos trmicos a los materiales o alimentos permiten mantener condiciones para poder trabajar libres de contaminacin y dar ms tiempo de anaquel. 4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento trmico. Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Caldo nutritivo (g/l) Cajas petri Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 1000 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml gradilla Asa varilla de vidrio Tubos para centrifuga 10 ml Pipetas de 1 ml Puntas para micropipeta de 1 ml Cantidad 23 8 40 25 Equipo Autoclave Estufa incubadora Horno Bao metablico con control de temperatura Campana de flujo laminar Potencimetro Mechero Fisher Centrifuga Micropipeta de 0.1 a 1 ml Vortex
1 1 2 1 1 10 10 100
Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, cepa pura.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 5. METODOLOGIA Soluciones
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1. Solucin salina al 0.85 % .- Colocar 8.5 g de NaCl en un matraz volumtrico de 1000 ml; disolver y llevar a volumen con agua destilada. 2. Hidrxido de sodio 1 N.- En un matraz volumtrico de 100 ml, pesar 4.0 g de NaOH disolver y aforar con agua destilada. 3. Solucin amortiguadora de fosfatos.- Disolver 34 g de fosfato monobsico de potasio en 500 ml de agua destilada; ajustar el pH a 7.2 con hidrxido de sodio 1 N. Se requieren aproximadamente 175 ml. Diluir a 1000 ml con agua destilada, esterilizar durante 20 min a 121C y conservar en refrigeracin hasta su uso. 4. Solucin de trabajo.- A 1000 ml de solucin salina al 0.85 %, adicionar 1.25 ml de solucin amortiguadora de fosfatos; si es necesario, ajustar el pH a 7.2. 5. Transferir 9 ml de solucin de trabajo en 20 tubos con tapn de rosca y esterilizar. Paquete Celular 1. Crecer el microorganismo seleccionado durante 24 horas, en un matraz de 500 ml con un volumen de 200 ml de medio de cultivo. 2. Centrifugar, y resuspender en 20 ml de la solucin de trabajo el paquete celular. Refrigerar hasta su transferencia. Sobrevivencia trmica 1. Transferir 1 ml del paquete celular resuspendido en la solucin trabajo a cada uno de los 20 tubos conteniendo 9 ml de solucin de trabajo estril. 2. Mantener los tubos bajo las condiciones de tratamiento trmico siguientes: a. 100C b. 105C c. 110C d. 115C e. 120C f. 125C
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3. Por cada temperatura, obtener muestras por triplicado a los siguientes tiempos (minutos): 1, 2, 4, 8, 16, 25. Tomar 2 tubos como muestra control (tiempo 0). 4. Determinar viabilidad celular en cada una de las muestras. 5. Graficar los resultados. 6. Determinar los valores de D y Z.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto del tratamiento trmico y su influencia en la muerte trmica de los microorganismos. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Calcule los valores de D y Z. 2. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados: Tratamiento trmico (C)
100 105 etc
Tiempo (minutos)
0, 1, 2, 4, etc 0, 1, 2, 4, etc
Concentracin celular (viables)

Nmero/ml, etc Nmero/ml, etc
Observaciones
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Instituto Tecnolgico de Mrida 8. BIBLIOGRAFIA
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1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill. 5. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar.
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Prctica 4. Obtencin de cultivos puros, utilizando las diversas tcnicas de aislamiento.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas de varilla acodada y estra cruzada para la purificacin de cultivos bacterianos.
2. INTRODUCCION Un cultivo puro es aquel que se desarrolla a partir de una clula nica y que pertenece a la misma especie y cepa. Obtener un cultivo puro es uno de los problemas en la microbiologa, ya que el estudio organizado de cualquier organismo requiere que se le examine una especie a la vez, el mtodo analtico no se puede aplicar cuando hay ms de una. Idealmente, uno debera aislar una sola clula individual y luego transferirla a un medio estril hasta que se divida para generar una sola poblacin a la cual se le denomina clona y, en este caso tener un cultivo puro. Generalmente las bacterias son inoculadas e introducidas en medios lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin, como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es importante recordar que la inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre deben realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes. Los cultivos puros al estar formados por un solo tipo de microorganismos; nos permite conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades de tincin, actividad qumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e identificacin a las especies microbianas; para todo esto se utilizan las tcnicas de aislamientos quienes permiten la obtencin de microorganismos a partir de muestras complejas (suelo, agua,
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2009
alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, as como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos, esto se logra con las tcnicas de aislamiento y s purificacin. Una manera para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, es aplicar mtodos de cultivos especiales, en los que se utilizan medios que contienen nutrientes como: antibiticos, altas concentraciones de sales y/o pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters. SIEMBRA.-Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio adecuado que provee los requerimientos necesarios, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, la creencia de transferir una gran cantidad del material de cultivo para tener xito es un error. Luego de sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento. La siembra puede realizar en medio lquido, slido o semislido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estril, etc.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas. Subtema. Mtodos y tcnicas de aislamiento y seleccin. Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfologa y estructura bacteriana; Reproduccin bacteriana.
El cultivo de los microorganismos en condiciones artificiales se logra reproduciendo las condiciones medioambientales, adicionando los nutrientes que le den ventajas de crecer al microorganismo de inters, a travs de tcnicas de siembra que permiten obtener un cultivo puro.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Cajas petri
2009
Cantidad 23 20 10
Equipo Autoclave Estufa incubadora Horno
Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml gradilla Asa de platino Asa de varilla acodada Pipetas de 1 (ml) Alcohol 96 (ml) Vaso de precipitado 500 ml Lactosa (g/l) NH4H2PO4 (g/l) K2HPO4 (g/l) MgSO4 (g/l) KCl (g/l) Purpura de bromocresol (ml) Agar bacteriolgico (g/l)
1 1 1 1 1 1 10 100 1 10 2 5 1 0.2 1 15
Campana de flujo laminar Potencimetro Mechero Fisher Vortex
Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo, tierra.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 5. METODOLOGIA Preparacin del material
2009
1. Pesar la cantidad indicada en el frasco de medio de cultivo. (agar nutritivo 4.6 g para 200 ml para 10 cajas petri). 2. Pesar las sales y lactosa calculando para la preparacin de 200 ml. (para 10 cajas petri). 3. Disolver al inicio en una cantidad de la fraccin del volumen total con agua. 4. Mezclar bien y agregar el resto de agua necesaria enjuagando con el agua las paredes del recipiente. 5. Calentar suavemente entre 50 y 60C, agitando constante el recipiente hasta su incorporacin del medio al agua o clarificar, espere 5 minutos agitando antes de llevarlo a ebullicin. (Nunca sobrecaliente, uno o dos minutos de ebullicin es suficiente). 6. Prepare 5 tubos con 9 ml con la solucin de trabajo (solucin salina y amortiguador de fosfatos) para hacer las diluciones decimales y cierre suavemente el tubo con el tapn de rosca. 7. El agar nutritivo se esteriliza en el matraz Erlenmeyer y las cajas de petri debern esterilizarse previamente por separado. 8. La esterilizacin por autoclave a 121C a 1 atm de presin manteniendo estas condiciones durante 15 minutos, cortar un segmento de cinta testigo para cada lote). 9. Los tubos con las diluciones decimales se cierran despus de su esterilizacin y que estos estn a una temperatura entre 50 y 60C. 10. El agar nutritivo estril se vaca a las cajas petri cuando ste alcance una temperatura entre 45 y 50C. Aislamiento 1. Cernir la muestra de tierra y pesar 1 g. 2. Transferir la muestra de tierra al primer tubo (1) con la solucin de trabajo estril. 3. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 4. Tomar 1 ml del tubo (1) y transferirlo al siguiente tubo (2) con la solucin de trabajo estril.
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5. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 6. Tomar 1 ml del tubo (2) y transferirlo al siguiente tubo (3) con la solucin de trabajo estril. 7. Homogenizar con el vortex y esperar que sedimente la tierra. 8. Repetir el procedimiento hasta agotar los tubos con solucin de trabajo estril. (serie de diluciones decimales de 1/10, 1/100, etc.) 9. Inocular por duplicado (transferir 0.5 ml de las diluciones decimales 1,3 y 5) a los medios de agar nutritivo y agar de lactosa. 10. Extender la alcuota con el asa de varilla acodada (previamente esterilizada con alcohol) en toda la superficie de la caja petri con el medio de cultivo no presionando el agar. 11. Incubar a 35C y observar cada 24 horas, por 3 das. 12. Escoger 2 colonias aisladas diferentes y marcarlas con un circulo (por fuera de la caja). Purificacin 1. Esterilizar el asa de platino en la llama directa del mechero, que est en contacto con la parte exterior de llama en posicin vertical hacia abajo (20-30). 2. Transfiera la colonia seleccionada a una caja de petri estril con medio fresco, tocando sobre la colonia y sembrar con la tcnica de estra cruzada. 3. Incubar a 35C, durante 24 horas, observar colonias separadas y que solo exista un solo tipo de colonia. 4. Repetir la siembra en medio fresco hasta obtener el cultivo puro.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 6. SUGERENCIAS DIDACTICAS
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1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de los diferentes medios de cultivo en los microorganismos. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los tratamientos y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados: Medio cultivo
Agar nutritivo Agar de lactosa 1, 3, 5 1, 3, 5
de Dilucin decimal
Colonias diferentes
Nmero/caracterstica Nmero/caracterstica
Observaciones
8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill.
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2009
5. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar.
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Prctica 5. Observacin colonial y microscpica de cultivos bacterianos.
1. OBJETIVO Obtendr cultivos bacterianos puros y describir su morfologa colonial y aplicar las tcnicas de tincin para su observacin de la morfologa microscpica.
2. INTRODUCCION Una bacteria simple esta formada por tres capas externas que envuelven las estructura internas; la capa pegajosa protege la pared celular rgida, que a su vez cubre la membrana celular semipermeable. El flagelo es un medio de locomocin y los pelos que se extienden por fuera de la cpsula, ayudan la bacteria a sujetarse de las superficies. Hay dos grupos principales de bacterias: las saprofitas, que viven sobre los cuerpos muertos de animales y vegetales, y los simbiontes, que viven en animales o plantas vivas. Las saprofitas son importante s por que descomponen los cuerpos de
plantas o animales muertos en
sus componentes esenciales, haciendo se plantas. Muchas bacterias
accesibles para ser utilizados como alimento por las
simbiontes se encuentran en condiciones normales, en los tejidos humanos, incluso en el tubo digestivo y la piel, donde pueden resultar indispensables para los procesos fisiolgicos este tipo de relacin recibe el nombre de mutualismo. En el comensalismo, las bacterias simbiontes obtienen los nutrientes de sus huspedes vivos causndoles un dao considerable. El tercer tipo los parsitos, pueden provocar la destruccin de las plantas o los animales en los que viven. Cada bacteria es una porcin definido. microscpica de materia viva sin un ncleo bien
En su mayora las bacterias son incoloras, aun que algunas tienen
sustancias y colorantes. Por trmino medio miden una micra (0.001mm) de dimetro.
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En cuanto as tipo de agrupacin pueden ser, respecto a los cocos: Diplococos, se agrupan de dos en dos; estreptococos, si se agrupan en fila, tetra cocos, si se agrupan en cuatro; sarcinas, si forman cubos; estafilococos si lo hacen en racimos. Tambin se caracterizan algunas bacterias por la facultad que tienen de producir cuerpos ovales de pared gruesa (una por clula) que es una clula de alta resistencia llamada endospora o ms comnmente espora. Todos los organismos del gnero Bacillus y Clostridium se caracterizan por su capacidad de producir esporas.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificacin de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfologa y estructura bacteriana; Reproduccin bacteriana. La observacin de la morfologa colonial y microscpica de las bacterias, permite determinar el tamao, forma, agrupacin, caractersticas de sus estructuras como la membrana, pared celular, esporas, etc., lo cual ayuda para su clasificacin. 4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Cajas petri Portaobjetos (caja por equipo) Cubreobjetos (caja por equipo) Cultivo bacteriano Aceite de inmersin Safranina Cantidad 2 1 1 1 1 1 Equipo Microscopio Mechero bunsen
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Instituto Tecnolgico de Mrida Asa de Platino
Manual de Prcticas de Microbiologia 1 1
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Alcohol 96 (frasco de 500 ml, por equipo)
Algodn, cinta adhesiva, papel absorbente, cultivo puro (joven).
5 METODOLOGIA Para las observaciones de las caractersticas macroscpicas se estudia el tiempo de colonia formada por cepa. Procedimiento 1.-Del cultivo puro de la cepa se toma una asada y empleando la tcnica de estra cruzada se inocula una caja petri con agar nutritivo. 2.-Se incuba durante 24-48 horas, despus de la caja se escoge para la observacin una colonia aislada. 3.-Se hace la observacin de la colonia. Observacin de morfologa colonial a) Edad: tiempo transcurrido a partir e la inoculacin b) Tamao de la colonia: Dimetro de la colonia. c) Color: se compara con un catalogo de colores. d) Consistencia: suave, dura, cremosa, otras (especificar) e) Luz translcida, puede ser: transparente, translcida u opaca. f) Borde: entero, ondulado, gastado, filamentoso, arborescente, ensortijado. g) Elevacin: esparcida, plana, elevada, convexa, encazoleta, umbilicada. h) Estructura interna: Homognea, granulosa y rizada.
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i) superficie. Pudiendo ser; lisa, rugosa, anular. Observacin morfologa microscpica Para las observaciones microscpicas se procede de la siguiente manera: De la caja de cultivo puro se toma una azada. Se hace un frotis fijo. Preparacin de frotis fijo Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme y se coloca el portaobjetos sobre un vaso de precipitados. A continuacin se tie la muestra: Se le adiciona cristal violeta por un minuto, Se le agrega lugol por un minuto, despus se lava suavemente con un chorro de agua
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Se le agrega alcohol-cetona durante 10 o 15 segundos, Se le agrega safranina por un minuto, despus se lava suavemente con un chorro de agua hasta que el agua salga sin colorante. Una vez que la preparacin est totalmente seca, observar en los objetivos de 10, 45, y 100x, poniendo en este ltimo el aceite de inmersin.
6 SUGERENCIAS DIDACTICAS 1 Fomentar la investigacin a travs de observar las tinciones y el tipo de microorganismo aislado en el cultivo puro. 2 Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos cepas puras y su morfologa colonial y microscpica.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 7 REPORTE DEL ALUMNO
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1. Describir en una tabla y figura la morfologa colonia y microscpica de cada cepa pura observada. Morfologa colonial
Forma de Crecimiento Forma Elevacin Borde
Estra en agar Forma
Puntiforme Circular Filamentosa Amiboide etc Plana Elevada Convexa etc Entero Ondulado etc Filiforme etc
Picadura en gelatina Lnea

Filiforme etc
Crecimiento en caldo Medio

Floculenta etc
Licuefaccin
Crateriforme Etc
Superficie
Peliculada etc
Morfologa microscpica Edad del cultivo

(hrs)
Tincin
Gram ( ) Acidorresistente etc
Forma unicelular
Bacilo Coco etc
Modo de agrupacin
Clulas sueltas Diplos etc
8 BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill.
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5. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar.
7. www.escuelasecundariaanexa.com.mx
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Prctica 6. Aplicacin de los mtodos de preservacin de microorganismos y diseo de un cepario.
1. OBJETIVO Aplicar diferentes tcnicas para la conservacin de cepas microbianas.
2. INTRODUCCION Desde tiempos remotos los microorganismos han sido empleados como materiales esenciales de trabajo en la obtencin de medicamentos (antibiticos, vitaminas y aminocidos), elaboracin de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricacin de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biolgicos en la biotecnologa y la proteccin medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables. La preservacin de cepas microbianas no es tarea fcil y debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad gentica de los cultivos, caractersticas que coinciden con los objetivos de un buen mtodo de conservacin. El conocimiento de las peculiaridades de las dismiles tcnicas de preservacin existentes para su correcta aplicacin, as como el seguimiento continuo de las propiedades de las cepas, propician su empleo como inculo confiable en la industria, la docencia y la investigacin. Con frecuencia la eleccin de la tcnica ms adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difcil, pues deben tomarse en consideracin los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genticos, nmero y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, as como la frecuencia del uso de los cultivos. Los procedimientos de conservacin utilizados para estos microorganismos son:
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Instituto Tecnolgico de Mrida Subcultivos:
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Alta probabilidad de que se produzcan mutaciones, alto riesgo de contaminacin, escasa vialibidad a largo plazo. Conservacin a bajas temperaturas: En placas de agar Conservacin de las esporas en agua Conservacin en congelacin Se requiere el uso de crioprotectores (DMSO, glicerol, trehalosa), las temperaturas ms utilizadas son 80C y mediante nitrgeno lquido entre 150 y 196C, se recomienda una congelacin lenta y una descongelacin rpida, buena estabilidad gentica, suele ser caro mantener temperaturas tan bajas. Conservacin en forma deshidratada : Cultivos con aceite mineral Liofilizacin Es un mtodo muy utilizado, tiene buena estabilidad gentica, es una tcnica sofisticada.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificacin de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfologa y estructura bacteriana; Reproduccin bacteriana.
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La conservacin de microorganismos en los laboratorios y la industria permite poder disponer de los microorganismos en el momento que se requiera, adems de poder realizar todos los trabajos necesarios para su clasificacin y determinar sus caractersticas de inters.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Caldo nutritivo Cajas petri Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Tubos de 2 ml para microcentrifuga Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 125 ml gradilla Asa de platino Cantidad 23 8 4 30 Equipo Autoclave Horno Estufa incubadora Campana de flujo laminar
20 1 2 5 1 1
Refrigerador Mechero Fisher Vortex Microcentrifuga
Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo
5. METODOLOGIA Preparacin de la muestra 1. Incubar de 24 a 48 horas en medio lquido un cultivo puro hasta alcanzar concentraciones de 107 a 108 clulas/ml, para poder obtener un paquete celular. 2. Centrifugar y obtener el paquete celular resuspender las clulas con la menor cantidad de solucin de trabajo estril.
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3. Incubar de 24 a 48 horas en cultivo slido un cultivo puro, aplicando la tcnica de estra cruzada, seleccionar las colonias separadas. 4. Preparar tubos de 18x150 mm con tapn de rosca con 10 ml de agar nutritivo, esterilizar y al sacar los tubos de la autoclave inclinar hasta que el menisco del agar este a 2 cm del cuello de la rosca del tubo, esperar hasta que gelifique. (tubos con agar inclinado). 5. Esterilizar 100 ml de aceite mineral en un matraz de 250 ml. 6. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapn de rosca conteniendo 2 gramos de slica gel. 7. Esterilizar por calor seco tubos de 18x150 mm con tapn de rosca conteniendo 2 gramos de tierra cernida. Aplicacin de la tcnica de conservacin Resiembra peridica: 1. Transferir por triplicado las colonias seleccionadas del cultivo puro joven al tubo de agar inclinado, aplicando la siembra de estra a todo lo largo del medio inclinado. 2. Incubar los tubos sembrados utilizando las mismas condiciones ambientales de donde proviene, esperar hasta tener un buen crecimiento del cultivo puro. 3. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3 y 4 del paso de preparacin de la muestra y todos de la resiembra peridica). 4. Los tubos con las cepas crecidas podrn aadirles el aceite mineral hasta cubrir todo el agar inclinado, refrigerar hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 3, 4 y 5 del paso de preparacin de la muestra y todos de la resiembra peridica). 5. Etiquetar todos tubos de conservacin antes de refrigerar, con la siguiente informacin: cepa, clave de identificacin, medio de cultivo utilizado, fecha de siembra, fecha de resiembra, nmero de resiembra, nombre del alumno, institucin, carrera, asignatura. Deshidratacin: 1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con slica gel, cerrar y dejar reposar 12 horas permitiendo que se efectu la deshidratacin. (usado principalmente para cepas productoras de esporas).
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2. Refrigerar los tubos con las cepas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 6 del paso de preparacin de la muestra y todos de la deshidratacin).
Limitacin de nutrientes: 1. Transferir por triplicado el paquete celular resuspendido al tubo con suelo estril, cerrar y dejar reposar por 12 horas y refrigerar posteriormente. (el suelo est limitado en nutrientes y por estar seco atrapa la humedad de las clulas secndolas, esta tcnica es muy econmica emplendose principalmente para cepas que esporulan). 2. Refrigerar los tubos con las cepas ya crecidas, hasta la fecha de su resiembra. (repetir los pasos 1, 2 y 7 del paso de preparacin de la muestra y todos de la limitacin de nutrientes).
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto de los mtodos de conservacin sobre la sobrevivencia de las cepas. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de las tcnicas de conservacin. 2. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados: Tcnica de Costos conservacin de Dificultad de la Resultado tcnica Observaciones
conservacin
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8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill. 4. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial A guilar.
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Prctica 7. Cultivos de microorganismos en anaerobiosis.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas de cultivos anaerobios.
2. INTRODUCCION La presencia de una atmsfera terrestre rica en oxgeno permiti a los seres vivos evolucionar desarrollando un metabolismo aerbico, el cual se caracteriza por ser una forma muy eficiente de obtencin de energa. Las bacterias anaerobias precedieron largamente a las aerbicas y sin duda, predominaron largamente en un mundo vivo que comenzaba a desarrollarse. El reconocimiento de la naturaleza anaerobia de determinados microorganismos se acredita a Pasteur, quien en 1863 observ que la motilidad de ciertas bacterias desapareca con la exposicin al aire. El conocimiento sobre las bacterias anaerobias es poco y relativamente reciente, ya que para poder lograr condiciones de anaerobiosis en el laboratorio se necesitaban, hasta los aos 60, equipos costosos y tcnicas bacteriolgicas muy dificultosas. A partir de la introduccin de sistemas simples para producir anaerobiosis con equipos y reactivos de bajo costo, el conocimiento de los anaerobios se desarrolla intensamente. Aun as, no hay un gran nmero de microbilogos que se dediquen al tema, la taxonoma est en permanente revisin e infinidad de aspectos se mantienen oscuros. Anaerobios son aquellos grmenes que slo pueden desarro llarse en ausencia de cantidades significativas de oxgeno (O 2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas mueren cuando son expuestos al oxgeno molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Los esporos bacterianos no son afectados
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por tratarse de formas biolgicas metablicamente inertes y con muy escasa proporcin de agua en su composicin. Si bien se considera bacteria anaerobia aquel germen que puede crecer slo en ausencia de oxgeno, la sensibilidad frente al oxgeno vara ampliamente de una especie a otra. As, distinguimos bacterias microaerfilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados. Las bacterias microaerfilas resultan daadas por niveles altos de oxgeno como el atmosfrico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%. Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves al oxgeno atmosfrico
desarrollando ptimamente en condiciones anaerobias. Los anaerobios estrictos no toleran el oxgeno y mueren en su presencia, por tanto slo desarrollan en condiciones anaerobias; (de aqu en adelante los denominaremos simplemente anaerobios). Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias orgnicas son los aceptores finales de electrones, aunque tambin pueden obtener energa a partir de la respiracin anaerobia. Otras caractersticas comunes a los microorganismos anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad, lo cual, sumado a sus requerimientos atmosfricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su aislamiento sea difcil; adems, al ser la mayora de las infecciones mixtas (aerobios y anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento ms rpido pueden crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias. Otro factor crucial para el xito en el aislamiento de anaerobios es el transporte adecuado de la muestra. Se debe proteger a los microorganismos de los efectos nocivos del oxgeno atmosfrico durante el tiempo que transcurre entre la extraccin y la siembra anaerbica de la muestra. La primera y ms efectiva medida es correr ya que en ninguna otra ocasin como esta el envo inmediato al laboratorio es tan fundamental. Las muestras deben ser colocadas en un sistema de transporte que asegure la anaerobiosis. Existen tubos, comercialmente disponibles en los que se ha sustituido el aire por otro gas, como CO 2 o N2, denominados tubos gaseados y que contienen un indicador de anaerobiosis. Dichos tubos sirven para el transporte de
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muestras lquidas que se inyectan a travs de un tapn de goma luego de eliminar todo el aire de la jeringa y aguja. Luego de sembrar la muestra en un medio de cultivo adecuado, la incubacin en anaerobiosis se consigue por medio de alguno de los siguientes sistemas: jarras anaerbicas, bolsas de anaerobiosis y la cmara de anaerobiosis o cmara de guantes. El ltimo mtodo es muy caro, requiere equipamiento complejo, es lento y se usa para estudios de flora normal y en laboratorios altamente especializados. Desde el punto de vista prctico las jarras y los sobres o bolsas son equiparables en rendimiento a los sistemas ms sofisticados y son aceptables para el aislamiento de bacterias anaerobias en el laboratorio clnico. Con estos sistemas son posibles los cultivos en medios slidos para la obtencin de aislamientos que permitan la identificacin bacteriana. Jarras de anaerobiosis Es el sistema ms utilizado para generar una atmsfera anaerbica. Consiste en una jarra de plstico con una tapa que cierra hermticamente. La atmsfera anaerobia puede lograrse por dos mtodos diferentes. El ms sencillo utiliza un sobre comercial generador de hidrgeno y CO2 que es activado, ya sea mediante la adicin de agua o por la humedad de las placas de agar. El H 2 se combina con el O2 del aire para formar agua generando la anaerobiosis. Esta reaccin es catalizada por granallas de zinc recubiertas de paladio que se encuentran depositadas en una canastilla fija a la tapa de la jarra. El segundo mtodo consiste en la extraccin del aire contenido en la jarra a travs de la generacin de vaco, sustituyendo el mismo por otro gas libre de O2 como el nitrgeno. El contenido final de la jarra consiste en una mezcla de gases conteniendo generalmente 80-90% de nitrgeno, 5-10% de hidrgeno y 5-10% de CO2. Una tirilla de papel impregnada en azul de metileno (azul en presencia de O 2, incoloro en su ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas

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Subtema. Aislamiento de microorganismos; Cultivo de microorganismos; Criterios utilizados en la identificacin de microorganismos Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Morfologa y estructura bacteriana; Reproduccin bacteriana. El cultivo de los microorganismos anaerobios en condiciones artificiales se logra con una adecuada toma y manejo de la muestra (condiciones anaerbicas), incubando para su desarrollo en ambientes anaerbicos.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Caldo tioglicolato (g/l) Caldo nutritivo (g/l) Agar gelosa sangre Agar tripticasa sulfato de neomicna y polimixina TSN (g/l) Aceite mineral (ml) Cajas petri Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml matraz Erlenmeyer de 500 ml Vaso de precipitados de 500 ml gradilla Asa de platino 8 10 20 8 Cantidad Equipo Autoclave Estufa incubadora Jarra de anaerobiosis Horno
Mechero Fisher Campana de flujo laminar Vortex
1 1 1 1 1 1
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Algodn, gasa, papel Manila o estraza, cinta adhesiva, cinta testigo.
5. METODOLOGIA 1. Colocar 1 gramo de muestra en solucin de trabajo, homogenizar con el vortex y dejar sedimentar. 2. Tomar una asada del sobrenadante y sembrar por estra cruzada en una placa de agar TSN. 3. Incubar a 37C durante 48 horas en una jarra de anaerobiosis conteniendo slica gel en el fondo, introducir un indicador de oxido-reduccin (papel filtro impregnado con azul de metileno). 4. Meter el sobre generador de H2 y CO2 (gas pak) y adicionar 10 ml de agua en el interior de sobre para activarlo. 5. Cerrar inmediatamente la jarra. 6. Homogenizar la muestra en el tubo y calentar a ebullicin durante 10 minutos. 7. Dejar enfriar y esperar que sedimente. 8. Repetir los puntos del 2 al 5.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el cultivo de la muestra. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Escribir las diferencias de los desarrollos en los medios de cultivo. 2. Describa a travs de una tabla los siguientes resultados:
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Instituto Tecnolgico de Mrida Medio cultivo
Manual de Prcticas de Microbiologia de Resultado
2009
de Morfologa de la Forma colonia Crecimiento

Tincin gram
Observaciones
8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, 2. Cowan S. y Steel K. 1985. Manual para la Identificacin de bacterias de importancia mdica. Editorial C.E.C.S.A. 3. Martnez A., 1983. Manual de prcticas de laboratorio. Edito CREGIT, IT Veracruz.
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2009
Prctica 8. Identificacin bioqumica de enterobacterias.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas y medios de cultivo para la identificacin a travs de pruebas bioqumicas del grupo de enterobacterias.
2. INTRODUCCION Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms de 40 gneros, ms de 150 especies y 20 especies con patologa humana. Pueden tener morfologa de bacilos o cocos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros rganos del ser humano y de otras especies animales, aerobios o anaerobios facultativos En la definicin clsica de una Enterobacteriaceae se usan siete criterios bsicos, adicional a la aparicin de nuevos mtodos taxonmicos para incluir a ciertos gneros que no cumplen todos los siguientes criterios, pero que forman parte de esta familia:
1. Son bacterias gram negativas, la mayora bacilos, otros cocobacilos y otros
pleomrficos.
2. No son exigentes, son de fcil cultivo. 3. Son oxidasa negativo (excepto Plesiomonas, que es oxidasa positivo), es decir,
carecen de la enzima citocromo oxidasa, catalasa positiva

4. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. 5. Son anaerbicos facultativos. 6. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin la
produccin de gas (en especial glucosa y lactosa), y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aerbicas.
7. Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos
gneros no son mviles.

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2009
Adicional a ello, las Enterobacteriaceae no forman esporas, algunas producen toxinas y pueden ser encapsuladas y son organismos catalasa positivos. Son quimiohetertrofos, y necesitan para su crecimiento compuestos simples de carbono y nitrgeno, generalmente slo con D-glucosa, aunque algunas requieren aminocidos y vitaminas. La temperatura ptima de crecimiento es de entre 22C y 37C. En el intestino, representan una fraccin importante de la flora aerbica, se encuentran en grandes nmeros en el colon (desde el ciego hasta el recto), donde contribuyen a la degradacin de residuos alimenticios y a la produccin de gas intestinal como parte de la fermentacin. En ciertas oportunidades, los comensales del intestino pueden resultar patognicos como oportunistas en infecciones urinarias, pulmona, septicemia o sobreinfecciones, en especial en inmunosuprimidos, en el uso de ciertos antibiticos, desnutricin, etc. La presencia de Enterobacteriaceae dentro del organismo es anormal y determina la aparicin de infecciones, cuya gravedad depende del punto de entrada. Introducidas por los alimentos, provocan problemas intestinales al adherirse y atravesar la barrera de la mucosa gastrointestinal, manifestada por diarreas y deshidratacin. Ciertas especies provocan patologas especficas: La especie Salmonella typhi es responsable de la fiebre tifoidea. La especie Shigella dystenteriae es el agente responsable de la disentera bacilar. La especie Escherichia coli enterotxica es responsable de la gastroenteritis infantil. La especie Yersinia pestis es responsable de la peste. La especie Serratia marcescens usualmente causa infecciones nosocomiales como resultado de tratamiento en un hospital. Para la identificacin completa es necesaria la realizacin de las pruebas bioqumicas las cuales muestran las diferencias en sus rutas metablicas de cada especie como parte de la expresin de su informacin gentica.
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2009
El aislamiento de este grupo se realiza con pruebas presuntivas y su posterior prueba confirmativa, utilizando medios selectivos diferenciales, seguido de pruebas bioqumicas y por ltimo el uso de pruebas serolgicas. Las diferencias entre los nombres de los diversos gneros provienen de criterios ms precisos, como la fermentacin de los diferentes azcares, la produccin o no de azufre, la presencia de enzimas metablicas (-galactosidasa, desaminasas, descarboxilasas), etc. Los serotipos de importancia medica y sanitaria pueden distinguirse entre s por la presencia o ausencia de antgenos en su constitucin celular, tales como en el lipopolisacrido (antgeno O), el antgeno flagelar (antgeno H) o el antgeno capsular (antgeno K), etc.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Mtodos y tcnicas microbiolgicas bsicas. Subtema. Criterios de clasificacin en la identificacin de microorganismos. La identificacin de las Enterobacteriaceae se realiza a travs de incubar a los presuntos microorganismo con medios de cultivo selectivos y diferencias y posterior incubacin con sustratos especficos para determinar su asimilacin y fermentacin de los mismos, para la identificacin de sus rutas metablicas, como su expresin de su informacin gentica.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Caldo lactosado (g/l) Caldo verde bilis brillante (g/l) Agar MacConkey (g/l) Cantidad 12 40 51.5 Equipo Autoclave Estufa incubadora Horno
54
Instituto Tecnolgico de Mrida Agar XLD (g/l) Caldo base fermentacin (g/l) Glucosa (g/l) Lactosa (g/l) Agar hierro de Kliger (KIA) (g/l) Medio de SIM (g/l) Medio de Citrato de Simmons (g/l) Medio TSI (g/l) Agar manitol (g/l) KNO3 (g/l) Cajas petri
Manual de Prcticas de Microbiologia 55 15 7 7 52.5 30 23 63.5 35 1 20 30 1 1 1 3 1 1 40 80 Mechero Fisher
2009
Campana de flujo laminar Unidad filtracin millipore
Tubos 18 x 150 mm c/tapn de rosca Probeta de 100 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml matraz Erlenmeyer de 500 ml gradilla Asa de platino Asa varilla de vidrio Tubitos Durham Tubos 16 x 150 mm c/tapn de rosca
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2009
1. Esterilizar solucin de trabajo en 5 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml, para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas. 2. Esterilizar 15 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo lactosado. (Prueba presuntiva) 3. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo verde bilis verde brillante. (Prueba confirmativa). 4. Esterilizar 10 tubos (16 X 150 c tubo de Durham) con caldo base para fermentacin 5. Esterilizar solucin de azucares (glucosa y lactosa) utilizando el filtro millipore. 6. Aadir 1 ml de solucin estril de los azucares en tubos con caldo base por separado, al momento de aplicar la prueba. 7. Esterilizar los medios agar MAcConkey y XLD y transferir a 5 cajas petri por cada medio. (seguir indicaciones de etiqueta). 8. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar manitol (con nitrato de potasio) y SIM. Solidificar el agar en forma vertical. (agar semislido). 9. Esterilizar 5 tubos (16 x 150) con cada uno de los siguientes medios: agar hierro de Kliger, citrato de Simmons, TSI. Solidificar los medios inclinndolos hasta que el medio este entre 2 y 3 cm de la boca del tubo. Aislar 1. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilucin hasta terminar la serie. 2. Inocular por triplicado, transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilucin a tubos con caldo lactosado, incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (prueba presuntiva) 3. Inocular cada 1 ml del caldo incubado que resulto positivo (produccin de gas en el tubito de Durham) en tubo con medio de caldo verde bilis brillante, incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (prueba confirmativa, reportar).
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2009
4. Inocular por duplicado, transfiriendo 1ml de la muestra de las primeras 3 diluciones por separado en cajas petri con agar MacConkey. Sembrar por estra e incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfologa colonial). Purificar 1. Inocular el agar XLD con los tubos positivos de la prueba confirmativa. Sembrar por estra. Incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfologa colonial). 2. Inocular el agar XLD con las colonias con caractersticas de enterobacterias de las cajas incubadas de agar MacConkey. Sembrar por estra. Incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar morfologa colonial). Identificar 1. Inocular al menos tres colonias con caractersticas tpicas de enterobacterias en cada uno de los siguientes medios: KIA, Citarto de Simmons, TSI, sembrando por picadura al fondo y estra sobre el agar inclinado; SIM y Manitol, sembrando por picadura recta en medio del agar semislido. Usar el asa de platino recta. 2. Incubar a 37C por 48 horas observando cada 24. (reportar).
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar la relacin de los medios de cultivo diferenciales y selectivos con rutas metablicas como expresin del genoma de las especies. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con los distintos medios de cultivo y muestras utilizados.
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2009
7. REPORTE DEL ALUMNO

Prueba MAC HEK Colonias EMB Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3
Coloracin de Gram
Morfologa Catalasa Oxidasa TSI Lactosa Glucosa SH2 Movilidad Indol SH2 RM VP Citrato LIA Lisina SH2 Identificacin
SIM
8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, 2. Cowan S. y Steel K. 1985. Manual para la Identificacin de bacteria s de importancia mdica. Editorial C.E.C.S.A. 3. Koneman E., Allen S., Dowell V., Sommers H., 1989. Diagnostico microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana S.A. 4. Martnez A., 1983. Manual de prcticas de laboratorio. Edito CREGIT, IT Veracruz.
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2009
Prctica 9. Aislamiento, cultivo y observacin colonial y microscpica de hongos filamentosos y levaduriformes.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas de aislamiento y purificacin de hongos y levaduras para la observacin de la morfologa colonial y tinciones para la observacin de su morfologa microscpica.
2. INTRODUCCION Los hongos son seres microscpicos o macroscpicos que viven sobre diversos materiales orgnicos, a los cuales descomponen para as alimentarse; gracias a sta caracterstica son la clave para la reincorporacin de los materiales orgnicos en el suelo, favoreciendo no solo su formacin sino tambin su enriquecimiento. Actualmente existen alrededor de 80,000 especies identificadas de hongos, con diversos hbitats; algunos son acuticos, viviendo fundamentalmente en agua dulce, pero se sabe tambin de algunos hongos marinos; la gran mayora son de hbitat terrestre y habitan en los suelos o en la sustancia muerta de las plantas, jugando un papel preponderante en la mineralizacin del carbono orgnico. Gran cantidad de hongos son parsitos de plantas terrestres, con esta particularidad agrcolas.(1) Se identifican dos formas generales de crecimiento de hongos: los mohos y las levaduras. La estructura vegetativa de los primeros recibe el nombre de talo, los hongos
producen las principales enfermedades econmicamente significativas de los cultivos
compuesto por filamentos usualmente ramificados. A su vez cada uno de los filamentos es denominado como hifa y a un conjunto de ellas se les conoce como micelio. Las levaduras por su parte se diferencian de los mohos en su crecimiento, pues stas a pesar de ser unicelulares en su mayora, crecen por un proceso de gemacin en que las clulas hijas se separan de las madres tan pronto han
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madurado y tienen un ciclo sexual en donde la fertilizacin tiene lugar por medio de fusin de dos clulas vegetativas de ncleos haploides que al fusionarse forman el ncleo diploide que se mover al brote. As pues la sntesis del DNA y la divisin nuclear de las levaduras se correlacionan ntimamente con el proceso de gemacin, a comparacin de los mohos que experimentan un crecimiento filamentoso por una extensin continua de las puntas de las hifas. Los hongos se clasifican en cuatro grupos diferentes: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes (tambin denominados hongos imperfectos). sta clasificacin se basa en diversas caractersticas, pero la ms importante es el tipo de espora reproductiva que se forma, tanto asexual como sexual. Como organismos sin clorofila, los hongos, a diferencia de las plantas verdes no poseen la capacidad de fotosntesis, sino que necesitan el suministro de carbono fijado orgnicamente. La intensidad de crecimiento del hongo depende, entre otras cosas, de la concentracin de materias nutritivas y ya que el anhdrido carbnico como fuente nica de carbono no le es suficiente para vivir, la fuente de carbono acta en forma limitadora. Las temperaturas especialmente altas (60 C) y fro extremo no excluyen la presencia de hongos, predominan en medios ricos en hidrgeno y a gran diversidad de pH (3,5 8,5). Dicho esto, se puede entender como la nica condicin para el crecimiento de los hongos en la naturaleza es, pues, la presencia previa o simultnea de otros organismos. Por ello, los hongos pueden ser hallados prcticamente en todas partes, incluso en lugares que a simple vista no presentan ni rastro de materiales nutritivos.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos eucariotas. Subtema. Hongos pluricelulares y unicelulares.
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2009
El aislamiento, conservacin y purificacin de los microorganismos (hongos y levaduras) es una etapa crucial para su posterior clasificacin, manejo, estudio y uso, permitiendo el desarrollo de la microbiologa industrial.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Agar PDA (g/l) Cajas Petri Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 500 ml Gradilla Asa de siembra Asa para picadura Varilla de vidrio V Pipetas de 1 ml Pipetas de 2 ml Pipetas de 10 ml Porta objeto Cubre objeto Microesptula o Esptula Cantidad 39 30 5 Equipo Autoclave Estufa incubadora Campana de flujo laminar vertical Horno Mechero bunsen Mechero Fisher Microscopio Vortex
1 2 2 1 1 1 5 2 2 1 20 20 1
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1. Solucin de cido Tartrico (10%).- Pesar 10 g y disolver en 100 ml de agua destilada, esterilizar durante 15 minutos a 121C y 1 atm de presin, conservar en refrigeracin hasta su uso. 2. Preparar medio PDA para hongos.- Pesar y diluir (39 g/l), esterilizar durante 15 minutos a 121C y 1 atm de presin, esperar hasta alcanzar 45C y agregar 1 ml de la solucin estril de cido Tartrico por cada 100 ml, homogeneizar y vaciar en las cajas petri, esperar hasta su solidificacin y conservar en refrigeracin hasta su uso (el pH obtenido se aproxima a 4.0). a. Para la preparacin de un microcultivo tomar una caja petri con medio de cultivo fresco y fraccionarlo en cortes de 1 centmetro cuadrado. b. Esterilizar una caja petri con un papel filtro. c. Esterilizar varillas de vidrio en forma de una V con tamao adecuado para estar dentro de la caja petri. d. Esterilizar porta objeto y cubre objeto. e. Preparar una solucin estril de glicerol al 10 % en agua. 3. Preparar medio PDA para levaduras.- Pesar y diluir (39 g/l), esterilizar durante 15 minutos a 121C y 1 atm de presin, vaciar en las cajas petri, esperar hasta su solidificacin y conservar en refrigeracin hasta su uso. 4. Esterilizar solucin de trabajo en 3 tubos de 18 X 150 conteniendo cada uno 9 ml, para disolver la muestra en diluciones decimales conocidas. 5. Los medios conservados en refrigeracin se utilizaran, sacndolos previamente hasta que estos alcancen la temperatura ambiente de trabajo. 6. Tomar 50 gramos de fruta madura con alto contenido de azucares, macerarla y dejarla reposar al menos 24 horas, acondicionando el lugar de reposo en forma asptica, usarla como fuente de levaduras. Aislamiento 7. Aislamiento de hongos: a. abrir 2 cajas petri exponindolos al medios ambiente por 1 hora, con medio de cultivo PDA + cido Tartrico, cerrar e incubarlos a
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2009
temperatura ambiente, dejarlos hasta que estos desarrollen los microorganismos (72 a 96 horas). b. Tomar 1 gramo (o 1ml de muestra) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilucin hasta terminar la serie. Inocular transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilucin a una caja petri con medio de cultivo PDA + cido Tartrico, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (72 a 96 horas). 8. Aislamiento de levaduras: Tomar 1 gramo de muestra (muestra de fruta macerada) previamente homogenizada y cuarteada y transferirla al primer tubo de la serie de diluciones decimales, esperar que sedimente y transferir 1 ml a la siguiente dilucin hasta terminar la serie. 9. Inocular transfiriendo 1 ml de la muestra de cada una de las dilucin a una caja petri con medio de cultivo PDA, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (48 a 72 horas). Purificacin 10. Obtencin de cultivo puro de hongos: De las cajas previamente inoculadas e incubadas, seleccionar al menos 2 colonias diferentes y transferirlas resembrndolas con el asa de picadura, rasgando el micelio y picando el medio de cultivo fresco en sus cuatro puntos separados y centro de la caja, incubar a temperatura ambiente hasta que estos desarrollen los microorganismos (48 a 72 horas). a. Obtencin de microcultivo: Tomar la caja petri estril adicionado con el papel filtro y colocar en su superficie la V, sobre esta el porta objeto y colocar en el porta el agar cortado de 1 cm2, resembrar el cultivo puro rasgando la superficie de la colonia y sembrar por picadura en los costados y al centro del agar, poner en la superficie del agar el cubre objeto estril, verter la solucin de glicerol estril para crear un microambiente hmedo y cubrir con la tapa la caja petri, incubar en estufa de incubacin a 35C. 11. Obtencin de cultivo puro de levaduras: De las cajas previamente inoculadas e incubadas, seleccionar al menos 2 colonias diferentes y transferirlas resembrndolas con el asa de siembra, tocando la superficie de la colonia y aplicar la tcnica de estra cruzada en el medio de cultivo fresco, incubar a
63
2009
temperatura ambiente hasta que se desarrollen los microorganismos (24 a 48 horas). Morfologa colonial 12. Hongos: Observar los cultivos puros obtenidos al frente y reverso de la caja de crecimiento, calificar color, textura, superficie, edad del cultivo, produccin de pigmentos. 13. Levaduras: Evaluar las siguientes caractersticas, edad del cultivo, dimetro de la colonia, color, textura, consistencia, luz transmitida, borde, superficie, elevacin, estructura. Morfologa microscpica 12. Hongos: Observar en el microcultivo el desarrollo de las estructuras del hongo, al inicio cada 12 horas desde la caja petri con un estereoscopio y cuando el micelio presente las estructuras de reproduccin, tomar el porta y cubre para teirlos y observar al microscopio. a. Observar e informar: Tipo de micelio vegetativo, areo y estructuras de reproduccin. 13. Levaduras: Evaluar las siguientes caractersticas tiendo y observando al microscopio, forma y tamao de la clula vegetativa, tipo de reproduccin, tipo de esporas. *Teir con azul de algodn o azul de metileno.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar las preparaciones y el tipo de microorganismo aislado en el cultivo puro. 2. Generar una discusin en grupo de los resultados obtenidos con las distintas cepas puras y su morfologa colonial y microscpica.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 7. REPORTE DEL ALUMNO
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1. Describir en una tabla y figura la morfologa colonia y microscpica de cada cepa pura observada. Morfologa colonial hongos
Edad
(hs)
Forma (Frente)
Circular etc
Superficie
Lisa etc
Color
Azul 3215* etc
Textura
Algodonosa etc
Pigmento
Excrecin ( ) Color* etc
Forma (Reverso)
No aplica etc *Compare con catalogo de colores
Superficie
Llisa etc
Color
Azul 3215* etc
Textura
No aplica etc
Pigmento
Excrecin ( ) Color* etc
Morfologa microscpica hongos
Edad*
(hrs)
Tincin
Azul de metileno etc
Tipo de micelio
Cenoctico ( ) Septado ( ) etc
Estructura reproductora
Tipo etc
Forma de espora
Tipo etc
*Hora de observacin del microcultivo.
Morfologa colonial levaduras

Forma de Crecimiento Forma Elevacin Borde
Estra en agar Forma
Puntiforme Circular Filamentosa Amiboide etc Plana Elevada Convexa etc Entero Ondulado etc Filiforme etc
Picadura en gelatina Lnea

Filiforme etc
Crecimiento en caldo Medio

Floculenta etc
Licuefaccin
Crateriforme Etc
Superficie
Peliculada etc
Morfologa microscpica levaduras

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Instituto Tecnolgico de Mrida Edad

(hrs)
Manual de Prcticas de Microbiologia Modo de agrupacin

Clulas sueltas Diplos etc
2009
Tincin
Gram ( ) Acidorresistente etc
Forma unicelular
Bacilo Coco etc
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Carpenter P., 1969, Microbiologa. Editorial Interamericana. 3. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia. 4. Pelczar M., 1984,Microbiologa. Editorial McGraw Hill. 5. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 6. Stanier R., Doudoroff M. y Adelberg E. 1981.Microbiologa. Editorial Aguilar. 7. Zapata M., 1988. Manual de prcticas de microbiologa avanzada. Tesis, Editorial Instituto Tecnolgico de Mrida. 8. Martnez A., 1983. Manual de prcticas de microbiologa general. Editorial CREGIT, Instituto Tecnolgico de Veracruz. 9. Cardenas A., 1989. Identificacin de hongos filamentosos y determinacin de su capacidad biodegradativa del bagazo del henequn. Tesis, Editorial Universidad Autnoma de Yucatn.
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2009
Prctica 10. Produccin de cidos orgnicos por hongos.
1. OBJETIVO Aplicar tcnicas de cultivo sumergido para la produccin de cidos orgnicos y evaluar su rendimiento.
2. INTRODUCCION El cido ctrico (cido 2 hidroxipropano-1,2,3 tricarboxlico) es un producto metablico primario y se forma en el ciclo de los cidos tricarboxlicos. La glucosa es la principal fuente de carbono utilizada para la produccin de este cido. En muchos microorganismos el 80% de la glucosa utilizada para esta biosntesis se metaboliza por reacciones de la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) y 20 % por reacciones del ciclo de la pentosa fosfato. El descubrimiento del cido ctrico se atribuye al alquimista islmico Jabir Ibn Hayyan en el siglo octavo d.C. El cido ctrico fue el primer cido aislado en 1784 por el qumico sueco Carl Wilhelm Scheele, que lo cristaliz a partir del jugo del limn. La produccin de cido ctrico a nivel industrial comenz en 1860, basado en la industria italiana de los ctricos, en 1880 la compaa Pfizer fundada por los hermanos alemanes Charles Pfizer, Charles Erhart, comenzaron a fabricar cido ctrico, utilizado por varias industrias, volvindose su producto ms importante. En 1893, C. Wehmer descubri que cultivos de Penicillium podan producir cido ctrico a partir de la sacarosa molecular. Sin embargo, la produccin microbiana del cido ctrico no lleg a ser industrialmente importante hasta la Primera Guerra Mundial que interrumpi las exportaciones italianas de limones. En 1917, el qumico americano James Currie descubri que ciertos cultivos de Aspergillus niger podan ser productores eficientes de cido ctrico, desde 1920 en adelante fueron desarrollados con xito procesos de fermentacin, en donde se utiliza generalmente
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2009
cepas del hongo Aspergillus nger, aunque tambin han sido empleadas ciertas cepas de levaduras. En 1923, los hermanos Pfizer logran obtener cido ctrico a partir de Aspergillus nger y la fermentacin del azcar, utiliz como sustrato la melazas de remolacha y se diversific en sustratos como sacarosa, melazas de caa o jarabe de glucosa. En 1950, la produccin de cido ctrico alcanzaba las 50.000 toneladas/ao. Posteriormente, se registr una importante expansin debido al desarrollo del proceso de fermentacin sumergida, mucho ms econmico. El cido ctrico puede ser producido tanto en procesos de superficie como sumergidos. Varios factores afectan la eleccin del tipo de proceso: la existencia de capital de inversin, la abundancia de energa, el costo, el entrenamiento de la mano de obra, la existencia de tcnicas para la medida y la regulacin. El cido ctrico actualmente es obtenido principalmente en la industria gracias a la fermentacin sumergida de azcares como la sacarosa o la glucosa, utilizando cepas modificadas para industria del gnero Aspergillus. El proceso de obtencin tiene varias fases como la preparacin del sustrato de melaza, la fermentacin aerbica de la sacarosa por el hongo, la separacin del cido ctrico del sustrato por precipitacin al aadir hidrxido de calcio o cal apagada para formar citrato de calcio. Despus se aade cido sulfrico para descomponer el citrato de calcio. La eliminacin de impurezas se realiza con carbn activado o resinas de intercambio inico, se contina con la cristalizacin del cido ctrico, el secado o deshidratacin y el empaquetado del producto.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Crecimiento y propagacin de microorganismos. Subtema. Cultivo sumergido. Tema. Actividades metablicas de hongos y levaduras. Subtema. Produccin de matabolitos.
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2009
El proceso para la obtencin del cido ctrico nos permite utilizar las tcnicas del cultivo sumergido para la produccin de un metabolito de inters, y relacionar el laboratorio con el amplio mundo de las industrias pues cuenta con aspectos genricos utilizados en la elaboracin de muchos otros productos.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material PDA (g/l) Tubos de 18 x 150 mm con tapn de rosca Probeta de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 250 ml Matraz Erlenmeyer de 1000 ml Gradilla Asa para picadura Bureta Pipetas de 1 ml Pipetas de 10 ml Microesptula o Esptula Medio de produccin Cantidad 39 5 Equipo Autoclave Campana de flujo laminar vertical Horno Mechero bunsen Vortex Espectrofotmetro Incubadora agitadora
1 15 1 1 1 1 5 2 1
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Instituto Tecnolgico de Mrida 5. METODOLOGIA Preparacin
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1. Medio de cultivo bsico para produccin.

Componentes principales Sacarosa (NH4)2SO4 KH2PO4 NaCl MgSO4.7H2O (g/l) 140 2.5 0.15 0.15 1.1 Trazas CuSO4.5 H2O ZnSO4.7 H2O FeSO4.7 H2O (mg/l) 0.24 1.50 0.1
Procedimiento 1. Esporulacin: Tomar una azada de una colonia de Aspergillus niger e inocular en agar inclinado de PDA, se incuba (hasta su esporulacin) durante 7 das a 30C. a. Cosecha de esporas: Las esporas se resuspenden en 5 ml de solucin de estril de Tween-80 de solucin salina (0.85%), rasgando suavemente el cultivo esporulado. b. Las clulas resuspendidas se homogenizan durante 1 minuto con el vortex. 2. Inoculacin: Se inoculan 11 matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio de cultivo con 0.5 ml de la suspensin de esporas. 3. Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 das a 30C en un agitador a 200 rpm para favorecer una buena oxigenacin del medio, se tomar un matraz cada da para determinar los parmetros de produccin de cido ctrico y biomasa a travs del tiempo de fermentacin. 4. Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado colocado en un embudo Buchner conectado a una trampa de agua. Se guarda el filtrado sobre el que se realizar la determinacin de cido ctrico y el micelio se lava con 50 ml de agua para eliminar los hidratos de carbono remanentes que caramelizaran y afectaran la determinacin de peso seco. Se determinar peso seco (biomasa), consumo de azcar y produccin de cido ctrico.
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Instituto Tecnolgico de Mrida 6. SUGERENCIAS DIDACTICAS
2009
1. Fomentar la investigacin a travs de observar el proceso para la obtencin del cido ctrico. 2. Relacionar sus resultados con la discusin con la industria biotecnolgica.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Reporte de los datos de fermentacin.

Tiempo (hs)
0 24 etc *Biomasa
Sustrato (g/l)
140
Concentracin celular* (g/l)
Acido Ctrico (g/l)
2. Grafique los resultados en una sola tabla. 3. Determine el rendimiento de la produccin de cido ctrico. Yp/s (g ctrico producido / g azcar consumida) 4. Compare sus resultados con los resultados de sus compaeros y presente un resumen. 5. Escriba sus conclusiones.
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.
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2009
Prctica 11. Pruebas de identificacin para levaduras.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas de observacin microscpica y pruebas bioqumicas para la identificacin de levaduras.
2. INTRODUCCION Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscpicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentacin de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Aunque en algunos textos de botnica se considera que las levaduras "verdaderas" pertenecen slo a la clase Ascomycota, desde una perspectiva microbiolgica se ha denominado levadura a todos los hongos con predominio de una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los hongos basidiomicetes. A veces suelen estar unidos entre s formando cadenas o pseudomicelio, no existe conexin entre las clulas. Producen enzimas capaces de descomponer diversos sustratos, principalmente los azcares. Una de las levaduras ms conocidas es la especie Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura tiene la facultad de crecer en forma aerbica y anaerobia realizando fermentacin alcohlica. Por esta razn se emplea en muchos procesos de fermentacin industrial, de forma similar a la levadura qumica, por ejemplo en la produccin de cerveza, vino, hidromiel, pan, produccin de antibiticos, etc. Las levaduras se reproducen asexualmente por gemacin o brotacin y sexualmente mediante ascosporas o basidioesporas. Durante la reproduccin asexual, una nueva yema surge de la levadura madre cuando se dan las condiciones adecuadas, tras lo cual la yema se separa de la madre al alcanzar un tamao adulto, dejando una
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2009
cicatriz en la madre. En condiciones de escasez de nutrientes las levaduras que son capaces de reproducirse sexualmente formarn ascosporas. Las levaduras que no son capaces de recorrer el ciclo sexual completo se clasifican como imperfectas, dentro de estas se encuentra el gnero Candida. La forma tradicional de identificar las levaduras son las de la observacin de la morfologa colonial, morfologa microscpica, su formacin de multiplicacin vegetativa, formacin de micelio, su reproduccin sexual y por ltimo las pruebas bioqumicas de su asimilacin de compuestos carbonados y nitrogenados, fermentacin de compuestos carbonados en condiciones de 25C y su crecimiento a 4C y 37C, etc.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos eucariotas. Subtema. Clasificacin de hongos y levaduras. Las clulas tienen codificado en su genoma las capacidades metablicas con las que est armado, las pruebas bioqumicas nos permite observar su informacin a travs de su expresin fenotpica de asimilacin y fermentacin con las diferentes fuentes de nutrientes que se adicionan a un medio base.
4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento trmico. Descripcin del material Agar PDA (g/l) YPG (g/l) Agar YPG (g/l) Cantidad 39 20 35 Equipo Autoclave Bao metablico Estufa de incubacin
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Instituto Tecnolgico de Mrida Agar extracto maltosa (g/l) Glucosa Maltosa Sacarosa D-Galactosa Lactosa Rafinosa L-Sorbosa L-Ramnosa Glicerol D-Manitol KNO3 (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4 7H2O Acetato de Sodio (g/l) Tubos Durham Tubos con tapn de rosca 18x150 Jugo V-8 (ml/l) Extracto de levadura
Manual de Prcticas de Microbiologia 50 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 10 10 1 0.5 5 20 30 350 3 Microscopio Filtro Millipore
2009
5. METODOLOGIA Preparacin
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2009 y N,
1. Preparar medio base para pruebas de asimilacin de fuentes de C, esterilizar y conservar en refrigeracin hasta su uso.
Medio base Asimilacin
Fuente de C* (g/l) (NH4)2SO4 (g/l) KH2PO4 (g/l) MgSO4 7H2O (g/l)
Cantidad
20 10 1 .5
Medio base Asimilacin

Fuente de N* (g/l) (NH4)2SO4 (g/l) KH2PO4 (g/l) MgSO4 7H2O (g/l) Glucosa (g/l)
Cantidad
10 10 1 .5 20
*Se esteriliza aparte con filtro Millipore y se adiciona a los medios base estriles al momento de su uso.
2. Preparar medio base para pruebas de fermentacin de fuentes de C, esterilizar y conservar en refrigeracin hasta su uso.
Medio base Fermentacin
Fuente de C* (g/l) Extracto de levadura (g/l)
Cantidad
20 3
*Se esteriliza aparte con filtro Millipore y se adiciona a los medios base estriles al momento de su uso.
3. Preparar medio Agar extracto de malta en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeracin hasta su uso. 4. Preparar medio Agar de acetato (Fowell) en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeracin hasta su uso. 5. Preparar medio Agar V-8 en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada, conservar en refrigeracin hasta su uso. 6. Preparar medio Agar de PDA en placas y en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada los tubos, conservar en refrigeracin hasta su uso. 7. Preparar medio Agar de YPG en placas y en tubos de 12 x 150, esterilizar y solidificar en forma inclinada los tubos, conservar en refrigeracin hasta su uso. 8. Preparar caldo YPG en tubos de 12 x 150, esterilizar y conservar en refrigeracin hasta su uso Procedimiento
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1. Resembrar la cepa pura en medio de cultivo PDA y YPG por estra cruzada, incubar a 35C, por 48 horas. 2. Cada cepa pura de levadura se observara y anotaran las caractersticas de la morfologa colonial y microscpica. 3. Inocular cada cepa pura en los medios de agar inclinado, incubar a 25C en oscuridad hasta 7 das, para inducir la reproduccin sexual, observar caractersticas microscpicas de esporulacin y anotar. 4. Probar la asimilacin de las fuentes de C, inoculando la cepa pura (Glucosa, Maltosa, etc). 5. Probar la asimilacin de las fuentes de N, inoculando la cepa pura (Nitrato de Potasio, Sulfato de Amonio). 6. Probar la fermentacin de las fuentes de C, inoculando la cepa pura (Glucosa, Maltosa, etc). 7. Evaluar los resultados y determinar gnero por comparacin bibliogrfica.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar y discutir los resultados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Compare sus resultados con los resultados de sus compaeros y presente un resumen. 2. Escriba sus conclusiones.
8. BIBLIOGRAFIA 1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A.
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2. Frazier W., 1976. Microbiolga de los alimentos. Editorial Acribia. 3. Meller S., Kutzman C., Lodder J., Van Rij K. y Fell J. 1984 . Manual de Taxonomia y Biotecnologa de las Levaduras. Editorial CINVESTAV-IPN, Mxico, D.F.
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2009
Prctica 12. Recuento en placa.
1. OBJETIVO Aplicar las tcnicas de diluciones decimales y tcnicas de cultivo para el recuento en placa.
2. INTRODUCCION La forma de cuantificar clulas viables ms utilizada en Microbiologa, es la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo especficos para la poblacin de inters. Esta tcnica se basa en la suposicin de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en su superficie se multiplicar y producir una colonia visible, en consecuencia el nmero de colonias que se observarn a simple vista ser igual al nmero de bacterias viables o unidades formadoras de colonias (UFC) inoculadas en el agar multiplicadas por la dilucin. Esta tcnica aplicada en muestras complejas, dar una estimacin aproximada del nmero total de microorganismos, dependiendo del medio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de incubacin que favorezcan el crecimiento de todos los microorganismos. Tambin pueden presentarse problemas relacionados con la falta de homogeneidad de las diluciones y en la inoculacin de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si es que las clulas no se separan bien y valores elevados si la toma de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concentrado por sedimentacin los microorganismos.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos procariotas y/o eucariotas. Subtema. Crecimiento y reproduccin.
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Los microorganismos cuando se encuentran en condiciones favorables para su desarrollo poblacional, lo expresan utilizando los nutrientes donde se encuentran, una de las formas de cuantificar el aumento de su poblacin es el conteo en placa, que cuyo criterio es una clula viable una colonia.
4. MATERIAL Y EQUIPO Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Matraz Erlenmeyer 250 cc Matraz Erlenmeyer 500 cc Pipetas de 1 cc Pipeta de 10 cc Gradilla Cajas Petri Tubos de tapn de rosca de 18x150 Asa de varilla acodada Cantidad 23 1 1 7 1 1 15 5 1 Equipo Autoclave Estufa de incubacin Horno Cuenta colonias
5. METODOLOGIA Preparaciones 1. Prepare 5 tubos con 9 ml de solucin salina (0.85%) para hacer las diluciones decimales y cierre suavemente el tubo con el tapn de rosca, consrvela en refrigeracin hasta su uso.. 2. Prepare 350 ml con medio Agar nutritivo, esterilice y vierta en 12 placas de caja Petri, espere hasta que solidifique el medio y consrvela hasta su uso en refrigeracin.
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2009
3. Utilice como fuente de microorganismos un agua fresca preparada en casa el da anterior. Procedimiento 1. Agite el agua fresca, espere que sedimente y que este a temperatura ambiente al igual que la solucin salina y los medios de cultivo. 2. Transfiera 1 ml del agua fresca al primer tubo con 9 ml de solucin salina y homogenice el tubo (dilucin de 10 -1), tome 1 ml de esta dilucin y transfiera 1 ml hasta completar la serie de diluciones (100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5). 3. Siembre un duplicado del medio de cultivo en las cajas Petri con varilla acodada, transfiriendo 0.5 ml de cada una de las series, espere hasta que el agar absorba la solucin de microorganismos, incube a 35C y haga lecturas a las 24 y 48 horas. 4. Cuente el nmero de colonias en las cajas sembradas y saque un promedio con su duplicado, reporte solo los conteos de las cajas que el nmero de colonias es de 30 a 300 por caja, si el nmero es mayor en la dilucin 10 -5, reporte mayor que 600,000 UFC /ml.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin y discusin a travs de observar la concentracin celular en los alimentos.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Calcule la concentracin celular del alimento y reperte la concentracin con 2 dgitos y con exponenciacin decimal.
Tiempo (hs) 100
67 423
Dilucin 10-1
etc etc
Concentracin celular
10-4 10-5
10-2
10-3
(UFC*/ml)
24 48
*Unidades formadoras de colonias
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8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Modern o, S.A. 2. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.
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Prctica 13. Tcnica del nmero ms probable (NMP).
1. OBJETIVO Aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP), y evaluar con sus resultados aplicando las tablas aceptadas por la NOM.
2. INTRODUCCION NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES. TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE. Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.Secretara de Salud. JOSE MELJEM MOCTEZUMA, Director General de Control Sanitario de Bienes y Servicios, por acuerdo del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, con fundamento en los artculos 39 de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 38 fraccin II, 47 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 194 fraccin I de la Ley General de Salud; 2o. fraccin III, 34, 37, 40 y dems aplicables del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 8o. fraccin IV y 13 fraccin I del Reglamento Interior de la Secretara de Salud. PREFACIO En la elaboracin de la presente norma participaron los siguientes Organismos e Instituciones: SECRETARIA DE SALUD Direccin General de Control Sanitario de Bienes y Servicios Laboratorio Nacional de Salud Pblica SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA Y DESARROLLO RURAL Comisin Nacional del Agua SECRETARIA DE MEDIO AMBIENTE, RECURSOS NATURALES Y PESCA Instituto Nacional de la Pesca INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
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Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas INDUSTRIAS VINICOLAS PEDRO DOMECQ, S.A. DE C.V. JUGOS DEL VALLE, S.A. DE C.V. LABORATORIO FERMI, S.A. LABORATORIO ICCABI, S.A. DE C.V. LECHE INDUSTRIALIZADA CONASUPO, S.A. DE C.V. LICONSA SIGMA ALIMENTOS, S.A. DE C.V. SOCIEDAD MEXICANA DE NORMALIZACION Y CERTIFICACION, S.C. NORMEX INDICE 0. INTRODUCCION 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 2. FUNDAMENTO 3. REFERENCIAS 4. DEFINICIONES 5. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 6. REACTIVOS Y MATERIALES 7. APARATOS E INSTRUMENTOS 8. PREPARACION DE LA MUESTRA 9. PROCEDIMIENTO 10. EXPRESION DE LOS RESULTADOS 11. INFORME DE LA PRUEBA 12. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 13. BIBLIOGRAFIA 14. OBSERVANCIA DE LA NORMA 15. VIGENCIA 0. Introduccin Las bacterias coliformes son un grupo heterogneo compuesto por varios. Existe poca evidencia que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo gnero taxonmico. La falta de certeza en cuanto a su filiacin taxonmica y la imprecisa correlacin entre los mtodos recomendados para la deteccin de coliformes han presentado problemas. El primero, es que Escherichia coli es aceptada como bacteria coliforme, la especie contiene variantes que no producen gas de la lactosa o lo hacen despus de 48 horas, por lo que no se les identifica por medio de esta tcnica. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa est frecuentemente asociada a genes localizados en plsmidos. Estos determinantes extracromosomales son fcilmente transferidos
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2009
entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del anlisis. No obstante en la prctica, la tcnica ha demostrado su efectividad. El nmero de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias (NOM-113-SSA1-1994. Mtodo para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa) o el uso de la tcnica del nmero ms probable. Esta ltima, tambin llamada tcnica de dilucin en tubo, proporciona una estimacin estadstica de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado. 1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece el mtodo microbiolgico para estimar el nmero de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms probable (NMP) despus de la incubacin a 35 C de la muestra diluida en un medio lquido. Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados trmicamente, as como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mnimo de una bacteria en 10 ml de producto lquido o una bacteria por gramo de alimento slido. Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aqu citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el mtodo de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el mtodo en placa. 1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales o de importacin, para fines oficiales. 2. Fundamento El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 1C durante 24 a 48 horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin.
3. Referencias Esta norma se complementa con lo siguiente:

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NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.* NOM-110-SSA1-1994 Anlisis Microbiolgico.* 4. Definiciones Para fines de esta norma se entiende por: Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 C fermentan la lactosa con la produccin de gas bajo las condiciones especificadas en esta norma. 5. Smbolos y abreviaturas Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes smbolos y abreviaturas se entiende por: g ml l mm C % pH N NMP gramo mililitro litro milmetro grado Celsius por ciento potencial de hidrgeno normal nmero ms probable Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su
4. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Microorganismos procariotas. Subtema. Crecimiento y reproduccin. La cuantificacin de los microorganismos puede ser basada en la medicin indirecta de su actividad metablica, la tcnica de NMP (nmero ms probable) es utilizada como tcnica oficial dentro de las NOM (Normas Oficiales Mexicanas).
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Instituto Tecnolgico de Mrida 5. MATERIAL Y EQUIPO 6.Reactivos y materiales
2009
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico. Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.
6.1 Reactivos 6.1.1 Soluciones diluyentes 6.1.1.1 Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
FORMULA INGREDIENTES CANTIDADES 34,0 g 1,0 l
Fosfato monopotsico Agua Preparacin:
Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solucin de hidrxido de sodio 1 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0 C. Conservar en refrigeracin (solucin concentrada). Tomar 1,25 ml de la solucin concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml segn se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1 C. Despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo deben ser iguales a los iniciales. 6.1.1.2. Agua peptonada FORMULA INGREDIENTES CANTIDADES
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Instituto Tecnolgico de Mrida Peptona Cloruro de sodio Agua Preparacin: 1,0 g 8,5 g 1,0 l
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Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidrxido de sodio 1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen mltiplo de nueve segn se requiera. Esterilizar durante 15 minutos a 121 1,0 C. Despus de la esterilizacin los volmenes finales de la solucin de trabajo deben ser iguales a los inciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin. 6.1.2 Medios de cultivo. Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmacin). En el caso del anlisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol (concentracin 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas de fermentacin. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. 6.1.2.1 Caldo lactosado CUADRO 1 Ingrediente Medio de concentracin 1,5 Extracto de carne Peptona de gelatina Lactosa 4,5 g 7,5 g 7,5 g concentracin sencilla 3,0 g 5,0 g 5,0 g
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Instituto Tecnolgico de Mrida Agua destilada 1000,0 ml
Manual de Prcticas de Microbiologia 1000,0 ml
2009
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 6,9 0,2 a 25 C. Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentracin 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1,0 C. Enfriar rpidamente para evitar una exposicin excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearn 10 ml del caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra. 6.1.2.2 Caldo lauril sulfato triptosa. CUADRO 2 Ingrediente Medio de concentracin 1.5 Triptosa Lactosa Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua destilada 30,0 g 7,5 g concentracin sencilla 20,0 g 5,0 g
4,125 g 4,125 g 7,50 g 0,15 g 1000,0 ml
2,75 g 2,75 g 5,0 0,1 g g ml
1000,0
Disolver los componentes en 1 litro de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 6,8 0,2 a 25 C.
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2009
Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentracin sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentracin 1,5, cada tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1,0 C. Se recomienda almacenar el medio una vez preparado. Las campanas de fermentacin no deben de contener burbujas de aire despus de la esterilizacin. Se puede utilizar una concentracin doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearn 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra. 6.1.2.3 Caldo lactosa bilis verde brillante FORMULA INGREDIENTES Peptona Lactosa Sales biliares Verde brillante Agua CANTIDADES 10,0 10,0 20,0 g g g g
0,0133 1,0 l
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal manera que despus de la esterilizacin ste sea de 7,2 a 25 C. Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 1,0 C. Las campanas de fermentacin no deben contener burbujas de aire despus de la esterilizacin. 6.2 Materiales Pipetas bacteriolgicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapn de algodn. Las pipetas pueden ser graduadas en volmenes iguales a una dcima de su volumen total.
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Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca. Utensilios esterilizables para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, etc. Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metlicos o de rosca. Campanas de fermentacin (tubos de Durham). Pipetas bacteriolgicas graduadas de 10 y 1 ml. Gradillas. Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de dimetro. Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: Horno, durante 2 horas a 170 a 175 C o 1 h a 180 C o autoclave, durante 15 minutos como mnimo a 121 1,0 C. El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones deseadas. No debe usarse material de vidrio daado por las esterilizaciones repetidas y ste debe ser qumicamente inerte.
7. Aparatos e instrumentos Horno para esterilizar que alcance una temperatura mnima de 170 C. Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1,0 C, provista con termmetro calibrado. Termmetro de mximas y mnimas. Autoclave que alcance una temperatura mnima de 121 1,0 C. Potencimetro con una escala mnima de 0,1 unidades de pH a 25 C.
8. Preparacin de la muestra Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
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*Tomar la muestra de un alimento, agua fresca preparada en casa un da antes.
6. METODOLOGIA 9. Procedimiento 9.1 Para agua potable y hielo (*muestra de casa) 9.1.1 Prueba presuntiva 9.1.1.1 Inoculacin. Agitar la muestra. Transferir volmenes de 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado de mayor concentracin y 1,0 ml y 0,1 ml de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 ml de caldo lactosado de concentracin sencilla o caldo lauril sulfato triptosa con prpura de bromocresol. (Ver punto 6.1.2) 9.1.1.2 Incubacin. Incubar los tubos a 35 C. Examinar a las 24 2 h y observar si hay formacin de gas o la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 h. 9.1.2 Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin, caldo lactosa lauril bilis verde brillante. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 2 horas. En esta Norma Oficial Mexicana, para el anlisis de agua potable, agua purificada as como hielo, se emplea la serie de 5 tubos inoculados, 5 tubos con 10 ml, 5 tubos con 1 ml y 5 tubos con 0,1 ml, vase el cuadro 4. 2.2 Para alimentos. Preparar suficiente nmero de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la ltima dilucin rindan un resultado negativo. 9.2.1 Prueba presuntiva 9.2.1.1 Inoculacin. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentracin. Usar una pipeta estril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es lquida o 10 ml de la dilucin primaria inicial, en el caso de otros productos. 9.2.1.1.1 Tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una pipeta estril para transferir a cada uno de estos tubos 1
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2009
ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la dilucin primaria en el caso de otros productos. 9.2.1.1.2 Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el prrafo anterior, usando una pipeta diferente para cada dilucin. Mezclar suavemente el inculo con el medio. 9.2.1.2 Incubacin. Incubar los tubos a 35 0,5 C por 24 2 horas y observar si hay formacin de gas, en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 2 horas. 9.2.2 Prueba confirmativa De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una azada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, prolongar la incubacin por 48 2 horas. En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinacin de tres tubos por cada dilucin de la serie. Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisin en los resultados, ser necesario inocular una serie de cinco o diez tubos. 10. Expresin de los resultados Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que d formacin de gas despus del periodo de incubacin requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes. El cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar. Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando slo una dilucin muestra tres tubos positivos, elegir sta y las diluciones mayores posteriores. Ejemplo 2. Cuando ms de una dilucin muestra tres tubos positivos y la ltima da menos de tres, elegir esta ltima y las dos diluciones anteriores ms bajas. Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilucin hay tres tubos positivos y stos se encuentran en ms de tres diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente. Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos slo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y en la primera dilucin (1 ml o 10-1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el clculo del nmero ms probable.
92
2009
En cada caso se obtiene un nmero de tres cifras, lo cual es representado en los cuadros 4 al 7, segn corresponda. En la columna que indica el nmero de tubos positivos se busca el ndice del NMP. La tcnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta tcnica deben ser utilizados con precaucin. Los lmites de confianza estn representados en los cuadros 4 al 7. Por ejemplo, para una muestra slida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los lmites de confianza en el 95% de los casos variarn de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 del cuadro 3) y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los lmites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 cuadro 3). CUADRO 3.- Ejemplos de la seleccin de resultados positivos para el clculo del NMP. Nmero de tubos positivos obtenidos de tres E J E M P L O Otros productos (g) 1 10-1 10-2 10-3 10-4 lquido g-1 (5)* (5)* (6)* (4)* 150 240 70 24 2,1 (6)* (6)* (7)* (5)* (5)* productos NMPb
tubos incubados, para las siguientes cantidades de muestra inoculada por tuboa Producto lquido(ml) 10 1 10-1 10-2 10-3 Producto Otros
mayor dilucin = menor concentracin ml-1 1 2 3 4 5 3 3 2 3 2 3 3 2 3 2 2 3 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 15 24 7 2,4
0,21 (4)*
CUADRO 4. Indice del NMP y lmites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando son usados varios nmeros de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1 g)a
93
2009
3 tubos por dilucin 5 tubos por dilucin combinacin ndice 95% Lmites de ndice 95% Lmites de de del NMP confianza del NMP confianza positivos por g bajo alto por g bajo alto
0-0-0 <0,03 <0,005 0-0-1 0,03 0-1-0 0,03 0-2-0 -1-0-0 0,04 1-0-1 0,07 1-1-0 0,07 1-1-1 0,11 1-2-0 0,11 2-0-0 0,09 2-0-1 0,14 2-1-0 0,15 2-1-1 0,20 2-2-0 0,21 2-2-1 0,28 2-3-0 -3-0-0 0,23 3-0-1 0,39 3-0-2 0,64 3-1-0 0,43 3-1-1 0,75 3-1-2 1,20 <0,005 <0,005 ---
<0,09 <0,02 <0,005 <0,09 0,02 0,13 0,02 <0,005 <0,005 0,11
<0,07 0,07 0,07
0,04 <0,005 0,20 0,02
<0,005 0,01 0,01 0,03 0,03 0,01 0,03 0,03 0,07 0,04 0,10 -0,04 0,07 0,15 0,07 0,14 0,30
<0,005 0,11 0,11 0,15 0,15 0,13
0,07
0,21 0,04 <0,005 0,23 0,04 <0,005 0,36 0,06 <0,005 0,36 0,06 <0,005 0,36 0,05 <0,005 0,37 0,07 0,01 0,44 0,07 0,01 0,89 0,09 0,02 0,47 0,09 0,02 1,50 ---0,17 0,17 0,21 0,21 -0,28 0,19 0,25 -0,25 0,34 --
0,12 0,03
1,20 0,08 0,01 1,3 0,11 0,02 --
3,80 -2,1 2,3 3,8
0,11 0,02 0,14 0,04 ---
94
Instituto Tecnolgico de Mrida 3-2-0 0,93 3-2-1 1,50 3-2-2 2,10 3-3-0 2,40 3-3-1 4,60 3-3-2 11,0 0,15 0,30 0,35
Manual de Prcticas de Microbiologia 0,34 0,46 -----0,31 0,46 0,46 0,63 0,78 0,67 0,78 0,80 0,93 0,93 0,70 0,89 1,14 0,93 1,2 1,5 1,3 1,70
2009
3,80 0,14 0,04 4,40 0,17 0,05 4,70 ----------
0,36 13,0 0,71 24,0 1,50 48,0
3-3-3 >11,0 >1,50 >48,0 -4-0-0 -4-0-1 -4-1-0 -4-1-1 -4-1-2 -4-2-0 -4-2-1 -4-3-0 -4-3-1 -4-4-0 -5-0-0 -5-0-1 -5-0-2 -5-1-0 -5-1-1 -5-1-2 -5-2-0 -5-2-1 --
0,13 0,03 0,17 0,05 0,17 0,05 0,21 0,07 0,26 0,09 0,22 0,07 0,26 0,09 0,27 0,09 0,33 0,11 0,34 0,12 0,23 0,07 0,31 0,11 0,43 0,15 0,33 0,11 0,46 0,16 0,63 0,21 0,49 0,17 0,70 0,23
95
Instituto Tecnolgico de Mrida 5-2-2 -5-3-0 -5-3-1 -5-3-2 -5-3-3 -5-4-0 -5-4-1 -5-4-2 -5-4-3 -5-4-4 -5-5-0 -5-5-1 -5-5-2 -5-5-3 -5-5-4 -5-5-5 --
Manual de Prcticas de Microbiologia 2,2 1,9 2,5 3,4 5,0 3,0 4,9 7,0 8,5 10,0 7,5 10,0 14,0 32,0 58,0 --
2009
0,94 0,28 0,79 0,25 1,10 0,31 1,4 0,37
1,80 0,44 1,30 0,35 1,70 0,43 2,20 0,57 2,80 0,90 3,50 1,20 2,40 0,68 3,50 1,60 5,40 1,80 9,20 3,0 16,09 6,40 ---
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Aplicar tcnicas la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994. 2. Fomentar la investigacin a travs de observar y discutir resultados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Calcule la concentracin celular del alimento y reporte la concentracin con 2 dgitos y con exponenciacin decimal.
96

Tiempo (hs) 10
24 48
0
Manual de Prcticas de Microbiologia Concentracin celular

10
-4
2009
Dilucin Presuntiva 10
-1
10
-2
10
-3
10
-5
(NMP*/ml)
103 223
etc etc
Tiempo (hs) 10
24 48
0
Dilucin Confirmativa 10
-1
Concentracin celular
-4
10
-2
10
-3
10
10
-5
(NMP*/ml)
202 212
etc etc
*Nmero ms probable de microorganismos
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A. 3. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nomssa.html.
97
2009
Prctica 14. Curva de crecimiento poblacional en cultivo sumergido.
1. OBJETIVO Aplicar tcnicas de cultivo sumergido, y seguimiento de su desarrollo poblacional para observar el modelo de crecimiento.
2. INTRODUCCION El crecimiento y desarrollo de una poblacin microbiana se da cuando las condiciones ambientales y nutritivas son adecuadas, as la variacin del aumento del nmero de microorganismos por unidad de tiempo est en funcin de muchas variables como son la Temperatura, el pH, la Concentracin de nutrientes, la Concentracin celular, la Viscosidad, la Humedad, etc. La clula requiere para su crecimiento de una fuente de energa y de materia, en los procesos de fermentacin industrial estas fuentes en trminos generales es la misma, pero para la aparicin de una nueva clula es necesario que la materia contenga todos los componentes elementales que constituyen a la clula madre en composiciones que esta tenga la maquinaria para ser utilizada, primero degradndola en componentes pequeos y luego estos utilizarlos como bloques para ser ensamblados nuevamente en cada componente celular, algunas estructura qumicas de sus constituyentes ser necesario proverselos por carecer de la
maquinaria para producirlos a partir de los sillares de construccin, a estos se les conoce como factores de crecimiento, por lo que la clula bacteriana es esencialmente una maquinaria de sntesis capaz de duplicarse a s misma. El proceso de sntesis para el crecimiento bacteriano involucra unas 2000 reacciones qumicas de una amplia variedad. Una vez sintetizados los polmeros, el crecimiento contina con el ensamblaje y formacin de nuevas estructuras celulares que finalizan con la divisin en dos clulas hijas. En un medio apropiado se puede establecer un
98
2009
cultivo donde se reproduce continuamente mientras los nutrientes absorbidos y metabolizados permiten crecer al microorganismo. El crecimiento es definido como un incremento ordenado de todos los constituyentes y estructura celular. En muchos microorganismos, este incremento contina hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas: Fisin binaria El crecimiento microbiano conlleva usualmente a un incremento en el nmero de clulas. Es importante distinguir entre el crecimiento individual de clulas y el crecimiento de poblaciones de clulas: si analizamos el crecimiento microbiano en el tiempo, ste describe una tpica curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles. La curva de crecimiento puede dividirse en 4 principales fases: fase de adaptacin (lag), fase exponencial (log) esta fase es la ms significativa en el ciclo de crecimiento de los microorganismos y se caracteriza porque los parmetros cinticos del crecimiento (, td, Y, P, q) se mantienen constantes. , fase estacionaria y fase de muerte. Las fases de crecimiento de una poblacin bacteriana pueden determinarse midiendo la absorbancia a 600 nm del cultivo. Aunque no es una medida directa del nmero de clulas, su incremento es una indicacin del crecimiento bacteriano. A medida que la concentracin celular aumenta, se reduce la cantidad de luz transmitida que alcanza la celda fotoelctrica, como consecuencia de la difraccin de la luz por parte de las clulas. El cambio de luz se registra en el espectrofotmetro como porcentaje de transmisin (cantidad de luz transmitida) y absorbancia o densidad ptica (D. O). El desarrollo de una poblacin microbiana se puede modelar, por lo que utilizaremos en esta prctica el modelo exponencial del crecimiento microbiano basado en la fisin binaria.
99
2009 (ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Crecimiento y propagacin de microorganismos. Subtema. Determinacin del crecimiento. La curva y fases de crecimiento de una poblacin y su modelo exponencial.
4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento trmico. Descripcin del material Caldo nutritivo (g/l) Matraz Erlenmeyer 250 ml Tubos de ensaye de 18 x150 Tubos con tapn de rosca 18 x 150 Papel filtro Millipore Gradilla Crisol de 5 cm dimetro Pipeta 1 ml 2 15 Cantidad 8 15 10 15 3 1 Equipo Autoclave Espectrofotmetro Incubadora agitadora Filtro Millipore Microscopio Cmara de Neubauer Campana de flujo laminar Horno Vortex
5. METODOLOGIA Preparacin 1. Preparar 50 ml del medio Caldo nutritivo en cada matraz Erlenmeyer de 250 cc, esterilizar y conservar en refrigeracin hasta su uso.
100
2009
2. Preparar 2 tubos con tapn de rosca con 15 ml de solucin salina, esterilizar y conservar en refrigeracin hasta su uso. 3. Preparar el filtro Millipore y esterilizar. 4. Esterilizar las pipetas de 1 ml. Procedimiento 1. Transferir las clulas del cultivo puro de bacterias a los tubos de solucin salina y homogeneizar con el vortex durante 1 minuto, en la campana de flujo laminar. 2. Inocular con 0.5 ml de la solucin de bacterias. 3. Tomar muestra cada 2 horas de un matraz y cuantificar los parmetros tiempo y concentracin celular (D.O. y nmero de clulas). 4. Recuperar la masa celular con el filtro Millipore y determinar peso seco de los matraces donde la densidad ptica repiti.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar, comparar y discutir resultados.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Construya una tabla y construya una grfica.

Tiempo (hs)
2 4 etc
D.O.
Concentracin celular (nmero/ml)
Concentracin celular (g/l)
Observaciones
2. Calcule la velocidad de crecimiento ( ).
101
2009
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. Quintero R., 1981. Ingeniera bioqumica. Teora y aplicaciones. Editorial Alhambra Mexicana, S:A.
102
2009
Prctica 15. Efecto de los agentes fsicos y qumicos sobre el crecimiento microbiano.
1. OBJETIVO Probar el efecto de diferentes agentes fsicos y agentes qumicos a diferentes grupos microbianos, evaluar el efecto de los agentes sobre el crecimiento microbiano.
2. INTRODUCCION Los microorganismos, como todos los seres vivos, requieren unas condiciones ambientales especficas para su desarrollo. Esto significa que existen numerosos parmetros y sustancias que influyen en su crecimiento. La resistencia bacteriana se define como "una condicin microbiolgica caracterizada por la capacidad natural o adquirida, por parte de una cepa bacteriana de permanecer refractaria a los efectos bactericidas o bacteriostticos de un antibitico". La resistencia bacteriana obliga al desarrollo y utilizacin de nuevos antibacterianos, que son ms costosos y a veces ms txicos que los empleados habitualmente. Cuando se lanza al mercado un frmaco antibacteriano, se define el espectro de microorganismos sobre los cuales es eficaz, pero luego este patrn va cambiando a medida que la droga se utiliza clnicamente, llegando en algunos casos a caer en el desuso.
Factores Fsicos En lo que se refiere a los agentes fsicos, son numerosos los factores que influyen en el crecimiento microbiano, si bien no todos ellos son susceptibles de ser empleados para ejercer control. Entre los principales factores fsicos y fsico-qumicos que influyen decisivamente sobre el crecimiento de los microorganismos, cabe destacar: Temperatura
103
Instituto Tecnolgico de Mrida Energa sonora pH Radiaciones Actividad de agua Oxgeno Tensin superficial.
2009
Todos estos factores son importantes, pero a nivel prctico, los ms empleados son la temperatura, el pH, la actividad de agua y la concentracin de oxgeno. La actuacin sobre estos factores es una prctica habitual para el control del crecimiento microbiano. Se emplean temperaturas elevadas con fines de
esterilizacin de materiales, o temperaturas bajas, con la finalidad de conservacin. El pH se establece en valores del rango cido en alimentos fermentados como el yogur o lo encurtidos. La desecacin (disminucin de la actividad de agua) es otra de las tcnicas habitualmente empleadas en la industria alimentaria para el control del crecimiento microbiano. Por ltimo, la modificacin de las concentraciones de oxgeno, en alimentos envasados a vaco o productos envasados en atmsferas inertes, es tambin una prctica extendida a nivel industrial. Entre todos estos factores, sin duda alguna, la temperatura es el agente fsico que ha recibido una mayor atencin por parte de los investigadores, ya que su efecto sobre el crecimiento microbiano es extraordinario. La mayora de las bacterias, especialmente las especies patgenas para el hombre, tienen un intervalo de crecimiento comprendido entre 20C y 45C, con un ptimo de temperatura a 35-37C (bacterias mesfilas). Pero hay otras, que pueden o incluso necesitan desarrollarse a otras temperaturas (Psicrotrficas: 4-20 C, Termoflicas: 65C). De especial inters en cuanto a su resistencia trmica son las bacterias esporuladas, ya que las esporas pueden resistir temperaturas cercanas a los 80C durante periodos de tiempo que resultan mortales para el resto de las bacterias.
Factores Qumicos
104
2009
Existen ciertas sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: bacteriostticos: cuando impiden el crecimiento bacteriano; bactericidas: cuando destruyen (matan) las bacterias. En general, si no slo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostticos y
microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia qumica, la lnea de demarcacin entre un efecto microbiosttico y otro microbicida depende muchas veces de la concentracin de dicha sustancia y del tiempo durante el que acta. Por lo que respecta a sustancias qumicas, desde el comienzo de la Microbiologa se han buscado compuestos que limitaran e inhibieran el desarrollo de los microorganismos. As naci la denominada Era Antibitica desde mediados del siglo XX, que ha ido evolucionando desde los antibiticos clsicos hasta los modernos compuestos de origen sinttico (quimioteraputicos). Existen algunas pruebas que sirven para poner de manifiesto la capacidad antimicrobiana de los diferentes quimioteraputicos y antibiticos. Entre estas pruebas, se pueden destacar la determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la realizacin de Antibiogramas. La determinacin de la CMI se realiza a partir de medios lquidos inoculados con la misma cantidad de cultivo microbiano y a los que se aaden cantidades crecientes del antimicrobiano objeto de estudio. La mnima concentracin en la cual no aparezca enturbiamiento ser considerada como la CMI de ese quimioteraputico. El antibiograma, realizado en medios slidos, se lleva a cabo por el mtodo de difusin en placa. El organismo se siembra mediante esta tcnica y se le expone a la accin de varios discos de papel impregnados antimicrobianos, que en funcin de su actividades frente al microorganismo darn lugar o no a un halo de inhibicin a su alrededor. En caso de que se forme dicho halo, el dimetro de ste clasificar la bacteria como sensible, moderadamente sensible, intermedio o resistente.
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2009 (ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Crecimiento y propagacin de los microorganismos. Subtema. Factores fsicos y qumicos que influyen en el crecimiento microbiano. Los agentes fsicos y qumicos y su influencia en el control de los microorganismos.
4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento trmico. Descripcin del material Agar nutritivo (g/l) Caldo nutritivo (g/l) Etanol (ml) Cloro comercial (ml) Microdin (ml) Amoxicilina Tetraciclina l-quine Tubos tapn con rosca de 18 x 150 Cajas Petri Pipeta de 10 ml Pipeta de 1 ml Matraz Erlenmeyer 250 ml Cantidad 23 8 10 10 10 unidad unidad unidad 40 20 5 15 2 Equipo Autoclave Bao metablico (3) Horno Microscopio Cmara de Neubauer Estufa incubadora
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Instituto Tecnolgico de Mrida 5. METODOLOGIA Preparacin
2009
1. Preparar 10 ml de una solucin de 10 % de cloro comercial en tubo con tapn de rosca. 2. Prepara 10 ml de una solucin de 5 % de microdin (plata coloidal) comercial en tubo con tapn de rosca. 3. Preparar 10 ml de una solucin de etanol al 70 % en tubo con tapn de rosca. 4. Preparar una solucin de NaOH 0.1 N, envasarlo en un frasco. 5. Preparar una solucin de HCl 1 N, envasarlo en un frasco. 6. Esterilizar 10 tubos con 5 ml de agua destilada y conservar en refrigeracin hasta su uso. 7. Esterilizar 5 tubos con 9 ml de solucin salina y conservar en refrigeracin hasta su uso. 8. Esterilizar 2 tubos con 9 ml de caldo nutritivo a pH de 5.0, 7.0 y 9.0 (ajustar con las soluciones cida y base previamente elaborada) y conservar en refrigeracin hasta su uso. 9. Esterilizar 10 tubos con 9 ml de caldo nutritivo y conservar en refrigeracin hasta su uso. 10. Esterilizar 1 matraz Erlenmeyer con 99 ml de solucin salina y conservar en refrigeracin hasta su uso. Procedimiento 1. Inocular la cepa bacteriana en una caja Petri con agar nutritivo e incubar durante 24 horas. 2. Suspender las clulas crecidas en un tubo con caldo nutritivo e incubarlo durante 8 horas. 3. Tomar una alcuota de 1 ml de las clulas suspendidas en el caldo nutritivo y transferirlo a matraz de 99 ml de solucin salina estril. Determinacin del efecto del pH 1. Tomar los tubos con caldo nutritivo estril a pH de 5.0, 7.0 y 9.0 e inocularlos con 1 ml de suspensin celular (en solucin salina) cada uno.
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2009
2. Incubarlos en bao metablico a 35C, durante 24 horas y contar las concentracin celular usando la cmara de Neubauer. Determinacin del efecto de la Temperatura 1. Tomar 3 tubos con caldo nutritivo estril e inocularlos con 1 ml de suspensin celular (en solucin salina) cada uno. 2. Incubarlos en bao metablico a 20C, 30C y 40C respectivamente, durante 24 horas y contar la concentracin celular usando la cmara de Neubauer. Determinacin del efecto de agentes qumicos 1. Tomar 3 tubos con caldo nutritivo estril e inocularlos con 1 ml de suspensin celular (en solucin salina) cada uno, adicionar 1 ml de los 3 diferentes qumicos (Etanol, Cloro comercial y microdin) respectivamente, exponindolos al qumico durante 15 minutos. 2. Tomar 0.5 ml del caldo de cada uno de los tratamientos y utilizarlo para inocular una caja Petri con agar nutritivo, hacerlo por duplicado, respectivamente. 3. Incubarlas en la estufa de incubacin a 35C, durante 24 horas y contar la concentracin celular usando cuenta viable. Determinacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) 1. Previamente se preparan 5 tubos de ensayo con 1 ml de Caldo Nutritivo y un tubo de ensayo con 1,8 ml. A este ltimo se aaden 0,2 ml de solucin madre de antimicrobiano (dilucin 1:10). 2. Tras homogeneizar, se toma 1 ml y se transfiere a uno de los tubos con 1 ml el proceso se repite (diluciones seriadas) con todos los tubos para ir obteniendo concentraciones de antimicrobiano mitad de la anterior (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160). 3. Cada tubo se inocula con 1 ml de un cultivo bacteriano de 8 horas llevado a dilucin 1:100, de solucin salina estril; se emplea para inocular cada uno de los tubos con las diferentes concentraciones del antimicrobiano. 4. Los tubos se incuban a 37C durante 24 horas. Se tomar como CMI la del tubo de menor concentracin en el que no se obtenga crecimiento (turbidez). Antibiograma 1. Se prepara un inculo de idnticas caractersticas al que se describi para la determinacin de la CMI.
108
2009
2. Se introduce en el medio un hisopo, eliminando el exceso de lquido presionando sobre las paredes del tubo antes de sacarlo de ste. 3. Con el hisopo se siembran placas de Agar Nutritivo por descarga masiva sobre la superficie del medio. 4. Se dejan secar las placas durante cinco minutos y se colocan los discos impregnados en antibiticos mediante el uso de pinzas estriles. 5. Para colocar los discos hay que dejar unos 20 mm entre disco y disco, y unos 15 mm con respecto a los bordes de la placa. 6. Transcurridos 15 minutos (durante los cuales se produce la difusin de los antibiticos), se incuba a 37 C durante 18-24 horas. 7. Transcurrido el tiempo de incubacin, se miden los halos de inhibicin alrededor de cada disco.
6. SUGERENCIAS DIDACTICAS 1. Fomentar la investigacin a travs de observar el efecto agentes fsicos y qumicos sobre los microorganismos.
7. REPORTE DEL ALUMNO 1. Describa a travs de una tabla los resultados:

Tratamiento C
20 30 40
Concentracin celular (Clulas/ml)

1289 44567 etc
Observaciones
109
2009
8. BIBLIOGRAFIA
1. Bradshaw J., 1979. Microbiologa de laboratorio. Editorial El manual Moderno, S.A. 2. www.ual.es/Universidad/Depar/microbiologia
110
2009
Prctica 16. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
1. OBJETIVO Utilizar la tcnica de PCR para la amplificacin de molculas de ADN, y evaluar el resultado de la amplificacin.
2. INTRODUCCION En 1983, Kary Mullis desarroll la tcnica denominada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) que desde entonces ha revolucionado la investigacin gentica y la biologa molecular , lo que le vali el Premio Nobel en 1993. Muchas de las
tcnicas de biologa molecular utilizadas antes de la PCR eran de mano de obra intensiva, requiriendo mucho tiempo y alto nivel de conocimientos tcnicos. Antes de la PCR, el uso de tcnicas de biologa molecular para usos teraputicos, forenses, farmacuticos, o mdicos con fines de diagnstico no era prctico ni
rentable. El desarrollo de la tecnologa de la PCR cambi estos aspectos de la biologa molecular de una ciencia difcil a uno de los ms accesibles y ampliamente utilizado como herramienta de la investigacin gentica y la medicina. La PCR produce cantidades grandes de forma exponencial de un fragmento especfico de ADN a partir de una plantilla. La plantilla puede ser cualquier forma de doble hlice de ADN, como el ADN genmico. Un investigador puede tener trazas de ADN de una gota de sangre, un nico folculo piloso, clulas de las mejillas, muestra de microorganismos, etc., y el uso de PCR podra generar millones de copias de un fragmento de ADN deseado. En teora, slo una nica cadena molde es necesaria para generar millones de nuevas molculas de ADN. La amplificacin por PCR requiere la presencia de al menos una cadena molde de ADN. Una de las principales razones por la que la PCR es una herramienta especificidad. Todo lo que se requiere es:
111
poderosa es su simplicidad y
2009
amortiguadores para la reaccin, cuatro subunidades de ADN
(desoxinucletido
trifosfato de adenina, guanina, timina y citosina), DNA Polimerasa, dos iniciadores (primers) de ADN, y cantidades mnimas de la cadena molde o plantilla de ADN a ampliar. La especificidad proviene de la posibilidad de orientar y ampliar un segmento especfico de ADN de un genoma completo.
3. CORRELACION
CON
EL
PROGRAMA
DE
MICROBIOLOGIA
(ING.
BIOQUIMICA BQO-0525) Tema. Gentica microbiana. Subtema. La reaccin en cadena de la polimerasa PCR. Los tratamientos trmicos a los materiales o alimentos permiten mantener condiciones para poder trabajar libres de contaminacin y dar ms tiempo de.
4. MATERIAL Y EQUIPO Para cada tratamiento trmico. Descripcin del material 1 Kit Biotecnologa Explorer Cromosoma 16: PV92 PCR Kit de Informtica Catlogo # 166-2100EDU 4 tubos con tapa con InstaGene matrix and protease 2 soportes para tubos: Foam micro test tube holders Puntas micropipetas 1001,000 l 1 1caja Bao de hielo Cantidad Equipo Bao metablico (2)
Termociclador
Cmara de electroforesis
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Instituto Tecnolgico de Mrida Puntas para 20200 l Micropipet de 1000 l vol variable Micropipet de 200 l vol variable 1 Pinzas de diseccin Tijeras Contenedor para desperdicios
Manual de Prcticas de Microbiologia Fuente de poder 1 1 1 1 1 1 4 4 1 Horno de microondas
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Agitador de plataforma Microcentrifuga Vortex
Marcador ultrafine de tinta permanente Tubos para PCR Micro tubos sin tapa Tubo con Complete master mix (containing primers) en bao de hielo Micropipeta de 20 l o de 10 l puntas de micropipeta de 220 l Foam micro test tube holders controles positivos: PV92 homozygous (+/+) PV92 homozygous (/) PV92 heterozygous (+/) Molten agarose, 40 ml por gel muestra de PCR por estudiante tubo de PV92 XC DNA loading dye 1x TAE electrophoresis buffer 275 ml puntas de micropipeta de 220 l tubo de marcador de pares de bases EZ Load molecular mass ruler (DNA
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1 1 1 1 12 1
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Instituto Tecnolgico de Mrida standards)
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Fast Blast DNA stain, 1x o 100x solution* 120 ml por cada 8 estudiantes bandeja de Gel por cada 8 alumnos charola de tincin (plstica) Gel staining tray por cada 8 estudiantes contenedor charola plstica grande (2 litros) para desteir, por cada 8 alumnos protocolo del 1 Kit Biotecnologa Explorer Cromosoma 16: PV92 PCR Kit de Informtica. Catlogo # 166-2100EDU 1 1
5. METODOLOGIA 1. Seguir las instrucciones del protocolo anexadas a continuacin, indicado por el productor del Kit utilizado.
Lesson 1
Hair Follicle DNA Template Preparation (Lab Protocol)
1. Each member of your team should have 1 screwcap tube containing 200 l of InstaGene matrix plus protease. Label the tube on the cap and side with your initials.
2. Collect 2 hairs from yourself. Choose hairs that leave noticeable sheaths (a coating of epitheleal cells around the base of the hair). Alternatively, choose hairs that have a 114
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large root. The root is the bulb-shaped base of the hair. Keeping the end of the hair with the sheath and bulb, trim the hair with scissors so it is ~2 cm long. Place your trimmed hairs into the screwcap tube with your initials. Screw the cap tightly on the tube.
3. Place your tube in the foam micro test tube holder and incubate it at 56C for 10 minutes in a water bath. At the halfway point (5 minutes), shake or vortex the tube gently, then place it back in the 56C water bath for the remaining 5 minutes.
4. Remove your tube, gently shake or vortex it, then place it in a boiling water bath (100C) 5 minutes.
5. Remove your tube from the boiling water bath and shake or vortex to resuspend the contents. Pellet the matrix by spinning at 6,000 x g for 5 minutes (or 2,000 x g for 10 minutes).
6. Store your screwcap tube in the refrigerator until the next laboratory period (or proceed to step 2 of Lesson 2).
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Lesson 2 PCR Amplification (Lab Protocol)
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1. Obtain your screwcap tube that contains your genomic DNA template from the refrigerator. Centrifuge your tubes for 2 minutes at 6,000 x g or for 5 minutes at 2,000 x g in a centrifuge. 2. Each member of the team should obtain a PCR tube and capless micro test tube. Label each PCR tube on the side of the tube with your initials and place the PCR tube into the capless micro test tube as shown. Place the PCR tube in the foam micro test tube holder.
3. Transfer 20 l of your DNA template from the supernatant in your screwcap tube into the bottom of the PCR tube. Do not transfer any of the matrix beads into the PCR reaction because they will inhibit the PCR reaction.
4. Locate the tube of yellow PCR master mix (labeled Master) in your ice bucket. Transfer 20 l of the master mix into your PCR tube. Mix by pipetting up and down 23 times. Cap the PCR tube tightly and keep it on ice until instructed to proceed to the next step. Avoid bubbles, especially in the bottom of the tubes.
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5. Remove your PCR tube from the capless micro test tube and place the tube in the Gene Cycler or MyCycler thermal cycler.
6. When all of the PCR samples are in the thermal cycler, the teacher will begin the PCR reaction. The reaction will undergo 40 cycles of amplification, which will take approximately 3 hours. 7. If your teacher instructs you to do so, you will now pour your agarose gels (the gels may have been prepared ahead of time by the teacher).
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Lesson 3
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Gel Electrophoresis of Amplified PCR Samples (Lab Protocol)
1. Remove your PCR samples from the thermal cycler and place in the micro test tube holder. If a centrifuge is available, place the PCR tubes in the capless micro test tubes and pulsespin the tubes (~3 seconds at 2,000 x g) to bring the condensation that formed on the lids to the bottom of the tubes. 2. Add 10 l of PV92 XC loading dye to each PCR tube and mix gently. 3. Obtain an agarose gel (either the one you poured or one pre-poured by your teacher). Place the casting tray with the solidified gel in it, onto the platform in the gel box. The wells should be at the cathode () end of the box, where the black lead is connected. Very carefully remove the comb from the gel by pulling it straight up, slowly. 4. Pour ~275 ml of electrophoresis buffer into the electrophoresis chamber, until it just covers the wells.
5. Using a clean tip for each sample, load the samples into the 8 wells of the gel in the following order: Lane 1 2 3 4 5 6 7 8 Sample MMR (DNA standard) Homozygous (+/+) control Homozygous (/) control Heterozygous (+/) control Student 1 Student 2 Student 3 Student 4 Load Volume 10 10 10 10 20 l 20 l 20 l 20 l
6. Secure the lid on the gel box. The lid will attach to the base in only one orientation: red to red and black to black. Connect the electrical leads to the power supply.
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7. Turn on the power supply. Set it to 100 V and electrophorese the samples for 30 minutes.
8. When electrophoresis is complete, turn off the power and remove the lid from the gel box. Carefully remove the gel tray and the gel from the gel box. Be careful, the gel is very slippery. Nudge the gel off the gel tray with your thumb and carefully slide it into your plastic staining tray.
Staining of Agarose Gels The moment of truth has arrived. What is your genotype? Are you a homozygote or a heterozygote? To find out, you will have to stain your agarose gel. Since DNA is naturally colorless, it is not immediately visible in the gel. Unaided visual examination of gel after electrophoresis indicates only the positions of the loading dyes and not the positions of the DNA fragments. DNA fragments are visualized by staining the gel with a blue dye called Fast Blast DNA stain. The blue dye molecules are positively charged and have a high affinity for the DNA. These blue dye molecules strongly bind to the DNA fragments and allow DNA to become visible. These visible bands of DNA may then be traced, photographed, sketched, or retained as a permanently dried gel for analysis.
Directions for Using Fast Blast DNA Stain Below are two protocols for using Fast Blast DNA stain in the classroom. Use protocol 1 for quick staining of gels to visualize DNA bands in 12 15 minutes, and protocol 2 for overnight staining. Depending on the amount of time available, your teacher will decide which protocol to use. Two student teams will stain the gels per staining tray (you may want to notch gel corners for identification). Mark staining trays with initials and class period before beginning this activity.
WARNING
Although Fast Blast DNA stain is nontoxic and noncarcinogenic, latex or vinyl gloves should be worn while handling the stain or stained gels to keep hands from becoming stained blue. Lab coats or other protective clothing should be worn to avoid staining clothes.
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Protocol 1: Quick Staining of Agarose Gels in 100x Fast Blast DNA Stain This protocol allows quick visualization of DNA bands in agarose gels within 15 minutes. For quick staining, Fast Blast DNA stain (500x) should be diluted to a 100x concentration. We recommend using 120 ml of 100x Fast Blast to stain two 7 x 7 cm or 7 x 10 cm agarose gels in individual staining trays provided in Bio-Rads education kits. If alternative staining trays are used, add a sufficient volume of staining solution to completely submerge the gels. Following electrophoresis, agarose gels must be removed from their gel trays before being placed in the staining solution. This is easily accomplished by holding the base of the gel tray in one hand and gently pushing out the gel with the thumb of the other hand. Because the gel is fragile, special attention must be given when handling it. We highly recommend using a large spatula or other supportive surface to transfer the gel from one container to another. Destaining requires the use of at least one large-volume container, capable of holding at least 500 ml, at each student workstation. Each student team may utilize separate washing containers for each wash step, or simply use a single container that is emptied after each wash and refilled for the next wash. 1. Mark the staining tray with your initials and class period. You will stain 2 gels per tray. 2. Stain gels (23 minutes). Remove each gel from the gel tray and carefully slide it into the staining tray. Pour approximately 120 ml of 100x stain into the staining tray. If necessary, add more 100x stain to completely submerge the gels. Stain the gels for 2 3 minutes, but not for more than 3 minutes. Using a funnel, pour the 100x stain into a storage bottle and save it for future use. The stain can be reused at least 7 times.
3. Rinse gels. Transfer the gels into a large container containing 500 700 ml of clean, warm (4055C) tap water. Gently shake the gels in the water for ~10 seconds to rinse.
4. Wash gels. Transfer the gel into a large container with 500 700 ml of clean, warm tap water. Gently rock or shake the gels on a rocking platform for 5 minutes. If no rocking platform is available, move the gels gently in the water once every minute.
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5. Wash gels. Perform a second wash as in step 4.
6. Record and analyze results. Examine the stained gels for expected DNA bands. The bands may appear fuzzy immediately after the second wash, but will begin to develop into sharper bands within 515 minutes after the second wash. This is due to Fast Blast dye molecules migrating into the gel and binding more tightly to the DNA molecules. To obtain maximum contrast, additional washes in warm water may be necessary. Destain to the desired level, but do not wash the gels in water overnight. If you cannot complete the destaining in the allocated time, you may transfer the gel to 1x Fast Blast stain for overnight staining. See Protocol 2. a. Place your gel on a light background and record your results by making a diagram as follows. Place a clear sheet of plastic sheet or acetate over the gel. With a permanent marker, trace the wells and band patterns onto the plastic sheet to make a replica picture of your gel. Remove the plastic sheet for later analysis. Alternatively, gels can be photocopied on a yellow piece of transparent film for optimal contrast. b. With the help of your instructor, determine whether you are homozygous or heterozygous for the Alu insertion. First look at the control samples and note the migration patterns of the homozygous +/+, the homozygous /, and the heterozygous +/ samples (also refer to the example on page 59). You may notice that in the heterozygous sample the smaller 641 base pair band is more intense than the larger 941 bp band. This difference is due to the fact that the smaller fragment is amplified more efficiently than the larger fragment. Copies of the shorter fragment can be made at a faster rate than the bigger fragment, so more copies of the shorter fragment are created per cycle. Refer to pages 6972 for more information on how to analyze your data.
c. Dry the agarose gel as a permanent record of the experiment. i. Trim away any unloaded lanes with a knife or razor blade. Cut your gel from top to bottom to remove the lanes that you did not load samples into.
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ii. Place the gel directly upon the hydrophilic size of a piece of gel support film. (Water will form beads on the hydrophobic side of a piece of gel support film.) Center the gel on the film and remove bubbles that may form between the gel and film. Place the film on a paper towel and let the gel dry in a well-ventilated area, making sure to avoid direct exposure to light. As the gel dries it will bond to the film but will not shrink. If left undisturbed on the support film, the gel will dry completely at room temperature after 2 3 days. The result will be a flat, transparent, and durable record for the experiment. Tape the dried gel into your laboratory notebook.
Note: Avoid extended exposure of dried gels to direct light to prevent band fading. However DNA bands will reappear if the dried gels are stored in the dark for 23 weeks after fading.
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Protocol 2: Overnight Staining of Agarose Gels in 1x Fast Blast DNA Stain For overnight staining, Fast Blast DNA stain (500x) should be diluted to a 1x concentration. We recommend using 120 ml of 1x Fast Blast to stain two 7 x 7 cm or 7 x 10 cm agarose gels in individual staining trays provided in Bio-Rads education kits. If alternative staining trays are used, add a sufficient volume of staining solution to completely submerge the gels. Following DNA electrophoresis, agarose gels must be removed from their gel trays before being placed in the staining solution. This is easily accomplished by holding the base of the gel tray in one hand and gently pushing out the gel with the thumb of the other hand. Because the gel is fragile, special attention must be given when handling it. 1. Mark staining trays with your initials and class period. You will stain two gels per tray. 2. Stain gels (overnight)* Pour 1x stain into a gel staining tray. Remove each gel from the gel tray and carefully slide it into the staining tray containing the stain. If necessary, add more 1x staining solution to completely submerge the gels. Place the staining tray on a rocking platform and agitate overnight. If no rocking platform is available, agitate the gels staining tray a few times during the staining period. You should begin to see DNA bands after 2 hours, but at least 8 hours of staining is recommended for complete visibility of stained bands.
3. Analyze results No destaining is required after staining with 1x Fast Blast. The gels can be analyzed immediately after staining.
a. Place your gel on a light background and record your results by making a diagram as follows. Place a clear sheet of plastic sheet or acetate over the gel. With a permanent marker, trace the wells and band patterns onto the plastic sheet to make a replica picture of your gel. Remove the plastic sheet for later analysis. Alternatively, gels can be photocopied on a yellow piece of transparent film for optimal contrast.
* Shake the gels gently and intermittently during overnight staining in 1x Fast Blast DNA stain; small DNA fragments tend to diffuse without shaking.
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b. With the help of your instructor, determine whether you are homozygous or heterozygous for the Alu insertion. First look at the control samples and note the migration patterns of the homozygous +/+, the homozygous /, and the heterozygous +/ samples (also refer to the example on page 59). You may notice that in the heterozygous sample the smaller 641 base pair band is more intense than the larger 941 bp band. This difference is due to the fact that the smaller fragment is amplified more efficiently than the larger fragment. Copies of the shorter fragment can be made at a faster rate than the bigger fragment, so more copies of the shorter fragment are created per cycle. Refer to pages 6972 for more information on how to analyze your data.
c. Dry the agarose gel as a permanent record of the experiment. i. Trim away any unloaded lanes with a knife or razor blade. Cut your gel from top to bottom to remove the lanes that you did not load samples into.
ii. Place the gel directly upon the hydrophilic size of a piece of gel support film. (Water will form beads on the hydrophobic side of a piece of gel support film.) Center the gel on the film on a paper towel and let the gel dry in a wellventilated area, making sure to avoid direct exposure to light. As the gel dries it will bond to the film but will not shrink. If left undisturbed on the support film, the gel will dry completely at room temperature after 2 3 days. The result will be a flat, transparent, and durable record for the experiment. Tape the dried gel into your laboratory notebook.
Note: Avoid extended exposure of dried gels to direct light to prevent band fading. However, DNA bands will reappear if the dried gels are stored in the dark for 2 3 weeks after fading
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Instituto Tecnolgico de Mrida SUGERENCIAS DIDACTICAS
2009
1. Fomentar la investigacin con la observacin y discusin de los resultados.
6. REPORTE DEL ALUMNO 1. Compare sus resultados con los resultados de sus compaeros y presente un resumen. 2. Escriba sus conclusiones.
8. BIBLIOGRAFIA 1. Glick B. y Pasternak J. 1998. Molecular Biotechnology. Editorial ASM Press, Washington DC. 2. biologia.ucr.ac.cr/profesores/laboratorio/Practica%205.pdf 3. www.discover.bio-rad.com
125

Manual Microbiologia FINAL

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