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BIO 368 ANALISIS INSTRUMENTAL

Métodos cromatográficos I

CROMATOGRAFIA Conjunto de técnicas utilizadas para la separación de mezclas de solutos, basada en la diferente solubilidad (afinidad) de los solutos por dos solventes (fases) inmiscibles. e la clasifica seg!n los criterios f"sico#$u"micos responsables de la separación. e desarrolló en Inglaterra en la década del %&' para la separación de sustancias coloreadas (de all" su nombre( cromatograf"a). )l fundamento de todas las formas de cromatograf"a es el *coeficiente de partición+ (Kd ) $ue describe la distribución de un compuesto en las dos fases inmiscibles(
concentración en la a!e A

Kd " ###########################

. # -ase móvil( un l"$uido o un gas. un gel. . $ue flu. e escoge las fases de modo $ue los coeficientes de partición de los componentes de la mezcla sean lo más distintos posible.e sobre o a través de la fase fija.as dos fases de todo sistema cromatográfico se denominan( # -ase estacionaria o fase fija( un sólido. un l"$uido.

()j( cromatograf"a de intercambio iónico4 cromatoenfo$ue). I37)2C/M8I1 I13IC1( e$uilibrio entre un intercambiador iónico fijo . 6/27ICI13( e$uilibrio entre una fase fija l"$uida .TI$OS %E CROMATOGRAFIA e los clasifica de acuerdo al principio f"sico#$u"mico $ue permite la separación( /0 12CI13( e$uilibrio entre una fase fija sólida . una fase móvil l"$uida o gaseosa. ()j( cromatograf"a de adsorción4 cromatograf"a de interacción 5idrofóbica). . una fase móvil con electrolitos. ()j( cromatograf"a en fase reversa4 cromatograf"a gas#l"$uido4 cromatograf"a de contra#corriente). una fase móvil l"$uida.

/-I3I0/0( e$uilibrio entre un ligando inmovilizado (fase fija) . ()j( cromatograf"a de afinidad4 cromatograf"a de inmunoafinidad4 cromatograf"a de ligando#colorante). ()j( cromatograf"a de filtración molecular). un fase móvil l"$uida. es com!n $ue dos o más de estos tipos de e$uilibrio operen en forma simultánea en una determinada cromatograf"a. )n la práctica.: I13( e$uilibrio entre un l"$uido atrapado en los poros de una fase fija sólida . .TI$OS %E CROMATOGRAFIA (continuación) )9C. un ligando en solución (fase móvil).

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se supone un coeficiente de partición igual a =.< mg de una sustancia en = ml de fase móvil . >?ué ocurre si tenemos además otro compuesto con coeficiente =''@ . /l cabo de un n!mero de e$uilibrios el compuesto se distribu.)n el ejemplo se agregan .e en una banda simétrica.

con ello el éAito de la separación( =. partición. intercambio iónico. <.# 6rocesos $ue tienden a oponerse a la separación. etc. difusión. . ej. $ue producen bandas más anc5as . p. *tailing+.).$ARAMETROS %E REN%IMIENTO CROMATOGRAFICO )n cromatograf"a. adsorción.. dos tipos de procesos afectan el comportamiento de los analitos .# Mecanismos f"sico#$u"micos básicos $ue definen el proceso (p. ej.

Influenciado por las dimensiones de la columna. # *ol+&en de el+ción (*e). #*elocidad de l+-o (Fc) de la fase móvil (mlCmin). *e " tr A Fc . la caracter"stica f"sica de las part"culas./. la viscosidad de la fase móvil.B:3/ 0)-I3ICI13) ( # Tie&'o de retención (tr)( tiempo re$uerido por un analito para emerger de la columna. . volumen de fase móvil re$uerido para eluir el analito.

e grafica la respuesta del detector en función del tiempo de retención (o volumen de elución). mal empa$ue de la columna. etc. .UN CROMATOGRAMA. .a asimetr"a de un pico puede tener distintas causas( aplicación de un eAceso de analito. deficiente aplicación de la muestra.

a resolución de dos picos / . Dalores de 2s de =. 8 (R!) depende de las propiedades de éstos( . /A . lo $ue es adecuado para análisis cuantitativo. de B1 . . . /B el anc5o de la base de los picos respectivos.' corresponde a una separación del EF G. (trB # trA) R! " ################ /A 0 /B donde( trA .)l éAito de una cromatograf"a se mide por su capacidad de separar (resolver) completamente un analito de una mezcla. trB son los tiempos de retención de A .

). pero también aumentan el tiempo de retención . /. tr el tiempo de retención. Una col+&na e! &3! e ecti4a &ientra! &3! 'lato! teórico! ten5a1 )l n!mero de platos teóricos (N) involucrados en la elución de un analito determinado está dado por( N " 66 (tr7/). o N " 898: (tr7/. ser aumentado alargando la columna. 0onde / es la anc5ura de la base de cada pico. dentro de ciertos l"mites. el anc5o . su altura en la columna es la Haltura del platoH (2). la anc5ura del pico medida a la mitad de su altura . )l n!mero N puede.e considera $ue las columnas cromatográficas consisten de un conjunto de zonas ad. móvil. Cada una de estas zonas 5ipotéticas se denomina un Hplato teóricoH .acentes donde 5a. suficiente espacio para $ue los solutos logren un e$uilibrio completo entre las fases fija .

. (. Mientras ma.or sea 3.)fecto del n!mero de platos teóricos en la distribución de un soluto. menor I) más angosto será el pico del analito.

menor la tendencia a la difusión. más rápido es el e$uilibrio . . la fase móvil. # Caminos m!ltiples. )l analito tiende a difundir de zonas de alta concentración a a$uellas de baja concentración. #7iempo re$uerido para el e$uilibrio entre las dos fases. esto genera muc5os caminos entre las part"culas para el analito .$ROCESOS <UE TIEN%EN A AUMENTAR LA ANC2URA %EL $ICO %E ELUCION %E UN ANALITO #7iempo re$uerido para aplicar la muestra a la columna. Mientras más pe$ueJas las part"culas de la fase estacionaria. )l empa$ue de la columna es aleatorio . # 0ifusión longitudinal.

$ue se sobreponen. . el cromatoenfo$ue son de alta capacidad. )s una medida de los efectos de difusión $ue producen picos más anc5os . . Capacidad del sistema de discriminar entre compuestos relacionados estructuralmente. depende de los siguientes parámetros( # electividad.a cromatograf"a de intercambio iónico . 0epende de la naturaleza $u"mica de las fases fijas . e refleja en los valores de Kd.)l éAito de un sistema cromatográfico determinado se eval!a por su capacidad de resolución . )s un "ndice de la cantidad de material $ue puede ser resuelto sin sobreposición de picos. # Capacidad. móvil. # )ficiencia. /lta selectividad muestra la cromatograf"a de afinidad. Importante el empa$ue de la columna.

L' bar.C N<' # L' bar) Cromatograf"a de alta presión( presiones sobre L' bar.L M6a. (-6. 0enominada también I6.C. L.= /tm). Cromatograf"a de presión media( genera presiones entre M . .CLASIFICACION %E LA CROMATOGRAFIA LI<UI%A %E ACUER%O A LA $RESION GENERA%A %ENTRO %E LA COLUMNA Cromatograf"a de baja presión( presiones menores a L bar ('.

2$LC (. mejor la resolución pues se reduce el tiempo de e$uilibrio entre fase fija . éstos con el largo de la columna (dentro de ciertos l"mites. /l ac5icarse las part"culas. móvil).ro&ato5ra'. esto obliga a aplicar altas presiones.>). Cro&ato5ra ?a l?=+ida de alto rendi&iento . por la tendencia al ensanc5amiento de los picos).i5.a capacidad de resolución de una columna cromatográfica aumenta con el n!mero de platos teóricos . )l n!mero de platos teóricos está asociado al área de las part"culas de la fase fija (mientras más pe$ueJas. . 'er or&ance li=+id c. aumenta la resistencia al flujo. .

Isocrático( igual composición .

)l sistema de bombas en una elución por gradiente es más complejo pues re$uiere mezclar solventes. pero se obtiene una mejor resolución. .C de una mezcla de =M aminoácidos. una elución por gradiente en una cromatograf"a I6.0iferencias entre una elución isocrática .

7res tipos( Microporo (L#=' Om diámetro)4 microporos $ue se ramifican en toda la part"cula. sin generar pulsos . .argo 5asta L' cm4 diámetro( = a & mm. Fa!e &ó4il. $ue deben ser desgasificados.COM$ONENTES %E UN E<UI$O %E 2$LC Col+&na!. 6elicular (porosa superficial)4 part"culas porosas $ue cubren un sólido inerte (bolitas de vidrio de N&' Om de diámetro). -ases unidas (bonded p5ases). deben operar 5asta LL M6a. se las fabrica de acero inoAidable para $ue resistan presiones de 5asta LL M6a (LL' bar).a fase estacionaria está $u"micamente ligada a un soporte inerte como s"lice. solventes de alta pureza. Matrice! ( a!e! e!tacionaria!)( part"culas esféricas de tamaJo uniforme para minimizar difusión. Bo&@a!. .

Arre5lo de diodo!. 6ermiten detectar el espectro completo. al $ue se aplica un potencial constante. /lta sensibilidad. el otro *de trabajo+.COM$ONENTES %E UN E<UI$O %E 2$LC (Continuación) %etectore!. sensibles (poca muestra) . . 6ocos analitos fluorescentes. estables. 0os electrodos. /l fluir un analito. pasando una corriente entre ambos electrodos. Indice de re racción. deben ser mu. on espectrofotómetros de luz ultravioleta . ensibilidad limitada pero responden a cual$uier analito. visible con celdas de flujo continuo. 0etección . E!'ectró&etro de &a!a!. Fl+ore!cente!. :tiles en la detección de analitos $ue pueden ser oAidados o reducidos. Lon5it+d de onda 4aria@le. Electro=+?&ico!. uno de referencia . Mu. sensibles. éste se reduce u oAida. la $ue es registrada. determinación simultánea de la estructura del analito.

detector +ltra4ioleta1 .A. detector de arre5lo de diodo!1 B.