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Université Paris Nord - Institut Galilée

Laboratoire de Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires – Inserm U698

Thèse de doctorat
Présentée par

Sidi Mohammed DERKAOUI
Pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université Paris Nord Discipline : Sciences de l’ingénieur Spécialité : Génie biologique et médical

Revêtement bioactif pour stents métalliques : Synthèse, caractérisation et biocompatibilité

Soutenue le 02 décembre 2008 devant la commission d’examen : Rapporteurs: M. H. F. Hildebrand M. D. Labarre M. G. Legeay M. L. Feldman

Examinateurs:

Directeur de thèse : M. D. Letourneur Co-directeur : M. T. Avramoglou

Remerciements
Les recherches qui ont fait l’objet de ce mémoire ont été menées au Laboratoire de Bioingénierie de Polymères Cardiovasculaires de l’institut Galilée, université Paris 13 dirigé par Monsieur Didier Letouneur, Directeur de Recherche CNRS, Inserm U698, Université Paris 13, Villetaneuse. Je souhaite donc naturellement remercier tout d’abord les instigateurs de ce projet de recherche original et porteur, notamment mon directeur de thèse Monsieur Didier Letourneur qui m’a accueilli au sein de l’équipe de Bio-ingénierie de polymères cardiovasculaires. Il a su à la fois soutenir mes travaux, tout en me laissant une grande liberté de manœuvre quant au déroulement et à l’organisation de mes recherches. En complément, le soutien financier qu’il a pu m’apporter a permis de mener à terme cette thèse. Je souhaite également exprimer toute ma gratitude à Monsieur Thierry Avramoglou maître de conférences, Inserm U698, Institut Galilée, Université Paris 13, à la fois instigateur de ce projet de recherche mais également source d’un soutien sans faille vis-à-vis des orientations de mes travaux. La confiance qu’il a su rapidement m’accorder, alors que j’étais encore en DEA, m’a permise de m’impliquer totalement dans ce projet. J’ai pu apprécier sa disponibilité exceptionnelle et totale concernant mes interrogations sur tous les points scientifiques, son intérêt à mon égard, enfin sans lui cette thèse n’aurait jamais vu le jour. Je suis très reconnaissant à monsieur Denis Labarre, Professeur, Université Paris SudXI, UMR CNRS 8612 Faculté de Pharmacie, Chatenay-Malabry, ainsi qu’à Monsieur Hartmut Frédéric Hildebrand, Directeur de Recherche INSERM, Groupe Recherche Biomatériaux, Laboratoire de Biophysique UPRES EA 1049, Faculté de Médecine "H. Warembourg", Lille d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail. Je suis honoré de la présence dans ce jury de Monsieur Gilbert Legeay, Délégué Scientifique, Centre de Transfert de Technologie du Mans, Le Mans et de Monsieur Laurent Feldman, Professeur-Praticien Hospitalier, Service de Cardiologie, CHU X. Bichat, Paris. Qu’ils soient remerciés d’avoir accepté de juger ce travail. Je suis très reconnaissant à Madame Isabelle Bataille, maître de conférences, Inserm U698, Institut Galilée, Université Paris 13, de m’avoir beaucoup aidé à chaque fois que j’avais besoin d’elle. Mes remerciements les plus sincères à Madame Danielle Chaubet, maître de conférences, Institut Galilée, Université Paris 13 et Monsieur Frédéric Chaubet, Professeur Université Paris 13 de leur sympathie. i

J’ai beaucoup appris sur les techniques de la chimie en particulier en RMN au cours de mes discussions avec Madame Christel Barbaud, Professeur université Paris 13, qu’elle trouve ici ma profonde gratitude et ma sympathie. Je tiens à remercier Madame Amélie Labbé, Maître de conférences, Université Paris 13 de sa collaboration pour les manipes et la rédaction du troisième article. Je voudrais également exprimer ma gratitude envers toutes les autres personnes qui de façon directe ou indirecte m’ont aidé dans ce travail, notamment Monsieur, Marc Lecouvey Maître de Conférences, Université PARIS XIII et le Docteur Cédric Lorthioir, CNRS Thiais. Enfin, ce travail est l'aboutissement de longues années d'étude, auxquelles l'amour et le soutien de ma famille : ma mère, mes sœur et mon frère. Et a mon épouse Sihem, je voudrais rappeler mon amour et ma reconnaissance pour sa compréhension, sa présence affectueuse à mes côtés et le plus beau cadeau de ma vie, nos enfants : Lina, Anas et Lylia.

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Abréviations et anglicismes AFM : microscopie à force atomique AIBN : L 'α.'α-azobisisobutyronitrile ATR-FTIR : Attenuate Total Reflection Fourier Transform Infrared Ce(IV) : Ion cérium à l’état d’oxydation +4 BMA : n-Butyl Methacrylate BSA : Albumine de sérum bovin DH : dextrane-graft-PHEMA DBM: dextrane-graft-(PBMA-co-PMMA) DMA : Analyse mécanique dynamique DMEM : Milieu nutritif pour la culture cellulaire DMSO : Diméthyl sulfoxyde D.O : Densité optique DSC : Analyse enthalpique différentielle EDTA : L’acide ethylènediamine tétraacétique EMA : Ethyle méthacrylate FM : Fucane-graft-PMMA FB : Fucane-graft-PBMA GPC : Chromatographie par perméation de gel HB : Héparine-graft-PBMA HEMA : 2-hydroxyéthyle méthacrylate HM : Héparine-graft-PMMA HUVECs : Human Umbilical Vein Endothelial Cells KBr : Bromure de potassium MEB : microscopie électronique à balayage MMA : Méthyle méthacrylate PB : Pullulane-graft-PBMA PBMA : Poly (méthacrylate de butyle) PBS : Solution saline équilibrée par un tampon phosphate PM : Pullulane-graft-PMMA PMMA : Poly (méthacrylate de méthyle) RMN : Résonance magnétique nucléaire SVF : Sérum de Veau Fœtal Tg : Température de transition vitreuse iii .

THF : Tétrahydrofurane TMS : Triméthylsylilé TNF : facteur de nécrose tumorale PDGF : Platelet-Derived Growth factor bFGF: basic Fibroblast Growth Factor TGF: Transforming Growth Factor iv .

Sommaire iv .

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1. Abréviations et anglicismes…………………………………………………………………… Sommaire………………………………………………………………………….……. I.3.. Mécanisme de l’angioplastie au ballonnet…………………………………………….1...1... La matrice extracellulaire………………………………………………………….. inflammation..... I.2...8....6. Profils évolutifs de la plaque « stable » ……………………………………………........ L'adventice …………………………………………………………………………. Le sang………………………………………………………………………..8.... I. a.4...... La voie extrinsèque…………………………………………………………………....8. Stents Cypher®. enrobé de sirolimus …………………………………………….. La paroi vasculaire structure de l’artère…………………………………………….1.....1. Principales pathologies vasculaires……………………………………………………… I.6.2.... I...Sommaire Remerciements………………………………………………………………………….1..4.4.5.3. I.... La Resténose………………………………………………………………………....3..4. I.1...1............. Les cellules musculaires lisses…………………………………………………………...1.......4....... Les cellules endothéliales ……………………………………………………………..1....1.....1..1..........6.. Revue bibliographique……………………………………………………….1. Thrombose..1.7........1. c. I.. La sténose ……………………………………………………………………….... Genèse de la plaque ……………………………………………………………....2...... Physiopathologie de l’athérosclérose…………………………………......1.......1.7.3... b.. L’athérosclérose ……………………………………………………………...1...4. I. La média ………………………………………………………………………….... Les mécanismes de la resténose……………………………………………………….1...1. enrobé de paclitaxel…………………………………………………..5.....6....3.5.. I..2.. Stents Taxus®. I.2....1. I..1...5.. I.1.. L’angioplastie……………………………………………………………………….1..1..1.3.......... Epidémiologie des maladies cardiovasculaire…………………………………. Stents actifs et stents nu………………………………………………………………......1..1... Stents bioactifs……………………………………………………………………………......1.... I. I....3..1.1....3....1. L’inflammation…………………………………………………………………..... L'intima ………………………………………………………………………….1.8. I.... I. I. I.. La voie intrinsèque …………………………………………………………………. I.1..... I.1.. Retard de ré-endothélialisation ………………………………………………………… vi .1. Thrombose liée au stents actifs………………………………………………………… I. Les stents et leur implantation ………………………………………………………… I.....8.1... I... I....2..5...... I....1....... migration et prolifération ………………………………….5.4..8..4.1.1.. I.......2..5..... Les cellules vasculaires…………………………………………………………………....... I. I. i iii iv 1 7 9 9 9 10 10 11 11 11 12 13 13 14 14 15 15 16 16 16 18 18 20 20 20 21 21 21 22 23 23 23 24 24 25 26 26 27 Introduction générale……………………………………………………………………..2..2. Formation de la plaque mature…………………………………………………. I.8.2......... Stents imprégnés d’héparine……………………………………………………………........1.. I....5.. Le système vasculaire……………………………………………………………….1... I....7.2......1. I..5.. La coagulation……………………………………………………………………. I.. La fibrinolyse…………………………………………………………………………....

4......5.. L’héparine……………………………………………………………………………... Le butyle méthacrylate…………………………………………………..3. I.. II....2... Les polymères naturels (les polysaccharides) …………………………………………. b.1....2.1...... II.. Le Fucane……………………………………………………………………………… II.....….3...... Matériels et méthodes……..... II.1.…………………………....2.3. II. La polymérisation radicalaire ………………………………………………………......3..1....…………..3..8. L’activité antiproliférative de l’Héparine………………………………………………. d.... Le dextrane………………………………………………………………………. II........1...8..... I..... II......………………………………………………...1......2...1... la terminaison…………………………….6. I. L’activité anticomplémentaire de l’héparine ……………………………………………….... Les monomères méthacrylates …………………………………………….... Synthèse……………………………..... c.....3..2.1..2. I..5.2.....2. L'azobisisobutyronitrile ……………………….....1..………………………………………..….. Le Cérium IV…………………………………………….......4...... I...2.1...... II.2. Les polymères bioactifs………………….... La Biocompatibilité ……………………………………………………………….....2.2.. I....……………………………………………………....1.2...2.…………………………………………………….2......3.... II. I.. II..1.. I.1..... L’activité anticomplémentaire des fucanes ………………………………………………….1.5.5.3.3... II....2...1.. Interaction sang biomatériaux…………………………………………………………..........2......4. Le système rédox……………………………………………………………………....1..... I.....1.....3...1.. Adsorption de protéines sur la surface………………………………….8.1. L’héparine……………………………………………………………………….........3. l’adhésion cellulaire……………………………………………………………………….... Hydrophilie des polymères…………………………………………. Les amorceurs ……………………. Définition d’un Biomatériau…………………………………………………….....3....1...4.... Interaction polymères cellules………………………………………………………..... Les métaux………………………………………………………………………………..2...2... L’activité biologique des fucanes………………………………………………………. Les polysaccharides……………………………………………………………... a.8..3.2. II.. L’activité anticoagulante de l’héparine………………………………………………….2.....1.. I. ………………………………………………………………….. I.3...2.2... II....4. vii ......... I..2..1.2.2.. Morphologie de surface ……………………………………………......... c..... I..... Synthèse des polymères méthacrylates ……………………………………………….....1..1. Caractéristiques et mise au point de la réaction de greffage…………………………. L’activité anticoagulante des fucanes………………………………………………………....1.... II... II..... b. Les polymères synthétiques………...…………… I..2.1..2.. Purification des monomères méthacrylates………………………………….1.... L’amorçage……………………………………………………………………………..4.…. Modifications chimiques des polysaccharides…………………………………..I....2...2..2..1...1.. II. Le (2-hydroxyéthylméthacrylate) …………………………………………………….4.3.. L’Ethylméthacrylate.. Description de la réaction de greffage……………………………………………….………………..1. L’activité antiproliférative des fucanes………………………………………………………. Le dextrane………………………………………………………………………...4. I. Le méthyle méthacrylate……………………………………………………........ Synthèse des copolymères………………………………………………………………....3.. II.2.. II... I.7..5....... I.2...………………………………………...........1.. II... La propagation………………………………………………………………………….2. Le fucane………………………………………………………………………... Les biomatériaux et la biocompatibilité………………………………………..1...3.. a..1.. I..1........1. I... Le Pullulane…………………………………………………………………….....…………. I..…………………………………………… 28 29 29 30 31 31 33 33 34 34 35 35 35 36 37 37 38 38 38 39 39 39 39 40 40 40 41 41 41 43 45 45 45 45 45 45 45 46 46 46 47 47 47 47 48 48 48 49 49 II.. I.

…………..5.. Extraction des homopolymères acryliques…………………………………………. II.. II....1.5...………….5..4...... II......1..2.2..4.4. Purification des copolymères………………………………………………... II.….5. Décongélation des cellules…………………………………………………………….5....1... La solubilité des polymères…………………………………………………………..6...2.5. Détermination de la topographie des films par Microscopie à Force Atomique……...3. Congélation et création de stocks de cellules…………………………….. Lignées cellulaires ……………………………………………………………………….1..2....3. II... Tests de fluage………………………………………………………………………….… II.6.1..4.1. Par microscopie optique………………………………………………………………. Chromatographie d’exclusion stérique (CES) ………………………………………..... La résonance magnétique nucléaire………………………... L’infrarouge a transformée de Fourier………………………………………………….4. II..4..……………………..4.4...2..2 Analyse mécanique dynamique (DMA) ………………………………………………..………. Les techniques de caractérisation des copolymères……………………………………... Etude de la solubilité des copolymères et réalisation des films……………………….1.1. II........... II.3. Analyse des surfaces de stents enduits……………………………………………….4....….2.... II...2.6.3..3. Comptage des cellules……………………………………………………......4..6. Evaluation de la migration des C sur films de copolymère DB et sur fond de puits. 49 50 50 51 51 52 52 52 52 53 54 54 54 55 55 55 56 56 56 57 57 58 58 58 58 58 58 59 59 59 59 60 60 60 61 61 61 62 62 63 viii .……………. II.....……………. La dialyse……………………………………………………………………….... Greffage des méthacrylates sur les polysaccharides……………………..4..4.5.. II.5.. II.. II. II. Préparation des films de polymères …………………………………………………….6.6.4. Par microscopie électronique à balayage (MEB) ………………………………….. II.. Caractérisation et analyse des films de copolymères….4..1. II.. Entretien des cellules en culture………………………………………………......2.……...1..2. III. Conditionnement des films de polymères à la culturecellulaire……...5....6.5.......... II..... III.6... II. Ensemencement des cellules sur les films de polymères………………..II.... Observation des cellules sous microscope à fluorescence ………………...... Cinétique de prolifération des cellules sur les différents supports …………….4. II..3.2.2.4. II.. La lyophilisation …………………………………………………………………….1. Mesure de l’angle de contact sur les différents films de polymères…………………….. II.. II..3.....1..... II..1..6. Enduction des stents par les copolymères……………………………………………… II..... Mesure de la viscosité……………………………………………………….…………. II.............4..8.1.... II.. II.3. Evaluation biologique……………………………………………………………………. Analyse thermique différentielle ………………………………………... II.. II....5.6....3...6.3. Propriétés mécaniques des copolymères……………………………………………....7. Passage des cellules………………………………………………………. L’adhésion et la prolifération des cellules HUVECs sur stents…….. II.2. II. II...….6..2...6.6.4.. II.......…..6..2.2.........4....1.……….6.. II. II.6... Préparation des films de polymère à la culture cellulaire…………………………….. Lavage et stérilisation des films de polymère…………………………….3.4..3. Milieux de cultures ……………………………………………………………... II.1.……………………...3..2.1..4.

. Autres résultats………………………………………………………………………….... Synthèse d’autres polymères bioactifs………………………………………………........... Tests de solubilité de différents copolymères et réalisation des films……………….4.………………………………………………………..4..1... III....2..1..4...2.3.4..4.………. Effet du milieu réactionnel sur le dextrane …………………………………………. caractérisation du dextrane-graft-polyméthyleméthacrylate) III. III.. caractérisation infrarouge…………………………………………………………. III....... 125 III. Propriétés thermiques et mécaniques…………………………………………………… III...3...1.4.... Introduction au second article …………………………………………………….....4.3.1.....1.. Premier Article (synthèse... Discussion…………………………………………………………….. 141 III.4. 143 145 145 146 146 147 148 148 149 150 III.4. V..1.2. 181 ix .1..... DB2 et DB3…………………………………………..... 171 Annexe……………………………………………………………………………….2. Culture cellulaire…………………………………………………………………….4.1.... Introduction au troisième article……………………………………………………….2.. Conclusion……………………………………………………….………. III..1.III. III.. III.……...3... complément troisième Article………………………………………………………. Propriétés biologiques des différents copolymères synthétisés………………………..2.3.. Troisième Article……………………………………………………………………….4.…..3. Caractérisation…………………………………………………………………. deuxième Article (synthèse... Introduction au premier article…………………………………………………. III....3. 65 67 69 85 89 109 III.. 153 153 154 155 156 159 IV. Résultats……………….2. III.. III.. Prolifération des cellules HUVECs et CMLs sur les différents supports à J5……….3 Morphologie cellulaire sur les différents films de copolymères…...4. III...3..1. 153 III.2.2. III.... 167 Références bibliographiques……………………………………………...….......2.4. Analyse mécanique sous sollicitations dynamiques………………………………….3.......3..……. III. III.....……………….4..4..2..4.1.1 Étude cinétique de prolifération des cellules HUVECs……………………………. caractérisation du dextrane-graft-polybutylméthacrylate) III.... Fluage des copolymères DB1.4..3........4.3. Cinétique de prolifération des CMLs sur les différents supports………………….. 113 III. Effet du milieu réactionnel sur la chaîne de PMMA…………………………………. III. III.. Analyse thermique différentielle (DSC) …………………………………………….1.1....1...

Introduction Introduction générale 1 .

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la lutte contre les maladies cardiovasculaires reste essentiellement curative. avec un risque toujours important de resténose. Mais la maladie reste souvent silencieuse et le patient le plus souvent asymptomatique. sont gravement atteints par ces maladies induisant un problème socio-économique majeur. la matrice extra-cellulaire composant la 3 . et les éléments cellulaires de la paroi artérielle. macrophages dérivés des monocytes circulants et lymphocytes T. est le fait que souvent des gens en âge moyen. les cellules inflammatoires. Elle se manifeste par un épaississement de la face interne des artères. En effet la pose d’un stent dans l'artère crée un dommage sévère sur tous les éléments composant le vaisseau sanguin. Cette inflammation conduit à un processus réactionnel cicatriciel de la paroi artérielle impliquant les cellules musculaires lisses et la production de matrice extracellulaire. Selon les études menées par l’OMS dans le cadre du programme MONICA (Multinational Monitoring of Trends and Determinants in Cardiovascular Deseases). Suite à la dilatation. les cellules musculaires lisses situées dans la profondeur de la paroi subissent un étirement et une destruction inévitable. Les campagnes d’information pour une meilleure hygiène de vie (régime alimentaire. c’est à dire au sommet de leur productivité. ainsi que le recours à la pose de stents au niveau du site sténosé. Un facteur important à mentionner. tabagisme et sédentarité) ayant un impact limité. 6 millions de personnes (45. l'endothélium est dénudé de sa couche protectrice. La lame élastique interne se trouvant dans la média est endommagée. vont conduire à des lésions qui vont se compliquer par une rupture ou une érosion de plaque et une thrombose artérielle. D’autres études épidémiologiques montrent cependant que le développement de l’athérosclérose ne doit pas être considéré comme un héritage inéluctable de l’industrialisation et de l’urbanisation.Introduction Introduction générale Les maladies cardiovasculaires sont aujourd'hui la première cause de mortalité devant le cancer dans les pays développés. Les présentations cliniques de la maladie athéroscléreuse sont évidemment multiples et fonction de l’artère touchée. Cette pathologie artérielle correspondant à une inflammation chronique liée à l’interaction entre les lipoprotéines modifiées. trop importantes ou trop brutales. et l’athérosclérose est l’une des principales formes de ces maladies. Certaines de ces lésions inflammatoires. L’atteinte coronaire et l’infarctus du myocarde dominent par leur fréquence et leur sévérité suivis de près par les atteintes carotidiennes et les accidents vasculaires cérébraux.6% de tous les décès) meurent à la suite d’une maladie cardiovasculaire dans les pays développés. favorisant ainsi un environnement thrombogénique. réduisant la lumière artérielle ou bloquant le flux sanguin : c’est la sténose. Le développement de l’athérosclérose et l’extension des thromboses implique des traitements lourds par injections intraveineuses.

Notre recherche porte donc sur le choix des principaux constituants de ce revêtement. ces endoprothèses d’une nouvelle génération ont montré une diminution de la prolifération néo-intimale. Notre étude s’est donc orientée vers cette voie de recherche afin de tirer profit de deux types de polymères.Introduction média et l'adventice est également perturbée. En parallèle. Combattre ce phénomène de resténose a été la préoccupation de très nombreuses équipes de recherches. mécaniques et biologiques peut permettre de développer un tel revêtement. Même s’ils sont déjà employés en très grand nombre en clinique. Agissant comme réservoir médicamenteux. L’objectif est de mettre au point un biomatériau nouveau pouvant servir dans la confection d’un revêtement permanent pour stents. le fucane et l’héparine connus pour leurs activités biologiques et d’autre part un polymère de type méthacrylique (polyméthylméthacrylate et polybutylméthacrylate) car les monomères méthacryliques disponibles sur le marché sont suffisamment variés pour offrir la possibilité de contrôler finement les propriétés mécaniques et physico-chimiques du revêtement voulu. combinant les propriétés biologiques des polymères naturels (polysaccharides) et les propriétés mécaniques des polymères synthétiques (polyméthacrylates). la nature des polymères employés et le type de principe actif (antitumoraux/antimitotiques) sont également des aspects d’inquiétudes majeures. Le problème de la resténose persiste également malgré les avancés thérapeutiques liées au stents bioactifs. Cette intervention entraîne chez environ un tiers à la moitié des patients. Cependant. 4 . Une percée technologique récente a permis la mise au point de stents enrobés d’une substance pharmacoactive qui réduit l’incidence du risque de resténose. nous avons la certitude que les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales jouent un rôle important dans ce phénomène. de nombreuses études ont mis en évidence que les polymères naturels ou synthétiques pouvaient avoir des propriétés biologiques vis-à-vis des cellules impliquées dans la resténose. Seule une approche pluridisciplinaire prenant en compte simultanément les aspects physico-chimiques. la migration et la multiplication des cellules musculaires lisses conduisant à une nouvelle réduction de la lumière artérielle. d’une part des polysaccharides comme le dextrane. Ce revêtement. On assiste éventuellement à un phénomène de cicatrisation du site endommagé. Les groupes de recherche ont beaucoup de difficultés à cibler des éléments clés dans ce processus puisqu'il y a un très grand nombre de médiateurs dans le phénomène la resténose. serait capable d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses toute en préservant la migration et la prolifération des cellules endothéliales. Toutefois l’allongement du délai de cicatrisation dû au retard de la réendothélialisation induit par le médicament antimitotique a été associé avec la survenue de thrombose. Ainsi les stents ont été développés à grande échelle depuis les années 1990.

Lors de la formation des films par dépôt et évaporation des solvants. par les méthodes spectroscopiques et microscopiques appropriées. Au nombre de trois : Le premier article décrit la mise au point et l’optimisation de la technique du greffage du polyméthyleméthacrylate sur le dextrane « Synthesis and characterization of a new 5 . la tension de vapeur très différente entre l'eau et le THF nous impose de conduire cette étape sous atmosphère contrôlée. microscopie à force atomique (AFM) et angle de contact. Il était alors nécessaire de vérifier. les copolymères purifiés ont été solubilisés dans un mélange de solvants. mais faisant chacun l’objet d’une étude séparée et éventuellement de compléments de résultats. Les solvants retenus sont l'eau et le THF. Le manuscrit présente dans la première partie une revue bibliographique permettant de faire le point sur les connaissances et de préciser le contexte de l’étude. que les surfaces des stents étaient biens recouverts par le copolymère. Pour cela. présentés dans la troisième partie sous forme d’insertion d’articles (publié ou en préparation). Finalement une étude comparative de l’adhésion et prolifération des cellules endothéliales directement sur stents recouverts de copolymères et stents nus a été réalisée in vitro. Les principaux matériels et méthodes utilisés pour synthétiser et caractériser les propriétés et les effets des copolymères sont exposés dans une deuxième partie. Après séparation et purification. Caractérisés par des tests d’analyse mécanique dynamique (DMA). par résonance magnétique nucléaire (RMN) et par analyse thermique différentielle (DSC). la confection des films de copolymères. ces deux solvants étant parfaitement miscible l'un à l'autre. L’ensemble des résultats expérimentaux sont. les films ont été soumis à des tests de culture cellulaire afin d’explorer les effets biologiques des différents copolymères sur les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses.Introduction Notre premier objectif devait permettre de greffer d’une manière covalente les monomères méthacryliques sur les polysaccharides. Pour cela la synthèse décrite déjà par d’autres groupes avec différents polymères repose sur l'initiation d'une polymérisation radicalaire à partir du polymère hydroxylé (polysaccharide) grâce à une méthode redox utilisant les ions cérium IV. regroupés dans la partie résultats et discussion. quant à eux. cette proportion varie d'ailleurs avec la nature du polyméthacrylique. les copolymères ont été caractérisés par spectroscopie infrarouge (IR). La solubilité optimale n'est obtenue que pour une plage étroite de proportion d'eau dans le THF. Il fallait mettre au point dans une deuxième étape. La dernière étape était de choisir le copolymère approprié afin d’enduire des stents métalliques.

Introduction polysaccharide-graft-polymethacrylate copolymer for 3D hybrid hydrogels ». Il a été accepté pour publication en août 2008 dans la revue Biomacromolecules. Le second article intitulé « Dextran-graft-polybutylmethacrylate films for cardiovascular engineering » décrit la synthèse et la caractérisation d’un deuxième copolymère dextrane-graftpolybutylméthacrylate. Afin de comparer les propriétés physico-chimiques et mécaniques, trois types de ce copolymère sont synthétisés à différente concentration du dextrane. L’effet de ces copolymères sur la prolifération de cellules endothéliales et cellules musculaires lisses a été étudié. Il doit être soumis à la revue Tissue Engineering. Nous développerons enfin dans un troisième article intitulé « Copolymers dextran-graftpolybutylmethacrylate for stent coating » la préparation d’un revêtement pour stents en acier 316L. Ce revêtement constitué de film de copolymère (dextrane-graft-polybutylméthacrylate) est caractérisé par différentes méthodes physico-chimiques, ainsi que son effet sur la culture des cellules endothéliales in vitro. Des résultats complémentaires sont en cours d’obtention avec une collaboration avec le Pr Diégo Mantovani (Québec, Canada). Cet article doit être ensuite soumis à Biomaterials. Des résultats également obtenus avec d’autres monomères et d’autres polysaccharides terminent ce chapitre. La dernière partie est consacrée à une discussion de l’ensemble des résultats et propose des perspectives permettant d’approfondir l’analyse et l’utilisation de copolymères synthétisés.

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Revue bibliographique

I. Revue bibliographique

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Revue bibliographique I.1. Le système vasculaire Le système cardio-vasculaire a pour fonction d'apporter aux tissus et organes l'oxygène et les nutriments qui leurs sont nécessaires et de les débarrasser du dioxyde de carbone et des métabolites. Son rôle est également de répartir de manière homogène la chaleur interne générée par l’activité biologique. Les besoins des différents organes étant très divers et variables dans le temps, le système cardiovasculaire doit pouvoir assurer la distribution sanguine de façon adaptée et ajustable.

I.1.1. La paroi vasculaire structure de l’artère Les vaisseaux sanguins sont constitués de trois tuniques morphologiquement distinctes (figure 1). De l’intérieur vers l’extérieur du vaisseau on distingue : l’intima, la média et l’adventice. L’importance et la complexité de ces trois tuniques dépendent du vaisseau sanguin et peuvent être très grandes ou réduites à une simple monocouche cellulaire.
Adventice Limitante élastique externe Média

Intima

Endothélium Membrane basale Limitante élastique interne

Figure 1. Structure de la paroi d’une artère

a. L'intima est principalement constituée de l’intérieur vers l’extérieur, d’une monocouche de cellules endothéliales et d’une fine couche de tissu conjonctif. Ces cellules endothéliales sont directement en contact avec le sang circulant et donc avec les métabolites, les hormones, et tout ce que peut transporter le sang. Cette couche est identique quelque soit le territoire vasculaire et il y a très peu de différences dans sa structure. Il faut noter cependant que dans les artères élastiques, l’intima, très épaisse peut contenir des cellules musculaires lisses (CMLs) 9

Cette couche est très variable selon les différents territoires vasculaires. Dans certains types d’artères. Elle est limitée de part et d'autre par les membranes limitantes élastiques interne et externe. c. iliaques. 10 . Dans les artères élastiques (artères brachio-céphaliques. opposées aux artères musculaires. en effet cette couche permet l’encrage du vaisseau aux tissus environnants. Cette organisation en structure lamellaire n’existe que dans les artères élastiques. élastine. les CMLs sont arrangées de façon concentrique. Son organisation est à peu près la même quel que soit le type de vaisseau. fibrilles d’élastine. la plus épaisse. faisceaux et fibrilles de collagène. b. carotides. les petites artères périphériques particulièrement douées de vasomotricité. En général. Quelque soit le diamètre de la paroi. et quelques lamelles élastiques entre les différentes couches de CMLs. La média contient exclusivement des cellules musculaires lisses et des constituants extracellulaires : fibres élastiques. les artères musculaires ne possédant pas cette architecture. il y a toujours une seule couche de cellules endothéliales. elle est composée de cellules musculaires lisses et d'un réseau de collagène. artères sous-clavières. protéoglycanes. cette orientation étant déterminée par les forces de cisaillement appliquées à leur surface. Leur grand axe est orienté dans le sens de l’écoulement sanguin. et de mucopolysaccharides. gros vaisseaux proximaux. Dans ces deux types d’artères. artères pulmonaires et aorte). Cependant. et la présence et l’organisation aussi bien des fibres élastiques que des CMLs varient selon la fonction des vaisseaux. Les artères musculaires possèdent une lamelle élastique interne (limitante élastique interne) et externe (limitante élastique externe) qui séparent la média respectivement de l’intima et de l’adventice. et augmente progressivement avec le poids et la taille chez les différents animaux. Les CMLs et les lames élastiques forment une unité lamellaire. très souvent la média et l’adventice sont difficiles à distinguer.Revue bibliographique particulières dites myointimales. on peut voir la présence de CMLs entre l’intima et la média (notamment dans les artères coronaires et les artères rénales). Elle contient également quelques fibres élastiques épaisses et des fibroblastes. l’adventice est constituée de fibres de collagène. Ces cellules endothéliales sont en forme de losange et leur juxtaposition constitue une mosaïque. Suivant la prédominance de fibres élastiques ou de cellules musculaires on distingue les artères élastiques. Le nombre de ces lames élastiques est fonction du diamètre de l’artère. Le nombre d’unités lamellaires est proportionnel au diamètre du vaisseau. dans les veines. L'adventice est peu ou très présente selon le type de vaisseaux. La média est la tunique moyenne. la média est constituée de plusieurs lames élastiques concentriques entre lesquelles on retrouve les CMLs.

Revue bibliographique Les propriétés mécaniques des différentes couches constituant les artères dépendent de leur quantité d’élastine. alpha 2 adrénergiques.2. et l'athérosclérose [4]. une fois activés. Mais ce faisant. qui est un peptide possédant un effet vasoconstricteur important sur les cellules musculaires lisses. I. la contractilité. les fonctions risquent de devenir inopérantes parce que les facteurs de réparation. Les cellules vasculaires I. L’endothélium est sensible à des stimulis grâce à une grande variété de récepteurs membranaires (muscariniques.1..1. il survient un dérèglement dans la fonction de l'endothélium. Parmi les composés produits par les cellules endothéliales. la multiplication cellulaire et les mécanismes inflammatoires des vaisseaux sanguins [1]. le développement d'un thrombus ou l'athérosclérose [3]. La vasomotricité est régulée par les messagers agissant sur les cellules 11 . on trouve également l’endothéline.). Les cellules endothéliales Les cellules endothéliales ont des fonctions de transport actif et passif de nombre de constituants sanguins parmi lesquels les lipoprotéines. en particulier sur la média.2.2. I. Lorsqu'une agression de l’nedothélium se produit (suite à des pathologies telles le diabète ou de circonstances particulières telles que le tabagisme ou l’obésité). vasopressine.2.1. La dysfonction de l'endothélium conduit inévitablement à un processus de remodelage vasculaire marqué par des altérations structurelles et fonctionnelles et qui a pour objectif de redonner au vaisseau la protection nécessaire à sa survie. amènent habituellement leur part de problèmes. Cette couche opère ses différentes fonctions en maintenant la surface luminale non-adhésive et en ayant des propriétés fibrinolytique. Les cellules endothéliales peuvent élaborer des produits ayant une action sur les éléments figurés du sang et sur la paroi vasculaire elle-même. on trouve la prostacycline qui inhibe les fonctions plaquettaires et qui est vasodilatatrice (et par conséquent agit sur les fibres musculaires lisses de la média) . Les cellules musculaires lisses Les cellules musculaires lisses ont une fonction contractile qui assure la vasomotricité et le tonus artériel. sérotonine. entraînant plusieurs évènements graves comme les vasospasmes. Chaque type de vaisseau est donc conçu de telle façon à pouvoir supporter la pression du flux sanguin en se déformant en conséquence. anticoagulante et antithrombotique [2]. L'endothélium joue un rôle important dans l'homéostasie.. qui varie avec le diamètre du vaisseau. Une couche endothéliale vierge est sans doute la meilleure source de prévention contre des évènements telles que la thrombose artérielle..1.

La MEC. elle forme un support pour l’adhésion et la migration cellulaires. En outre. les intégrines donnent à la cellule la capacité de percevoir l’environnement et de répondre aux changements de ce dernier et de le modifier [9]. Interface cellule matrice extracellulaire [10] 12 . Ainsi en connectant le cytosquelette à la MEC et en contrôlant les interactions cellules-matrice. via les modulations. et génère les signaux relatifs à l’environnement des cellules (mécano-transduction).1. La proportion de chacun de ces éléments est très variable selon le tissu considéré. Les intégrines sont les récepteurs qui transmettent les forces et les changements de structure de la MEC au cytosquelette [8]. Les macromolécules de la matrice extracellulaire sont regroupées en plusieurs catégories : les collagènes. I. ce sont les cellules musculaires lisses qui synthétisent la MEC incluant une matrice fibrillaire insoluble et une membrane basale sur laquelle adhèrent les cellules. les glycoaminoglycanes. la synthèse et l’organisation tridimensionnelle de ces différents composants. Ainsi des pathologies de la paroi vasculaire sont associées à des défauts qui impliquent les liens moléculaires entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire. les cellules musculaires lisses assurent des fonctions métaboliques en particulier la sécrétion de matrice extracellulaire de la média et le catabolisme des lipoprotéines LDLs.3. Figure 2. Dans la paroi vasculaire. La matrice extracellulaire La matrice extracellulaire (MEC) est un réseau tridimensionnel de macromolécules qui constituent la charpente des tissus. l’élastine. Les liens entre la matrice et le cytosquelette via le complexe de protéines trans-membranaires (intégrines) constituent un lien physique entre les cellules et la MEC comme le montre la figure 2. Les interactions qui en découlent jouent un rôle important dans les nombreuses voies de signalisations [6].Revue bibliographique endothéliales qui à leur tour transmet l'ordre aux cellules musculaires lisses par l'intermédiaire d'un second messager. exerce différents effets sur la croissance et le phénotype des cellules du système cardiovasculaire [7]. les glycoprotéines de liaison et les intégrines [5].

13 . la plus courante étant la formation de thrombus.1. Le sang remplit des fonctions indispensables à la vie. aboutissant à la formation du "clou hémostatique" ce phénomène peut être observé lorsque le sang est placé en présence d'une surface étrangère [11]. Différents mécanismes maintiennent cet équilibre. La coagulation Le sang est un fluide en équilibre dynamique avec son environnement dont la moindre modification peut entraîner des conséquences graves. enzyme pivot de l'hémostase qui conduit à la conversion du fibrinogène soluble en fibrine insoluble constituant l'armature du caillot sanguin [12]. le plasma qui est composé à son tour de nombreuses protéines dont les fonctions sont très spécifiques et les éléments figurés sont représentés par des cellules nucléées. puis une agrégation des plaquettes entre elles. Le sang joue un rôle essentiel dans la défense de l’organisme contre les infections et agressions grâce aux anticorps et aux globules blancs. Il comprend une phase aqueuse de composition complexe. Le sang Le sang est un tissu mésenchymateux liquide contenu dans les espaces vasculaires. des hormones produites par les glandes endocrines vers les cellules cibles.4.1. I. les hématies (globules rouges) et les plaquettes.4. les leucocytes (globules blancs). Une autre fonction du sang qui est l’hémostase cette fonction est définit comme le maintien de la composition du milieu intérieur en particulier les liquides interstitiel et intracellulaire. contre la perte sanguine elle-même grâce au système de la coagulation. La génération de thrombine est l'aboutissement de deux voies différentes de la coagulation appelées voie intrinsèque et voie extrinsèque [13] (figure 3). La coagulation implique l'activation par protéolyse d'une dizaine de protéines plasmatiques qui interagissent entre elles et avec des surfaces cellulaires procoagulantes à l'aide d'ions calcium. et le maintien de la température corporelle. et par des cellules anucléées. La thrombine et la fibrine stabilisent le « clou hémostatique ». La coagulation passe par la production de thrombine.1. le transport de l’oxygène et des substances nutritives vers les cellules et des produits de dégradation du métabolisme cellulaire vers les émonctoires. l'étude in vivo des modifications conduisant à l'arrêt du saignement après traumatisme d'un petit vaisseau a permis de distinguer différentes séquences : d'abord une adhésion des plaquettes aux fibres de collagène formant l'ossature du vaisseau.Revue bibliographique I.

Cet élément est une protéine non plasmatique appelée « thromboplastine tissulaire ».4. La catalyse d'un certain nombre de facteurs de la coagulation est ainsi amorcée jusqu'au facteur activé Xa. Elle se poursuit par l'activation des facteurs IX et X en IXa et Xa. qui se lie à la thromboplastine tissulaire qu'elle active en facteur VIIa.1.4.1. Elle se trouve à la surface de diverses cellules dont les fibroblastes. La voie extrinsèque Nommée ainsi car un élément cellulaire extérieur au sang lui est nécessaire. incluant les fibres de collagène qui sont sous-jacentes à l'endothélium.2.1. La voie intrinsèque Nommée ainsi car tous les éléments qui lui sont nécessaires sont dans le sang.1. qui s'active en facteur XIIa quand il entre en contact avec certains types de surfaces. Cascade de la coagulation selon les voies intrinsèque et extrinsèque ainsi que le mécanisme de la fibrinolyse [14] I.Revue bibliographique Figure 3. Elle fait intervenir le facteur XII (Hageman). I. 14 .1. La voie extrinsèque fait intervenir le facteur VII.

Elle permet plus de prévenir l’accumulation de fibrine que de dissoudre une thrombose déjà constituée. TNF (facteur de nécrose tumorale) et interférons. virale. elle est générée par clivage peptidique sous l’action d’activateurs du plasminogène. Celui-ci implique plus de 30 protéines du plasma et des membranes cellulaires. radicaux libres. La fibrinolyse La fibrinolyse est un processus enzymatique de dissolution de la fibrine. IL6. La voie classique est activée par la formation du complexe antigène anticorps.Revue bibliographique I. Les premiers en place sont les polynucléaires. Parmi celles-ci. I.1. des synergies d’effet et des boucles d’amplification par le biais notamment du système du complément. Les médiateurs de l’inflammation mettent en jeu des phénomènes de production en cascade. parasitaire) • Immunologiques • Tumorales • Nécrose tissulaire • Traumatisme physique (intervention chirurgicale. c’est une réaction de défense immunitaire. L’enzyme principale qui intervient lors de la fibrinolyse est la plasmine. des endotoxines ou 15 . Le système fibrinolytique présente de nombreuses analogies avec celui de la coagulation. induisent leur prolifération. sérotonine et prostaglandines. La fibrinolyse permet la dissolution des dépôts fibrineux intra et extravasculaires. Dans le cas de l’artère. les macrophages qui participent à cette phase grâce à leur plus grande capacité de phagocytose. puis ils sont remplacés par les cellules mononuclées.3. En effet il existe un équilibre physiologique entre le système de la coagulation et celui de la fibrinolyse. la voie classique et la voie alterne. L’inflammation L’inflammation se définit par l’ensemble des phénomènes réactionnels déclenchés par l’organisme en réponse à une agression. brûlure) • Traumatisme chimique (surfaces de biomatériaux. tandis que la voie alterne est déclenchée spontanément par la présence des substances comme les polysaccharides des parois bactériennes.2. il comporte des activateurs et des inhibiteurs (régulateurs). microcristaux…) Le phénomène de l’inflammation permet l’arrivée des leucocytes dans le foyer inflammatoire. il peut être activé par deux voies. S’y associent des lymphocytes et des plasmocytes qui participent à la réponse immune.4. Ce mécanisme peut relever de nombreuses causes : • Infectieuses (bactérienne.1. cytokines : IL1. Toutes les cellules présentes sur le site inflammatoire sont activées et sécrètent de nombreux médiateurs : histamine.4. les médiateurs de l’inflammation participent au recrutement et à la migration des cellules musculaires lisses. tels que le tPA synthétisé par les cellules endothéliales [15].

Cette maladie est donc responsable d'ischémie (angor) et de nécrose (infarctus) du myocarde [22]. I. L’athérosclérose L’athérosclérose est la principale pathologie des artères coronaires. ce contact de surfaces artificielles perturbe l'hémostase et génère une réponse inflammatoire [18] après activation de multiples systèmes plasmatiques et cellulaires.5. Ces mécanismes interviennent lors d'un contact d'un biomatériau avec un tissu vivant.1.5. I.1. suivi de près par les accidents vasculaires cérébraaux [19]. L'incidence de ces maladies est variable d'un pays à un autre. la thrombose. I. Dans le monde. Une obstruction partielle ou totale de l’artère par une plaque athérosclérotique conduit à une sténose (figure 4) ou à une occlusion. se sont l’athérosclérose. Elle est beaucoup plus faible dans les zones méditerranéennes. 16 . Irlande. la formation d’anévrismes et la dissection.1. Principales pathologies vasculaires Les principales pathologies touchant le système vasculaire. soit 32 % des décès totaux. les habitudes alimentaires et le mode de vie [20]. À noter qu'aux États-unis et en Europe de l'ouest. elle se caractérise par une perte des propriétés structurales de la paroi artérielle [21]. Écosse et en Amérique du Nord). ce qui en fait la première cause de mortalité en France. Entre autres la nature chimique et le degré d'hydrophobie des surfaces d'implants modulent le degré de la réaction inflammatoire et l'adhésion des leucocytes [17]. avec 50 000 décès par infarctus du myocarde. Epidémiologie des maladies cardiovasculaire Les maladies cardio-vasculaires sont la principale cause des décès dans les pays occidentalisés. les complications de l'athérosclérose ont diminué de 30% ces trente dernières années à la fois grâce aux progrès de la prévention des facteurs de risque et aux progrès des thérapeutiques à la fois médicamenteuses et interventionnelles. l'incidence de la maladie est élevée dans les pays d'Europe du Nord (Scandinavie. L’athérosclérose est la principale forme de ces pathologies. elles seraient responsables d'environ 50 % des décès répertoriés. en France il y a environ 180 000 décès annuels liés aux maladies cardiovasculaires. cette incidence est plus élevée dans le nord de la France que dans le sud.5. Ce système répond finalement aux mêmes séquences physiopathologiques que celles qui régissent la cicatrisation après une lésion cutanée.1. dans les pays asiatiques et dans les pays émergents.Revue bibliographique encore par des surfaces artificielles [16].2. La prévalence de l'athérosclérose est corrélée avec le stade d'industrialisation d'une contrée. c’est pour cela que nous nous y intéresserons particulièrement.

de sang et de produits sanguins. réduction de la lumière de l’artère par la plaque athérosclérotique [21] .Revue bibliographique L’athérosclérose est définie par l’Organisation Mondiale de la Santé comme une « association variable de remaniements de l'intima des artères de gros et moyen calibre. trop importantes ou trop brutales. C’est une pathologie artérielle correspondant à une pathologie inflammatoire chronique liée à l’interaction entre les lipoprotéines modifiées. macrophages dérivés des monocytes circulants et lymphocytes T. Figure 4. Les présentations cliniques de la maladie athéroscléreuse sont évidemment multiples et fonction de l’artère touchée. de dépôts calciques et de plaquettes. 17 . consistant en une accumulation locale de lipides (formation de dépôts lipidiques par le cholestérol en excès). Représentation schématique d’une artère sténosée vue en coupe. Mais la maladie reste souvent silencieuse et le patient le plus souvent asymptomatique [27]. de tissus fibreux. vont conduire à des lésions qui vont se compliquer par une rupture ou une érosion de plaque et une thrombose artérielle [26]. Certaines de ces lésions inflammatoires. les cellules inflammatoires. s'imprégnant progressivement de glucides complexes. L’atteinte coronaire et l’infarctus du myocarde dominent par leur fréquence et leur sévérité suivis de près par les atteintes carotidiennes et les accidents vasculaires cérébraux. Cette inflammation chronique conduit à un processus réactionnel cicatriciel de la paroi artérielle impliquant les cellules musculaires lisses et la production de matrice extracellulaire [25]. et les éléments cellulaires de la paroi artérielle [24]. le tout s'accompagnant de modifications de la tunique intermédiaire (la média) » [23].

Ensuite viens le recrutement des monocytes du sang qui se transforment en macrophages et cellules spumeuses.1. Ces monocytes pénètrent ensuite l'espace sous endothélial et se transforment en macrophage sous l'influence de différents facteurs : le MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) est nécessaire au passage des monocytes entre les cellules endothéliales.5. et que l’agent d’agression entraînant la réaction inflammatoire est très probablement le cholestérol-LDL modifié notamment par oxydation [29-31] comme montre la figure 5. permettent d’affirmer aujourd’hui que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique des grosses artères à localisation intimale [21. la lésion fibro-lipidique et lésion compliquée [34].5. 28]. le M-CSF (monocyte-colony stimulating factor) est nécessaire à la différenciation 18 .1. Figure 5.Revue bibliographique I. Les différents stades évolutifs de l'athérosclérose comme le montre la figure 6 sont : la strie lipidique. puis à la complication de la plaque d'athérosclérose sont maintenant bien connus [33]. notamment secondaire à la présence des LDL oxydée qui favorise l'adhésion des monocytes circulant au niveau de la surface de l'endothélium.1. Cette infiltration lipidique est suivie d'une modification oxydative des LDL par différents mécanismes notamment enzymatiques [37].3.3. Genèse de la plaque Les différents mécanismes qui contribuent à la genèse. Ce phénomène est directement en relation avec la quantité de LDL-Cholestérol plasmatique [36]. La dysfonction de l’endothélium. Physiopathologie de l’athérosclérose Les études expérimentales les plus récentes. I. associées aux observations anatomopathologiques faites sur des plaques humaines. La première étape de l'athérosclérose est la pénétration passive et l'accumulation des lipoprotéines de basse densité (LDL-Cholestérol) dans l'intima [35]. Les Principes de base de Synthèse du Cholestérol [32].

Revue bibliographique des monocytes en macrophages et à leur prolifération. Ces macrophages vont alors jouer un rôle délétère important dans les différentes étapes de l'athérosclérose, essentiellement en entraînant une réaction inflammatoire chronique locale et la production de cytokines pro-inflammatoire [38]. Ces cytokines inflammatoires vont générer à la fois la croissance de la plaque, et sa fragilisation. D'autres macrophages se chargent en LDL oxydées et se transforment en cellules spumeuses [39, 40].

Figure 6. Les différentes étapes de la constitution de la strie lipidique et de la plaque d’athérosclérose [41] . A : infiltration et oxydation des LDL dans l'intima, B : Inflammation de la paroi artérielle, C : Transformation des monocytes en macrophages et cellules spumeuses, D : les LDL oxydées favorisent la formation du thrombus, E : lésion athéroscléreuse.

19

Revue bibliographique I.1.5.3.2. Formation de la plaque mature Le cœur lipidique de la plaque est constitué de lipides extra et intracellulaire, ce centre lipidique de la plaque est isolé de la lumière artérielle par une chape fibreuse constituée de cellules musculaires lisses, de collagènes et d'une matrice extracellulaire. Ces cellules musculaires lisses proviennent de la média, migrant à travers la limitante élastique interne vers l’intima où elles prolifèrent sous l’influence de facteurs de croissance tels que le PDGF (platelet derived growth factor) [42]. Cette réaction de croissance est tributaire d’un changement de phénotype des cellules musculaires lisses (transition d’un phénotype différencié « contractile » vers un phénotype dédifférencié « sécrétoire »). La thrombine semble aussi jouer un rôle important [43, 44]. L’intégrité de la chape fibreuse est un élément déterminant de la stabilité des plaques d’athérosclérose [45]..

I.1.5.3.3. Profils évolutifs de la plaque « stable » L'évolution sur des années de la plaque se fait par une progression parallèle du centre lipidique et de la chape fibreuse. Progressivement cette plaque d'athérome fait protrusion dans la lumière artérielle entraînant donc la formation d'une sténose artérielle. Longtemps cette sténose reste modeste grâce à des phénomènes compensateurs de l'artère appelés remodelage vasculaire (l'artère se dilate pour compenser la protrusion de la plaque). Ce mécanisme est ensuite dépassé et la sténose devient significative et serrée [46].

I.1.5.4. La sténose L'athérosclérose est caractérisée par la présence d'une plaque athéromateuse qui prend de l'expansion dans la lumière du vaisseau et abaisse significativement le débit sanguin des sujets. Cette plaque crée ce que l'on appelle une sténose. Avec l'assistance d'un système morphométrique informatisé, Kragel et al. ont pu définir les diverses composantes présentes dans la plaque athérosclérotique [47]. Il ressort de cette étude que les tissus fibreux composent la majorité de la plaque, soit 80%, alors que les lipides extracellulaires et le calcium en représentent 5%. Les 15% résiduels consistent en des composés variés. Dans une situation stable, le caractère fibreux de la plaque lui confère une protection contre des fissures possibles et permet d'éviter des risques d'accidents critiques, voire mortels, pour le patient. La complexité de la plaque athérosclérotique est indéniable suite à ces observations, d'où l'importance de bien connaître le milieu où se produisent les évènements afin de pouvoir cerner toute la problématique entourant l'athérosclérose. Le vaisseau déficient a donc été décortiqué par plusieurs groupes de recherche afin de récolter le maximum d'informations sur le mécanisme de l'athérosclérose. 20

Revue bibliographique I.1.6. L’angioplastie L'angioplastie est également appelée angioplastie par ballonnet, ou encore angioplastie coronarienne transluminale percutanée (ACTP). C’est une revascularisation coronarienne qui consiste à restaurer l’apport sanguin au myocarde à travers les artères coronaires par désobstruction mécanique de la lumière artérielle. Depuis la première angioplastie coronaire, réalisée par Gruntzig en 1977 [48], cette technique beaucoup moins traumatisante que le pontage, connaît un essor spectaculaire, avec 117000 procédures au cours de année 2007.

I.1.6.1. Mécanisme de l’angioplastie au ballonnet Le principe de cette technique, c’est la dilatation par ballonnet sous contrôle radioscopique pour écraser la plaque athéromateuse et remodeler le vaisseau. Cette méthode consiste à introduire, via l'artère fémorale, un cathéter muni d'un ballonnet à l'intérieur du système artériel et de le positionner au site sténosé. Une fois en position, l'opérateur gonfle le ballonnet afin d'écraser la lésion contre la paroi, favorisant le rétablissement d'un calibre coronaire correct et permettant ainsi une perfusion myocardique suffisante (figure 7) [49]. Les résultats de cette méthode sont fascinants, puisqu'un taux de succès de l'ordre de 90% est couramment atteint. Cette réjouissance est de courte durée, puisqu’il y a réapparition d'une nouvelle lésion au site dilaté dans les six premiers mois suivants la chirurgie [50]. On dénombre 30 à 60% [51-54] de patients victimes de cette réocclusion nommée resténose.

A

B

Figure 7. Angiographie de l’artère carotide interne A : sténosé à 95% ; B : après dilatation par ballonnet I.1.6.2. Les stents et leur implantation L’introduction des stents à la fin des années 80 a constitué une étape décisive dans le développement des techniques de cardiologie interventionnelle [55, 56]. Le stent est formé d’un 21

Revue bibliographique cylindre en grillage métallique, il agit à la manière d’un petit ressort pour maintenir la circulation sanguine dans une artère dont le conduit s’est rétréci (sténose) comme le montre la figure 8. Ces endoprothèses sont désormais la principale technique d’angioplastie coronaire percutanée en France, comme dans les autres pays occidentaux avec un taux de réussite non négligeable [57]. La principale limite de cette technique est la survenue de resténose au site d’implantation du stent. Comparé à la technique d’angioplastie simple, le placement du stent coronaire a un plus grand taux du succès clinique, avec une fréquence inférieure de restenose et de revascularisation du vaisseau cible [58, 59]. Cependant, cet avantage peut être lié à un risque important de complications vasculaires à long terme [53]. Les stents peuvent provoquer une inflammation de la paroi vasculaire et une prolifération de cellules musculaires lisses qui conduisent à la diminution de la lumière artérielle. La biocompatibilité de ces stents peut être améliorée en modifiant leur surface, par greffage ou adsorption de molécule bioactives ou par enrobage du stent par un film de polymère contenant un principe actif [60].

A

B

C

D

Figure 8. Les différentes étapes A : avant infarctus du myocarde, B : pendant infarctus du myocarde, C : angioplastie par ballonnet, D : pose de stent [61]

I.1.7. La Resténose La resténose est une réponse cellulaires au traumatisme artériel causé par l'angioplastie [62] et qui implique une interaction complexe entre cellules inflammatoires, protéines sanguines [63] et les lipides plasmatique [64] d’une part et les plaquettes [65], les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses [66] d’autre part . La réocclusion des artères représente un enjeu 22

les cellules vasculaires musculaires lisses subissent un étirement et une destruction inévitable.7. I. La diminution de la lumière est la conséquence directe de cette cascade d’évènements. inflammation.Revue bibliographique considérable puisqu'on lui attribue l'échec de plusieurs centaines de milliers d'interventions et un coût estimé à 2 milliards de dollars par année dans le système de santé américain. leur principale fonction est de relâcher les cytokines et les facteurs de croissance dans le milieu [70]. I.8. On assiste éventuellement à un phénomène de cicatrisation du site endommagé [68]. la formation d'une thrombose par l'accumulation de fibrine et la libération de substances issues des plaquettes (ex. et la matrice extracellulaire composant la média et l'adventice est également perturbée. Cette modification a pour but de réduire la prolifération néointimale.1.2. Thrombose. d’éviter les réactions de thromboses et d’inflammation. l'endothélium est dénudé de sa couche protectrice favorisant un environnement thrombogénique. une hyperplasie intimale liée à la réaction de cicatrisation de l’artère.1. Les mécanismes de la resténose Le gonflement du ballonnet et la pose de stent dans l'artère créent un dommage sévère sur tous les éléments composant le vaisseau sanguin. Elle constitue en quelque sorte une forme accélérée d'athérosclérose dont les conséquences sont très graves [67]. TGF qui vont agir sur les cellules musculaires lisses. PDGF. I. la modification chimique de la surface des stents par une association à un agent thérapeutique constitue un développement important depuis 1998 [71]. la thrombose et l'inflammation du vaisseau stimulent la migration des cellules musculaires lisses et provoque leur prolifération dans l'intima pour former une nouvelle couche appelée: néointima.1. qui entraînent comme nous l’avons vu précédemment. Et depuis l’introduction des stents actifs et le développement de cette technique le taux de resténose a été réduit à moins de 10%. Une fois ces cellules activées. Les évènements inflammatoires caractérisent le deuxième processus fondamental et débutent par l'adhésion des leucocytes. 23 . bFGF. les cellules inflammatoires et fibroblastes) [42]. migration et prolifération Le processus de cicatrisation se produit immédiatement après le dommage qui est initié par les évènements thrombotiques tels que la déposition et l'agrégation plaquettaire. La lame élastique interne se trouvant dans la média est endommagée.1. Stents bioactifs Afin d’améliorer les effets néfastes dus à la pose des stents.7. l'activation des lymphocytes et monocytes circulantes [69]. Suite à la dilatation. principales causes du phénomène de la resténose. Quelques jours après le dommage.

mais aussi de leur migration. [76] ont testé l’effet d’un stent recouvert de rapamycine dans un modèle de resténose coronaire chez le porc.2. effet cytostatique).Revue bibliographique I. [75] ont montré que des injections systémiques de rapamycine diminuent d’environ 50% l’hyperplasie intimale des coronaires de porc après une angioplastie au ballonnet. l’héparine fixée au stent inhibe la formation de thrombine dans l’environnement du stent. cette molécule joue un rôle d’immunosuppresseur [74] par l’inhibition de la transduction du signal initié par l’interleukine IL2 au niveau des lymphocytes T. Toutefois. la proportion de cas avec thrombose subaiguë intrastent était très faible (0. Stents Cypher®. Le copolymère (non biodégradable) utilisé dans cette étude était une association de poly-n-butyl méthacrylate et de polyéthylène-vinyl acétate contenant environ 185 µg de rapamycine. l’absence de groupe témoin recevant un stent classique ne permettait pas de conclure à l’efficacité spécifique du stent recouvert d’héparine. Stents imprégnés d’héparine La première expérience clinique utilisant un stent imprégné «actif» a été réalisée avec un stent en acier inoxydable auquel étaient liées de façon covalente des molécules d’héparine [72]. elle inhibe aussi l’agrégation plaquettaire [71] . ce qui fait de la rapamycine un candidat potentiel pour la prévention des resténoses.1. I. par rapport au groupe recevant le stent métallique sans polymère.4%). enrobé de sirolimus La rapamycine (sirolimus) est un antibiotique naturel de la classe des macrolides. Suzuki et al.1. R. cet effet intervient via une augmentation de l’expression de la protéine p27 (un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines) et une diminution de la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome (Rb). le sirolimus et le paclitaxel. contre 0% dans le groupe «rapamycine». 72.1.8. et le risque de resténose plus faible que dans le groupe témoin traité par une angioplastie au ballonnet seul (16% contre 31 %). Ces résultats encourageants ont ouvert la voie au développement d’autres stents bioactifs délivrant des molécules limitant la resténose intrastent. Il résulte de cette chaîne d’événements moléculaires une inhibition de la prolifération des cellules musculaires lisses (arrêt en phase G1.9% des patients étaient indemnes d’événements 24 .8. Et à 210 jours. Gallo et al. L’activité proliférante à 7 jours et la surface néointimale à 4 semaines étaient diminuées de 50% dans le groupe recevant le stent recouvert de rapamycine. Dans l’étude multicentrique Benestent-II [73]. 26% des patients du groupe témoin avaient une resténose angiographique. produit par un micro-organisme (champignon) Streptomyces hygroscopicus. Ces stents à élution de sirolimus réduisent considérablement le risque de resténose intrastent après une intervention coronarienne percutanée comparativement au stent nu [77-79] Les résultats de l’étude randomisée RAVEL ont confirmé ces résultats: après un suivi de 6 mois. en se liant à l’antithrombine III circulante.

de seulement 8% contre 20% dans les groupes témoins. les patients ayant reçu un stent libérant du Taxol® avec une cinétique lente et modérée ont une obstruction luminale. qui est réalisée chez une population de patients plus sévèrement atteints. dépendant de la dose de paclitaxel.7% dans le groupe «rapamycine» [80].3. Dans l’étude TAXUS II [87]. d’hémorragies intimales. qui est retrouvée chez 8. principale protéine impliquée dans la formation des microtubules du fuseau mitotique. cette drogue bloque la mitose en interphase et entraîne la mort cellulaire [83]. on note un excès. ce qui empêche la division cellulaire. [85] ont utilisé un stent recouvert de paclitaxel (0 à 42 µg/stent) stabilisé par une couche de gélatine et de sulfate de chondroïtine.1. sans adjonction de polymère. [84] ont implanté dans des artères coronaires de porcs un stent métallique recouvert d’un film de paclitaxel (0 à 187 µg/stent) dilué dans de l’éthanol.8. Farb et al. 25 . agent naturel présent dans l’écorce de l’if du Pacifique (Taxus brevifolia). aboutissant à une diminution nette du risque de resténose angiographique (2% à 5% contre 20% à 24% pour les sujets témoins). Plusieurs études randomisées ont été réalisées avec des stents recouverts de paclitaxel.6 % des patients ayant reçu un stent au sirolimus contre 21 % chez les patients témoins. D. le paclitaxel favorise l'assemblage de la tubuline en microtubules et stabilise les microtubules formés. Par ailleurs. contre 96. mesurée par échographie endocoronaire. Heldman et al. I.E. Dans le même modèle. on observe une réduction de l’hyperplasie intimale intrastent dépendante de la dose utilisée. un défaut de matrice extracellulaire et un retard net de réendothélialisation persistant à 6 mois. mais l’effet protecteur n’est plus observé après 90 jours. enrobé de paclitaxel Le paclitaxel (Taxol®). les stents au sirolimus diminuent la survenue à 9 mois de revascularisation. 2 mois et 6 mois. mais aussi la présence d’une hémorragie intra-intimale dont l’importance semble également liée à la dose de paclitaxel utilisée. Stents Taxus®. Responsable d’une polymérisation et de la stabilisation de la tubuline. infarctus ou resténose nécessitant une nouvelle procédure de revascularisation) dans le groupe témoin. mais on observe un excès de fibrine et d’infiltrat inflammatoire. est une molécule cytotoxique utilisée dans le traitement des cancers de l’ovaire.Revue bibliographique cliniques (décès. Une autre étude [82] démontre l'efficacité de ces stents après deux années de suivit. Dans l’étude SIRIUS [81]. Après 4 semaines de suivi. Une diminution de 35% à 50% de l’hyperplasie intimale de l’artère iliaque de lapin est observée après 4 semaines de suivi. A. Drachman et al. [86] ont utilisé un stent recouvert du copolymère poly(lactide-co-caprolactone) contenant 200 µg de paclitaxel: l’épaississement intimal est diminué de 50% à 60% à 1 mois. de dépôts de fibrine et d’inflammation vasculaire.

8.8. Par contre si on compare les stents nus avec les stents bioactifs au cours de l’infarctus le taux de réintervention du vaisseau cible est réduit avec les stents bioactifs sans influer significativement sur la mortalité ni sur le taux de réinfarctus [89].4. D’autres travaux sur l’artère iliaque du lapin ont montré que les zones de chevauchement de stents étaient le siège d’un retard de ré-endothélialisation encore plus marqué que les zones 26 . d'autant que susceptibles d'intervenir après la phase d'hospitalisation qui. a : stent métallique. D’autres études ont montré par la suite que la thromboses de stents actifs. Figure 9 : Complications des stents coronariens.5. aujourd'hui. Au cours des premiers mois suivant l’implantation. Stents actifs et stents nu.Revue bibliographique I. est d’environ 0. le risque n’est réduit que d’environ 2 à 3% par rapport aux stents nus. b :stent bioactif [90] I. ce qui est au-dessus des valeurs des stents nus [91-93]. le risque d'une thrombo-occlusion d'une artère traitée n'est pas nul et peut être responsable de complications parfois graves. Les taux de réintervention sont très proches si on compare les stents bioactifs entre eux (sirolimus et paclitaxel) [88].1.6% par an. ne dépasse pas en règle générale trois jours dans la plupart des centres d'angioplasties coronaires. Cela est due à la l’augmentation du taux de thrombose par les stents actifs contrairement au stents nu qui sont moins thrombogène mais présentent un risque plus élevé de resténose (figure 9).1. Thrombose liée au stents actifs Malgré l'amélioration considérable des endoprothèses coronaires liée à l'utilisation de stents actifs au sirolimus ou au paclitaxel.

Revue bibliographique sans chevauchement. 0.1% de thrombose aigue (phase hospitalière) . la thrombose sur stent est observée dans 0. la prolifération ainsi que la différenciation des cellules précurseurs endothéliales.1. Concernant le stent à élution de sirolimus. 27 . L’incidence de ce phénomène avec le stents actifs a fait l’objet d’une surveillance très étroite.8.6% des cas. la thrombogénicité du stent [96]. Ce retard de ré-endothélialisation peut jouer un rôle majeur dans la survenue de thrombose sur stent actif [94]. Comme le montre la figure 10. période habituellement décrite pour les stents nus. elles inhibent la migration et la prolifération des cellules endothéliales limitrophes et induisent l’expression de facteurs tissulaires qui accroissent potentiellement. L’ensemble de ces données est rassurant. ces substances inhibent également le «homing». le polymère comme la structure du stent peuvent entraîner une réaction d’hypersensibilité dans la paroi vasculaire. Retard de ré-endothélialisation L’allongement du délai de cicatrisation endothéliale induit par le médicament antiprolifératif a été associé avec la survenue de thrombose de stent tardive au delà du premier mois. D’autre part. par ailleurs. l’incidence de la thrombose est actuellement évaluée à moins de 1%. I. l’incidence de thrombose sur stents actifs reste faible sous réserve de maintenir l’association aspirine et clopidogrel (antiagrégant plaquettaire) de façon plus prolongée [95]. le sirolimus et le paclitaxel inhibent aussi bien la migration que la prolifération des cellules musculaires lisses et réduit ainsi la resténose.30% de thrombose tardive (au delà du premier mois).55% de thrombose subaiguë (premier mois) . La question a alors été posée d’un risque accru de thrombose sur stents actifs comparativement aux stents nus. et 0. Dans l’étude TAXUS IV portant sur plus de 1200 patients.6. Dans le monde réel de l’angioplastie coronaire avec stent non enrobé. le registre e-Cypher a permis une analyse précise de différentes composantes de la thrombose de stent : • • • 0. D’autre part.

soit localement. Pour l’instant. soit par la stimulation des cellules endothéliales progénitrices. C'est ainsi que dans le domaine de la substitution vasculaire 28 . possède des propriétés antithrombotiques et stimule la régénération et la migration des cellules endothéliales. Il est donc possible que le problème soit résolu par la combinaison de plusieurs substances. Il faudrait trouver un support inhibant aussi bien la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses. Les biomatériaux et la biocompatibilité Les besoins de la préservation de l’intégrité corporelle. Les biomatériaux doivent avoir à la fois des propriétés mécaniques adaptées à la fonction attendue et des propriétés biologiques garantissant une interaction sans inconvénient au niveau de l'interface matériau-tissus [98]. les stents bioactifs actuellement disponibles ne sont pas encore optimaux. qui soit anti-inflammatoire.2. bien que certaines molécules couvrent une partie de ces propriétés. la réparation des lésions d’organes ont conduit à l’utilisation de matériaux non-vivants au contact de l’organisme. ce profil n’est pas encore obtenu avec une seule substance.Revue bibliographique Figure 10. Effets biologiques des stents libérant des médicaments dans la circulation coronarienne [97] Finalement. I. Ces procédures déjà utilisées dans l’antiquité ont conduit la recherche scientifique à définir beaucoup plus précisément le concept de biomatériau.

l’étendue et la durée de la réaction inflammatoire caractérisent la biocompatibilité du 29 .2. I. Les biomatériaux peuvent être classé en quatre groupes : Métaux et alliages métalliques. à condition de leur absence d’effet délétère pour l’organisme [99]. Polymères synthétiques. I. Définition d’un Biomatériau La Société Européenne des Biomatériaux (European Society for Biomaterials) a énoncé en 1986 la définition d’un biomatériau. La Biocompatibilité Quelle que soit sa qualité. il est très difficile de trouver des matériaux répondant aux deux conditions à la fois.2. Matériaux d’origine naturelle. Alors que des millions de dispositifs médicaux sont implantés chez l’Homme chaque année avec un taux de succès très raisonnable. d’origine naturelle pour certains ou dérivant directement du domaine des matériaux de synthèse.Revue bibliographique artérielle de petit calibre. ces réponses doivent être perçues comme étant des réponses locales inévitables. Dans ce concept la biocompatibilité a été définie de façon consensuelle sous l’égide de la même société (European Society for Biomaterials). cette double exigence passe par la mise au point de matériaux combinant des propriétés structurales garantissant un comportement mécanique satisfaisant et des propriétés biologiques évitant la survenue de phénomènes de coagulation. Cette définition a été amendée en 1991. pour les autres.2. Cependant. Le domaine des biomatériaux est donc très vaste et regroupe plusieurs milliers de produits. tout implant non dégradable va induire chez l’hôte un passage à l’inflammation aigüe et même une réponse à un corps étranger à long terme. un biomatériau reste un corps étranger et son introduction dans l’organisme entraîne une réaction plus ou moins importante du tissu environnant.1. comme la « capacité d’un matériau à induire une réponse appropriée de l’hôte dans une application spécifique » [100]. Dans le contexte de l’implantation. carcinogénicité) et d’autre part que les tissus du receveur et les fluides physiologiques en particulier le sang ne sont pas susceptibles d’altérer le matériau au détriment de ses qualités intrinsèques ou au risque de générer des produits de dégradation toxiques. pour des applications en contact avec le sang. lors de la conférence de Chester (UK) : « Un biomatériau est un matériau conçu pour interagir favorablement avec les systèmes biologiques. qu’il participe à la constitution d’un dispositif à visée diagnostique ou à celle d’un substitut de tissu ou d’organe ou encore à celle d’un dispositif de suppléance (ou d’assistance) fonctionnelle ». La biocompatibilité signifie d’une part que le matériau n’est pas à l’origine de phénomènes locaux ou systémiques néfastes pour la santé du receveur (toxicité. Céramiques.

La notion de biocompatibilité n’est donc pas une propriété intrinsèque d’un matériau mais plutôt une propriété d’usage liée à une application particulière. Une évaluation du biomatériau isolé ne s’avère pas suffisante pour prévoir la réaction causée par le produit fini après son implantation [106]. Dans l’interaction entre l’implant et les tissus adjacents. encore appelées propriétés de masse (composition intérieure).3. il induit naturellement différentes réactions telles que la coagulation du sang. I. La biocompatibilité correspond à un processus dynamique bidirectionnel qui implique les effets temporels de l’hôte sur le matériau et du matériau sur l’hôte. Les propriétés de l’implant dans son ensemble. Mais d’un point de vue théorique. À cet effet. un matériau qui provoque une réaction adverse dans une application donnée n’est pas forcément à condamner d’office puisqu’il peut être tout à fait biocompatible dans une autre application [104]. ainsi lorsqu’un matériau est exposé à un environnement biologique. la réponse de l’hôte recherchée. de l’interaction de toutes les composantes et des caractéristiques du produit fini. Lorsqu’il est biocompatible. l’activation du système du complément et des interactions cellulaires. différents types de matériaux polymères ou métalliques sont aujourd’hui utilisés au contact du sang. est toute interaction positive entre le matériau implanté et les tissus avoisinants qui résulte en une participation active des cellules périphériques dans le bon fonctionnement de l’implant.Revue bibliographique biomatériau [101]. vont plutôt déterminer le succès de l’implant à long terme [105]. 30 . Interaction sang biomatériaux Le choix d’un matériau dépend de la fonction qu’il doit remplir et de la durée de son utilisation. des résidus et/ou contaminants de fabrication. un matériau ne doit pas affecter négativement l’hôte et vice versa. Par contre. des produits de dégradation. 103]. il n’existe pas de définition absolue de la biocompatibilité puisque le monde des biomatériaux est en perpétuelle évolution. il faut tenir compte non seulement du matériau qui le compose mais aussi des additifs.2. améliorant ainsi sa biocompatibilité. prévoir et donc orienter la réponse initiale de l’hôte favorablement en fonction du rôle de l’implant. Pour une évaluation plus globale de la biocompatibilité d’un système implantable. Finalement. les caractéristiques physicochimiques de la surface d’un matériau sont certainement parmi les paramètres les plus critiques à considérer pour comprendre. le degré de perturbation des mécanismes homéostatiques et l’étendue des réponses physiopathologiques sont des mesures de la réaction de l’hôte qui peuvent permettre de déterminer la biocompatibilité d’un biomatériau et ses chances d’utilisation en tant qu’implant [102. Ainsi.

2. Ainsi une protéine qui s’adsorbe rapidement mais avec une faible affinité sera remplacée par une protéine moins abondante qui s’adsorbe lentement avec une affinité élevée. l’adhésion cellulaire Les interactions des cellules avec leur environnement sont d’une importance cruciale pour leur devenir et leur comportement. En effet le déplacement successif des protéines plasmatiques adsorbées sur des surfaces artificielles. Divers mécanismes entrent en jeu suivant le partenaire avec lequel la cellule interagit : une autre cellule ou la matrice extracellulaire. Elle est généralement de faible affinité et le plus souvent dénaturante . Afin de pallier une cascade d’événements néfastes pour l’hôte il s’avère donc primordial d’améliorer la biocompatibilité des prothèses afin d’induire des réactions biospécifiques et bénéfique pour l’hôte. Il s’agit alors de pouvoir contrôler les étapes précoces de l’adsorption pour développer des matériaux hémocompatibles. I. dépend de la concentration.4. Interaction polymères cellules Pour croître et survivre in vitro ou en contact avec un polymère. par exemple.4. Ce processus est responsable de l’activation de la coagulation du sang ou formation du thrombus qui a lieu quelques minutes après le contact du sang avec le matériau. de kératine et de diverses glycoprotéines qui vont interagir avec les cellules de manière spécifique. De ce fait. les cellules en culture ont besoin d’adhérer et de s’étaler sur le support utilisé pour leur culture. Chaque type d’interaction dépendra de la nature et de la distribution des sites d’interaction du polymère avec les domaines de liaison présent sur la cellule ou dans la protéine si l’interaction est médiée. 108] et favorise l’endothélialisation de la prothèse. de l’affinité et de la vitesse de transport des protéines. Cette matrice est formée de collagène. dans la différenciation cellulaire et dans la morphogenèse. de protéoglycans. d’élastine. lorsque l’héparine est liée au stent d’une manière covalente.1. d’acide hyaluronique.2. elle inhibe la formation du thrombus [107. l’interaction des cellules avec des surfaces polymériques constitue un point crucial dans certaines applications biomédicales et biotechnologiques. Dans les conditions physiologiques les protéines du sérum recouvrent 31 . cette adsorption grossière concerne toutes les protéines qui entre en compétition entre-elles.Revue bibliographique Le premier évènement décrit lors du contact sang-matériau est en général une adsorption non spécifique de protéines plasmatiques. L’adhésion cellulaire sur des substrats tels que la matrice extracellulaire ou d’autres supports artificiels est un processus fondamental dans la formation des tissus. Ceci a pu être réalisé par la mise en œuvre des polymères biospécifiques. I.

dans ce cas on parle d’interactions médiées par des protéines. Il est bien établi que les cellules qui ont besoin de réaction d’adhésion pour exprimer leurs fonctions. ionique ou Van der Waals entre la membrane cellulaire et la surface du matériau. L’étalement des cellules sur le substrat est accompagné d’un réarrangement du cytosquelette. Interactions non spécifiques : Elles sont le résultat d’un processus d’absorption physicochimique. on peut citer la morphologie. plusieurs points d’interaction peuvent s’établir .Revue bibliographique rapidement le matériau. et la vitronectine. l’interaction est directe ou de sites de reconnaissance appartenant à des protéines adsorbées à la surface. phénomène indispensable à la survie et à la prolifération de la plupart des cellules. La membrane cellulaire est constituée d’une bicouche lipidique qui retient plusieurs types de molécules tels que les protéines. sa mouillabilité et l’adsorption protéique. De nombreuses cellules adhérentes présentent une dépendance vis-à-vis du sérum in vitro. Cette couche à généralement une épaisseur de 2 à 5 nm. Lorsque la cellule entre en contact avec un substrat. la laminine. les polysaccharides… Elles présente ainsi une structure hétérogène appelée mosaïque fluide. ceux-ci sont générés par des combinaisons complexes d’interactions non spécifiques de type hydrophobe. Pendant ces 20 min les cellules forment le contact avec le matériau et commence à adhérer. l’étalement et la prolifération cellulaire dépendent des propriétés physicochimiques des polymères. Il peut s’agir de composants du matériau. l’albumine. qui dépend d’ailleurs en partie de la mouillabilité. ces interactions peuvent être spécifiques ou bien non spécifiques. les cellules adhérentes sont alors en contact d’une couche protéique préadsorbée sur le polymère [109]. Ces protéines avec le collagène et les 32 . La manière dont le substrat adsorbe les composants du sérum (sélection des protéines. L’adhésion. Interactions spécifiques : Les cellules peuvent interagir fortement et de façon très spécifique avec une surface contenant des sites d’interactions ou des récepteurs présent dans une conformation et une densité appropriées. le fibrinogène. La prolifération cellulaire peut alors débuter. dans ce cas. Enfin. Ensuite l’étalement cellulaire intervient si les conditions sont favorables. conformation des protéines adsorbées…) conditionne le comportement des cellules qui adhérent à ce substrat. la composition chimique de la surface. Parmi ces propriétés. L’étalement se produit pendant la phase G1 et la phase S du cycle cellulaire. Les composants du sérum responsables de cet effet ont été identifiés par de nombreuses équipes. possèdent à leur surface des éléments de reconnaissance indispensables. avec un temps de temps de latence de 20min après l’ensemencement. Les protéines capables de médier l’attachement et l’étalement cellulaires sont la fibronectine.

Plusieurs sites de liaison cellules-support ont été décrits. de la morphologie ou de l’activité biologique des cellules. L’hydrophilie ou l’hydrophobie des polymères est corrélée à l’énergie libre de surface. Par ailleurs.4.2.1. Ces interactions directes ou médiées génèrent différents signaux dans les cellules et induisent des modifications de la croissance cellulaire. c’est les sites les plus forts d’adhésion. de nombreuses propriétés du support ont été décrites comme influençant le comportement des cellules en culture. Chaque type d’interaction dépendra de la nature et de la distribution des sites d’interaction du polymère avec les domaines de liaison présents dans la cellule ou dans la protéine d’attachement si l’interaction est médiée. De nombreuses études ont montré que l’affinité d’adsorption et la quantité des 33 . Morphologie de surface Certaines caractéristiques morphologiques de la surface des biomatériaux.Revue bibliographique protéoglycanes composent la matrice extracellulaire qui comble les espaces extracellulaires aussi bien in vivo qu’in vitro.1. Hydrophilie des polymères La nature des groupements chimiques portés par le polymère influence leur mouillabilité.2. la courbure. ils entourent généralement les sites d’adhésion focale. souvent observés aux extrémités des cellules. Il a été décrit que des polymères entièrement hydrophiles ou hydrophobes sont défavorables à l’adhésion cellulaire. Ce type d’adhésion est responsable de la mobilité cellulaire [110]. une cellule ne peut pas s’étaler sur une surface très anguleuse. I. • Les contacts fermés. La morphologie de surface d’un biomatériau est généralement hétérogène. De même la rugosité doit être faible pour permettre au cytosquelette d’épouser la forme de la surface. Les protéines extracellulaires impliquées dans ce type d’adhésion sont généralement la vitronectine et la fibronectine qui se lient aux récepteurs cellulaires nommés intégrines. telles que la porosité. on peut citer : • Les adhésions focales.1.2. de l’expression phénotypique. sont connues pour influencer l’adhésion cellulaire à un substrat extracellulaire.4. les trois paramètres retenus pour une bonne adhésion et prolifération sont les suivants : • • • Morphologie de surface Hydrophilie des polymères Adsorption de protéines sur la surface I. la texture. les discontinuités ou pores de celui-ci doivent être assez petits pour permettre aux extensions cytoplasmiques cellulaires d’adhérer et de former ainsi de sorte de ponts. Bien que chaque type cellulaire requiert des propriétés différentes vis-à-vis d’un support.

4. des ions et des solutés de faible poids moléculaire s’adsorbent rapidement à la surface. Les polymères synthétiques Les polymères sont des matériaux faciles à mettre en forme. tubulures d’hémolyse et de circulation extracorporelle.3. l’effet de la nature de la surface du biomatériau pour la sélectivité d’adsorption des protéines. Les propriétés individuelles des surfaces et les propriétés spécifiques des protéines déterminent ensuite l’organisation de la couche de protéines adsorbées et la nature de cette couche définit à son tour la réponse des cellules sur ces surfaces. il existe une vaste variété de monomères dont les associations conduisent à une large gamme de propriétés mécaniques. Bien que ces matériaux ne soient pas vraiment biocompatibles (ils sont thrombogènes et nécessitent l’administration d’anticoagulants). L’adsorption de protéines peut être exploitée pour modifier la surface d’un matériau. Certains polymères produits en grande quantité pour des applications industrielles sont également utilisés dans le domaine biomédical. canules. 34 .2.1. du polychlorure de vinyle (Tygon) et de certains polyuréthannes. Des expériences in vivo avec des prothèses vasculaires de petit diamètre ont montré que l’adsorption des protéines sériques ne suffit pas à une parfaite hémocompatibilité [112. Plus généralement. leur coefficient de diffusion et les réactions de compétition qui s’établissent entre différentes protéines.2. de l’eau. les protéines ont tendance à se déposer très rapidement sur une surface.5. la concentration des protéines dans le milieu environnant. surtout si le support est luimême hydrophobe.Revue bibliographique protéines adsorbées augmentaient avec le caractère hydrophobe de la surface adsorbante [111]. I. L’adsorption de protéines ensuite est la résultante de l’ensemble de ces interactions solide-liquide. I. Les principes qui déterminent l’adsorption de protéines à un biomatériau incluent l’adsorption de monocouches de composés de faibles poids moléculaires. La formation d’une couche de cellules endothéliales est indispensable afin d’obtenir une hémocompatibilité à long terme [114]. les propriétés de surface des protéines. ils sont utilisés dans des applications de courtes durées tels que cathéters. Il s’agit du polyéthylène (Intramedic). Lors du premier contact entre le milieu environnant et la surface. De même plus la protéine est hydrophobe. de plus. 113]. mieux elle est adsorbée. Les fluides biologiques ou le milieu de culture complémenté par du SVF ont une composition complexe et riche. Adsorption de protéines sur la surface Les protéines présentes dans le milieu environnant ou sécrétées par les cellules peuvent s’adsorber à l’interface solide-liquide.

et des alliages à base de titane (prothèses dentaires). l’acier inoxydable 316L est utilisé pour fabriquer des stents. La microstructure ainsi que l’état de surface de ces polymères détermine l’hémocompatibilité. Les métaux Ils sont utilisés dans des situations nécessitant des résistances mécaniques considérables. Les métaux les plus couramment utilisés sont l’acier inoxydable (316L. le débit sanguin est suffisamment important pour éviter ce problème. on les trouve aussi dans les carapaces des insectes et crustacée (chitosane).8. Tous sont néanmoins thrombogènes. les polymères doivent répondrent à des critères stricts de non toxicité.2. En revanche. Pour des applications biomédicales. principalement. Il est également possible d’associer de manière covalente ou non des molécules biologiques à des polymères synthétiques.2. Dans le but de rendre ces matériaux non thrombogènes. I. carraghénanes. l’occlusion de la prothèse peut avoir lieu suite à la formation du thrombus. La conception des polymères synthétiques doit être adaptée aux applications pour lesquelles ils sont destinés. Polysaccharides structuraux : la cellulose qui participent à la formation des 35 . On peut les classer sous deux catégories selon leur fonction biologique : polysaccharides de réserve : la molécule source d'énergie pour les êtres vivants est le glucose. Les polymères bioactifs Les polymères se prêtent bien aux modifications chimiques. I.6. plusieurs recherches porte sur la modification de leur surface. Ces matériaux sont destinés à des applications de long terme car leur surface structurée leur confère une bonne flexibilité et une bonne stabilité.7. tout en préservant leurs propriétés mécaniques.Revue bibliographique Les prothèses vasculaires sont les plus souvent confectionnées en fibres de polytéréphtalate d’éthylène (Dacron) ou bien en polytétrafluoroéthylène expansé (Goretex). Ces macromolécules sont les éléments structuraux majeurs de la paroi des cellules végétales et des algues marines (cellulose. I. alginates).2. la formation du thrombus dans les vaisseaux moins larges provoque l’occlusion de la prothèse. Les polysaccharides Les polysaccharides sont les macromolécules les plus abondantes sur terre et dans les océans [115]. Selon le diamètre du vaisseau à remplacer. En effet dans les prothèses de diamètres supérieurs à 6mm. Fe/Cr18/Ni10/Mo3). Il est possible par exemple de fixer des groupements chimiques fonctionnels sur une chaîne macromoléculaire pour lui conférer des propriétés biologiques particulières. On aura alors l'amidon chez les végétaux et le glycogène chez les animaux.

L’héparine est utilisée comme agent antithrombotique depuis 1940 [117]. Dans le milieu vivant. l’héparine standard (ou héparines non fractionnées = HNF) et les héparines de bas poids moléculaire (ou héparines fractionnées = HBPM). poumon.8. 6-O-disulfatée). ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme la catalyse de réaction enzymatiques ou les phénomènes de reconnaissances cellulaires. Mais ces polysaccharides n’ont pas toujours les propriétés physico-chimiques souhaités pour les différentes applications. la compréhension des mécanismes d’action biochimiques de ces polysaccharides nécessite leur analyse structurale. cette macromélcule est essentiellement localisée dans les mastocytes (foie. relié par une liaison 1→ 4 à une D-glucosamine disulfatée sur la fonction amine et en position 6 (glucosamine-N. les polysaccharides sont des hydrates de carbone qui ont pour formule générale (―[Cx(H2O)y)]n―). les polysaccharides jouent des rôles très divers. viscères).1. I. d’origine animale. Cette molécule a été découverte par McLean en 1916 et isolée par Howell en 1917. ils peuvent être modifiés par des réactions chimiques grâce aux fonctions hydroxyles afin de leurs conférer de nouvelles propriétés. Ils constituent donc une famille très importante de molécules souvent ramifiées.2. Appartenant à la famille des glucosaminoglycanes (mucopolysaccharides) sa masse molaire varie de 4.Revue bibliographique structures organiques chez les végétaux. Cette molécule est constituée d’un enchaînement linéaire répétitif d'un "disaccharide régulier" : acide L-iduronique sulfaté en position 2. La nature de l’unité saccharidique et le type de liaison glycosidique varient d’un polysaccharide à un autre mais ils ont tous en commun le fait d’être très hydroxylés et donc hydrophiles. Certains polysaccharides présentent un intérêt biomédical. Ils ont tendance à ne pas prendre de forme particulière : on dit qu'ils sont amorphes. On distingue deux catégories de polysaccharides : les homopolysaccharides constitués du même monosaccharide et les hétéropolysaccharides formés de différents monosaccharides. Ce sont des polymères formés d'un certain nombre de monosaccharides. On distingue deux types d’héparines . 36 .000 daltons. leur modification par différentes méthodes afin d’isoler des sites spécifiques pour des ligands donnés ou la caractérisation des groupements chimiques spécifiques des interactions. D’autres polysaccharides entrent dans la composition de la capsule entourant certaines bactéries et virus et peuvent être impliqués dans des mécanismes de reconnaissance cellulaire. Sur le plan chimique. L’héparine L’héparine est un polyholoside hétérogène sulfaté. dont l’héparine qui est largement utilisé dans le traitement des thromboses [116].000 à 40.

b. l’héparine est également capable d’inhiber l’activation du complément à différentes étapes. L’activité anticomplémentaire de l’héparine En plus de sa capacité à inhiber la coagulation. L’activité anticoagulante de l’héparine La propriété la plus connue de l’héparine est son activité anticoagulante. résident dans des sites différents. et les deux tiers restant n’ont aucune affinité pour cet inhibiteur plasmatique. Il s’avère que seulement un tiers des molécules contenues dans l’héparine standard (non fractionnée) est capable de se fixer à l’antithrombine. C’est cette séquence qui est responsable de l’activité anticoagulante de l’héparine par la formation d’un complexe ternaire entre la thrombine. Cette propriété est due à la présence d’une séquence particulière. diversement substituées par des groupes sulfates. Le site de liaison de l’héparine à l’antithrombine est constitué d’une séquence pentasaccharique dont la structure est parfaitement déterminée et confirmée par synthèse chimique. sulfamates et acétyles. seul les masses moléculaires suffisantes (entre 6 et 12kDa) sont capables d’inhiber tous les facteurs de la coagulation sensibles à l’héparine. L’héparine se lie à l’antithrombine. Antithrombine et héparine. l’antithrombine et l’héparine.Revue bibliographique a. ce qui permet une inhibition efficace de la thrombine. induit un changement de conformation de cette protéine qui renforce la vitesse d’inhibition de la thrombine (× 4 000 fois) et du facteur Xa (× 500 fois) [10]. L'héparine régule l'activité du complément et interagit avec les 37 . constitutive du thrombus figure 10. ces deux activités indépendantes l'une de l'autre. Ainsi l’héparine favorise l'inhibition de la thrombine qui convertit le fibrinogène en fibrine insoluble. Facteur déclenchant Antithrombine Facteur X Facteur Xa Prothrombine (facteur II) Thrombine (facteur IIa) Fibrinogène Fibrine (caillot) Figure 10. Parmi ce tiers apte à opérer cette activation. Le système de la coagulation (très simplifié sur ce schéma) est maintenu en équilibre à l’aide d’inhibiteurs physiologiques parmi lesquels l’antithrombine qui joue un rôle régulateur fondamental. dont la thrombine.. Cette séquence possède une forte affinité pour l’antithrombine. facteur clé de la coagulation.

Fucus vesiculosus. Le fucane Le nom fucane est un terme générique désignant une famille de polysaccharides sulfatés extraits de la paroi des algues brunes (phéophycées).2.Revue bibliographique protéines du système du complément en interférant sur la formation des C3 convertases des voies classique et alterne. les ascophyllanes ou xylofucoglucuronanes et les sargassanes ou glucuronofucogalactanes. généralement avec un haut poids moléculaire [122]. I. leur permet d'interagir avec un certain nombre de molécules de l'organisme humain. et plus ou moins riches en unités L-fucose. Pelvetia canaliculata…). ainsi Garg et al ont réussi à déterminer la séquence responsable de cette inhibition [121]. Les fucanes possèdent des structures très hétérogènes. Ils sont répartis en trois groupes : les fucoïdanes ou homofucanes. L’activité antiproliférative de l’Héparine Si le rôle anticoagulant et antithrombotique de l'héparine sont bien établis.2. Physiologiquement. la saison de récolte ainsi que les conditions d’extraction. les fucanes interagissent avec des protéines solubles ou structurales. De nombreux travaux ont montré que l’héparine inhibe la prolifération des CMLs [120] in vitro et in vivo réduit leur migration et module le métabolisme de la matrice extracellulaire.8. l’historique de l’algue. L’activité anticomplémentaire de l’héparine est surtout liée aux fonctions sulfates. c. inhibe la liaison du facteur B au fragment C3b et interfère avec l’assemblage de C5b-9 [118]. leur structure proche de celle de l'héparine ou des glycosaminoglycannes en général. Cet effet est du à une interaction spécifique entre l’héparine et les CMLs. Grâce à ces capacités de reconnaissance. l'inflammation [122] et la prolifération cellulaire. impliquées dans des processus biologiques comme la coagulation sanguine. Fucus spiralis. L’activité biologique des fucanes Les fucanes au même titre que d'autres polysaccharides sulfatés. l’habitat. l’activation de ces composés initie la réaction inflammatoire et intervient dans la réponse immunitaire afin d’éliminer les agents infectieux. l’héparine joue aussi un rôle d’inhibiteur des cellules musculaires lisses [119]. En effet. 38 . l’âge. présentent des activités biologiques diverses dont certaines peuvent se révéler intéressantes en pharmacologie [123]. La composition chimique des fucanes est très variable selon l’espèce (Ascophyllum nodosum. a.

de galactose et d’acide glucuronique augmente.Revue bibliographique b. La masse moléculaire et la composition chimique des fucanes déterminent leur activité anticomplémentaire. L’activité anticoagulante des fucanes Les fucanes catalysent fortement l’inhibition de la thrombine par les inhibiteurs plasmatiques cofacteurs de l’héparine. des fucanes de bas poids moléculaires obtenus par dégradation radicalaire possèdent une activité anticoagulante qui toutefois reste faible par rapport à celle de l’héparine. L’activité anticomplémentaire des fucanes Les fucanes sont de puissants inhibiteurs des deux voies du système de complément in vitro. de plus.8. 39 . Cette activité augmente quand la proportion de xylose. Il est constitué d'unités α-D-glucose essentiellement liées entre elles par des liaisons glucosidiques alpha 1-6 (95%) et parfois alpha 1-3 (5%) [127]. et surtout par le deuxième cofacteur de l’héparine [124]. les fucanes sont internalisés par les cellules sans que l'on puisse dire si cette internalisation est nécessaire à l'activité antiproliférative[126].3. Ce polysaccharide à généralement une très grande solubilité en milieu aqueux et dans certain solvant organique trés polaire comme le DMSO du fait de la forte proportion de liaison glycosidique de type α-D(1→6). c. Ces composés empêchent la formation et la fonction de la C3 convertase alterne en bloquant la fixation du facteur B à la protéine C3b et en interférant dans la stabilisation du complexe par la properdine.2. en bloquant la progression du cycle cellulaire en phase G0/G1. les fucanes sont 5 fois plus actifs que l’héparine dans l’inhibition de la voie classique et possèdent une activité similaire à l’héparine dans l’inhibition de la voie alterne du complément [125]. À concentrations égales. Le dextrane Le dextrane (C6H10O5)n est un polyglucoside naturel synthétisé par des bactéries de la famille lactobacillus. Ils interfèrent dans le mécanisme d’activation de la protéine C1 ou inhibent le clivage de la protéine C4 et l’interaction entre C4b et C2. l’antithrombine. d. I. inhibent la prolifération des cellules musculaires lisses. De plus. cette proportion élevée confère au dextrane une meilleure stabilité dans les conditions acides ou basiques. Les fucanes empêchent la formation des C3 convertases classiques. L’activité antiproliférative des fucanes Une étude de cinétique de synthèse d’ADN par incorporation de thymidine tritiée a montré que les fucanes de faible masse moléculaire (19 kDa).

3. Les radicaux libres résultent d'une rupture homolytique de liaisons covalentes. où. le cobalt III ou de l’argent II sur des acides carboxyliques. Ce mécanisme se décompose en trois étapes : L’amorçage. Dans notre étude nous nous limiterons à la réaction entraînant une liaison covalente entre le polysaccharide et un polymère méthacrylate comme c’est montré par D. ainsi de la distribution des nouveaux motifs sur la chaîne polysaccharidique. Trois méthodes majeures permettent d’engendrer des radicaux : la photolyse. Les radicaux ont une durée de vie très brève liée à leur grande réactivité. Modifications chimiques des polysaccharides Les modifications des polysaccharides par des réactions chimiques ont principalement comme but une modification de leurs caractéristiques physico-chimiques pour améliorer ou leur conférer de nouvelles propriétés [130-132]. au cours duquel des radicaux sont formés. comme le cérium IV. ces polysaccharides peuvent être modifiés grâce à une méthode redox utilisant les ions cérium (IV) [134-136]. 40 . La polymérisation radicalaire La polymérisation radicalaire est une réaction en chaîne qui. I.1. Il est par conséquent nécessaire de pouvoir engendrer facilement des radicaux. de manière à les engager dans des réactions ultérieures. la terminaison. I. Et du fait de leurs nombreuses fonctions hydroxyles. I.2. du degré de substitution ou d’addition. Sa quasi-inertie biologique fait du dextrane l'objet de nombreuses applications. Ces propriétés aussi bien biologiques que physicochimiques dépendent de la nature. Il est produit de façon industrielle à partir du saccharose par les glucosyltransférases de la souche Leuconostoc mesenteroïde [129]. un nouveau radical est formé.3. qui conduit à la disparition des espèces radicalaires.Revue bibliographique Le dextrane est dégradé par une enzyme la dextranase produite par les bactéries et non par les tissus [128]. la propagation. à partir d’un radical. Cette possibilité de modification chimique des polysaccharides est très vaste. Nous nous intéressons spécialement au processus redox qui fait l’objet de notre étude. Le système redox Ce sont des réactions d’oxydo-réduction qui sont réalisées par action des cations métalliques. le plomb IV. comme son nom l’indique fait intervenir des radicaux libres comme espèce propagatrice. conduisant à la formation d’un radical. Labarre et al [133]. allant des additifs alimentaires jusqu'aux utilisations pharmaceutiques et médicales. la thermolyse et les processus redox.3.

2. C'est au cours de cette étape que la chaîne macromoléculaire se forme par addition successive d'unités monomères sur le « polysaccharide-radical » en croissance. Cette étape de polymérisation est déterminante pour la structure et les propriétés du matériau résultant. soit par dismutation Dans le premier cas.2. Elle comprend deux réactions successives. D’une manière générale la première réaction qui constitue l’étape et gouverne donc la vitesse globale du processus d'amorçage. La propagation La propagation est la principale étape de la polymérisation radicalaire.2. Polysaccharide-OH + Ce IV ⎯→ Polysaccharide-O• + H+ + CeIII et/ou Polysaccharide-CH + Ce IV ⎯→ Polysaccharide-C• + H+ + CeIII I. La croissance des chaînes peut être interrompue à chaque instant par les réactions de terminaison au cours desquelles deux radicaux polymères se neutralisent soit par combinaison ou couplage.3. suivie d'une recombinaison. deux macro-radicaux reforment une liaison covalente : Polysa-Mn• + Polysa-Mm• ⎯→ polysa-Mn+m (combinaison) Dans le deuxième cas. La deuxième réaction est l'addition du radical primaire sur une première unité monomère pour former le premier « maillon » de la chaîne polymère en croissance.3. la réaction de dismutation.1.Revue bibliographique I. c'est-à-dire de l’encombrement stérique des sites actifs et de la concentration des radicaux. les deux macro-radicaux donnent lieu à une réaction de transfert d'hydrogène. il est nécessaire que la concentration en radicaux soit faible pour que les réactions de terminaison par combinaison des radicaux puissent être négligées.3. Polysa-Mn• + Polysa-Mm• ⎯→ polysa-Mn + Polysa-Mm (dismutation) La proportion relative de ces deux modes de terminaison dépend essentiellement du type de monomère employé. la terminaison Les réactions de terminaisons sont relativement importantes puisqu’elles provoquent la disparition des radicaux.3. Pour obtenir un processus efficace. Chaque radical formé est consommé par la réaction suivante. La première est la génération de radicaux dits primaires à l'aide du cérium.2. L’amorçage Cette étape est également nommée initiation. il est souvent utile de chercher à diminuer au maximum l’influence de la terminaison par recombinaison puisqu’il s’agit d’un processus souvent mal contrôlé. En chimie radicalaire. la réaction de recombinaison. de l'accessibilité des sites radicalaires. Polysa-Mn• + M ⎯→ polysa-Mn+1• I. 41 .

42 .

Matériels et méthodes 43 .Matériels&Méthodes II.

44 .

M = 100.2.22 g/mol) (Acros)). NaCl 20% ). à l’abris de la lumière sous atmosphère d’argon et sur tamis moléculaire. (NH4)2[Ce(NO3)6] (548. on élimine la phase aqueuse qui contient les inhibiteurs. II. Les amorceurs II. puis placés à 4°C pendant 24 heures. il faut les débarrasser de leurs inhibiteurs de polymérisation. après avoir bien mélangé et laissé décanté.1.1.1. Conservé à 8°C sous azote. Les cristaux formés sont récupérés par filtration. à 30°C.1.1.2.1.1. 100 mL de monomère à l’exception de l’HEMA sont mélangés à 10 mL d'une solution aqueuse alcaline (NaOH 5%. à l’abri de la lumière.1.12g/mol) est pur à 99%. séchés sous vide à 30°C et conservés à 4°C.21 g/mol).2. Le méthyle méthacrylate Le méthyle méthacrylate commercial (MMA) (Acros.'α-azobisisobutyronitrile (AIBN) (Acros) (M = 146. il est séché à 60°C pendant 24h et utilisé sans purification supplémentaire. est purifié par solubilisation et recristallisation dans un mélange eau distillée/éthanol (10/90).1. Dans une ampoule à décanter. la phase organique est lavée 3 fois avec 10 mL d'eau distillée. on obtient ainsi du monomère méthacrylate que l’on conserve à 4°C.2. on obtient 2 phases (une phase aqueuse et une phase organique qui contient le monomère méthacrylate).1.1. pur à 99%. Après dissolution de l'AIBN la solution est filtrée.2. L'azobisisobutyronitrile L 'α. jusqu'à son utilisation. II. Les monomères méthacrylates II. II. et on élimine l'eau.943 .1. Le Cérium IV Le cérium IV est utilisé sous forme d'ammonium cérium nitrate (hexanitratocérate(IV) d’ammonium. Synthèse II.Matériels&Méthodes II. CH3 H 2C O C C O CH3 Formule du méthyle méthacrylate 45 . Purification des monomères méthacrylates Avant l’emploi des monomères méthacrylates. France) (d = 0.

M = 142. Le butyle méthacrylate Le butyle méthacrylate (BMA) (Acros. CH3 H 2C O C C O (CH2)3 CH3 Formule du butyle méthacrylate II.Matériels&Méthodes II.896 . CH3 H 2C O C C O CH2 CH3 Formule de l’éthyle méthacrylate II.073 . L’HEMA purifié est conservé à 4°C.2. M = 114.4.1.2.5. jusqu’à son utilisation. France) (d = 0.1. Sa distillation sous vide permet d’éliminer le stabilisant qui inhibe la polymérisation. CH3 H2C O C C O (CH2)2 OH Formule d’hydroxyéthylméthacrylate 46 . M = 130.3. L’Ethyle méthacrylate (EMA) (Acros. à 4° et à l’abri de la lumière pour éviter la polymérisation. Il est conservé sous azote.915 . Le (2-hydroxyéthylméthacrylate) Le 2-hydroxyéthylméthacrylate (HEMA) commercial (Acros.2.1. France) (d=1. France) (d = 0. Il est conservé sous azote. à 4° et à labri de la lumière pour éviter la polymérisation. L’Ethylméthacrylate.2g/mol) est pur 99%.15g/mol) est pur 99%.14) est pur à 96%. sous azote et à l’abri de la lumière.

France) est séché avant toute utilisation à 60°C pendant 24h.3.ou acide glucuronique ou ose neutre O CH3 SO3 OR n O Structure du fucane II. Le Fucane Le fucane (SIGMA. II.3. 80.2.3.Matériels&Méthodes II. 70. R = H ou SO3.5 kg/mol) est séché pendant 24h à 60°C.3.3. 73. 40.1.1.1.7. O CH2 O OH HO CH 2 O OH O OH OH n OH Structure du pullulane 47 . 50.1. 1-5% R = glucose 95% et plus R = H OH OH n O CH2 O OR Structure du dextrane II. Le Pullulane Le pullulane (Hayashibara.1. Les polymères naturels (les polysaccharides). France) (M = 100. 264 kg/mol) (SIGMA. Le dextrane Le dextrane de différente masse (M : 10. Japon) 500 kg/mol dégradé au rayon β et chromatographié afin d’obtenir des fractions de masses molaires moyennes de 50 kg/mol. Le dextrane-FITC 70 kg/mol c’est du dextrane marqué à la fluorescéine isothiocyanate (FITC) afin d’être visualiser sous microscope à fluorescence.

57 mL de toluène anhydre sont introduites sous une atmosphère d'azote.1. En fin de réaction les homopolymères sont récupérés par précipitation des solutions dans le méthanol (200 mL).1. Le réacteur tricol est alors équipé de bouchons hermétiques à jupes rabattables et d’un réfrigérant. Dans un réacteur sphérique de 250 mL. L’héparine Héparine commerciale extraite de la muqueuse intestinale porcine (Sigma. Le temps de polymérisation a été fixé à 3 heures. 48 . la concentration des monomères méthacrylates. Les fractions utilisées ont une masse molaire moyenne de 17 à 19 kg/mol. PEMA et PHEMA) sont synthétisés afin d’être comparés à nos polymères hybrides.Matériels&Méthodes II. Synthèse des polymères méthacrylates Les homopolymères polyméthylméthacrylate.5. Une fois que les 70°C sont atteintes. puis recueillis par filtration sous vide et lavés avec une solution d'acide chlorhydrique diluée à 0. Synthèse des copolymères Plusieurs réactions de polymérisation ont été réalisées afin de déterminer les meilleures conditions de synthèse des copolymères polysaccharide-polyméthacrylate. Les monomères sont introduits séparément afin d'être mélangés au solvant avant l'addition de l'amorceur. Les polymères sont ensuite séchés sous vide jusqu'à poids constant. II.10-2 moles du monomère acrylique (MMA BMA. France). EMA et HEMA) ainsi que 5. polybutylméthacrylate. 5. COOO OH O OSO3 CH2OSO3O OH NH SO3O n Structure de l’héparine II. Sa température est porté à 70°C par immersion dans un bain d'huile. polyéthylméthacrylate et le polyhydroxyéthylméthacrylate (PMMA. Des synthèses contrôles sont réalisées dans les mêmes conditions de greffage sans l’ajout de polysaccharide. PBMA.10-3 moles d'AIBN dissous au préalable dans 2.4.5 mL de tétrahydrofurane (THF) sont additionnés au solvant par injection à l'aide d'une seringue.3.1 mol. Les paramètres que nous avons fait varier sont la concentration d’amorceur (CeIV). Ce polysaccharide est soluble dans l’eau mais pas dans le méthanol ni dans l’acétone. et la quantité du polysaccharide.4.L-1 et de l'eau permutée.1.

le cérium (IV) et le monomère MMA sont ajoutés en même temps.5.2. après 10 minutes d’agitation sous une atmosphère d’azote à une température de 40°C.1. II.O en fonction du temps à un intervalle de 5 minutes pendant 40 minutes.5. Représentation Schématique de la polymérisation. Greffage des méthacrylates sur les polysaccharides Les procédures générales de synthèse sont les suivantes : comme le montre la figure 12.1.5. volume du monomère méthacrylates et masse du cérium) sur l’apparition d’un précipité en suspension mesuré par D. ce qui est le cas après une quarantaine de minutes. (a) oxydation du poysaccharide par le CeIV. elle est amorcée par l’oxydation du polysaccharide par le cérium (IV).2 M. d’un proton H+ et d’un ion cérium (III). On note la variation du pH et la D.Matériels&Méthodes II.1. Caractéristiques et mise au point de la réaction de greffage L’étude de l’influence de divers paramètres (masse du polysaccharide. le polysaccharide est dissout dans 500mL d’une solution aqueuse d’acide nitrique 0. Le pH est alors amené à 8 par de la soude concentrée et la solution obtenue est concentrée à l’aide d’un rotavapor (Heidolph 94200) jusqu'à 49 . Cette réaction de polymérisation se fait en présence de monomères acryliques et sous une atmosphère inerte (argon ou azote) en milieu très acide (acide nitrique à un pH proche de 1). Description de la réaction de greffage La réaction de greffage se fait en suspension. elle est représentée par le schéma de la figure11 : HO HO HO O HO O HO Polymère O HO O HO O O HO HO HO + nCeIV O nCeIII + nH+ + O HO O HO O + Monomere HO O O O HO O O O (a) (b) Figure 11. dans un réacteur de 1 litre équipé de cinq cols.3. (b) greffage des monomères méthacrylates sur les sites radicalaires.1. II.O et sur le rendement qui est défini comme le rapport de la masse finale de copolymère sec obtenu à la masse initiale du polysaccharide et de monomère acrylique introduit dans le milieu réactionnel. la réaction peut être considérée comme achevée lors que le pH ne varie plus. conduisant à la formation d’un radical libre.

Photo du montage de la réaction de synthèse II. Les composés de poids moléculaire inférieur au seuil de coupure de la membrane utilisée sont éliminés. En effet. la dialyse s’effectue dans des membranes de cellulose de porosité 50 kDa (Spectra/Por® 7). Le précipité est alors recueilli et placé dans un boudin de dialyse. lavés deux fois avec 50mL d’EDTA 10-2M à pH 4. la présence d’impuretés.1. Les différents copolymères sont donc purifiés par dialyse. Toutes les autres synthèses ont été réalisées dans les mêmes conditions de température et pendant la même durée sous atmosphère inerte (argon ou azote).5. Cérium (IV) Azote Réfrigérant Monomères pH-mètre 40°C Réacteur à cinq cols Figure 12.5. Cette technique permet de séparer les molécules selon leur poids moléculaire grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables dont les pores permettent aux particules de petite taille de diffuser à travers la membrane. le suivi de la conductivité permet d’observer l’avancement de la purification. Ces boudins sont ensuite posés dans 2L l’eau distillée durant 24h sous agitation.1. Dans le cas présent.4.8 pour éliminer le cérium. La dialyse Les copolymères obtenus. cette solution est verséee goutte à goutte dans environ 300 mL de méthanol pour obtenir un précipité que l’on laisse ensuite reposer pendant 4h. Purification des copolymères II. Le renouvellement de l’eau de dialyse s’effectue toutes les 2 heures. des chaînes de polysaccharide et des monomères qui n’ont pas réagi peut perturber certaines analyses. Des boudins de 25 cm de long sont remplies avec 50 mL de solution de copolymère à purifier et mises à dialyser sous un filet d’eau du robinet pendant 24h minimum. suivit de plusieurs 50 . Ainsi les échantillons sont centrifugés. les molécules de taille plus importante sont conservées à l’intérieur de la membrane.4.Matériels&Méthodes un volume d’environ 20 mL.1. nécessitent une purification avant d’être analysés.

Les lavages sont arrêtés lorsque la conductivité de l’eau est constante et proche de 0. afin d’éliminer tous les homopolymères méthacrylates formés. Les échantillons dialysés sont congelés à -80°C pendant 1h puis placés dans le lyophilisateur (Telstar Cryodos) dans des conditions permettant la sublimation des molécules d’eau (température d'environ –50°C et pression de 1mBar).4. Après une nuit de lyophilisation les échantillons récupérés se trouvent sous forme d'une poudre complètement anhydre. le copolymère pur obtenus est séché sous vide puis pesé.Matériels&Méthodes lavages à l’eau distillée. Photo Extracteur de soxhlet 51 . II.5g de produit séché est purifié à l’acétone dans un extracteur Soxhlet pendant 24h.3.1. Les échantillons purifiés sont congelés avant d’être lyophilisés. Une étape de lyophilisation permet d’éliminer l’eau des échantillons par congélation et sublimation.5. 0. La lyophilisation La réalisation de certaines analyses nécessite des échantillons en phase solide. Les mêmes conditions réactionnelles et les mêmes méthodes de purifications que précédemment ont alors été utilisées pour réaliser d’autres synthèses avec d’autres polysaccharides et/ou d’autres monomères méthacrylates.2. Extraction des homopolymères acryliques Un essai réalisé préalablement avec un mélange physique de dextrane et de PMMA (50% : 50% w/w) nous a permit de déterminer la durée de séparation des deux homopolymères par la méthode du Soxhlet (Behr Labor Technik) figure 13. La durée minimale trouvée est de 6h. Vapeur d’ d’acé acétone Acé Acétone condensé condensé Figure 13.4.1. II.5.

pressé à 15 tonnes durant 4 minutes puis stocké à 45°C à l’abri de l’humidité. la différence de flux de chaleur entre un creuset contenant l'échantillon et un creuset référence alors que ces derniers sont tous deux soumis à une même rampe de température. II.3. L’infrarouge a transformée de Fourier La spectroscopie Infra-Rouge est applicable à tous types de composés (film de polymère. auquel cas les deux températures de transition vitreuses (Tg) seraient 52 . II.1. c’est à dire que la polymérisation du méthacrylate ne se ferait qu’aux extrémité des chaînes de polysaccharide.2. ou dans le THF deutéré (pour le PMMA). qualité infrarouge. Les déplacements chimiques propres à chaque composé sont exprimés par rapport au tétraméthylsilane (TMS). Grâce à cette technique il est possible de trancher entre deux hypothèses : soit le copolymère obtenu est un copolymère à blocs. Analyse thermique différentielle Des mesures calorimétriques ont été réalisées sur une DSC (Differential Scanning Calorimeter) Setaram DSC131. Dans le cas des copolymères. Il est également possible de calculer la concentration relative des composants d’un copolymère en traçant une courbe d’étalonnage du mélange des deux homopolymères.2. Unity Inova 500 MHz).2. les tubes RMN sont remplis de 50 mg d'échantillon dissous dans D2O (pour le dextrane). Chaque spectre est le résultat du cumul de 32 incrémentations afin de diminuer le bruit de fond. Les échantillons sont analysés par spectroscopie RMN du proton (1H RMN) et du carbone (13C RMN) à l’aide d’un spectromètre (VARIAN. Ces pastilles sont analysées à l’aide d’un spectrophotomètre infrarouge à transformée de Fourier (Perkin Elmer 1600). Les polymères synthétisés sont solubilisés dans les solvants deutéré. Les techniques de caractérisation des copolymères II. on réalise des pastilles de 150 mg de KBr (bromure de potassium. Tous les spectres sont analysés par le logiciel Thermo Nicolet. La résonance magnétique nucléaire La spectroscopie RMN est un outil indispensable. la DSC est un bon moyen d’analyse de mise en évidence du type de greffage. le mélange est séché sous vide à 45°C pendant 6 heures. L’échantillon est mélangé au KBr et broyé. Cette technique est plus souvent utilisée pour vérifier la structure d’un produit que pour l’identifier. Afin d’identifier certains groupements chimiques présents sur les polymères et les copolymères. poudre ou liquide). Fluka) à 1% en masse d’échantillon à analyser.Matériels&Méthodes II. pour la détermination structurale des polymères synthétisés.2.2. ou bien dans le DMSO deutérié (pour le copolymère dextran-PMMA). En pratique le principe consiste à mesurer.

La relation entre la viscosité intrinsèque et la masse moléculaire M est calculé grâce à la relation de Mark-Houwink : [η] = K. Viscosimètre de type Ubbelohde 53 .4.3% . Une pression est appliquée dans le tube de droite pour faire monter le liquide à travers le capillaire centrale vers les olives inférieure et supérieure. Une courbe étalon est tracée à l’aide de la viscosité du dextrane de masses 10.4% . Les concentrations choisies sont comprises entre 0. avec des rampes de montée en température de 10°C/min sous azote.8% et 1%.5 mL de DMSO. Mesure de la viscosité La viscosité des solutions organiques des différents copolymères obtenus est mesurée dans un viscosimètre de type Ubbelohde. Ce viscosimètre possède un réservoir communiquant avec trois tubes : un capillaire au centre et un tube de chaque côté. 0. 0. 0. Le réservoir contient une quantité suffisante de liquide (environ 5 mL). [η] Représente la viscosité intrinsèque. Tous les échantillons ont subi deux passages.1 et 1% (m/v) pour cela on prépare une solution mère à 2 % soit 0. placés dans des creusets en aluminium percés ont été chauffés de -100 à +200°C.6% .4 mm.1% .25g pour 12. 70. 80. II.Ma où K et a sont des constantes caractéristiques de la macromolécule. Figure 14. elle est déterminée à partir d’une régression linéaire.7 et 264 kg/mol. soit l’amorçage de la polymérisation se fait tout au long de la chaîne de polysaccharide conduisant à un polymère greffé de type « peigne » auquel cas une seule Tg intermédiaire est observée. Le liquide s’écoule librement et le temps d’écoulement entre deux repères est mesuré. 0. Des échantillons de 50 mg. (figure 14). les ouvertures sont remises à pression atmosphérique. Le capillaire choisi a un diamètre de 0.Matériels&Méthodes visibles en DSC . 0. 40.2% . 0. Cette technique a été utilisée afin d’étudier la température de transition vitreuse (Tg) pour caractériser le greffage des monomères méthacrylates sur les polysaccharides. Une fois que le liquide se trouve dans l’olive supérieure. À partir de cette solution des dilutions sont faite pour obtenir les concentrations (m/v) suivantes : 0.2.5% .

3. le débit de 0. 54 . acétone. Les échantillons de copolymères non solubles dans des solvants purs ont été testé avec des mélanges d’eau et de solvants organiques allant de 5%/95% jusqu à 95%/5% v/v. 10 mM phosphate. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement. un polymère soluble se prête mieux à divers caractérisations ainsi qu’à la formation de dépôts minces sur un substrat. à l'aide d'une colonne (TSK GMPWXL. Viscotek.2.0. GB). Le volume hydrodynamique des trois échantillons a été obtenu et comparé après un traitement des donnés par le logiciel (Omnisec 3. diméthyl sulfoxyde. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières.Matériels&Méthodes II. Les échantillons à analyser sont préparés (à 10mg/mL) et élués avec une solution de PBS (137 mMNaCl. De plus.5. dichloromethane. Les trois échantillons (dextrane non traité. leur migration est freinée.1. les propriétés de solubilité d’un composé dans un solvant donné permettent donc de déduire certaines caractéristiques structurales de ce composé.7 mM KCl ) tamponnée à pH 7. Etude de la solubilité des copolymères et réalisation des films La solubilisation d’un composé dans un système donné implique des phénomènes physicochimiques et des interactions inter-moléculaires favorables entre le soluté et le solvant . Tosohaas. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire. GB). Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Dans le cadre de notre étude la CES a été utilisé pour comparer la masse du dextrane 70 kg/mol non traité avec celle du dextrane traité dans les mêmes conditions de synthèse en absence de l’amorceur et du monomère. étalonnée avec des standards de Pullulane. GB). II. La phase mobile est liquide tandis que la phase stationnaire est composée de perles poreuses non absorbantes. 2. Japon). 100µl de l’échantillon sont injectés. traitement pendant 40min et traitement pendant 2h) ont été caractérisés par CES sur gel (détecteurs réfractomètre et viscosimètre. Chromatographie d’exclusion stérique (CES) Cette technique appelée aussi filtration sur gel permet de séparer les molécules en fonction de leur poids moléculaire. Viscotek. agitée pendant 24h à température ambiante pour des tests de solubilités. tetrahydrofurane. dioxane et chloroforme). II. La solubilité des polymères Une quantité de 40mg de polymères séchés est mélangée à 1mL de différents solvants organiques (l’eau. car incluses dans le gel.4.5mL/min est réglé par une pompe (Viscotek GPC max VE2001.3.

La taille des disques de copolymère obtenus est de 2 cm2 qui correspond parfaitement à la taille des plaques de 24 puits. 55 .Matériels&Méthodes II. des « mini-éprouvettes » sont fabriquées à partir de polymères lyophilisés solubilisées dans un mélange THF/H2O. Le système est laissé à température ambiante. Une quantité de 20 mg de copolymère solubilisé dans 0.2. Les solutions sont coulées dans des moules rectangulaires en aluminium d’une géométrie de 2cm sur 0. avec une très haute résolution pouvant aller jusqu’à la résolution atomique.4. est un outil indispensable pour la caractérisation et l’étude des propriétés fondamentales des structures de basse dimensionnalité. L’utilisation de l’AFM permet d’analyser la topographique tridimensionnelle des surfaces.5cm. Les éprouvettes sont découpées afin d’obtenir des films d’une longueur de 1. Caractérisation et analyse des films de copolymères II. Des acquisitions d’images topographiques et d’image de phase ainsi que les mesures de rugosité sont obtenues en utilisant le logiciel WSxM version 3. elle est de l’ordre de 0. Par ailleurs le recyclage des films par dissolution dans le même solvant est possible.035cm. Tous les films sont ensuite séchés 24h dans une étuve ventilée à 30°C. les films de copolymères sont préparés dans les mêmes conditions et sont déposés dans des cristallisoirs en verre de 16mm de diamètre. Toutes les surfaces ont été étudiées en mode semi-contact (tapping) pour une analyse morphologique de surfaces de 10 x 10 µm2. II. L’épaisseur des films est mesurée par un micromètre.5cm et d’une largeur de 0.4. Le moule contenant le copolymère solubilisé est placé dans une cloche en verre sous une atmosphère contrôlée suturée en THF et en présence de CaCl2 afin d’absorber l’eau.5mL du mélange de solvants est nécessaire compte tenu des pertes ayant lieu sur les paroi des moules.3. Préparation des films de polymères Pour les films destinés à des tests mécaniques. les films de copolymères sont récupérés par un démoulage dans un bain à ultrason. Détermination de la topographie des films par Microscopie à Force Atomique La Microscopie à Force Atomique (AFM pour Atomic Force Microscopy). après 24h.5cm. Pour servir de supports à la culture cellulaire. des films d’homopolymères. Les homopolymères méthacrylates solubilisés dans du THF pur ont permit d’obtenir des films utilisé en tant que témoin. Les mesures de rugosité ont été effectuées avec cette technique sur des films de copolymères. L’observation des films et des stents en AFM oblige à la fixation des échantillons sur des supports en verre.1. des stents nus et des stents enduits de polymères à l’aide d’un microscope à force atomique (Nanoscope III Digital instruments dimension 3100). Aucun film ne peut être obtenu avec les polysaccharides.

125g . Le rapport des deux modules (tan δ= E"/ E') est appelé facteur de pertes.Matériels&Méthodes II. on observe aux environs de la Tg calorimétrique un pic de tan δ (T) et une diminution abrupte du module élastique (E'). on peut définir le module de Young complexe (E* =E'+iE"). II. La partie imaginaire E". Les films de copolymères de 15mm de longueur.0 °C/min de-100 à +200°C et une déformation dynamique de l’ordre de 0. La déformation des films est suivit par prise de photos chaque minute jusqu'à la rupture. II. largeur de 5mm et d’une épaisseur de 0.4. Propriétés mécaniques des copolymères La connaissance des caractéristiques mécaniques des copolymères synthétisés est nécessaire afin de déterminer le comportement des revêtements après enduction des stents. appelée module élastique. Dans notre étude et afin de tester les différents films de polymères plusieurs charge 100g . Les mesures mécaniques dynamiques sont réalisées en traction en utilisant un appareil DMA Q800 (TA instruments). Dont la partie réelle E'. 5mm de largeur et 0.035mm d’épaisseur globale. sont testés en mode isochrones (1Hz) lors d’une chauffe à une vitesse de 3. et dans les limites de la réponse linéaire.4.2. la phase quasi élastique réversible : le film de polymère peut revenir dans son état initial lorsqu’il n’est plus sollicité. Des courbes sont tracés pour le pourcentage de déformation en fonction du temps. Ainsi pour un polymère entièrement amorphe. caractérise le comportement visqueux du matériau.2. Dans ce travail. 150g et 175g sont suspendus à l’extrémité des films de longueur de 15mm. 56 .035mm.2 Analyse mécanique dynamique (DMA) Une des manifestations les plus spectaculaires de la transition vitreuse est la variation des propriétés mécaniques qui surviennent aux environ de Tg.1. et la phase irréversible : le film de polymère ne peut plus revenir dans son état initial et la rupture apparaît au terme de cette phase. lorsqu’on sollicite le matériau par une contrainte cyclique (sinusoïdale).2.4. En effet. Une des techniques de mesure très répandue est de tester la réponse du matériau à une déformation périodique de fréquence constante tout en imposant une montée en température.03%. il existe deux phase successives pour la réponse contrainte-déformation. Tests de fluage Le film de polymère répond à une contrainte par une déformation. appelée module de perte. traduit le comportement élastique conservatif du matériau.

Il est utile d’évaluer la tenue du revêtement de polymère sur le stent dans des conditions qui s’approchent de celles qui seront subies au moment de la pose au bloc opératoire. θ < 90° θ > 90° Caractère hydrophile Caractère hydrophobe Figure 15. Le recouvrement de ces stents par les copolymères se fait par immersion.5mm et d’une longueur de 23mm. Ireland) d’un diamètre interne expansé de 3. Le sertissage des stents recouverts de copolymère séché sur ballonnet se fait dans l’eau afin de protéger le revêtement.3. Les angles de contact sont mesurés à partir de 5 gouttes déposées en différents endroits sur chaque échantillon considéré. L’expansion se déroule également en immersion dans l’eau : le ballonnet est gonflé à une pression de 4 bars puis dégonflé et le stent déployé est recueilli pour analyser la tenue du revêtement en copolymère. Pour chaque matériau.4. Un mouvement de rotation axial est effectué pendant l’enduction. qui permet une mesure automatique des angles de contact. Enduction des stents par les copolymères Tous les stents utilisés dans cette étude sont des stents en acier 316L (Guidant. Les résultats correspondent à une moyenne sur l’ensemble de ces mesures. Les stents déployés sont introduit verticalement dans une solution de copolymère solubilisé préalablement dans le mélange THF/H2O pendant 20 secondes à température ambiante. Ils sont mesurés sur un côté de la goutte d’eau déposée (2µL). Pour cela les angles de contact sont mesurés par un appareil Krüss. Mesure de l’angle de contact sur les différents films de polymères La mesure de l’angle de contact θ entre une goutte d’eau pure et une surface plane et propre permet de déterminer la mouillabilité de surface du matériau.Matériels&Méthodes II. c'est-à-dire dans une atmosphère saturée en THF et en présence du CaCl2 pendant une nuit. model DSA 10. Cet instrument comprend un logiciel. Plus l’angle de contact est élevé plus le matériau a un caractère hydrophobe figure 15. Les stents sont ensuite extraits et séchés dans des conditions contrôlées. 57 . 3 surfaces préparées de façon indépendante sont utilisées. Angle de contact II.Mk2.5.

Matériels&Méthodes II.5.1. Analyse des surfaces de stents enduits II.5.1.1. Par microscopie optique Les surfaces de stents enduits sont observées à l’aide d’une loupe binoculaire. Elles sont aussi observées par un microscope optique à transmission Zeiss Axiovart100. Pour le revêtement utilisant le dextran-FITC, l’observation est effectuée au microscope à fluorescence. Le traitement des images est effectué au moyen du logiciel Adobe Photoshop.

II.5.1.2. Par microscopie électronique à balayage (MEB) Si à l’échelle macroscopique les films semblent toujours uniformes et sans défaut leurs microstructures peuvent être hétérogènes et sous forme d’agrégats. La microscopie électronique à balayage peut être une bonne technique afin d’examiner la microstructure du films ou du revêtement de stent. Pour cela des examens des surfaces des stents et des films de copolymères ont été réalisés à l’aide d’un microscope électronique à balayage (Leica S-440, Grande Bretagne). Pour les rendre conductrices les surfaces des échantillons sont recouvertes d’une fine couche métallique d’or-palladium de 2 nm déposée par évaporation cathodique au moyen d’un métalliseur (Polaron, Grande Bretagne).

II.6. Evaluation biologique Si les méthodes physico-chimiques permettent de caractériser la composition chimique et les caractéristiques physiques des copolymères synthétisés, l’analyse du comportement cellulaire induit par ces matériaux offre des informations capitales sur le devenir de ce dispositif. L’analyse in vitro avec des tests de culture cellulaire permet de déterminer les effets des différents films de copolymères sur l’adhésion et la prolifération cellulaire. Nous ne nous intéressons qu’au système vasculaire faisant intervenir l’adhésion et la prolifération des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses.

II.6.1. Lignées cellulaires La ligné de cellules endothéliales HUVECs (cellules endothéliales humaines issues de veine de cordon ombilicale) utilisées pour réaliser les tests de cultures cellulaires provient de l’American Type Culture Collection (ATCC). Les cellules musculaires lisses (CMLs) utilisées appartiennent à une lignée nommée RB1 qui est issue du lapin.

II.6.2. Milieux de cultures Tous les milieux et additifs, y compris le sérum, utilisés en culture cellulaire ont été obtenus auprès de la société Gibco. Les cellules endothéliales (HUVECs) et les cellules 58

Matériels&Méthodes musculaires lisses (CMLs) sont cultivées dans du milieu de culture DMEM (Dubbelco's Eagle Medium) additionné de 10% de sérum de veau fœtal, de 2% de L-glutamine (concentration finale : 2 mM), et de 1% d’antibiotiques (concentration finale : pénicilline 100 UI.mL–1, streptomycine 100 µg.mL–1) (toutes les proportions étant exprimées en rapport volumique). Les cellules sont cultivées à 37°C dans un incubateur Heraeus, sous atmosphère humide à 5% de CO2.

II.6.3. Entretien des cellules en culture II.6.3.1. Décongélation des cellules Les cellules HUVECs et les cellules CMLs sont décongelées de façon très rapide pour augmenter la viabilité cellulaire. Le cryotube est réchauffé rapidement dans un bain-marie à 37°C, puis avant même la complète décongélation, les cellules sont transférées dans un tube à centrifuger, contenant 10 mL de DMEM à 10% de SVF. Les cellules sont centrifugées pendant 3 minutes à 150 G (1000 T/min, R = 134 mm), le surnageant est ensuite éliminé et les cellules sont re-suspendues dans 15 mL de DMEM à 10% SVF et transférées dans un flacon à bouchon ventilé de 75 cm2 (Costar). Le milieu est changé le lendemain afin de débarrasser la culture des cellules mortes et non adhérentes.

II.6.3.2. Passage des cellules La confluence des cellules est atteinte en 4 à 5 jours, il est nécessaire pour entretenir la culture d'effectuer une récolte des cellules par trypsinisation et réensemencement dans d'autres boîtes de culture (chaque trypsinisation correspond à un passage). Pour effectuer un passage le milieu de culture est aspiré puis les cellules sont rincées 2 fois avec du milieu PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite la trypsine (trypsine/EDTA 1:250) est ajoutée à raison de 3 mL pour une boîte de 75 cm2, puis les cellules sont placées dans l'incubateur au maximum pendant 3 minutes. On peut alors frapper latéralement sur la boîte pour décoller toutes les cellules et homogénéiser à la pipette la suspension cellulaire. Du milieu de culture contenant 10% SVF est ajouté pour inhiber l'action de la trypsine et une fraction correspondant à 1/10 de cette nouvelle suspension cellulaire est alors placée dans une nouvelle boîte de culture contenant déjà 10 mL du milieu de culture à 10% de SVF.

II.6.3.3. Congélation et création de stocks de cellules Les cellules en phase exponentielle de croissance sont rincées rapidement deux fois avec du milieu de culture de base sans sérum puis détachées par action de la trypsine (3 mL de trypsine pour une boîte de 75 cm2) pendant 3 minutes à 37°C. La trypsine est inhibée par 59

Matériels&Méthodes addition de milieu DMEM à 10% de SVF (7 mL de milieu complet sont ajoutés). La concentration de cellules dans la suspension est évaluée par comptage avec un Coulter Counter ZM (Coultronics) et centrifugée à 150 G (1000 T/min) à température ambiante pendant 3 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot est mis en suspension dans du SVF contenant 10% de DMSO (diméthylsulfoxyde testé pour la culture cellulaire, Sigma) à raison de 2.106 cellules/mL. Cette suspension cellulaire est aliquotée à raison de 0.5 mL dans des cryotubes (106 dans chaque cryotube) et ensuite congelée à – 20 °C pendant 2h puis à – 80°C. Grâce à ce lent refroidissement les cellules se contractent en éliminent leur eau et seul de la glace extracellulaire est formée. Le stock ainsi constitué est conservé au congélateur à –80 °C.

II.6.4. Préparation des films de polymère à la culture cellulaire Les films de copolymère sous forme de disques de 16mm de diamètre sont séchés dans une étuve ventilée à 50°C, puis pour extraire toute trace de THF susceptible d’influer sur la réponse cellulaire, les disques sont maintenus sous vide à 50°C dans une étuve pendant 24h minimum. Pour les films de l’homopolymère PBMA qui nous ont servi de témoin, la culture cellulaire est faite directement dans les cristallisoirs car ces films sont très fragiles et cassants.

II.6.4.1. Lavage et stérilisation des films de polymère Avant toute expérience de culture cellulaire, les supports sont abondamment lavés à l’eau distillée stérile pendant 3 jours minimums, l’eau est changée chaque jour. Ensuite les films de polymères sont stérilisés pendant 15 min pour chaque face sous rayonnement ultraviolets à 254 nm et conservé dans du PBS stérile à température ambiante pour prévenir d’éventuelles contaminations. Tout au long de cette étape les disques sont maintenus sous agitation.

II.6.4.2. Conditionnement des films de polymères à la culture cellulaire Afin de tester la prolifération des cellules HUVECs et des CMLs sur les différents films, les polymères synthétisés sont conditionnés. La veille de l’ensemencement, les films de polymères sont placés au fond des plaques de 24 puits. Ayants le même diamètre que les puits, les disques se maintiennent par effet ventouse au fond des puits. La face choisie pour servir de support aux cellules est la face qui n’a jamais été en contact avec le moule lors de la formation des films. Les films mis en place sont alors incubés dans du milieu de culture complet. Cette étape est nécessaire pour s’assurer d’un équilibre en ions et en protéines entre le milieu et la surface des polymères. Tous les autres supports (pions d’acier 316L, stents) utilisés dans la culture cellulaire ont été traités de la même manière. 60

Matériels&Méthodes II.6.4.3. Ensemencement des cellules sur les films de polymères Les cellules HUVECs et CMLs sont détaché d’une ou plusieurs boîte de culture et réunies en une seule suspension pour chaque type cellulaire. 0.5 mL de la concentration cellulaire obtenue sont rajoutés à 9.5 d’Isoton II. Le comptage des cellules est réalisé à l’aide du compteur de cellules (Coulter Counter ZM). Les films de copolymères stérilisés et conditionnés pour la culture cellulaire sont déposés au fond de boîtes de 24 puits. Les cellules sont ensemencées à une concentration de 5000 cellules/puits, le volume de chaque puits est complété à 1mL avec le milieu complet et les plaques sont alors ranger dans l’incubateur. Des puits vierges sont utilisés comme témoins. La viabilité des cellules est évalué par un test d’exclusion au bleu Trypan (Gibco), 100µL de suspension cellulaire sont mélangés à 100µL de solution de bleu de trypan, les cellules mortes sont perméables au colorant et deviennent bleu. Une goutte du mélange est déposée sur un hémacytomètre de Malassez. Observée sous le microscope inversé, cette grille de numération permet de déterminer la proportion de cellules mortes dans la suspension qui doit être inférieure à 10%.

II.6.4.4. Cinétique de prolifération des cellules sur les différents supports La prolifération des cellules est effectuée sur 5 jours et le nombre de cellules par puits est compté chaque jour. Le comptage des cellules ayant adhéré et proliféré sur les différents supports (films et pions en acier 316L) a lieu au bout de 1 ; 2 ; 3 ; 4 et 5 jours d’incubation à 37°C. Pour ce faire, les supports contenus dans deux puits sont rincés deux fois avec du tampon PBS. Les cellules sont décollées des supports par action de 500µl de Trypsine-EDTA. Cette solution est ajoutée à 9.5mL d’isoton et les cellules sont comptées à l’aide du compteur de particule. Une courbe représentant le nombre de cellules détachées des supports en fonction du temps d’incubation est alors établie.

II.6.4.5. Comptage des cellules Les comptages des cellules sont effectués à l’aide d’un compteur de particule (Coulter Counter ZM - Coultronics). Pour cela les cellules sont détachées par incubation avec la trypsine pendant 2mn, placées dans un milieu de culture ne contenant pas de sérum de veau fœtal. 500µL de suspension sont ajoutés à 9.5mL d’Isoton II, une solution à la fois isotonique et conductrice (Coultronics). Cette nouvelle suspension est dénombrée grâce à un compteur de particule qui prélève le milieu par 500µL. une multiplication des valeurs du compteur par 40 permet d’obtenir le nombre des cellules par mL de solution.

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L’observation des cellules nécessite leur coloration par un produit fluorescent. Le premier cliché. 62 .6. diagnostic instrument inc. Les photos sont prise par une caméra (spot. puis perméabilisées dans du Triton x 100 à 0. effectué avec un filtre laissant passé la fluorescence rouge.4 mm de largeur est pratiquée à l’aide d’une pointe de micropipette.7. Cette vitesse est comparée à celle observée sur le fond de puits des plaques de culture cellulaire (polystyrène ayant subit un traitement de surface). 24h . Au bout de 5 jours. révèle le cytosquelette des cellules.4. La migration cellulaire est exprimée sous la forme d’un histogramme présentant la surface restant dénudée en fonction du temps. Zeiss) et sont analysé par un logiciel de traitement d’images (image-Pro Plus). Des mesures de la surface envahie par les celles sont réalisées à l’aide du logiciel image-Pro Plus.6. Les photos de l’encoche sont prises au même endroit à 0h . Le même nombre de cellules est ensemencé directement sur fond de puits pour servir de référence.1% (v/v) dans du PBS pendant 5 minutes.) associer à un microscope à fluorescence (Axiolab HBO50. 48h et 56h. Les cellules sont observées en microscopie optique (x 10) et photographiées à l’aide d’un appareil photo numérique. Les images présentées résultent de la superposition des deux clichés. une blessure de 0. 8h .Matériels&Méthodes II. Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS et incubées dans le milieu DMEM complet. les cellules étant à confluence. 32h . Le second cliché réalisé avec un filtre perméable à la fluorescence bleu montre l’ADN des cellules (noyau) coloré en bleu. Les filaments d’actine sont visualisés grâce à un marquage avec une solution phalloïdin FluoProbes547 (Interchim) 5% (v/v) dans du PBS pendant 20min à température ambiante et à l’abri de la lumière.6. Evaluation de la migration des HUVECs sur films de copolymère DB et sur fond de puits L’évaluation de la migration des cellules HUVECs sur des films de copolymères DB (dextrane-graft-polybutylméthacrylate) est basée sur les mesures de la vitesse de colonisation in vitro d’une surface du copolymère. Observation des cellules sous microscope à fluorescence Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope à fluorescence pour tous les supports opaques (stents et pions en acier 316L). Des cellules HUVECs (5 x 103 cellules) sont ensemencées sur un film DB placé au fond de plaque de 24 puits.4. Les noyaux des cellules sont marqués avec du DAPI (20g/mL) pendant 20 minutes à température ambiante et à l’abri de la lumière. II. Les cellules lavées une fois avec du PBS sont préincubées avec du BSA (Sigma) 1% (v/v) dans du PBS pendant 30min afin de diminuer le bruit de fond. Pour cela les cellules adhérentes sur le matériau sont rincées avec du milieu de culture sans sérum avant d’être fixées dans une solution de 10% (v/v) formaldéhyde pur (Sigma) dans du milieu sans SVF pendant 10 minutes à 4°C.

les boîtes contenant des stents sont incubées à 37°C. 1mL de milieu de culture complet est ajouté. L’adhésion et la prolifération des cellules HUVECs sur stents Une étude de comparative de la prolifération des cellules HUVECs sur des stents nu et des stents enduits de copolymère DB a été réalisée. Stérilisés par exposition au rayon UV à 254 nm pendant 30 min.8.4.Matériels&Méthodes II.6. 63 . Des cellules HUVECs sont ensemencées à raison de 5 x 105 cellules par stent. Les stents recouvert de DB copolymère sont déposés au fond des plaques de culture cellulaire. Après 3 jours les cellules sont fixées sur les stents marquées à la phalloïdin et au DAPI et sont observées et photographiées sous microscope à fluorescence.

64 .

Premier article III. Résultats 65 .

66 .

Ils possèdent des propriétés biologiques intéressantes. Dans cet article nous présentons donc. Leur modification chimique est donc une voie afin de leur conférer des propriétés mécaniques améliorées. Ainsi. la concentration de l’amorceur (cériumIV) et la concentration du monomère méthyle méthacrylate.1. il est soluble dans un mélange eau/THF (20/80). ni dans le THF.Premier article III. Ceci est compatible avec une augmentation de la masse due à un greffage de chaînes de MMA sur le dextrane. Le taux de dextrane dans le copolymère est de l’ordre de 30%. le milieu devient laiteux et il y a formation de polymère. D’autre part. Introduction au premier article Les polysaccharides sont une source importante de structures macromoléculaires. le greffage réalisé dans ce travail par des polymères méthacryliques pourrait conduire à de nouveaux biomatériaux aux propriétés innovantes. de même pour l’analyse RMN. l’échantillon a été soumis à une analyse infrarouge. Afin de mieux maîtriser les paramètres de greffage. le milieu reste limpide en l’absence de polysaccharide et il a été impossible d’obtenir un polymère. mais leurs propriétés mécaniques sont médiocres. Ce qui nous a permis de réaliser des films dans des conditions contrôlées (sous une atmosphère saturée en THF et en présence de CaCl2). Dans une seconde partie. Il est intéressant de 67 . mais en revanche. La viscosité intrinsèque du copolymère final est supérieure à celle du dextrane du départ. les tests de solubilité révèlent que le copolymère obtenu n’est soluble ni dans l’eau. Une partie importante a consisté à mettre au point les paramètres de la technique de greffage par copolymérisation radicalaire de polyméthyleméthacrylate sur le dextrane afin de servir de modèle de synthèse pour l’utilisation d’autres monomères méthacryliques et d’autres polysaccharides. Dans une première partie et afin d’identifier la nature et la composition du produit synthétisé. Dans l’étude des conditions de polymérisation en solution aqueuse. une analyse RMN et une étude de viscosité. La spectroscopie infrarouge du copolymère révèle à la fois des bandes caractéristiques du dextrane et les bandes caractéristiques du polyméthyleméthacrylate. Une analyse d'images sur des microphotographies MEB permet de déterminer l’homogénéité des films. une nouvelle technique de réalisation de films de copolymère qui a été développée dans le but de tester la biocompatibilité de ce nouveau biomatériau. Ils sont généralement solubles dans le milieu aqueux. d’une part la technique de greffage et la caractérisation du copolymère dextrane-graft-polyméthyleméthacrylate (DM). et ne peuvent donc généralement pas former directement de films stables. une approche expérimentale a consisté à faire varier la quantité du dextrane (de masse molaire 70 kg/mol). puis toute une série de purification du produit obtenu afin d’être caractérisé. À l’inverse. en présence du dextrane.

la DSC (analyse calorimétrique différentielle) et la DMA (analyse thermomécanique). nous avons constaté que les films de copolymère dextran-graft-polyméthyleméthacrylate sont biocompatibles et aucune différence n’est observée par rapport à la culture témoin. Alors que pour un mélange physique des deux polymères. une seule Tg apparaît s’il y a réellement une liaison covalente entre le dextrane et le polyméthyleméthacrylate. aucune séparation de phase n’a pu être observée alors que les deux polymères impliqués sont réputés incompatibles. en utilisant. pour les tests de cytocompatibilité. il est observé deux Tg distinctes. de façon complémentaire deux techniques d'analyses. Enfin.Premier article noter la microstructure homogène et monophasée des films de copolymère puisque. Ces deux techniques sont utilisées pour caractériser le type de greffage et confirmer l’existence d’une liaison covalente entre les deux constituants. D’après cette étude. Dans la troisième partie. même à un grossissement important. des cellules endothéliales humaines ont été ensemencées directement sur les films de copolymère. Nous avons proposé que les macromolécules obtenues avaient une structure de greffage en peigne mais des caractérisations plus approfondies sont nécessaires (collaboration Amélie Labbé au laboratoire). 68 . nous nous sommes intéressés au comportement thermomécanique du copolymère.

D. Institut Galilée. 99 Av. J.Premier article III. Université Paris 13.univ-paris13. PhD Inserm. Derkaoui. U698.fr 69 .1. Letourneur* INSERM. Université Paris 13. 93430 Villetaneuse. Barbaud. C. U698. Premier Article Synthesis and characterization of a new polysaccharide-graftpolymethacrylatecopolymer for 3D hybrid hydrogels S.M. Institut Galilée.-B. Avramoglou. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires.1. T. Clément.letourneur@galilee. France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier. 93430 Villetaneuse. France * Correspondence to: Didier Letourneur. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires.

and viscosimetric analysis. and a marked difference with the two homopolymers. 13 C nuclear magnetic resonance spectroscopy. Interestingly. thermomechanical properties 70 . The thermo-mechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass transition temperature. In conclusion. Keywords : dextran. the copolymer but not dextran or PMMA could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). Fourier transform infra-red spectrometry. The obtained polymers were studied by solubility measurements. proliferation and morphology after 5 days in culture on these gels. Indeed. a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran using ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion. we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. acrylic monomer and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail. methyl methacrylate. The effects of concentrations of dextran. copolymer. In this context. this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as 3D scaffold or for coating in biomedical applications. biocompatible materials.Premier article Abstract Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications.

The present work describes a simple and reproducible method to synthesize new amphiphilic materials that are suitable for biomedical applications. followed by distilled water. For instance. Dextran also allowed easy chemical substitutions for the coupling on or the mimicking of biological molecules 10. Products Dextrans of different molecular weights (MW in kg/mol: 10. Ammonium cerium (IV) nitrate (Acros 71 . Methyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were purified by washing with 5% NaOH and 20% NaCl. In fact. The different parameters (concentrations of initiator. we used dextran for the graft copolymerization of an acrylic monomer with ceric ammonium nitrate for initiator. 2. 40.1. The aim of our study was to obtain hybrid materials in which the physicochemical and biological properties of the two components are well combined. Other investigators have used this strategy with heparin. 70. However. Introduction Polymers are widely used for their tailor-made properties and represent the largest class of materials for biomedical devices such as vascular grafts 1. it would be advantageous to combine hydrophilic and hydrophobic polymers to develop biomaterials for drug delivery. Experimental section 2. the hydrophobic part of the polymer may act as drug carrier.7. In this study. Dextran (70 kg/mol) was also used for synthesis (see below). we synthesized grafted amphiphilic copolymers and make homogenous 3D structures endowed of viscoelastic properties. acrylic monomer and dextran) and conditions of solubilization allowed us to obtain 3D structures compatible with human cells with new hybrid thermomechanical properties.Premier article 1. both polyacrylate and polysaccharides are already used in preclinical or clinical applications polysaccharides. Indeed. We used an acrylic monomer for the hydrophobic structure and polysaccharide as a hydrophilic part. dextran or carrageenan 30-34 . Indeed. It was dried in vacuum oven at 60°C for 24 h. 80. Among the wide family of and dextran 20-23 have largely demonstrated interesting properties for the use in biomaterials. drug delivery system 2. the development of new biocompatible polysaccharide materials is still an intense area of research in the field of polymeric biomaterials . resorbable implants 3. 264 kg/mol) were purchased from Sigma for molecular weight assessment.27-29 24-26 . heparin 16-19 12-15 . and matrices for tissue engineering and coating of biomaterial surfaces 4-7. while the hydrophilic part ensures biological interactions. For coating purposes. combining the advantageous properties of natural and synthetic polymers is often a challenge because of the immiscible features of such polymers 8-11. such hybrid polymers must be stable and resist deformation. In this context.

the reaction product was allowed to cool at ambient temperature. the product was poured into 200 mL of methanol to induce precipitation. The mixture was raised at pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10 M) and concentrated with a rotavapor. Dried samples (1. The particle suspensions were dialyzed under water for 48 h. Solvents were of the highest commercially available purity. 5 mL of solution of Ce(IV) (2. 72 . After the complete dissolution of the polysaccharide to form a homogeneous solution (10 min). Graft copolymerization we synthesized the copolymers by varying the concentrations of dextran and ammonium cerium(IV) nitrate and the concentration of acrylic monomer in the reaction mixture by radical polymerization with ceric ion/nitric acid redox initiator in aqueous medium 35-38 .2.3. 2.5 g. The purified copolymer was frozen at -20°C and lyophilized for 24 h. PMMA and copolymer DM were recorded by using Varian Gemini 200 MHz spectrometer in deutered dimethyl sulfoxide-d6 at ambient temperature. PMMA and copolymer DM were obtained from a PerkinElmer 1600 spectrometer. Pure copolymer was dried under vacuum and weighted. In the typical reaction.5 mg) were ground with 150 mg KBr powder and pressed into pellets for FT-IR examination. and the flask was immersed into thermostated oil bath and was purged by nitrogen gas. NMR analysis 13 C-NMR spectra of dextran.2. The general experimental procedure was as follows: the reactions were carried out into 1 L five-neck flask equipped with stirrer and condenser. Infra-red spectral analysis The infra-red spectra of dextran. washed twice with 50 mL of EDTA (10-2 M). The obtained copolymer was named dextran-graft-poly(methyl methacrylate) (DM).3.1. 2.000 g of crude dried product was taken and extracted in a soxhlet for 24 h to remove the homopolymers and the remaining products. 70 kg/mol) was dissolved in 500 mL of nitric acid (0. Characterizations 2. dry dextran (0. Exactly 1.4 10-4 mol/L) and 2 mL of methyl methacrylate were simultaneously added to the reaction mixture and after 40 min.Premier article France) was dried at 80°C under vacuum for 24h. 2.2 M) and the reactor was placed in oil bath at 40°C.3. Then. Omnic software was used for data acquisition and analysis. Homopolymer was extracted with acetone. followed by three washes with 50 mL distilled water in order to remove cerium ions and the dextran who did not react.

035 mm were analyzed on dynamic-mechanical analyzer. Before use.4. A morphological analysis of cross-section of films was carried out using a Leica S-440 scanning electron microscope (SEM). 2. Differential scanning calorimetry (DSC) Thermal behavior of polymers (dextran. 2. The equipment was operate in a single cantilever bending mode at 1 Hz in frequency. Dynamic mechanical analysis (DMA) DMA was used to analyze loss modulus. 2. PMMA. Thin films were stripped from the mould and dried in oven at 30°C.5. Viscosity measurements Viscometric measurements were carried out using an Ubbelohde capillary viscometer (0. To obtain discs. operating in combination with the liquid nitrogen cooling accessory. amplitude 5 μm and a heating rate of 3°C/min from -100°C to +200°C. two consecutive scans were carried out on each sample.3. 73 . All 3D structures were extensively washed with water before any biological and mechanical assays. Solutions were prepared by dissolving the copolymer in the same solvent (DMSO).3 mm diameter).Premier article Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard.3. A standardization curve was drawn (viscosity vs molecular weight) with dextrans of various molecular weights dissolved in DMSO. solutions were poured in Petri dishes for 24 h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 to absorb water. 2. all products were lyophilized twice with deuterium oxide (D2O).5. A simple mixture of dextran and PMMA was also used as control. Films of 15 X 5 X 0.2. DMA Q800 (TA Instruments).1. Copolymer DM was dissolved in 1mL of THF/H2O (80/20) treated in ultrasonic bath for 1 h. The furnaceswere purged with nitrogen and samples were passed in temperature range from -50 to 200°C at heating rate of 10°C/min. The glass transition temperature (Tg) of the polymers was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline. In each case. and copolymer DM. storage modulus and tanδ of films obtained from PMMA. DM) was analyzed with a Setaram DSC131 thermal analyzer.5. Dextran could not be used since this polymer gave any film. Thermo-mechanical analysis 2. Dextran gave any 3D structures. The temperature was regulated at 25°C by circulating bath. Preparation of 3D structures Discs or films were prepared using 15 mg of dried homopolymer PMMA solubilized in THF.

We then confirmed by solubility measurements the hybrid property of copolymer DM (Table 2). They were seeded either on tissue culture plates or on the films at a cell density of 5 103 cell/cm2. The cells were incubated for 5 days at 37°C in 5% CO2/95% air in a humidified incubator. Dioxane. lower yields were obtained and solubility of these compounds was not found (Table 1). The optimum conditions for DM 11 were thus kept for the following study. Human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) were obtained from ATCC.5 g/l of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin. Interestingly. the cell morphology on films was directly observed by conventional optical microscopy. In the absence of dextran.7 10-2 mol/L). and led to the formation of suspensions of colloidal particles. 74 . films were sterilized by exposure of each surface sample to UV at 254 nm for 15 min.6. THF). polymerization occurred after 10 min of addition of the Ce(IV) and monomers.2 to 3.1. monomer and initiator have a significant effect on the polymerization with yields ranging from 10 to 50% (Table 1). The reaction conditions affording the maximum percentage of grafting of monomer onto dextran (0. DM 14 and DM 15).2 to 4 10-4 mol/L) and methylmethacrylate (1. The optimum conditions for the polymerization were 143 mmol/L of dextran. no polymer was formed. 3. Cells were cultured with DMEM (Gibco) with 4. The polymerization yields are presented in Table 1.Premier article 2. Chloroform. In all other experiments. With the transparency of 3D structures. HUVEC cell culture For all cell cultures.24 mmol/L of Ce(IV) and 37 mmol/L of methyl methacrylate. copolymer DM was insoluble in most organic solvents (Dichloromethane. Acetone. copolymer DM was insoluble in water. In contrast to PMMA. Results and discussion 3. the compounds DM1 to DM12 were found to be soluble in a mixture of water/THF (20/80 v/v). but was soluble in a mixture of water/THF (20/80). By increasing the dextran content (DM 13. 0. In contrast to dextran.125 to 2 g/L) were determined by varying the concentrations of ceric ammonium nitrate (1. yield was quantified and solubility of copolymer DM was tested. Results showed that the weight of dextran. Copolymerization conditions for dextran graft polymethylmethacrylate (DM) For studying the graft polymerization.

8 3.4 4.7 3.4 4. I: insoluble.7 1.1 7.0 1. Copolymer DM exhibited a broad absorption band characteristic of hydroxyl groups of 75 .8 3.7 3.2 2.4 4.2 2.8 1.0 Yield (%) -2 mol/L x 10 3.1 7.7 3. and copolymer DM (c) are presented on Figure 1.8 1.8 1. and monomer (MMA) Concentrations on yield and solubility of series of Copolymer DMs in water.7 3.3 14.2 2.4 4.7 3.7 1.1 7. THF or a 20/80 (v/v) Mixture of Water and THF reagents copolymer DM Dextran mol x 10 DM0 DM1 DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 DM7 DM8 DM9 DM10 DM11 DM12 DM13 DM14 DM15 0 1.8 1.8 7.7 3. dextran (b).8 1.8 1.8 1. Physico-chemical characterizations of copolymer DM Infrared spectra of pure PMMA (a).0 1.1 7. Water/THF mixtures are v/v 3.3 -6 Solubility in MMA -4 Ce(IV) mol/L x 10 2.2 2.7 H2O THF H2O/THF 20/80(v/v) 0 13 18 17 15 19 11 23 21 19 25 48 37 21 15 11 - - + + + + + + + + + + + + - Table 2: Solubility of the studied polymers in various solvents Polymer Solvents Water DMSO Dichloromethane Acetone Chloroform Dioxane THF Water / THF 10/90 20/80 50/50 Dextran S S PMMA I S Copolymer DM I S I I I I I I I I S S S S S I I I I I I I I I S I S: soluble.2 2.0 1.Premier article Table 1: Effects of dextran.1 7.8 1.7 3.8 1. initiator.1 14.4 4.3 14.2.0 1.4 1.

Premier article dextran at 3400 cm-1. Semiquantitative analysis gave a 20-30% ratio of dextran in DM copolymer. 76 . PMMA and copolymer DM. As reported in literature. The spectra reported on figure 2 for copolymer DM showed the characteristic peaks of PMMA and dextran. we calculated that the copolymer contains 30% of dextran.1. the only common solvent (Table 2) for dextran. all peaks of dextran are located between 65 and 100 ppm. The 13 C-NMR spectroscopy was also used to confirm quantitatively the percentage of dextran in the copolymer. (k) for PMMA (O-CH3) at 55 ppm. Fig. and (j) carbonyl groups (C=O) of PMMA at 180 ppm. b) Dextran . Infrared spectra of polymers : a) PMMA . By comparing peak integrals assigned to dextran and PMMA (the (a)/(j) ratio) in copolymer DM. a chemical shift (a) at 100 ppm who is attributed to the anomeric carbon of glucose unit of dextran. and an additional band of carbonyl groups at 1730 cm-1 of acrylic polymer. the peaks (f) C-CH2 of dextran at 68 ppm. c) copolymer DM The 13 C-NMR spectra were recorded for the copolymer DM in deutered dimethyl sulfoxide-d6 .

48) was higher than the viscosity of the starting 70 kg/mol dextran (η = 0. 13C-NMR spectra of copolymer DM in deutered DMSO Figure 3 represents the intrinsic viscosity versus the known molecular weight of various dextrans in DMSO. Viscometric results obtained with copolymer DM in DMSO 77 .3.Premier article Fig.2. The viscosity of copolymer DM (η = 0.37). The extrapolation of the viscosity value for copolymer DM gave an apparent molecular weight of 140 kg/mol. Fig.

Preparation of 3D structures In contrast to dextran and PMMA. Morphology of DM disc after controlled evaporation (a). In the case of natural evaporation. the resulting films from copolymer DM were found insoluble in water (in contrast to dextran) even after days of immersion. Fig. respectively.3. a simple physical mixture of dextran with PMMA exhibited two distinct transitions (Fig. The morphologies of dry DM films were influenced by the evaporation conditions. In contrast. 5d). 5c).4. SEM image (cross-section) of a thin DM film (b). 3. Thermo-mechanical analysis of copolymer DM The determination of the glass transition temperature was carried out for dextran. Then. homogenous and transparent structures were obtained (Fig. The thermograms are reported on Figure 5. whereas in the case of controlled evaporation for both solvents (THF and water). 5a) and PMMA (Fig. A single Tg was obtained at 126°C for copolymer DM (Fig. PMMA. the solution containing copolymer DM could be molded in Petri dishes after evaporation for 24 h at room temperature as reported in Materials and Methods. 4a). 78 . Interestingly. Scanning electron microscopy provided additional information on morphology. dextran (Fig. Tg of the two homopolymers.4. and were thus suitable for been tested in biomedical applications. films presented micro-phase separation and became opaque and brittle. Figure 4b evidenced the compact and homogenous structure of a thin DM film.Premier article 3. 5b) were 152°C and 118°C. This value is thus intermediate as compared to the homopolymers. copolymer DM could be dissolved in a 20/80 mixture of water/THF (Table 2). and copolymer DM.

dextran and PMMA. since dextran gave any film. The loss modulus curve for copolymer DM was clearly shifted to higher temperatures as compared to PMMA (Fig.5. The maximum signal of tanδ is related to the molecular mobility transition. 6c) showed a maximum peak that was also used for the determination of the glass transition temperature: PMMA (109°C) and DM (141°C). such as the glass transition temperature in DSC thermograms. 6b). including 37°C. and for PMMA of 5700 MPa. (b) PMMA. As expected. (b) the loss modulus (E”). which induced changes in both the storage and loss modulus.Premier article Fig. The results on Figure 6 are reported for DM and PMMA. DSC thermograms of : (a) Dextran. The temperature dependence of the Tanδ (Fig. All together. both polymers showed a continuous decrease of the storage modulus with increasing temperatures (Fig. 6a). 79 . (c) copolymer DM Dynamic mechanical analysis enables the assessment in a large range of temperature of the mechanical behavior of the 3D structures. The figure illustrated three parameters: (a) the storage modulus (E’). which is the working temperature for biomedical materials. and (c) tanδ which is the ratio (E”/E’). Data indicated a storage modulus E’ at 37°C for DM of 4100 MPa. The differences with DSC values were attributed to the presence of water tightly associated to polymer. these results evidenced the hybrid properties of the resulting copolymer DM structures that are significantly different from the two corresponding homopolymers.

3. The morphology of cells on DM films was normal as shown on Figure 7. Proliferation of HUVECs was also studied until 5 days after seeding at low cell density. and no morphological alterations were observed as compared to control cultures. 80 . Dynamic-mechanical spectra of PMMA (----) and copolymer DM (_____) : storage modulus (a).Premier article Fig. The adhesion of cells on the transparent DM films was directly observed under the microscope. Surfaces of DM films were not previously modified with cell adhesive proteins or peptides before cell cultivation. Dextran gave any film. which will be studied in detail for vascular biomaterial purposes 10.6. loss modulus (b) and Tanδ (c) as function of temperature. These results strongly suggested a high compatibility with human cells of these structures. Cell biocompatibility Studies were performed to evaluate the in vitro cytocompatibility of DM films with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).5. Cell density strongly increased from sparse cells to an almost confluent layer on the DM surface after 5 days.

The overall mechanism of copolymerization would consist of three steps.Premier article Fig. Indeed.6. Adhesion studies demonstrated that human endothelial cells (HUVEC) adhere and proliferate on DM film (Original magnification 12. In contrast to a linear di-bloc polymer. (2) chain propagation. and THF/water only for copolymer DM). namely (1) free radical formation where the hydroxyl groups of dextran form a complex with ceric ions. By adjusting the different conditions indicated in the Material section.7. the solubility experiments evidenced a narrow range of solvents for copolymer DM (DMSO is the only common solvent to dextran-PMMA-DM. the proposed mechanism for grafting is outlined on Figure 8. the complex dissociate. we were able to obtain a compound with a peculiar behavior. by recombination of radicals. Thermo-mechanical properties were also evaluated above. as previously reported by others 30-38 . Copolymerization scheme Graft copolymerization of acrylic monomer onto polysaccharide was carried out using acrylic monomer and Ce(IV) as an initiator. and DSC for copolymer DM evidenced a single Tg. Experiments are currently in progress to definitively define the precise structure of this promising biocompatible copolymer.5 x) 3. as well as in dynamic mechanical spectra. giving rise to free radical sites onto oxygen of polysaccharide and acrylic polymer chain propagate and (3) termination of the chain. 81 .

Indeed. Guenin (University Paris 13.19.8. Acknowledgements This work was supported by Inserm. (c) grafting of acrylic monomers on free radicals (This representation does not imply that all glucosidic units are substituted). France) for his excellent technical assistance in DMA tests. Schematic representation of the proposed polymerization process. Thermal and mechanical analysis evidenced intermediate properties between acrylic polymer and dextran. (a) dextran. These compounds were chosen as model systems for copolymerization of polysaccharides with polyacrylates able to be included in bioartificial polymeric materials 10. the obtained copolymer DM formed 3D homogenous and transparent structures such as thin films or discs. University Paris 13. the morphological analysis indicated that graft copolymers were more stable than the homopolymers. Therefore. Materials with improved mechanical properties were thus obtained by controlled reaction of dextran with acrylic monomer using ceric ammonium nitrate 36-38 . 4. Interestingly.39. hybrid polymeric materials obtained from copolymerization between a synthetic acrylic monomer and a polysaccharide such as dextran could provide new biocompatible materials with improved properties. Conclusion The purpose of this work was to study the copolymerization of dextran with metyl methacrylate. and E. (b) dextran oxidation by Ce(IV) with formation of free radicals. School of Medicine) for NMR spectra. and was highly compatible with human endothelial cells. The authors wish to express their gratitude to Dr. a peculiar solubility of the copolymer was found in mixtures of THF/H2O.Premier article (a) CH2 O H H H OH H OH O H OH CH2 H OH O H CH2 (b) CH2 CH2 H OH O H O H H H OH H •O O H •O H H OH O H (c) O H H O O H H OH H H + nCe (IV) O H OH H H + nCe (III) + n H+ O + monomer (MMA) OH m •O m O H H OH H OH O H O CH2 m Fig. Furthermore. and IFR Paris Nord-Plaine de France. Cédric Lorthioir (CNRS Thiais. 82 (P M M A) .

. Nilsson.. D. S. B. Jozefonvicz. E. A. Feldman.. J. R.. S. T. Meddahi-Pelle. M. Jozefonvicz. A.. S. Bree. L.. 385-390. Fermandjian. 121-130. Hunt. Deux. M. Chaubet. M. Biomaterials 2000. D. A. Crepin... 27. A. L.. E. D. 1017-1022. 176-183. Barbucci.. B.. 27. S. 332. R... 10.. Dawson. Biomater.. A. Jenkins. J.. Larsson. 79. Huh. Progress in Polymer Science 2007.-P. W. Pekna. 22. 1. Biomaterials 1995. Maillet. Keenan. D. 5546-5553. Cheng.... Boudghène.. Baudys. 337. Biomaterials 1993.-C. Lamponi. Nilsson. 1-15. P. Nater. Lee. Avramoglou. K. M. U. K. 8. 349-355. L. Rezai. 17.. Michel. S. F. Formgren. Froehlich. Carbohydrate Research 2002. Jozefonvicz. W. Kang. P.. Puvion. F. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 2000. H. Circulation 2001. Letourneur. 21. S. Feng. D. Biomaterials 2006.. J. 22... Chaubet. A. D. C. B. 9.. 33. M.. Fagerholm... J. 3281-3293. Marchant.. 611646. F. Takahashi. E. Ware... Chaubet. D. E. Polymeric Biomaterials 2001. W.. I. Brinker.... Valente. Jozefonvicz. 83 (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) . G. J. Mix. J. F. W.. Boudghene. 22. J. 16... Letourneur. Letourneur. F. Kottke-Marchant. J. Kazatchkine. 1998. J. Thomas. N. M. Labarre. Letourneur. Consumi... D. A... J. I. Mourao. How. J. 1457-1466. Sollott. D. H.. Passirani. D.. M. J. L. Rochev. Vilela-Silva. S. Jozefonvicz. G. P. d'Angelo. J. 119-125... Kazatchkine. D. Carbohydrate Research 1999. De Groot. M. T. Biomaterials 2005. M.. C. Larsen.. Yuk. Kinsella... A. S. Chaouat. Magnani. M. Biomaterials 2006. A. J. K. S. A. T. M. H. G. Pharmacology & Therapeutics 2004. F. Pereira. W.. Black. G. S. Otter. Autissier. Sci. Fischer.. A.-F. Cadee. 42. M. Van Luyn. Kligman. Larsson. P. Boisson-Vidal. Kavanagh. P. L..... Letourneur.. D.. 102.-B. E. Heldman. K... D. Kim.. Prigent-Richard. Carbohydrate Research 2001.. H. Larsson. Feldman. Selén.. Bunge. Deux. T. 511-516.. J. Pellé. D. 322. J... J. Bittoun. G. Emanuelsson. 669-697. Le Visage. Bioconjugate Chem.. F. Y.. 35. Huynh.. Chaubet.. W. 1163-1167. Logeart. 1604-1609. C.. Maillet. Blondin.. J. Barratt. Elgue.. Polymer 2001. J. LogeartAvramoglou. P. Rappuoli.. Letourneur.. Journal of Vascular Surgery 2002.. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002.. J.Premier article References (1) (2) (3) (4) (5) (6) Feugier. Liu.. C. Ferrarini. A. D. Van Dijk-Wolthuis. Letourneur.-B. Heller. Vassy. G. Kim. A. C. J. Devissaguet. Bjorklund... Le Blanche. Kim..... Biomaterials 2001. 23. H. Yang.. C. E. F..... 643-648. Christensen. L. R.. 189-192. Bataille. R. Gallagher. F. F. 32. M. A. W. E.-K. 103.-C.-W. L. 10.. K. Shen.. Recent Patents on Materials Science 2008.. 14. J. Thomas. Biomacromolecules 2007. A. S.. Colliec-Jouault.... Larsson. J. F. A. A. M. Jozefonvicz. Biomaterials 1989. European Journal of Cell Biology 1997.. S.-H. A.. Avramoglou. W. P.. Durand. 247-255. R. Letourneur. Hunter. P. Prigent-Richard. L. Polymer Edn 1999. Jozefonvics. Y... P. C.. K. D. S. Michel. R. R. A. F. R. Y. V... Yoon. B. Grainger. 1197-1203. E. Hruban. D. 47-62. D. H. R. 2231-2238.-F. Biomaterials 2001. 26.. J.. Jr. C. C. Hennink. A. 29-40.. F. Plantinga. 4846-4855. H.. 75-83. 74. Lakatta. Journal of Inorganic Biochemistry 2000. Abella. R. Guo. J. Molecular immunology 1996. 2289-2295. Letourneur.... S. W. 973-981.. 327-375.

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Deuxième article

III.2. Introduction au second article

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Deuxième article III.2. Introduction À l’issue du premier article, nous nous sommes rendus compte des avantages mais également des inconvénients du copolymère dextrane-graft-PMMA (DM). En effet, ce copolymère est biocompatible mais il est rigide et présente des propriétés mécaniques limitées. Ceci nous a conduit à changer les monomères méthylméthacrylates par des monomères n-butylméthacrylates (BMA). Comme nous l’avons expliqué l’article, les conditions de synthèses restent les mêmes. Trois copolymères sont synthétisés avec différentes proportions de dextrane et de BMA (11/89, 30/70 et 37/63; dextrane/BMA en masse) et sont nommés respectivement DB1, DB2 et DB3. Purifiés et caractérisés par infrarouge, DSC, les produits de synthèse permettent de réaliser trois types de films DB1, DB2 et DB3. Les propriétés mécaniques de ces films sont étudiées par DMA, le PBMA seul est exclu de ce test car il est très fragile et cassant. L’état de surface est caractérisé par la mesure de l’angle de contact et par AFM. Une étude comparative, de prolifération des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses a été réalisée sur ces films afin de déterminer leurs comportements vis-à-vis de ces trois copolymères. Nous avons complété cette étude par un test de comparaison de la migration des cellules endothéliales sur copolymère et sur fond de puits de plaques de culture traitées pour la culture cellulaire. Au cours de la synthèse, on a constaté une diminution du pH du milieu réactionnel pendant les réactions, ce qui traduit la libération d'ion hydrogène. Après 8 minutes environ, le milieu réactionnel change de couleur et devient de plus en plus laiteux ce qui correspond à la formation de micelles de copolymères en suspension. L'opacité du milieu réactionnel est suivi par l'étude de la densité optique (650 nm) chaque 5 minutes depuis le début de la réaction. Après 40 minutes la formation d’un palier indique la fin de la réaction de polymérisation. La spectroscopie infrarouge nous a permis d’effectuer une analyse qualitative et quantitative des copolymères synthétisés. Nous avons ainsi mis en évidence la présence simultanée du dextrane et du BMA dans les trois échantillons. Cette technique nous a aussi servi à quantifier le rapport du dextrane/PBMA dans chaque copolymère. Le pourcentage de dextrane dans le copolymère augmente avec l’augmentation de la masse introduite de dextrane. L’analyse par DSC permet de mettre en évidence et de comparer les Tg des trois échantillons et d’un mélange dextrane + PBMA. Les trois copolymères présentent une seule Tg, avec une valeur qui augmente avec la quantité du dextrane. Le mélange physique, lui, présente deux Tg distinctes. L’étude de la solubilité montre que nos trois échantillons ne sont solubles ni dans l’eau ni dans le THF, mais ils sont solubles dans le mélange eau/THF 10%/90% v/v. Ceci nous a conduit 86

Deuxième article à réaliser trois types de films sous des conditions contrôlées. Quelque soit la quantité de dextrane, les films obtenus sont monophasés et parfaitement transparents. Une autre méthode de détermination du point de transition vitreuse de nos copolymères est utilisée avec l'analyse mécanique dynamique (DMA). Comme pour les résultats de la DSC, les mesures par DMA soulignent la présence d’une seule transition vitreuse (Tanδ présente un seul pic qui correspond à la Tg) apparaissant à une température Tg qui augmente avec la quantité dextrane dans le copolymère. Nous avons par ailleurs constaté une différence de valeurs entre les Tg obtenues par DSC et celles obtenues par DMA, différence qui peut être attribuée aux molécules d’eau liées. En effet, en DMA les échantillons subissent un seul passage à température élevée et l’eau joue le rôle de plastifiant. Les mesures d’angle de contact à l’eau évoluent avec la quantité de dextrane dans le copolymère. Le résultat de ces mesures montre que le PBMA seul présente l’angle de contact le plus élevé c'est-à-dire le plus hydrophobe. Pour les copolymères, l’augmentation de la quantité du dextrane conduit à une diminution de l’angle de contact. L’augmentation significative de l’angle de contact entre les trois copolymères (de 57° à 80°) peut être attribuée à la quantité du dextrane présent en surface. La rugosité et la topographie de surface des films PBMA et des copolymères ont été analysées par microscopie AFM. Les résultats de mesures de rugosités montrent qu’il existe pas de différence notable entre les trois types de copolymères DB. L’ensemble des résultats de culture cellulaire montre que la proportion du dextrane dans le copolymère joue un rôle majeur sur la prolifération cellulaire. Cette différence dans les réponses cellulaires peut s’expliquer par les interactions différentes des protéines d’adhérence adsorbées sur les surfaces, les trois copolymères étant de même nature chimique. De plus, nous remarquons que le copolymère contenant 11% de dextrane favorise la croissance des cellules endothéliales et inhibe la prolifération des cellules musculaires lisses ce qui est une propriété très intéressante pour des applications cardiovasculaires. Nous avons également pu observer que le film de copolymère favorise la migration des cellules endothéliales et de façon plus efficace que les puits traités pour la culture cellulaire. Cette action sur la réendothélialisation est également susceptible d’activités très favorables pour le développement de ces produits pour le recouvrement de dispositifs biomédicaux.

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88

Clément. Derkaoui.univ-paris13. Institut Galilée. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires. D. Avramoglou. Université Paris 13. 99 Av. T. C.2. 93430 Villetaneuse.fr 89 . 93430 Villetaneuse. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires. J. Institut Galilée. Second article Films of dextran-graft-polybutylmethacrylate for vascular tissue engineering S. Letourneur* INSERM.M. PhD Inserm. France * Correspondence to Didier Letourneur. U698.-B. Université Paris 13.Deuxième article III. U698. Barbaud.letourneur@galilee. France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier.

the resulting films were stable in water. and copolymers characterized by FTIR. Polymer film. Keywords : Cell proliferation and migration. Copolymer. Three copolymers were obtained (11. Increasing the dextran content in the copolymers decreased the proliferation for both vascular cell types.Deuxième article Abstract We have synthesized new structures made of amphiphilic copolymer dextran-graftpolybutylmethacrylate to evaluate their behaviors with vascular cells for the purpose of endothelialized tissue engineering devices. 30 and 37% dextran) and homogeneous thin films were successfully prepared. 90 . Polybutylmethacrylate. In contrast to dextran. Surfaces of films were smooth when analyzed by AFM (roughness 2 +/-1 nm) but greatly differed in their hydrophilicity by increasing the dextran content (water contact angle from 99° to 57°). DSC and DMA evidenced hybrid properties between the parent homopolymers. Altogether. In contrast to polybutylmethacrylate where the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) was excellent but very low for endothelial cells. the copolymer containing 11% of dextran was excellent for endothelial cells and very limited for VSMCs. Vascular smooth muscle cells. an in vitro wound assay evidenced that copolymer with 11% dextran is even more favorable for EC migration than tissue-culture polystyrene. Endothelial Cells. Dextran. Grafting of butylmethacrylate onto dextran has been carried out using ceric ammonium nitrate as initiator. these results indicated that these copolymers with an appropriate composition could be of interest for endothelial cell regeneration. Finally.

differing in their wettability by varying the concentration of dextran. natural biological polymers such as polysaccharides possess good biocompatibility [10-12] . Introduction The development of amphiphilic copolymers based on copolymerization of hydrophilic and hydrophobic parts is of great importance due to their versatility and potential applications in regenerative medicine [1-4]. we and others have already investigated graft copolymerization of a synthetic polymer (polymethylmethacrylate) onto a natural macromolecule (dextran) using ceric ammonium nitrate as a redox initiator [15-18]. the radicals so formed.14]. We found that films with a peculiar composition were able to greatly enhance endothelial cell growth and migration. but not vascular smooth muscle cell proliferation.Deuxième article 1. but their mechanical properties are often inadequate. and we studied their behaviors with vascular cells. Some other synthetic polymers showed physicochemical and mechanical properties comparable to those of the biological tissues to substitute. For instance. The main difficulty is the thermodynamic incompatibility of natural and synthetic polymers that is the result of enthalpy and entropy barriers caused by the differences in hydrophilicity/hydrophobicity. Improvements of the characteristics of synthetic polymers could be attained by the addition of biological components in the macromolecule structures. The resulting materials could combine the appropriate mechanical properties of the synthetic polymer with the biocompatibility of the natural polymer. In this context. We described here new compounds obtained from graft polymerization of dextran with butylmethacrylate that were used to prepare a series of films. initiated copolymerization with methylmethacrylate monomers [19-22]. This incompatibility is a frequent phenomenon observed for many polymer mixtures and results in phase separation [13. In order to overcome this problem. but were not sufficiently biocompatible. This strategy consisted on the creation of free-radical grafting sites on the dextran backbone by reaction with cerium IV. methacrylic polymers have been widely studied as a biocompatible matrix for use in tissue engineering [5-9]. 91 .

Materials Dextran 70000 g/mol obtained from SIGMA. and were purified by washing with NaOH 5%. 92 . Ce(IV) ammonium nitrate and nitric acid were obtained from Acros.75/2 w/w) were used. Three different mass ratios of dextran to BMA (0. The general experimental procedure was as follow: the reactions were carried out into 1L five-neck flask equipped with stirrer and condenser then the flask was immersed into thermostated oil bath at 40°C and purged by nitrogen gas. France. Dextran was dissolved in 500mL of nitric acid 0. the resulting products were extracted with acetone in a soxhlet for 24h. After solvent evaporation. France.5/2. NaCl 20%. 0. Procedure for graft copolymerization Three types of copolymers were synthesized by varying the amount of dextran. the films were soaked in distilled water for 2h and then carefully removed from the Petri dishes. The samples were air dried for 24h to remove the solvent and obtained films are 35µm in thickness.2M for 10min. Materials and methods 2. France.4 10-4 mol/L) and 2g of monomers were simultaneously added. 2. DB2 and DB3 were frozen at -20°C and lyophilized for 24h. while in the case of PBMA (very fragile). 2.2M (2. followed three times by distilled water. In order to obtain pure graft copolymers. Films of copolymers were cut for mechanical tests in the shape of 15mm x 5mm. The system was continuously stirred for 50 min and the solution was neutralized to pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10M) and concentrated with rotavapor. Pure copolymers were dried under vacuum and weighted. but PBMA film was not prepared because it was very brittle. 0.125/2. 500µL of the transparent solution obtained was molded in Petri dishes (15mm in diameter) for 24h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 to absorb water. Methanol was used as a non-solvent to precipitate the polymeric material.Deuxième article 2. The three purified copolymers named DB1.2.3. The films were rinsed several times with PBS.1. Preparation of films Preparation of copolymers films was carried out by dissolving 6% (w/v) of copolymers in mixture THF/H2O 90/10 (v/v). films were released from the mold upon addition of distilled water. was dried under vacuum at 60°C for 24h. that was washed with 50mL EDTA 10-2M to remove cerium ions. 5mL of solution of Ce(IV) dissolved in HNO3 0. Butylmethacrylate monomers were obtained from Acros.

dextran gave any film) and the obtained values were averaged.035 mm were analyzed on dynamic-mechanical analyzer. Contact angle measurements For an evaluation of surface wettability. The glass transition temperature (Tg) of the products was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline. DB2 and DB3) were obtained using a Perkin-Elmer 1600 spectrometer. the water contact angles of films were measured at room temperature using a contact angle system (Krüss. 93 . In each case. A droplet of deionized water (2µL) was put on the air-side surface of the films and after 10s the contact angle was measured. 35/65 and 40/60). 25/75. amplitude 5μm and a heating rate of 3°C/min from -100 to +200°C.6. Omnic software was used for data acquisition and analysis. The process was monitored by a video contact angle system. 30/70. The atmosphere spectrum was subtracted as background for each scan. model DSA 10. 20/80. DB2 and DB3). 15/85. Dynamic-mechanical analysis (DMA) on copolymer films DMA test was used to analyze loss modulus. Films of 15 x 5 x 0.5mg of physical blend of dextran/PBMA weight ratio (5/95.Mk2). The equipment has operated in a single cantilever bending mode at 1Hz in frequency.7. PBMA and each synthesized copolymer. operating in combination with the liquid nitrogen cooling accessory. 2. Fourier transform infra-red (FT-IR) spectroscopy was also used to semi-quantitatively estimate the percentage of dextran in the copolymers using physical mixtures of dextran and PBMA at different ratios. DB2 and DB3) were performed with a Setaram DSC131 thermal analyzer. A quantity of 15 mg of fine KBr powder was mixed with 1. DB1. DMA Q800 (TA Instruments). 50% w/w) was also tested. 2. DB2 and DB3. two consecutive scans were carried out on each sample. 10/90. We used the integrated area of (O-H) band at 3400cm-1 with different concentrations of dextran.5. Each film was mounted on the sample holder. Infra-red spectral analysis The infra-red spectra of copolymers films (DB1.Deuxième article 2. Ten measurements were carried out for each simple (PBMA.4. The furnaces were purged with nitrogen and samples were passed in temperature range from -50 to +200°C at heating rate of 10°C/min. PBMA was not tested because it was rigid and very fragile at room temperature. 2. A mixture of dextran + PBMA (50%. Differential scanning calorimetric analysis (DSC) Thermal behavior of homopolymers (dextran and PBMA) and all copolymers (DB1. Each spectrum was obtained at a resolution of 1 cm-1 using 32 scans. storage modulus and tanδ of all films of copolymers (DB1.

25/0. Briefly. Three areas per sample were imaged under Tapping contact mode and analyzed with WSxM 3. The ECs and VSMCs cells were seeded on each film at 5x103 cell/cm2. afterwards PBS was replaced with DMEM. The mean cell number from two wells per tested material was counted. and the two surfaces were submitted to UV at 254nm for 15min. 94 . The cell layer adhering to the each disc was washed twice with PBS 1x to remove remaining materials and loose cells and the cells were detached with trypsin/EDTA 0.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin. All films were imaged with a Nanoscope III Digital instruments dimension 3100 atomic force microscope (Veeco Metrology Group) and a resonance frequency range 50-100Hz.0 to obtain roughness (Ra) and peak heights of each film. 24.10.Deuxième article 2. 0. Endothelial cell migration In vitro migration assay of ECs was performed as described [23. and 48 hours after taken pictures by a digital camera (Pentax istD). The kinetics of proliferation has been determined daily for 5 days after starting cell culture. Cell adhesion and proliferation on copolymer films Endothelial cells (human umbilical vein endothelial cells (HUVEC from ATCC) and smooth muscle cells (aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs. The films (15 mm in diameter) were placed on the bottom of 24-well plates. Topography and roughness (AFM) Atomic force microscopy (AFM) was performed to determine the surface roughness and the uniformity of coating. Axiovert 100). Equivalent numbers of cells were also seeded directly into in 24-wells of tissue culture treated polystyrene surface (TCPS) as a reference surface.02 (w/v).9. 2. resuspended and counted with a Coulter (Coulter Counter ZM). pH = 7. ECs at 5x103 cell/cm2 were seeded into 24-well plates. Gibco) with 4. EC monolayers were scraped (denuded) using a 10µL plastic micropipette tip and washed by sterile phosphate buffered saline solution (PBS.24].8. The cells were incubated for 5 days at 37°C in air containing 5% CO2 and in a humidified incubator. 32. were used in this study. Cells were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM. where DB1 film has been placed on the bottom of wells. line Rb1 ). The transparency of all films allowed to see the cell morphology with a classical inverted phase contrast light microscope (Zeiss. All measurements were performed under ambient conditions. Area of migration was observed with optical microscopy and measured at 8.4).01M. After 5 days.0 beta 10. 2. Results are averaged from two separate experiments.

D at 650nm pH . as well as increase of optical density (appearance of tiny white particles shortly after the cerium and monomer addition) suggested initiation of copolymerization as shown in Figure 1. Results and discussion 3. the resulting copolymers were not soluble in any solvents of the parent homopolymers (Table 1) but only in a mixture 90/10 of THF/water.34 0.28 0. 0.25 0. Dextran-graftpolybutylmethacrylate copolymers were synthesized via redox initiation. no grafting polymer was observed in the absence of dextran or butylmethacrylate monomer. Interestingly. Variation of pH (▲) and optical density (■) during copolymerization.1. Synthesis of the graft copolymers In this work. In contrast. No change was observed in the absence of dextran or butylmethacrylate monomer. The decrease in pH of the reaction mixture. 95 O. three types of dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymers were synthesized via redox initiation in 500mL of acidified aqueous solution.15 0. as well as increase of optical density at 650 nm (right) was plotted as a function of time. DB2 and DB3) were successfully synthesized by increasing the dextran content in the starting solution. The decrease in pH (left).4 0.1 0 10 20 30 40 50 60 0. Three copolymers (DB1.1 0.16 0. 1.Deuxième article 3.22 0.2 0.05 0 Time (min) Fig.

96 . gave a calibration curve using physical mixtures of dextran and PBMA of known proportions (Fig. and characteristic band for dextran corresponding to OH stretching absorption at 3400 cm-1. dextran (b) and all copolymers DB1 (c). Semi-quantitative analysis of the integrated area of the 3400 cm−1 peak as previously described [25]. respectively). 3) and an estimate of the content of dextran in the copolymers (11.2. 30 and 37 % in dextran for DB1. The intensity of O-H band increased with increasing proportion of dextran in copolymers. Infra-red analysis As shown in Figure 2. DB2 and DB3. the comparison of FT-IR spectra of PBMA (a). DB2 (d) and DB3 (e) showed the presence of typical absorption band of PBMA at 1730 cm−1 corresponding to C=O stretching vibrations.Deuxième article 3.

15/85.393 R = 0. (b) DB2 and (c) DB3.Deuxième article 1730 a 3400 % Transmittance b c d e 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers (cm-1) Fig. Surface area estimated by IR according to the percentage of dextran (a) DB1.5 y = 0. 20/80. 35/65 and 40/60) were used for the integrated area of (O-H) band at 3400cm-1.10. Physical blends of dextran/PBMA (5/95. 50 40 37 % of dextran 30.1 20 11. 25/75. (d) DB30 and (e) DB37. (b) dextran. 97 . (c) DB11. 10/90.0019x . Fourier transform infra-red spectroscopy was used to semi-quantitatively estimate the percentage of dextran in the copolymers. Note the presence of typical absorption band of PBMA at 1730 cm−1 corresponding to C=O stretching vibrations. 2. Fourier transform infra-red spectra of (a) PBMA.97 0 0 10000 a 20000 b c 30000 40000 FTIR estimated surface area of OH bands Fig. 30/70. and characteristic band for dextran corresponding to OH stretching absorption at 3400 cm-1. 3.

Tg value of DB copolymers increased with increasing percentage of dextran in copolymer (31°C. Each DB copolymer showed a single glass transition. Differential scanning calorimetric analysis The determination of the glass transition temperature is a useful tool to evaluate the miscibility of polymers. f). The Tg was taken as the midpoint in the shift of heat flow baseline. In each case. 42°C for DB1. (e) DB2 and (f) DB3 are reported in temperature range from -50 to +200°C at heating rate of 10°C/min. e. and 153°C for pure dextran). 38°C. (d) DB1. These values greatly differed from copolymers when methylmethacrylate was used instead of butylmethacrylate. Curves for (a) dextran. physical mixture dextran + PBMA (c). PBMA (b). respectively) as previously observed . Figure 4 shows the DSC curves of dextran (a). (c) mixture of dextran + PBMA (50% + 50%). the existence of a single glass transition of the copolymers confirmed the successful grafting of BMA onto dextran in all synthesized copolymers. DB2 and DB3. the graft copolymer obtained was not a simple physical mixture between dextran and PBMA macromolecules. 4.Deuxième article 3. 98 . Therefore. Thus. When dextran and PBMA were physically blended in equal amounts (Fig. 4c). two separate Tg were obtained. very close to the Tg of the single homopolyers (28°C for pure PBMA.3. Miscible polymers by grafting show a single Tg that is different and intermediate between those of the single components . DSC curves showing the glass transition temperature (Tg). Dextran Tg = 152°C a DB1 Tg = 31°C d Exo -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 PBMA Heat flow Tg = 28°C b DB2 Tg = 38°C e -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 PBMA + Dextran Tg1 = 28°C Tg2 = 153°C c DB3 Tg = 42°C f -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Temperature (°C) Fig. (b) PBMA. two consecutive scans were carried out on each sample. with an intermediate value compared to the parent homopolymers. and all DB copolymers (d.

The data shown in figure 5 a. thin films were obtained. (b) the loss modulus (E”). decreased with increasing amount of dextran in copolymers as shown in figure 5 b. E’ decreased with increasing temperature. The elastic modulus. i. 680 MPa for DB2 and 1010 MPa for DB3 at 37 °C. DMA results are composed of three parameters: (a) the storage modulus (E’). the stiffness. It can be consider that the detection of a single peak in Tanδ is a sufficient criterion to assume the miscibility. DB2 (60°C) and DB3 (64°C).Deuxième article 3. the solubility of copolymers was only found for a specific mixture of THF/water. and after controlled solvent evaporation. temperature dependence of the Tanδ showed a maximum peak which was used for the determination of the glass transition temperature as showed in figure 5 c: DB1 (57°C). The dynamic-mechanical analysis (DMA) is a powerful technique to study the graft polymerization of different compounds. On the other hand. and (c) Tanδ which is the ratio (E”/E’). of interest for biomedical use. which induced changes in mobility of macromolecules. revealed a storage modulus E’ of about 480 MPa for DB1. 99 . In all cases.4. The films from copolymers were homogenous. each film exhibited one glass transition relaxation confirming the graft copolymerization.e. as usual for polymers. PBMA could not be used for mechanical assessment since it was too fragile. Copolymers films were thus obtained by dissolving copolymers in THF/H2O 90/10 (v/v). such as the glass transition temperature (Tg). that increased with increasing amount of dextran.27]. This technique also enable the evaluation of the mechanical behavior at 37 °C. for determining the occurrence of molecular mobility transition. Mechanical properties of copolymer films As indicated above (Table 1). These values were thus much lower than for pure polymethylmethacrylate (109°C) or dextran-graft-polymethylmethacrylate (141°C) [26. transparent and insoluble in water (in contrast to dextran). Similar to DSC results. Differences in values with DSC could be attributed to the presence of water tightly associated to copolymers.

0 Storage modulus E’ (GPA) 0.6 Loss modulus E’’ (GPA) a b 0. whereas DB3 (θ = 57°) film showed the lowest contact angle. Contact angle on copolymer films exhibited a progressive decrease with increasing dextran content (Fig. The higher contact angle indicates lower hydrophilicity. PBMA exhibited the highest contact angle (θ = 99°) and was the most hydrophobic material. 6).5. This result was expected. As a consequence.0 0.5 c Tang δ (E’’/E’) 1 0. Storage modulus E’ (a). an indication of surface wettability. DB2 (-------) and DB3 (________). 3. 5. The static water contact angles on the films are shown in Figure 6. Dynamic-mechanical analysis for copolymer films. 100 .5 0 -50 0 50 Temperature (°C) 100 150 Fig.Deuxième article 6. DB1 (θ = 80°) and DB2 (θ = 73°) film had moderate level of wettability. given the highly hydrophilic nature of dextran.2 0 -100 -50 0 Temperature (°C) 50 100 0 -100 -50 0 Temperature (°C) 50 100 1. Water contact angle of the films Hydrophilicity was evaluated by water contact angle (θ) measurement. PBMA was too fragile to be characterized.0 2. Loss modulus E’’ (b) and Tang δ (E’’/E’) (c) as function of temperature of films from copolymers DB1 (……….4 4. thus indicating increased hydrophilicity.).

Deuxième article 120 Contact Angle (degrees) 80 40 0 0% 30% Dextran content (wt%) 11% 37% Fig.6 . DB2 (30% dextran) and DB3 (37% dextran). The values for roughness of films were quite similar (PBMA Ra = 1. with no notable trends in topographical features upon increasing of dextran content (Fig.7). DB3 Ra = 2. 3. Contact angle with water was obtained using the sessile drop method with 10 measurements per tested surface. 101 . DB1 (11% dextran). DB1 Ra =1. and physical immobilization of biomolecules.6.9. 6. DB films exhibited smooth surface. Roughness observed on surface of DB films make them interesting and promising for biological applications in cell adhesion. 7). Topography and roughness of the films All films were further characterized by Atomic Force Microscope in tapping mode imaging to obtain information on the surface morphology. DB2 Ra = 2 . Water contact angle of films of PBMA.

analysis of the VSMC morphology on PBMA film showed that cells changed from spherical to fusiform shape. and spreaded out of its pseudopodia. (c) DB2 and (d) DB3 (scale X. 7. Atomic Force Microscopy of (a) PBMA. 8a).7. (b) DB1. analysis of cell numbers indicated that on copolymer film DB1 (concentration of dextran 11%). and proliferation for both types of cells was very limited (Fig. As shown in Figure 8. Three areas per sample were imaged and analyzed to obtain roughness (Ra) and peak heights of each film. and VSMC proliferation and morphology were comparable to the control cultures on TCPS. After 5 days. In this context. A detailed study of protein adsorption should be carried out to study this effect. VSMCs attained confluence on PBMA (never with ECs). in contrast to VSMCs that did not proliferate on DB1 (Fig. 8). ECs proliferated very well and reached confluence after 5 days (Fig. Cell proliferation on films Biocompatibility of the materials was tested by seeding ECs and VSMCs on films. indicating clear cell adhesion. Y 2µm/div). many studies have proved that surface characteristics of 102 . After 6 h cultivation. but could be related to a peculiar surface tension of the film and its subsequent adhesion of serum proteins that could differentially interact with cell receptors involved in cell adhesion. the number of spreading cells (ECs and VSMCs) decreased considerably. This marked difference for DB1 film was somehow unexpected. 8b). but no adhesion of ECs on hydrophobic PBMA.Deuxième article Fig. This result indicated that EC proliferation is sensitive to the hydrophobic/hydrophilic properties of films. When the dextran content in copolymers increases to 30% or 37%. 3. the chemical components being the same between the copolymers. All films were imaged under Tapping contact mode with a resonance frequency range of 50-100Hz.

. that may affect cell adhesion and can compromise hemocompatibility in the case of vascular prostheses[32-34] . In the work of Risbud et al. greatly affect the cell adhesion and growth on the materials [28. DB3. 8. Cell growth curves for PBMA and copolymers DB1. The chemical approach reported here by graft polymerization allowed to obtain fine tunable properties for excellent endothelialization. seems the main parameter to obtain the favorable endothelialization of the surface. A B Fig. It can be explained that preferential adsorption of some serum proteins like fibronectin and vitronectin from culture medium modulated adhesion and cell growth. Pictures were taken after 5 days in culture (Original magnification 12. According to the AFM results. DB2. Effect of film copolymers on cell adhesion and proliferation. DB2.Deuxième article biomaterials such as wettability. Consequently. They found that the untreated PMMA surface did not support endothelial growth and PMMA treated by plasma was better but exhibited growth rates lower than the TCPS. the roughness is similar among the different films.29]. (A) ECs and (B) VSMCs were cultured on PBMA or copolymers DB1.31]. the proportion of dextran in the copolymer that greatly affected the hydrophilicity. PMMA substrates were exposed to radio-frequency argon and nitrogen plasmas to decrease the water contact angle [30.5 x). Surface roughness is another important parameter in biomedical materials. DB3 103 .

8. In contrast. (a) DB1 (b) TCPS 0h 8h 24h 32h 48h 104 . Endothelial cell migration The in vitro migration assay. left panel). created from a wound in a confluent EC monolayer.Deuxième article 3. right panel). the cells on copolymer had extensively migrated from the edge of the scrape into the denuded space. They reach confluence at 32h on copolymer. Cell migration was measured as the denuded area in which ECs invading. was used to assess the effect of DB1 on EC migration compared to TCPS (the other polymer surfaces did not allowed a confluent EC monolayer). 9. EC migration on TCPS was slower (Fig. As shown in Figure 9 (top. This evidenced that surface of DB1 film was appropriate for EC migration and proliferation. and migration area remained non-confluent until 48h.

3 bottom of wells TCPS DB1 Denuded area (mm2) 0. In contrast to dextran. DB retained the excellent characteristics of dextran and PBMA for applications in tissue engineering. Conclusion The aim of this study was to synthesize new copolymers having the biological biologic properties of polysaccharides and the mechanical properties of polyacrylate. cell adhesion and proliferation can be controlled by varying the content of dextran incorporated into the DB copolymer. DB1 was able to inhibit VSMC proliferation. 32. In particular. Therefore. 4. Bar is 100µm for each picture. left panel) or on TCPS (top. homogenous and transparent films were easily prepared from all DB copolymers. and at the same time to support endothelial cell proliferation and migration.2 0. Area of migration was observed with optical microscopy and measured at 8. IR. Lastly. The properties were enhanced as compared to our previous report with dextrangraft-polymethylmethacrylate . 9. EC migration of a denuded EC monolayer on DB1 film (top. A series of copolymers of dextran and butylmethacrylate was successfully synthesized by radical polymerization and characterized by various techniques. and 48 hours. Moreover. right panel). 105 .1 0 0 8 24 32 48 56 Incubation time (hrs) Fig. DSC and DMA revealed that the graft copolymerization has been taken place and the miscibility between the two different natures of polymers could be obtained.Deuxième article 0. 24. a potential benefit of this approach is the availability of bioactive surfaces with tunable properties of interest for vascular tissue engineering. Bottom panel : Quantitative analysis of EC migration versus time.

France) for her help in contact angle measurements. Cédric Lorthioir (CNRS Thiais. The authors wish to express their gratitude to Dr. 106 . and IFR Paris Nord-Plaine de France. Guegen (Institut Galilée. University Paris 13. and V.Deuxième article ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by Inserm. France) for his excellent technical assistance in DMA tests. Université Paris 13.

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Introduction au troisième article 109 .Troisième article III.3.

Une observation au microscope à fluorescence des stents enduits par le copolymère contenant du dextrane-FITC. nous a permit d’enduire les stents après un séchage dans des conditions contrôlées. Une étude comparative de prolifération des cellules HUVECs et SMCs a été réalisée sur les plots 316L et films DB. nous ont conduit à tester ce copolymère comme revêtement sur des stents métalliques en acier 316L.3. que la prolifération des CMLs est retardée. Introduction Les avantages du copolymère dextrane-graft-polybutyleméthacrylate (DB) cités dans le second article. Le protocole retenu est l’évaluation de la prolifération des cellules sur les surfaces des plots et des films DB en procédant au détachement et au comptage quotidiens des cellules. Afin de confirmer ces résultats et de vérifier le comportement du recouvrement. Nous avons complété cette étude par un test in vitro. L’analyse par ATR-FTIR du revêtement nous révèle la présence simultanée du dextrane et du PBMA. L’observation directe du revêtement sur les stents a nécessité la métallisation de la surface.Troisième article III. dextrane-FITC 90%. et d’autre part la prolifération des HUVECs et beaucoup plus importante lorsque l’acier 316L est revêtu par DB film. nous avons complété cette analyse par une étude au MEB. cette rugosité a diminuée avec le recouvrement des stents (Ra = 16). L’étude de la prolifération sur des supports en 316L et sur des films de copolymère et le comptage quotidiens. 110 . une comparaison de l’endothélialisation entre sur des stents enduits avec le copolymère DB et sur des stents nus. Ce revêtement a été caractérisé par ATR-FTIR. La distribution du dextrane dans le copolymère et sur la surface des stents enduits est analysée par microscopie à fluorescence grâce au copolymère synthétisé avec un mélange dextran. tandis qu’il inhibe la croissance des CMLs. Le copolymère solubilisé dans le mélange eau/THF 90%/10% v/v. Des surfaces correspondant à 10 µm2 de stents nus et des stents enduits expansés ont été observés par microscopie AFM en mode tapping. nous révèle que le dextrane est distribué d’une manière homogène. Ces résultats indiquent que ce revêtement favorise la prolifération des HUVECs. son état de surface est étudié par AFM et MEB. montre d’une part. cette observation avant et après expansion confirme que le revêtement effectué est homogène et suit parfaitement la déformation du stent après l’expansion sans craquelures ni perte de matière. Les images topographiques des surfaces des stents nus révèlent une rugosité moyenne de (Ra = 22). 10% m/m. Il n’apparaît aucune différence significative entre les spectres des copolymères (DB) cités dans le second article et le revêtement déposé sur l’acier 316L.

111 . les cellules endothéliales sont fixées sur les stents marquées par la phalloïdine et sont observées en microscopie à fluorescence. Les résultats montrent que la prolifération des cellules HUVECs est plus importante sur les stents recouvert du DB que sur les stents nus. Apres 5 jours de prolifération.Troisième article Une observation des cellules directement sur les stents (supports opaques) à l’aide d’un marquage fluorescent avec la phalloïdine nous permet de voir la différence de prolifération des HUVECs sur les stents nus et les stents enduits.

112 .

D.-B. Université Paris 13.Troisième article III. C. Labbé1. 99 Av. Quebec City. U698. Institut Galilée. Clément. Letourneur1 * 1 INSERM. Avramoglou1.univ-paris13. D. Barbaud1. Institut Galilée. U698. PhD Inserm. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires. J. Bio-ingénierie de Polymères Cardiovasculaires. Quebec G1K 7P4. Mantovani2.fr 113 .M. S Holvoet2. A.1.letourneur@galilee. Derkaoui1. France 2 Laboratory for Biomaterials and Bioengineering. University Hospital Research Center. Troisième Article Dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymer for stent coating S. Department of Materials Engineering. S. France Fax: +33 1 49 40 30 08 e-mail: didier.3. Université Paris 13. 93430 Villetaneuse. Laval University. T. Tehrani2. ARTICLE EN PREPARATION * Correspondence to: Didier Letourneur. Canada. 93430 Villetaneuse.

This type of new copolymer with tunable properties seems of great interest for medical devices. Results indicated that stent coated with copolymer improve adhesion and proliferation of endothelial cell and inhibits proliferation of smooth muscle cell. Coating of endovascular metallic prosthesis (stent) was successfully prepared and characterized by atomic force microscopy analysis and scanning electron microscope. 114 . vascular cell adhesion and growth on the surface of stent was studied in vitro over 5 days.Troisième article Abstract Amphiphilic copolymers based on copolymerization of hydrophilic and hydrophobic parts offer versatility and various applications in the field of biomedical devices. A new biocompatible copolymer dextran-graft-polybutylmethacrylate was synthesized. Interestingly. The resulting coating of bare stents with copolymer was smooth and uniform with neither cracks nor detachment after balloon expansion.

16]. 115 . migration and proliferation of SMCs is one of the important mechanisms in the formation of atherosclerotic plaques to cause in-stent restenosis [2]. As cell adhesion is also depending on surface wettability [12]. On the other side. Coating metallic stents by polymeric biocompatible materials have been described and several polymers have been examined such as polyurethane. the proliferation of smooth muscle cells (SMCs) leading in some cases to thrombosis [1]. Indeed. Among biocompatible polymeric materials. Thereby.Troisième article Introduction Coronary stent implantation has become a common practice in cardiovascular surgery. highly hydrophobic surface are completely inert besides biological surroundings which limits the reconstruction of the arterial vessel. Poly(n-butyl methacrylate) is a particularly interesting methacrylate polymer thanks to its mechanical properties. several studies refer to the stent covering by a polymeric layer for improving stenting in coronary arteries [7. poly(l-lactic acid). 6] and avoid inflammation process. 8]. polymethacrylates are currently used in pharmaceutical or biomedical applications. Previous papers demonstrated the non-toxicity of dextran. methacrylate polymers and polysaccharides like dextran have been widely studied. One condition to avoid thrombus formation is to favour a fast re-endothelialisation of the arterial vessel after implantation and a limited proliferation SMCs. poly(ethylene terephtalate). 4] to reduce platelets adhesion [5. restenosis remains by far the main complication of this technique. These coatings build up a protective layer to the surrounding tissues against corrosion products of metallic stents [10. 11] while preserving metal mechanic properties. as an ultimate consequence. which was widely developed as biocompatible hydrogel [15. hydrophilic coatings are generally more blood compatible since platelets are less absorbed [14] and they facilitate the growth of endothelial cells by promoting the attachment of high-densitylipoprotein [12]. Furthermore it has already demonstrated its efficiency as biocompatible component of drug delivery stents. polydimethylsiloxane…[9]. First of all. On the contrary. polyorganophosphazene. However. metallic surface roughness can be decreased by electropolishing [3. Indeed the endothelium injury resulting from the stenting involves. Surface treatments have been developed in response to this lack of biocompatibility. this parameter can be controlled by varying the nature and the composition of the polymeric material [13]. Metallic surfaces are not adequate to endothelial cell development and they generally induce the adhesion of platelets that stimulate the proliferation of SMCs. In addition. This second strategy allowed to combine chemical modification and roughness reduction of the stent surface.

it was dried in vacuum oven at 60°C for 24h. the solution was neutralized to pH 8 by addition of NaOH aqueous solution (10M) and concentrated with rotavapor. 2. 10% respectively.2. The mixture of dextran was dissolved in 500mL of nitric acid 0. Methanol was used as a non solvent to precipitate the polymeric material. As already described in previous papers cerium(IV) ammonium nitrate was chosen as free radical initiator [17]. 5mL of solution of Ce(IV) dissolved in HNO3 0. followed three times by distilled water. Ireland). Butyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were purified by washing with NaOH 5%. the resulting product was extracted with acetone in a soxhlet for 12h to remove PBMA homopolymer.1. NaCl 20%. Synthesis of the copolymer The general experimental procedure was as follows: the reactions were carried out into 1L five-neck flask equipped with stirrer and condenser then the flask was immersed into thermostated oil bath at 40°C and purged by nitrogen gas. Ceric ammonium nitrate (CAN) and nitric acid was obtained from Acros France. Different dextran/n-butyl methacrylate ratios have been studied. Pure copolymers was lyophilised again. Dextran labelled with FITC was used to evidence the distribution of polysaccharide in copolymer and the coating can be visualized by the use of FITC-dextran-graft-polybutylmethacrylate.2M for 10 min. 116 . Radical grafting sites are created on the dextran backbone by reaction with Ce(IV) and initiate the copolymerization with n-butyl methacrylate leading to a grafted copolymer. which was washed with 50mL EDTA 10-2M to remove cerium ions. 2.4 10-4 mol/L) and 2g of BMA monomers were simultaneously added. Materials 316L stainless steel stents with internal expanded diameters of 3.2M (2. In order to obtain pure graft copolymer. By varying hydrophilic/hydrophobic balance of the copolymer the biological response can be optimized. The dextran and FITC-dextran were blended at mass ratios 90%. France. Materials and methods 2. In this context the adhesion of smooth muscle cells and endothelial cells has been examined for dextran/n-butyl methacrylate copolymer coated on stent. The purified copolymers were frozen at -20°C and lyophilized for 24h. dried under vacuum and weighted. FITC-dextran (70 kg/mol) (dextran labeled with fluorescein isothiocyanate) and Dextran 70 kg/mol was procured from SIGMA.5 mm were used in all experiments (from Guidant. The system was continuously stirred for 40min after that.Troisième article The present work describes the results obtained with a new dextran-g-poly(n-butyl methacrylate) copolymer for stent coating.

Expanded stents were dip-coated by immersion in copolymer solution.3 Morphological evaluation of coated stents Fluorescein isothiocyanate labeled dextran (FITC-Dextran) was used in order to evaluate the homogeneity and distribution of dextran in coated layers. Then all stent were rinsed several time with distilled water and PBS. The atmosphere spectrum was subtracted as background for each scan. The micrographs were obtained at 5. The samples were mounted on aluminium stubs covered with adhesive conductive carbon tape and coated with a layer of gold/palladium. Digital instruments dimension 3100 atomic force microscope (Veeco Metrology Group) and a resonance frequency range 50-100 Hz. stents were air dried for 24h.4. Copolymer solubility and stent preparation Obtained product was dissolved in mixture THF/H2O (90/10 v/v) at the rate of 6 % (w/v).0 kV on a scanning electron microscope Leica 340. The morphology of coated stents was also investigated by scanning electron microscopy (SEM) before and after balloon expansion. atomic force microscopy (AFM) was performed to determine the surface roughness and estimate the uniformity of coated and uncoated stents.4 Characterization 2. The scanning range was 10×10 μm2. and hand-crimped after that stents were deployed by balloon inflation.0 beta 10.4. Plots of AISI 316L (Goodfellow) coated with PBMA and DB were mounted on the sample holder.4. 117 . Fluorescent coating was analysed by confocal microscope using standard rhodamine and fluorescein filters.2.Troisième article 2. All measurements were performed under ambient conditions. This procedure left a fine copolymer film covering the surface of the stents. Therefore coated stents were mounted over a balloon.0 to obtain roughness (Ra) which is the centreline average between the highest and the lowest points of the surface irregularities. Each sample was imaged under tapping contact mode and analyzed with WSxM 3. 2. Each spectrum was obtained at a resolution of 1 cm-1 using 64 scans. the recovered stents are valid to characterization and cell seeding. 2. After evaporating of solvent for 24h at room temperature in saturated atmosphere of THF and in presence of CaCl2 who’s absorbs water. Samples were imaged with a Nanoscope III. 2. Omnic software was used for data acquisition and analysis.2 Topography and roughness of stents (AFM) In this study.1 Infra-red spectral analysis Attenuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) was recorded on a Nicolet spectrometer.

and hand-crimped. 2. Expanded stents were dip-coated by immersion in copolymer solution. Cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM. cells were detached with trypsin/EDTA 0.Troisième article 2. The kinetics of proliferation of HUVEC and SMCs has been determined on discs of DB films and plots of AISI 316L.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% of penicillin and streptomycin.25/0. resuspended and counted with a Coulter (Coulter Counter ZM).1 Fluorescence staining of F-actin and nucleus After 5 days of incubation. All samples were thoroughly washed three times with PBS before inspection with confocal microscopy. No grafting polymer was observed in the case of absence of dextran or butylmethacrylate monomers.5 Cell adhesion and proliferation on the surface of stent Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC from ATCC) and vascular smooth muscle cells (VSMCs line Rb1 [18]). the cell layer adhering to the each disc and plots was washed twice with PBS 1X to remove remaining materials and loose cells. cells were fixed with 10% of paraformaldehyde in DMEM at 4°C for 10 min and permeablized with 0. The cells were incubated at 37°C in air containing 5% CO2 and in a humidified incubator. Bare metal stents were also used as a reference.1% Triton-X 100 for 5 min. the nucleus was stained with DAPI (INTERCHIM). Daily and for 5 days after starting cultures. The F-actin was stained with red phalloidin FluoProbes 547 (INTERCHIM) diluted to 20% in PBS for 30 min. and were sterilized by exposure to UV at 254 nm for 30 min. Gibco) with 4. After evaporating of solvent. were used in this study.02 (w/v). The copolymer dissolved in mixture THF/H2O (90/10 v/v) at the rate of 6 % (w/v) was used to prepare a coating for stent covering as reported in the experimental part. 118 . Coated stents were placed on the bottom of a 24-well tissue-culture polystyrene plate.5. 3. Then. HUVECs cells were seeded on each sample at 5 105 cell/stent.1 Synthesis of the graft copolymers and stent coating Dextran-graft-polybutylmethacrylate copolymer has been synthesised by radical polymerisation using cerium. The mean cell number from the two samples per tested material was counted and average used to determine the cell kinetics of proliferation. Results and Discussion 3. a fine copolymer film covered the surface of the stents that were mounted over a balloon. Samples were rinsed with PBS and cells were incubated with PBS 1% BSA for 20 min.

this indicates that stent can be successfully recovered with copolymer using dip-coating method. dextran (b) and DB coated stent (c).Troisième article 3.1 shows the FTIR spectra of PBMA (a). 119 .1. ATR-FTIR spectra of the homopolymers: PBMA (a). Fig. Tapping mode AFM images of the surface of DB coated stent and uncoated stents are shown in Figure 2. attributed to the hydroxyl groups. no damage of copolymer can be seen on the stent surfaces from AFM images. The FTIR spectra of the copolymers coating is compared with the spectra of the two respective homopolymers PBMA and dextran.2 ATR-FTIR characterization The surface chemistry of coated stent was investigated by ATR-FTIR. we clearly observe the strong peak at 1730 cm-1. The roughness of uncoated stent is about 22nm. In addition. with an average roughness of about 16nm. It can be seen that the surface of the stent coated with DB is very smooth. These results indicated the presence of dextran and butylmethacrylate simultaneously on the stent surface. dextran (b) and copolymer (c). in the spectra of the DB copolymer. In fact. 3. attributed to the stretching mode of the carbonyl groups of PBMA. 1730 a 3400 % Transmittance b c 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Wavenumbers (cm-1) Fig.3 Surface structure of the coating stents (AFM) AFM is a powerful tool for the topography of surfaces. Furthermore the existence of dextran is proved by the peak at 3400 cm-1.

the coating may break when the stent is dilated by an angioplasty balloon. Thus DB coating is able to withstand balloon expansion of the stent without separation from the metallic structure. the DB coatings is uniform and smooth before (a) and after (b) dilatation by an angioplasty balloon.Troisième article a b Fig.3. There are no fissures or destruction of the DB coating on the stent after expansion. Additional information on the characterization of the coating surface was obtained by SEM. As can be seen in Figure 4 (a) and (b). Fluorescence microscopic images of coated stent with DB (Scale bar. This indicates that the DB coating on the stent has the ability to tolerate the compressive and tensile strains without cracking in the stent expansion process.4 Coated stent morphology The evaluation of coating and distribution of polymer was performed with fluorescence as shown in figure 3 using FITC-dextran in the preparation of the copolymer. 120 . (b) coated stent (Ra = 16nm) 3. Analyses of the FITC-copolymer on stent indicate that the coating is homogeneous and continuous. Fig. 100 µm).2. Atomic Force Microscopy of: (a) uncoated stent (Ra=22nm). If the copolymer is not viscoelastic. DB coating on metallic stents was clearly visualized by scanning electron microscope.

8 x 103 cells/cm2. In contrast. Comparison of EC and SMC proliferation on the DB films and 316L plots. SEM pictures of stent coated with DB copolymer at different magnifications.2 x 103 cells/cm2 and reaching 5. Interestingly.(a) 2.Troisième article a b c unexpanded stent. d Fig. 121 . and (b.2 x 103 cells/cm2 at day 0 and reaching 70 x 103 cells/cm2 at day 5. As shows in figure 5. A low SMC proliferation was also observed in the case of 316L (14 x 103 cells/cm2). 8 HUVECs DB HUVECs 316L SMCs DB SMCs 316L 6 Cells/cm2 ( x 104 ) 4 2 0 0 1 2 days 3 4 5 Fig. After 5 days incubation. d) after expansion.4. the proliferation of endothelial cells over 316L is very low starting from 5.5. smooth muscle cell proliferation on DB film was very low as compare to endothelial cells. SMC number only reached 23 x 103 cells/cm2.4 In vitro vascular cell proliferation Proliferation of endothelial cells and smooth muscle cells on DB film and non coated metallic 316L plots was study for a 5 days period. proliferation analysis showed that the endothelial cells on DB film exhibited a rapid proliferation starting from 5. c.

importantly. The results obtained in this study evidence that DB coating is homogeneous and showed good mechanical properties and biocompatibility. Therefore DB copolymer has the ability to stimulate endothelial cell proliferation and in contrast.Troisième article A similar behaviour was observed with stents coated with copolymer as compared to uncoated stent. thus this technique can be applicable to a wide range of polymers of the same families. These tunable properties obtained by the copolymer could be of great interest in various applications of cardiovascular medical devices. DB copolymer was successfully synthesized. or (b) DB coated stent. Figure 6 showed that endothelial cells exhibit high proliferation rate on stent coated with DB copolymer (Fig 6B) strongly suggesting that copolymer coating can significantly improve the ability to endothelialization. to minimize vascular smooth muscle cell proliferation. Interestingly. 200 µm. Conclusion One major finding of this study is that the dextran-graft-butymethacrylate copolymer can be used as coating for stent. 122 . Confocal micrographs of F-actin stained EC on (a) uncoated stent. Scale bars. our in vitro data of endothelialisation of stent reveals a major difference between the coated and uncoated stent. 6. a b Fig.

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124 .

Troisième article III. Complément troisième Article 125 .3.2.

126 .

de la morphologie et des propriétés mécaniques des recouvrements de poly(Dextrane-co-BMA) 127 .Troisième article Recouvrement des stents métalliques à base de dérivés de dextrane Etude de la composition chimique.

1 L’échantillon en acier Les échantillons en acier inoxydable 316L (Goodfellow. d’acide nitrique (10% V/V).1. et d’eau déionisée (88% V/V) pendant 30s et enfin il est rincé à l’eau déionisée et séché à l’air comprimé. tout en la rendant plus homogène suivant une procédure rigoureuse et validée antérieurement dans notre laboratoire [29]. d’acide phosphorique (35% V/V) et d’eau déionisée (15% V/V) chauffée à 90°C. S (≤0. P (≤ 0. Mn (≤ 2.Troisième article 1 Matériel et Méthodes 1.1. PA.03). Il est alors trempé dans une solution acide chauffée à 50°C composée d’acide fluorhydrique (2% V/V). %) de l’acier est : Cr (18. eau déionisée et isopropanol) dans un bain à ultrasons pendant 10 minutes pour chaque solvant. 128 . 1.00). Après électropolissage.00). USA) sont poinçonnés en disques de 12.5 A est appliqué entre les deux électrodes.2 Nettoyage des échantillons Chaque échantillon est nettoyé en utilisant trois solvants (acétone.7 mm de diamètre. Un courant de 1.045). le reste étant du Fe. Générateur (U. l’échantillon est rincé à l’eau déionisée et séché avec de l’air comprimé. Si (≤1. L’électropolissage comporte deux étapes. Cette dernière étape de trempe acide est nécessaire pour réduire la couche d’oxyde présente à la surface de l’échantillon.1 Préparation des échantillons 1.00). C (≤ 0.1. 1. Devon. Mo (3.3 Électropolissage L’électropolissage est utilisé pour réduire la rugosité d’une surface métallique et la passiver.00).00). Le nettoyage des échantillons est nécessaire pour éliminer les contaminants organiques. A chaque étape.08). I) + - Thermomètre Couvercle Bain (verre) Anode O2 H2 Cathode Électrolyte Agitateur magnétique Figure 1 : Schéma de la cellule d’élecropolissage [15]. La composition (wt. La première étape est l’électropolissage pendant 3 minutes dans une solution de glycérol (50% V/V). les échantillons sont séchés avec un jet d’air comprimé. Ni (10.

Cette méthode a déjà été utilisée pour déformer des échantillons minces d’acier inoxydable 316L dans les travaux de Byun et al [16. les stents sont soumis à une déformation plastique qui peut atteindre 25%. Figure 2 : Déformation d’un échantillon en acier inoxydable 316L. 17] dans le but d’étudier l’effet des radiations nucléaires sur les propriétés mécaniques de cet acier. 1. a) Schéma du SPT. b) échantillon non déformé et c) échantillon déformé. Des spectres de survol (balayage des énergies de liaison 129 . celle–ci doit résister à la déformation plastique in vitro simulant le déploiement in vivo. 1. Pour avoir une couche de polymère appropriée au recouvrement de stents. Les figures 4 b) et 4 c) illustrent respectivement un échantillon recouvert avant et après déformation.3 Déformation plastique Lors de leur implantation. MN.Troisième article 1.4 Etude de la composition chimique 1.1 Spectromètrie à photoélectrons induits par rayons X (XPS) La composition en surface du PBMA et du copolymère poly[Dextrane-co-BMA] a été analysée par un spectromètre de photoélectrons X (XPS PHI 5600-ci spectrometer Physical Electronics USA. Chanhassen. USA).4.2 Dépôt Les couches de polymère ont été déposées sur la surface de l’acier inoxydable en trempant ce dernier dans la solution de PBMA ou dans la solution de poly[Dextrane-co-BMA]. La méthode de déformation retenue est le « Small Punch Test» (SPT). La figure 4 a) représente le schéma du montage du SPT utilisé pour déformer les échantillons.

la déconvolution du pic HR du carbone donne la fraction de liaisons C=O. Par exemple. La profondeur d’analyse de surface de cette technique est estimée à 5-10 nm. USA) a été utilisée. Le tableau 1 montre les différentes énergies de liaison interatomique associées au carbone et prises en compte dans cette analyse. sensible aux vibrations des liaisons chimiques. Madison. Le rapport C/O est calculé en utilisant la formule suivante : La collecte d’un spectre à haute résolution (HR) permet d’évaluer la fraction de chacun des liens interatomiques d’un élément. Le survol permet de déterminer la fraction atomique relative des éléments présents à la surface de l’échantillon. la spectroscopie infrarouge par réflexion totale atténuée (ATR-FTIR Spectrometer Nicolet. La courbe ajustée par rapport au spectre obtenu par XPS haute-résolution pour le pic du C(1s) est déterminée par la méthode des moindres carrés faisant intervenir des combinaisons de courbes simulées par des gaussiennes-lorentziennes (70% / 30%) en faisant l’hypothèse d’un bruit de fond linéaire comme proposé par Shirley (en utilisant le logiciel CasaXPS). C-O et C-C par rapport à tous les liens du carbone avec d’autres atomes. Cette méthode d’analyse. 130 .4. 1. La calibration de la bande C(1s) a été effectuée en prenant comme référence le pic de la liaison C-C à 284. Également. des spectres de haute résolution (balayage d’une région définie autour d’une raie caractéristique) ont été acquis en utilisant la raie Kα de la source de magnésium (Kα = 1253.6 eV).2 Spectroscopie infrarouge par réflexion totale atténuée (FTIR-ATR) Afin d’étudier la structure chimique du revêtement polymérique et son épaisseur.0 eV Tableau 1 : Énergies de liaison du carbone dans le spectre HR. À noter que cette technique de caractérisation n’est pas sensible aux métaux.6 eV 286.6 eV). en utilisant la raie Kα de la source d’aluminium (Kα = 1486.Troisième article comprises entre 0 et 1400 eV) ont été acquis à un angle de détection de 45°.3 eV 289. analyse en profondeur les échantillons sur environ 1 μm. Liaisons chimiques C-C C-O C=O Energies de liaison 284. WI.6 eV (annexes 1 et 2).

131 . 1. avec une tension appliquée de 15 kV). le bord et le centre des échantillons pourraient avoir une composition chimique et une épaisseur différentes. Jeol.5 Etude de topographie 1. Cependant. Japon.5. Tokyo. celles réalisées après déformation ont été effectuées au centre. ces derniers ont été analysés par microscopie à force atomique (AFM) avant et après la déformation plastique de 25%. Les observations avant déformation ont été faites sur des zones en bordure de l’échantillon afin de ne pas l’endommager en son centre .5.1 Microscopie électronique à balayage (MEB) L’observation de la surface des aciers recouverts a été réalisée à l’aide d’un microscope électronique à balayage (JEOL JSM-35CF Scanning Electron Microscope. Ces analyses ont été effectuées à l’aide d’une pointe ultra fine de silicium de rayon de carbure de 2 nm.2 Microscopie à force atomique (AFM) Afin d’observer la morphologie et la rugosité des échantillons à l’échelle atomique. La valeur de la rugosité RMS (Root Mean Square) mesurée sur chaque échantillon est identifiée sur les images AFM par le terme R.Troisième article 1.

En effet. le signal à 1668 cm-1 est attribué à la fréquence de vibration de la liaison C=O de la forme noncyclique du dextrane [18] et celui à 3342 cm-1 correspond à la vibration O-H du dextrane (une 132 . Les signaux à 1470 cm-1 et 2970 cm-1 correspondent respectivement aux vibrations en déformation et en élongation de la liaison C-H. Les données de la littérature confirment que le spectre noir observé sur la figure 5 est bien celui du poly(méthacrylate de butyle). Le but de cet analyse préliminaire est d’obtenir la composition chimique des deux polymères mais également d’estimer l’épaisseur approximative de la couche polymérique. Le signal à 1250 cm-1 correspond à la fréquence d’élongation de la liaison C-O.1 Composition chimique des échantillons non déformés Le deux types échantillons ont été analysés par FTIR. En effet. La figure 5 montre les spectres obtenus par FTIR pour le PBMA et le poly[Dextrane-co-BMA]. 102 101 100 transm ittance 99 98 97 96 95 94 93 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 nombre d'onde (cm-1) Figure 3 : Spectres FTIR obtenus sur des aciers inoxydables 316L recouverts par : ■ le poly(méthacrylate de butyle) et ■ le poly[Dextrane-co-BMA]. Le spectre en rouge présente les pics caractéristiques du poly(méthacrylate de butyle) et ceux caractéristiques du dextrane. nous observons un signal à 1725 cm-1 correspondant à la liaison C=O du PBMA.1 Avant déformation 2.1.Troisième article 2 Résultats et discussions 2.

Troisième article fraction de ce signal peut être également attribuée à l’eau).2 Topographie des échantillons Les images obtenues par AFM montrent la morphologie et la rugosité de la surface. Toutefois. Les images AFM des figures 7 et 8 ne montrent pas de défauts de surface majeurs tels que de la délamination ou des fissures. 2. 133 .1. des « trous » sont visibles sur les échantillons recouverts par le PBMA. Les résultats obtenus par XPS à haute résolution HR et présentés en figure 6 montrent une augmentation de la fraction C-O (correspondant à la liaison C-OH du dextrane) pour les échantillons recouverts par le copolymère. Figure 6: Histogramme présentant les résultats des analyses XPS HR des aciers inoxydables 316L recouverts par le PBMA (noir) et le poly[Dextrane-co-BMA]. Ils résultent certainement de l’évaporation du solvant. La rugosité de l’échantillon recouvert par le PBMA est approximativement de 24 nm et celle de l’échantillon recouvert par le poly[Dextrane-co-BMA] est approximativement de 12 nm. L’observation de signaux de réflexion du métal à environ 400 cm-1 amène à conclure que l’épaisseur de notre couche polymérique dans les deux cas est inférieure à 1 μm. Ceci pourrait confirmer la présence des deux polymères dans le copolymère.

3 Après déformation plastique 2.Troisième article 825.00 nm Figure 8 : Image AFM de la surface d’un échantillon d’acier inoxydable 316L recouvert par le poly[Dextrane-coBMA] (20 μm x 20 μm).1 = 24. 134 .1 ± ±4.0µm 0.0µm 0.2 4.2 nm nm 4.00 nm Figure 7 : Image AFM de la surface d’un échantillons d’acier inoxydable 316L recouvert par le PBMA (20 μm x 20 μm).4 Composition chimique des échantillons La composition chimique du film polymérique après la déformation plastique de 25% a été analysée par XPS de survol et les résultats sont présentés en figure 9. 2.1.28 nm RR=24.08 nm R = 12.0 nm 4.3± 3.1. 374.

elle est donc restée relativement superficielle.2 Topographie des échantillons déformés Les échantillons déformés ont également été analysés par microscopie AFM. Les couches de polymère ne se sont pas délaminées et la surface métallique n’est pas observée. En effet. Après déformation plastique. Il est intéressant de noter que la géométrie des déchirures diffère suivant la nature du polymère recouvrant l’acier. Les images font apparaître des zones plus foncées qui pourraient correspondre à l’apparition des fissures sur la surface des échantillons après la déformation. 2. L’augmentation de la rugosité des échantillons après leur déformation est due à l’apparition de bandes de glissement. En comparaison à l’AFM (20 μm x 20 μm).Troisième article Figure 9 : Histogramme présentant les résultats des analyses XPS de survol des échantillons recouverts par le PBMA et le poly[Dextrane-Co-BMA] avant et après déformation (def). Ceci suggère une bonne adhésion entre la surface métallique et le film polymérique. Ceci pourrait traduire un manque de cohésion de la couche polymérique soit un manque d’élasticité. les déchirures observées sur les échantillons recouverts par le PBMA sont plus larges et semblent interconnectées contrairement à celles observées sur 135 . Les images obtenues et montrées en figure 10 mettent en évidence la déchirure des échantillons déformés plastiquement. ce qui signifie que la déchirure ne s’est pas propagée à l’interface. le MEB permet d’observer la morphologie des échantillons sur une surface plus grande (400 μm x 400 µm). l’analyse de la surface des échantillons par XPS ne fait apparaître aucun élément métallique. Elle est peut-être liée au réarrangement du polymère après la déformation. une variation de la fraction de C est observée après la déformation.1% et que les films ne sont pas délaminés. Ceci nous indique que la distribution des fissures est inférieure à 0. Cependant.

a 1) b 1) a 2) b 2) Figure 10 : Images obtenues par MEB des échantillons d’acier inoxydables 316L recouverts par le PBMA (a1. la distribution des fissures est inférieure à 0. 3 Conclusion Les analyses par ATR-FTIR et XPS ont confirmé les compositions chimiques des deux types de recouvrement : PBMA et poly[Dextrane-co-BMA]. b2 : grossissement plus important) après déformation. a2 : grossissement plus important) ou par le poly[Dextrane-co-BMA] (b1.Troisième article les aciers recouverts par le copolymère. Après déformation. entre les couches polymériques.1% car aucun élément métallique n’est détecté par XPS de survol. Le copolymère poly[Dextrane-co-BMA] semble avoir une meilleure résistance à 136 . Ces analyses confirment donc la bonne adhésion entre les couches polymériques et la surface métallique mais révèlent néanmoins une faiblesse dans la cohésion la déformation plastique. Cette différence pourrait s’expliquer par une meilleure résistance à la déformation plastique du copolymère.

et AFM) effectuées sur les films CFX (de 40 et 100 nm d’épaisseur) déposés sur les surfaces d’acier inoxydable 316L dans notre laboratoire n’ont pas permis de détecter des éléments métalliques en surface. 20% et 25%) des échantillons recouverts sur leur topographie de surface sera suivie par AFM et MEB. MEB) seront étudiés. 15%. En effet. les méthodes plus sensibles précédemment citées ont permis de les mettre en évidence [19].Troisième article 4 Les futurs travaux Les mécanismes de fissuration à l’aide des méthodes d’imagerie précédemment utilisées (AFM. Mais. 10%. FTIR. MEB. les analyses (XPS. L’effet de différents pourcentages de déformation (5%. 137 . Des analyses plus poussées de la composition chimique de ces recouvrements seront effectuées en utilisant des méthodes plus sensibles : la spectroscopie électronique NEXAFS induite par le rayonnement synchrotron et la spectromicroscopie d’électrons photo-excités par rayons X (XPEEM: X-ray PhotoElectron Emission Microscopy).

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P. 7897-7905.. X-ray Photoelectron Emission Microscopy and Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry Analysis of Ultrathin Fluoropolymer Coatings for Stent Applications. bleu : courbe ajustée pour le pic de la liaison C-O. 24(15): p. rouge : courbe ajustée pour le pic de la liaison C=O. ANNEXES Annexe 1 : Déconvolution du spectre XPS HR effectué sur l’échantillon recouvert par le PBMA (en vert : spectre original. 139 . Langmuir. bleu : courbe ajustée pour le pic de la liaison C-O.Troisième article 19. rouge : courbe ajustée pour le pic de la liaison C=O. 2008.. Hale. violet : courbe ajustée pour le pic de la liaison C-C). et al. violet : courbe ajustée pour le pic de la liaison C-C). Annexe 2 : Déconvolution du spectre XPS HR effectué sur l’échantillon recouvert par le poly[Dextrane-co-BMA] (en vert : spectre original.

140 .

Résultats III. Autres résultats 141 .4.

142 .

environ 20% de la masse des copolymères est perdue. À concentrations en monomère et en ion cérium (IV) constante. aucun polymère n’est obtenu en absence du dextrane à l’exception du 2-hydroxyéthyleméthacrylate qui conduit à la formation d’un composé insoluble. Les monomères méthacryliques (l’éthyleméthacrylate et le 2hydroxyéthyleméthacrylate) et les polysaccharides (le fucane. 143 . la solubilité des copolymères devient difficile voir même impossible. Les autres résultats montrent que les conditions utilisées permettent d’obtenir des copolymères avec un rendement final allant 21% à 45%. Les rendements avant les cycles de purifications étaient élevés mais après l’extraction à l'eau et à l'acétone. Ce monomère est exclu de la suite des études.1. Ceci étant dû aux groupements hydroxyles qui génèrent des radicaux en présence du cérium. Dans un but de mieux comprendre le mécanisme de greffage. Synthèse d’autres polymères bioactifs D’autres synthèses ont été menées dans les conditions opératoires identiques à celles citées dans le premier et le deuxième article mais cette fois avec d’autres monomères et d’autres polysaccharides (Tableaux 1 et 2). qui est plus faible sur les fucanes que sur le dextrane. un autre copolymère DBM a été synthétisé avec un mélange de monomères (méthyleméthacrylate et n-butylméthacrylate 50%/50%). mais à une quantité supérieure à 3. L'explication tient probablement dans le nombre de sites susceptibles de former des radicaux libres. Il est ainsi probable que les chaînes de fucanes portent moins de greffons polyméthacrylates que les chaînes de dextrane.6.10-3M. La concentration optimale de cérium pour avoir un bon rendement tout en préservant la solubilité du copolymère est de 2. Comme le montre le Tableau 1. Des études complémentaires doivent confirmer cette observation. Ces lavages consistent à éliminer les monomères résiduels et les homopolymères formés au cours de la synthèse.4 10-4 M. Le rendement peut être amélioré en augmentant la quantité de cérium.Résultats III.4. l’héparine et le pullulane) utilisés nous ont permis d’obtenir de nouveaux copolymères capables de former des films parfaitement homogènes et transparents. le rendement obtenu avec le dextrane est meilleur que celui obtenu avec les fucanes.

7 HEMA mol/l x 10-2 3.7 29 Solubilité dans H2O Solubilité dans THF Solubilité dans H2O/THF (v/v) + (20/80) D2 Série (E) B1 9.14 7.7 MMA mol/l x 10-2 3.14 Dextrane mol x 10-6 0 7.14 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 2.4 2.9 Héparine mol x 10-6 27 2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 2.4 3.14 Dextrane mol x 10-6 0 7.8 3.7 1.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.4 EMA mol/l x 10-2 3.8 3.7 BMA mol/l x 10-2 36 Rd (%) 37 Solubilité dans H2O - Solubilité dans THF - + (10/90) Solubilité dans H2O/THF + (20/80) F2 10 2.7 BMA mol/l x 10-2 33 B2 Série (F) F1 27 Pullulane mol x 10-6 10 2.7 BMA mol/l x 10-2 3.Résultats Tableau 1 : conditions de synthèse en utilisant d’autres monomères méthacryliques Série (A) A0 A1 A2 Série (B) B0 B1 Série (C) C0 C1 C2 Dextrane mol x 10-6 0 7.8 BMA+MMA 50%/50% mol/l x 10-2 3.4 3.7 1.4 37 Solubilité dans H2O - Solubilité dans THF - + (10/90) Solubilité dans H2O/THF (v/v) + (20/80) MMA Rd (%) mol/l x 10-2 3.4 2.4 MMA mol/l x 10-2 Rd (%) 3.7 1.14 7.7 41 - - + (10/90) 144 .4 2.9 Ce(IV) mol/L x 10-4 2.7 Yield (%) 0 24 39 Yield (%) 49 58 Yield (%) 0 23 45 Solubilité dans H2O / Solubilité dans H2O Solubilité dans H2O / Solubilité dans THF / Solubilité dans THF Solubilité dans THF / Solubilité dans H2O/THF / + + Solubilité dans H2O/THF Solubilité dans H2O/THF / + + Tableau 2 : conditions de synthèse en utilisant d’autres polysaccharides Série (D) D1 Fucane mol x 10-6 9.

4. Cette technique nous a permis de comparer la taille des macromolécules du dextrane avant et après synthèse. (a) (b) (c) Figure 1. le PMMA a une faible hydrolyse à partir de 40min qui se manifeste par l’apparition de groupements hydroxyles (3400cm-1).2. Effet du milieu réactionnel sur le dextrane Afin de déterminer si les chaînes du dextrane subissent une hydrolyse acide. mais en absence d’amorceur et de monomère.1.1. Analyse du dextrane par CES a) Dextrane non traité b) Dextrane traité dans les mêmes conditions de synthèse pendant 40 min c) Dextrane dans les mêmes conditions de synthèse après 2h.) après synthèse ne varie pas. cette fois la masse n’a pas pu être évaluée car le produit obtenu réticule et deviens insoluble dans l’eau. il a été caractérisé par spectroscopie infrarouge.Résultats III. C’est le 145 . Nous avons donc fait subir au dextrane T70 (70 kg/mol) les mêmes conditions de synthèse et de purification que pour les autres produits. l’homopolymère PMMA a subit le même traitement de synthèse pendant 40min ou 24h.4. Comme le montre la figure 2. Un autre test a été réalisé en présence du cérium. Effet du milieu réactionnel sur la chaîne de PMMA Comme pour l’expérience précédente. III. cela indique une absence d’hydrolyse acide du dextrane dans nos conditions de synthèse. Les résultats obtenus montrent que la taille des macromolécules (leur volume hydrodynamique. Après extraction et purification. fig1. Nous avons eu recours à la chromatographie d'exclusion stérique (SEC).1.

146 . Ces analyses indiquent simplement et rapidement les différentes bandes caractéristiques des polyméthacrylates et des polysaccharides. on retrouve les deux bandes d’absorption caractéristiques des fucanes qui se situent à 1250 cm-1 pour la vibration antisymétrique des S=O. (B) : traitement pendant 24h. A:40min %Transmittance B:24h 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Nombre d'onde (cm-1) Figure 2. on retrouve les pics caractéristiques du pullulane et ceux du polyméthacrylate. Caractérisation III.4.2. De même pour le PM et le PB.Résultats temps utilisé pour la copolymérisation.4. Ce signal s‘accentue au bout de 24h.1. Pour le copolymère FB et FM. caractérisation infrarouge Les résultats des spectres infrarouges de la série de synthèse de copolymères à base de fucane ou de pullulane sont présentés dans la figure 3. III.2. Tous les spectres des copolymères présentent simultanément la bande du groupement carbonyle (caractéristique du PMMA ou PBMA à environ 1730 cm-1) ainsi que le pic des fonctions hydroxyle caractéristique des polysaccharides à 3400 cm-1. mais il reste négligeable devant le pic équivalent du dextrane du copolymère résultant . Spectre infrarouge du PMMA (A) : traitement pendant 40 min.

Résultats a Pullulane FM b Fucane %Transmittance %Transmittance FB PMMA PM PBMA PB 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 Nombre d'onde (cm-1) Nombre d'onde (cm-1) Figure 3. Tests de solubilité de différents copolymères et réalisation des films On a tenté de trouver des solvants susceptibles de dissoudre les polymères synthétisés en vue d'étudier leurs propriétés en solution et de les mettre sous forme de films. Cette difficulté à trouver un bon solvant de nos produits a été un obstacle à l’étude plus détaillée de leur structure et ne nous a pas permis de réaliser des spectres RMN ni de mesurer la masse de ces copolymères. ces copolymères comportent une partie hydrosoluble (le polysaccharide) et l’autre partie soluble dans certains solvants organiques comme le montre le Tableau 3. solubilisé par le DMSO (figure 4. Cependant. (b) copolymères III.2. Ces copolymères synthétisés possédant des propriétés de solubilités différentes de celles des homopolymères correspondants.2. En effet. Spectre infrarouge (FT-IR) des : (a) homopolymères. la comparaison avec les homopolymères dans les mêmes solvants n’étant pas possible. 147 . Les expériences montrent que le rapport des deux solvants dépend de la nature du méthacrylate utilisé au cours de la synthèse.a) qui est un solvant commun du dextrane et du PMMA. sauf pour le DM cité dans le premier article. Ce sont donc des polymères amphiphile. Des solvants connus des polyméthacrylates et des polysaccharides ont été testés (Tableau 3). Aucun d’entre eux n’a solubilisé ces copolymères.4. Il s'agit donc d’un greffage covalent. des mélanges des deux solvants eau/THF s’est révélé susceptible de dissoudre ces macromolécules.

3. (a) Tests de solubilités du DM . Propriétés thermiques et mécaniques III. ces films sont parfaitement homogènes et transparents.4.1. leur souplesse dépend de la nature et du rapport polysaccharide/polyméthacrylate. III. Lors de la première montée en température deux endothermes sont observés.3.4.Résultats Tableau 3 : Tests de solubilité des polymères copolymère Solvants Eau DMSO DMF Dichlorométhane Acétone Chloroforme Dioxane THF Eau / THF 10/90 20/80 50/50 dextrane PMMA PBMA DE DH DB FM FB HM HB PB DBM S S I I I I I I I I I I S S S S S S S I I I I I I S S S S S I I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I S I I I I I I I I I I S I I Tous les polymères solubles dans le mélange H2O /THF sont capable de former des films (figure 4. Analyse thermique différentielle (DSC) L’analyse enthalpique différentielle permet de mettre en évidence la transition vitreuse des polymères. H2O THF THF/H2O DMSO a b Figure 4. (b) films de copolymère. le 148 .b) dans les conditions contrôlées (cité dans le premier article).

cité dans le premier article) et celle du DB (Tg = 38°C . 149 . nous reprenons ici les spectres des PMMA. En outre.3.Résultats premier à environ 110°C qui correspond à l’élimination de l’eau libre présente dans l’échantillon.a).2. et à la fréquence de sollicitation choisie. autour de 185°C est attribué aux molécules d’eau liées (figure 5. Les spectres mécaniques du DBM correspondent à l’évolution des modules élastique (ou module de stockage E’) et du module visqueux (ou module de perte E’’) lorsque la température augmente (la fréquence de sollicitation étant constante et égale à 1 Hz) Classiquement. Analyse mécanique sous sollicitations dynamiques À titre de comparaison. cela suggère que ce copolymère est effectivement constitué de 3 espèces et associe d’une part le dextrane et d’autre part un copolymère (PMMA-PBMA). Thermogrammes du copolymère DBM (a) premier passage (b) deuxième passage III. Il faut noter que pour tous les échantillons. DM et DB (cités dans les deux premiers articles).4. Selon cette méthode. la Tg n’est pas affectée par les différents cycles thermiques. Ce déphasage noté δ est nommé angle de perte. Premier passage Exo a Heat flow -40 0 40 80 120 160 200 DBM Tg = 105°C b -40 0 40 80 120 160 200 Temperature Figure 5. la transition vitreuse se produit à une température de 92°C inférieure à celle observer en DSC probablement du fait des molécules d‘eau liées qui jouent le rôle de plastifiant. mais ne sont plus observés lors du deuxième passage et les suivants. cette Tg est intermédiaire entre celle du DM (Tg = 126°C . Ces endothermes sont observés uniquement au cours de la première montée en température.b) . on considère que la température de transition vitreuse correspond à la température à laquelle le déphasage entre la contrainte et la déformation est maximale. le second. Le copolymère DBM présente une seule Tg de 105°C (figure 5. cité dans le second article). cette Tg est toujours intermédiaire entre la Tg du DM = 141°C et celle de DB = 60°C.

2 0 -100 -50 100 0 50 Température (°C) 1. quant à la rupture. (b) module de perte .0 0.4.5 0 -100 -50 0 50 100 Température (°C) 150 200 Figure 6. 150 . nous avons donc mené des essais de fluages en traction des copolymères DB1.5 150 200 0 -100 -50 0 50 100 Température (°C) 150 200 60 92 109 141 c DB Tang δ (E’’/E’) DBM DM PMMA 1 0. 6. (c) Tang δ III. Spectres mécaniques : (a) module de conservation en fonction de la température .0 b 0. DB2 et DB3 (cité dans le second article). Les taux de déformations peuvent atteindre les 380% voir plus dans certain cas (Figure 8).0 Module élastique E’ (GPA) Module visqueux E’’ (GPA) 0.4 2. Fluage des copolymères DB1. elle dépend principalement de l’état du film. Avant d’enduire les stents.6 36 65 73 125 a 4. DB2 et DB3 Les copolymères contenant du méthyleméthacrylate sont rigides et cassants contrairement à ceux synthétisés avec du butylméthacrylate qui sont beaucoup plus souples.4.Résultats Cela signifie que la viscoélasticité du copolymère DBM peut être modulé par le rapport PBMA/PMMA.

L’élasticité retardée est responsable de la courbure de la courbe.Résultats a b Figure 7. Pour 151 . Déformation (allongement relatif) en fonction du temps du film DB1 pour une charge de 100 g La courbe de fluage obtenue pour les différents films est d’allure classique pour des corps visco-élastiques. Nous n’observons pas de déformation instantanée. Film DB1 (a) sans sollicitation. Pour chaque type de film. 250% 200% Déformation (%) 150% 100% 50% 0% 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Temps (min) Figure 8. (b) après sollicitation. Les résultats expérimentaux sont obtenus à partir d’essais réalisés à température ambiante pour des masses accrochées au film de copolymère allant de 100 g à 200 g. nous avons obtenu un faisceau de courbe de fluage correspondant aux différentes charges appliquées. alors que la composante visqueuse correspond à l’asymptote rectiligne observée pour les temps longs.

Résultats pouvoir comparer aisément les différents films les uns aux autres.1 0 75 100 125 150 175 200 225 Masse en gramme (contrainte) Figure 9. nous avons caractérisé chacune des courbes de fluage par un paramètre unique qui est la pente à l’origine.0.0013x .3 DB1 DB2 DB3 y = 0.1452 0. Si on note V1. 0. Or ce qui distingue les trois films. V2 et V3 les vitesses de déformation initiales respectivement pour les trois films DB1. La vitesse de déformation initiale de chaque film augmente avec la contrainte appliquée selon une relation quasi linéaire.1035 0. DB2 et DB3. La proportion de PBMA permet donc de moduler la souplesse des films. b et c sont ajusté grâce à l’utilisation du solveur du tableur Excel. nous pouvons remarquer que pour une charge donnée. c’est leur rapport polysaccharide/polyméthacrylate. DB1 étant le moins riche en dextrane et DB3 le plus riche.0901 Vitesse de déformation (min-1) y = 0.0. Dans ces conditions.0019x .2 y = 0. les vitesses de déformation initiale suivent toujours l’ordre suivant : V1 > V2 > V3. vitesse de déformation en fonction de la contrainte des copolymères DB 152 .0019x . Nous avons alors ajusté les courbes expérimentales à une courbe théorique selon la méthode des moindres carrés. Les paramètres a. La courbe de fluage suit une fonction du type ε = a[1 − exp(−bt)] + ct où (ε) est la déformation et (t) le temps. la pente à l’origine représente la vitesse de déformation initiale donnée par ab + c.0. Ces résultats sont présentés à la figure 9.

1. dans des moules en verre de 16mm de diamètre. de compositions chimiques variables. Pour le DM. les différents copolymères et homopolymères sont utilisés comme support de culture cellulaire. 20. les cellules sont presque confluentes.3. Les résultats obtenus sont comparés entre eux en utilisant la technique classique du dénombrement des cellules.4. Propriétés biologiques des différents copolymères synthétisés Une étude de comportement et de prolifération des cellules endothéliales (HUVECs) et des cellules musculaires lisses (CMLs) au contact des surfaces a été systématiquement réalisée sur tous les films de copolymères synthétisés.3. FM. Le temps de doublement des cellules HUVECs est calculé par régression linéaire dans la zone de croissance exponentielle.4.1h.1. sont analysés par le suivi des cinétiques de prolifération. DB.4. Ces disques ont été obtenus en coulant des solutions des différents copolymères (dans le mélange eau/THF).2h.3. La densité cellulaire atteinte sur film de DB est rapidement assez importante (environ 63700 cellules/cm2 à J5).Résultats III. À ce stade. HM et HB) permettent un temps de doublement et un nombre de cellules endothéliales à J5 significativement supérieur à ceux obtenu sur d’autres surfaces (PMMA. Étude cinétique de prolifération des cellules HUVECs Les résultats rapportés sur la figure 10 montrent que le temps de latence est presque le même quelque soit le film testé. Après évaporation des solvants et conditionnement des films. les propriétés biologiques de nos copolymères susceptibles de moduler la réponse cellulaire ont été étudiées sur des échantillons sous forme de disques. Cette étude a été complétée par un examen des cellules sur les surfaces des films par microscopie à fluorescence. 19.8h et 19. Culture cellulaire Avant de réaliser l’enduction des stents.1. Le protocole retenu est l’évaluation de la prolifération des cellules en procédant au détachement des cellules puis au comptage des cellules au compteur des particules chaque jour et cela pendant 5 jours. Les effets de modulation de l’adhésion et la prolifération des cellules sur ces films de polymères. le temps de doublement est différent d’une surface à l’autre. Par contre. PBMA. DB. III. III. FB et plot 316L). 153 . de l’ordre de 20 heures (20.8h respectivement). Quatre copolymères (DM. ce qui nous a permis d’observer l’étalement et la morphologie des cellules. HM et HB le temps de doublement est presque identique. Les résultats sont exprimés en nombre des cellules par cm2 de surface des films.

8h. et 19.1.3h. DB.6h.3. Les courbes de prolifération des CMLs sont présentées sur la figure 11.3h. les CMLs prolifèrent mieux que les HUVECs .4. 154 . Cinétique de prolifération des CMLs sur les différents supports Une étude similaire a été réalisée sur les mêmes supports mais avec cellules musculaires lisses. ce qui est globalement plus long que les temps de doublement des cellules endothéliales sur les mêmes supports.Résultats 80000 PMMA DM DB HM HB 60000 Nombre de cellules HUVECs FM FB 316L 40000 20000 0 0 1 2 3 Temps de culture (jours) 4 5 6 Figure 10. Cinétique de prolifération des HUVECs III. 22. le temps de doublement des CMLs sur les mêmes supports (DM. Sur l’acier 316L. HM et HB) est plus important que sur les autres supports et correspond respectivement à 26.2. leur temps de doublement est d’environ 25h alors que ce temps de doublement n’a même pas pu être déterminé pour les cellules endothéliales car ces cellules ont du mal à se maintenir sur l’acier nu. 24. Comme pour les HUVECs.

Résultats 80000 PMMA DM DB HM HB 60000 Nombres de cellules CMLs FM FB 316L 40000 20000 0 0 1 2 3 Temps de culture (jours) 4 5 6 Figure 11. HB. FB et l’acier 316 L. Par contre.4. Cinétique de prolifération des CMLs III. ce qui est très intéressant si l’objectif est de favoriser une réendothélialisation . Prolifération des cellules HUVECs et CMLs sur les différents supports à J5 En reprenant les résultats antérieurs. aucune différence significative entre les HUVECs et des CMLs n’est observée. Pour le PMMA. le DB favorise la prolifération des HUVECs par rapport à celle des CMLs.2. 155 .3. HM. DM. FM. on peut réaliser une comparaison de prolifération des cellules HUVECs et CMLs à J5 (figure 12).

Contrairement à son action lorsqu’elle est soluble. l’héparine immobilisée dans nos copolymères est incapable de moduler la prolifération des cellules musculaires lisses et 156 . III. La morphologie des CMLs sur ces mêmes supports est peu différente à celle sur les fonds de puits.3.4. les HUVECs s’étalent mieux sur le support DM et les CMLs ont une morphologie très différente que celle observée sur le fond de puits de culture (figure 13. HUVECs et CMLs à J5 sur les différentes surfaces de polymères et sur plots 316L. Les cellules HUVECs s’étalent moins bien que les CMLs sur le PMMA. montre que l’étalement et la morphologie des cellules varient d’une surface à une autre. les cellules HUVECs atteignent la confluence et restent en monocouche. et beaucoup d’entre elles restent quiescentes. À l’opposé. Sur les supports HM et HB.Résultats 80000 HUVECs CMLs 60000 Nombre de cellules (J5) 40000 20000 0 PMMA DM DB HM HB FM FB 316L polymères Figure 12.a).3. présentés à la figure13. Les clichés obtenus lors de l’observation des cellules sur la surface des différents copolymères sont présentés sur la figure 13. L’étude de la morphologie cellulaire associée à celle de la prolifération constitue un outil permettant de mieux comprendre le comportement des cellules adhérentes sur les surfaces de natures et de compositions chimiques variées. L’analyse de clichés obtenus après cinq jours de culture. Morphologie cellulaire sur les différents films de copolymères Nous avons observé les cellules directement sur les différents supports en utilisant un double marquage fluorescent. le second est un marquage de l’ADN au DAPI. Le premier est un marquage du cytosquelette à la phalloïdine. Ces supports ne semblent pas capables d’inhiber les CMLs malgré la présence de l’héparine.

b). Une comparaison de prolifération cellulaire entre le film DB et les plots d’acier 316L présentée dans la figure 13. article 3). A l’opposé. HUVECs PMMA CMLs PMMA HUVECs HM CMLs HM HUVECs DM a CMLs DM HUVECs HB b CMLs HB HUVECs FM CMLs FM HUVECs DB1 CMLs DB1 HUVECs FB CMLs FB HUVECs Plot 316L CMLs Plot 316L c d Figure 13.Résultats endothéliales (figure 13. Le copolymère à base de dextrane et de polybutylméthacrylate (DB) est donc le polymère qui présente les meilleures propriétés physiques et de sélectivité cellulaire. la présence des fucanes ne semble pas favoriser ou inhiber les cellules testées. Observation des cellules en microscopie par fluorescence après cinq jours de prolifération (Grossissement : PMMA x 75 . et c’est celui-ci qui sera utilisé pour l’enduction de stents métalliques (Cf.c montre que les HUVECs et les CMLs présentent une morphologie normale sur ces supports FM et FB et comme pour le support hépariné. La figure 13. les CMLs prolifèrent mieux sur les plots de 316L que sur le DB.d. les autres films et plot x 250). montre que les HUVECs prolifèrent mieux sur les films DB que sur plots 316L. 157 .

158 .

Discussion 159 .Discussion IV.

160 .

Bien que cette méthode permette de rétablir la lumière des artères. Pour cela. par une migration et une prolifération de cellules musculaires lisses. En outre. plusieurs essais de recouvrement de stents ont été réalisés. Plusieurs types de recouvrements ont été élaborés. Cependant. depuis quelques années. L’idée de rétablir le flux sanguin grâce à une intervention chirurgicale sur l’artère malade est née en 1964 et la première angioplastie réussie a été réalisée en 1977 par Andreas Grüntzig. ils doivent être biocompatibles. Dès 1912. L’opération avait échoué. et par la production de matrice extracellulaire entraînant ainsi une hyperplasie intimale. en vue d’obtenir un matériau susceptible d’enduire des stents métalliques afin de limiter le phénomène de resténose. de resténose ou d’hyperplasie néointimale. ces stents n’étaient pas beaucoup plus efficaces que les stents nus et certains polymères n’étaient pas aussi biocompatibles qu’on l’avait 161 . De plus. dans certains cas. il faut qu’ils puissent réduire les réponses inflammatoires conduisant aux phénomènes de thrombose.Discussion Discussion L’objectif de cette thèse était d’allier au sein d’un même matériau les propriétés biologiques des polysaccharides et les propriétés mécaniques des polyméthacrylates. les films protecteurs doivent pouvoir suivre les déformations et les mouvements des stents sans se fissurer. Alexis Carrel avait pensé au concept d’un implant endovasculaire ayant pour but de maintenir l’artère ouverte avec du verre et des tubes de métal dans l’aorte de plusieurs chiens. Les stents ont été recouverts avec des substances non-actives et des polymères. ils peuvent donc être responsables d’une réaction inflammatoire qui se manifeste par l’accumulation de plaquettes et de leucocytes vers le site d’implantation. non toxiques et non cancérigènes. puisqu’il n’y a rien pour soutenir les parois de l’artère. l’artère peut s’écraser (sur elle-même) dès le dégonflement du ballon d’angioplastie. Suite à l’observation de ces phénomènes d’inflammation. Cependant. Ainsi. Le premier objectif du recouvrement des stents est d’établir une barrière protectrice entre le métal et l’environnement biologique afin d’éviter les phénomènes de corrosion liés aux réactions chimiques et biologiques de l’organisme de l’hôte. L’avantage du stent métallique est qu’il permet de maintenir l’artère ouverte grâce aux forces mécaniques qu’il exerce sur ses parois. ni créer de résidus dans l’organisme où ils sont introduits. mais 80 ans plus tard. les stents sont des corps étrangers en contact avec les tissus sanguins. l'idée de recouvrir les stents avec une substance biocompatible qui permettrait d'éviter le risque de thrombose lié à l'insertion du stent dans les vaisseaux sanguins est apparue. Le principe consiste à introduire un stent monté sur un ballon d’angioplastie dans l’artère malade au niveau de la zone obstruée. l’idée a été réutilisée par Sigwart pour traiter un cas de resténose.

Puisque le DMSO n’est pas recommandé pour les applications biomédicales. nous avons validé la technique de greffage du monomère méthacrylate de méthyl (MMA) sur le dextrane. Une fois le DM solubilisé dans le DMSO. il a été caractérisé par spectroscopie infrarouge. le DM a été solubilisé dans un mélange eau/THF et des films ont été réalisés sous une atmosphère saturée en THF et en présence de CaCl2. En effet l’objectif était de faire croître un polyacrylate sur le dextrane afin d’obtenir une liaison covalente entre ces deux polymères dont les propriétés physico-chimiques sont totalement différentes. Dans une première étape. Des études se dirigent également vers la thérapie génique artérielle qui consiste à utiliser des stents recouverts d’un polymère comme réservoirs pour une libération locale de matériel génétique. nous devions obtenir un produit soluble pour faciliter la caractérisation et la mise en oeuvre. Les films obtenus sont parfaitement homogènes et transparents. L’infrarouge et la RMN révèlent la présence simultanée du dextrane et du polyméthyleméthacrylate. La DSC confirme quant à elle le greffage covalent par la présence d’une seule température de transition vitreuse à 126°C. ces mesures ont révélé une plus grande souplesse du copolymère DM par rapport au PMMA. Cependant. puisqu’ils engendraient des réactions inflammatoires. La combinaison des deux composés a été réalisée grâce à une copolymérisation radicalaire en milieu aqueux utilisant le cérium (IV) comme initiateur Redox. intermédiaire entre la Tg du dextrane (152°C) et celle du polyméthylméthacrylate (118°C) alors qu’un simple mélange physique des deux polymères conserve deux Tg distincts. Nous avons porté notre attention sur les propriétés biologiques des polysaccharides et les propriétés mécaniques des polyméthacrylates. Leurs propriétés mécaniques sous sollicitations dynamiques (DMA) ont été évaluées. des inhibiteurs de la prolifération cellulaire.Discussion cru. la viscosité montre que la masse du DM a doublé par rapport à celle du dextrane d’origine. aucune polymérisation n’est possible. Pour cela. les essais d’enduction de stents par le DM ont révélé que ces propriétés mécaniques 162 . L’expérience a révélé qu’en absence de polysaccharide ou de monomère. des agents antiinflammatoires ou des agents activant la régénération tissulaire introduits dans la formulation du revêtement. mesures de viscosité et par calorimétrie (DSC). les synthèses ont été réalisées dans un milieu dilué afin de limiter les recombinaisons radicalaires et les réticulations. Le but de ce travail était donc d’associer pour le recouvrement de stents plusieurs propriétés par la réalisation de nouveaux systèmes macromoléculaires. D’autre part nous avons déterminé les concentrations en réactifs permettant d’obtenir un copolymère nommé « DM ». De plus. L’autre stratégie qui n’est pas exclusive de la première approche est d’utiliser localement des agents médicamenteux tels que des agents immunosuppresseurs. RMN.

par conséquent. Les résultats issus de l’étude du DM ont permis de transposer les conditions de synthèse avec un autre monomère acrylique qui est le n-butylméthacrylate. Au terme de cette première étape.Discussion restent insuffisantes. En comparant l’intensité des pics correspondant au groupement hydroxyle. ce qui est en accord avec la valeur élevée de la Tg du dextrane. appelés DB1. des tests de culture cellulaire ont cependant montré que ce copolymère n’est pas cytoxique et présente une bonne biocompatibilité. les copolymères DB présentent une seule Tg. cette technique a permit aussi de quantifier la proportion relative de polysaccharide et de polyacrylate des trois échantillons DB. La présence des groupements chimiques caractéristiques du dextrane (3400 cm-1 pour le groupement hydroxyle) et du PBMA (1730 cm-1 pour le groupement carbonyle) met en évidence la présence simultanée des deux composés. et DSC. Comme nous pouvions nous y attendre. l’angle de contact étant maximum pour le PBMA seul. Les résultats montrent que les films DB présentent des propriétés viscoélastiques intéressantes. DB2 et DB3 révèle que la vitesse de déformation augmente avec la proportion du PBMA dans le copolymère. La comparaison des thermogrammes obtenus avec les copolymères montre qu’à l’instar du DM. DB2 et DB3. l’angle de contact diminue quand le taux de dextrane augmente. la viscoélasticité des copolymères peut être modulée grâce au contrôle du rapport dextrane – PBMA. Le PBMA étant trop cassant. Dans une seconde étape. la valeur de cette Tg augmente avec la proportion de dextrane. 175g. un autre monomère a été sélectionné dans un but d’améliorer les propriétés mécaniques du copolymère. Cela signifie que l'hydrophobicité peut être modulé par le rapport dextrane . 200g) à l’extrémité des films nous ont permit de déduire la vitesse de déformation en fonction de la contrainte. 125g. La comparaison entre les trois échantillons DB1. Les produits DB obtenus nous ont permit de réaliser des films parfaitement transparent et homogène dans les mêmes conditions que celles utilisées avec DM. 150g. et qu’il existe une relation linaire entre la masse suspendue à l’extrémité du film et la vitesse de déformation initiale. L’hydrophilie des films DB a été caractérisée par mesure de l’angle de contact.PBMA. Les propriétés mécaniques du DB ont été étudiées par des tests de fluages et par DMA. Trois copolymères ont été synthétisés avec différentes proportions de dextrane. il n’a pas été testé. Les tests de fluages en traction réalisés par la suspension d’une rampe de masse (100g. Les mesures sous sollicitations dynamiques (DMA) montrent qu’il n’y a pas de grandes différences entre les trois échantillons DB par contre une comparaison avec le DM révèle que les propriétés mécanique des DB sont meilleures (pour les applications visées) que celles du DM. ils ont été caractérisés par infrarouge. 163 . De plus.

Les autres résultats thermomécaniques révèlent que les propriétés mécaniques du DBM sont également intermédiaires entre celles du DM et des DB. Le nouveau copolymère obtenu (dextrane-graft-(PMMA-co-PBMA)) appelé DBM était caractérisé par DSC et DMA et comparé à DM et DB. Parmi les copolymères. FM et FB montrent que ces copolymères n’inhibent pas la croissance des CMLs malgré la présence d’héparine et ou de fucane qui sous forme solublent sont décrits comme inhibiteurs sur ces cellules. HB. Pour cela des films confectionnés sous forme de disque de même diamètre que les fonds de puits des plaques 24-puits ont été testés avec les cellules endothéliales (HUVECs) et des cellules musculaires lisses. à évaluer la biocompatibilité de tous les copolymères synthétisés. Un test comparatif entre ce copolymère et des plots d’acier 316L confirme ces résultats. le DB1 a été sélectionné pour enduire des stents métalliques.Discussion Dans une logique de confirmer les résultats de DSC et de DMA. un se révèle particulièrement sélectif. Étant donné es caractéristiques biologiques et mécaniques. Ces copolymères ont les mêmes propriétés que ceux cités précédemment. c’est le DB1. c'est-à-dire que la prolifération cellulaire est différente d’un copolymère à un autre. Les copolymères obtenus. FM et FB permettent de réaliser des films parfaitement homogènes et transparents. nommés HM. Nous avons étendu cette étude à l’utilisation de l’héparine ou de fucanes étant donné leurs propriétés biologiques intéressantes.PBMA. Ce copolymère favorise la croissance des cellules endothéliales et limite la prolifération des cellules musculaires lisses. une synthèse était réalisée avec dextrane-FITC (dextrane fluorescent). HB. Une autre observation en microscopie électronique à balayage a confirmé que ce revêtement suit parfaitement la déformation du stents après expansion et reste sur son support sans craqueler ni s’écailler. Les résultats obtenus avec les HM. La troisième partie consistait. Des cinétiques de croissance de ces cellules sur ces films de copolymères montrent d’une part qu’aucun de ces films n’est cytoxiques et d’autre part ils influencent l’adhésion et la prolifération cellulaire. Les résultats de DSC montrent que ce nouveau copolymère possède une seule Tg intermédiaire entre la Tg du DM et la Tg DB. Cela peut de plus être modulé en agissant sur le rapport PMMA . L’observation des stents sous microscopie à fluorescence montre d’une part que le dextrane est réparti d’une manière homogène dans le revêtement et d’autre part que ce revêtement est homogène sur la surface de stent. Des expériences complémentaires réalisées en 164 . Afin des mieux visualiser le revêtement avant et après l’expansion du stent. Les conditions de synthèse sont toujours les mêmes.. nous avons procédé à la synthèse d’un autre copolymère en utilisant cette fois un mélange de monomères méthyleméthacrylate et butylméthacrylate (50%/50%).

165 . Bien entendu d’autres paramètres doivent être explorés pour confirmer la parfaite adéquation entre ces matériaux et l’usage que l’on souhaite en faire.Discussion collaboration avec l’équipe du Professeur Diégo Mantovani à Québec confirment ces résultats sur des plots métaliques nus et recouverts. • Biocompatibilité • support favorable pour la migration et la prolifération des cellules endothéliales. • simplicité de mise en œuvre (enduction) . Les résultats montrent que les cellules endothéliales colonisent beaucoup mieux les stents enduits que les stent nus. Des expériences d’endothélisation in vitro ont enfi été réalisées avec des stents enduits de DB1 et des stents nus. En particulier. Le bilan des résultats obtenus pour les différents copolymères polysaccharide/polyacrylate montre que ces matériaux répondent au cahier des charges minimal imposé pour une enduction de stent à savoir : • bonne cohésion du revêtement avec son substrat . Ces études doivent se poursuivre pour valider les différents aspects de ce projet qui pourrait déboucher sur des applications biomédicales sur les stents ou pour le recouvrement de dispositifs médicaux. il est nécessaire d’évaluer l’hémocompatilité des revêtements obtenus et de vérifier par des essais in vivo chez des modèles animaux que des stents recouverts de nos copolymères réduisent effectivement le risque de resténose. Les expériences qui doivent être finalisées très prochainement permettent également de mieux caractériser la surface chimique du revêtement et ces propriétés mécaniques sous déformation. • possibilité de charger le support en principe actif (hydrophile ou hydrophobe) . La synthèse de ces différents copolymères et de leurs utilisations pour le recouvrement de stents apparaît ainsi comme particulièrement intéressante. • bonne souplesse du revêtement de manière à suivre les fortes déformations plastiques que subit le stent lors de sa mise en place .

166 .

Conclusion V. Conclusion 167 .

168 .

ce qui est un point essentiel dans la prévention de la resténose. Cette pathologie issue d’un mécanisme inflammatoire multifactoriel. En ce qui concerne l’un des copolymères. Néanmoins. Cependant. L’ensemble de ce travail a permis de montrer qu’il est parfaitement possible de synthétiser des polymères hybrides polysaccharide/polyacrylate qui soient filmogènes malgré la nonmiscibilité des deux homopolymères. implique en particulier une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires au détriment des cellules endothéliales. leurs propriétés mécaniques restent très limitées. il a été montré que le revêtement obtenu favorise in vitro la migration et la prolifération des cellules endothéliales au détriment des cellules musculaires lisses. La possibilité de créer des radicaux libres à partir de fonctions hydroxyles grâce à une réaction Redox nous a permis d’envisager une polymérisation radicalaire de différents méthacrylates. Des études ont aussi été réalisées afin d’incorporer dans la structure des polymères naturels ayant des propriétés thérapeutiques. notre approche est d’enduire des stents métalliques d’un revêtement permanent qui favorise la prolifération des cellules endothéliales et inhibe les cellules musculaires lisses. qui est un 169 . il fallait les combiner à des polymères hydrophobes et filmogènes. Dans ce contexte. Ces polymères. En effet plusieurs d’entre eux sont déjà utilisés dans le domaine médical. de mise en œuvre simple (dépôt par évaporation de solvant) possèdent les qualités mécaniques requises pour l’enduction de stents appelés à subir de grandes déformations plastiques : souplesse et adhérence au substrat. La nature amphiphile de nos films permet d’envisager de les charger en principes actifs de nature hydrophile ou hydrophobe. ils ne sont pas filmogène et sont généralement solubles dans le milieu aqueux. Les revêtements obtenus à partir de ces copolymères sont insolubles en milieu aqueux et sont parfaitement stables dans les fluides biologiques. Nous nous sommes alors intéressés aux polysaccharides qui peuvent moduler l’activité cellulaire. L’héparine. Les stents dénommés « bioactifs » utilisés actuellement en clinique comporte des agents antimitotiques et immunosuppresseurs.Conclusion Conclusion L’objectif de ce travail concernait la mise au point d’un revêtement bioactif pour stents métalliques dans un but de limiter la resténose intra-stents. Afin de rendre les polysaccharides compatibles avec l’utilisation envisagée. ces molécules agissent indifféremment sur les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales.

Les travaux réalisés ouvrent ainsi la voie. sur l’interaction de ces surfaces avec des constituants protéiques impliqués dans l’adhérence cellulaire. Les propriétés énumérées ci-dessus font des copolymères polysaccharide/polyacrylate d’excellents matériaux innovants pour des applications biomédicales.Conclusion anticoagulant utilisé en clinique humaine. sur les possibilités de délivrance locale de principes actifs (agents pharmacologiques. sont également introduits dans la composition du film de recouvrement du stent. Ceci permet donc d’adapter la composition aux propriétés physiques ou biologiques souhaitées. devront être réalisées. en particulier dans le domaine cardiovasculaire. des essais d’hémocompatibilités (in vitro) et d’implantation in vivo chez le lapin. agents de thérapie génique). Des expériences complémentaires et en tout premier lieu. D’autres polysaccharides comme les fucoidanes. Cette approche est tout à fait dans l’expertise du laboratoire Inserm U698. peut ainsi être introduit par ce procédé dans le recouvrement de stents. très étudiés au laboratoire pour leurs effets dans le domaine cardiovasculaire. La technique de synthèse et de recouvrement est donc adaptable à une large gamme de polysaccharides et à une grande variété de monomères. et sur la validation préclinique et clinique de ces matériaux. 170 . nous l’espérons à de futures études plus détaillées sur le mécanisme de copolymérisation.

Références bibliographiques Références bibliographiques 171 .

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Annexe 181 .

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2008 Revised August 22.Table of Contents | Journal Home Page | Search the Journals ASAP Biomacromolecules. 93430 Villetaneuse. The thermomechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass-transition temperature and a marked difference with the two homopolymers. C. Interestingly. 99 Avenue Jean-Baptiste Cle! ment. and D. 2008 Copyright © 2008 American Chemical Society Full Text HTML Download Citation Purchase Article Synthesis and Characterization of a New Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer for Three-Dimensional Hybrid Hydrogels S.1021/bm800470z Web Release Date: October 1. and viscosimetric analysis. . ASAP Article. Institut Galile! e. we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. 10. could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). U698. In conclusion. Bio-inge! nierie de Polyme" res Cardiovasculaires. the copolymer. acrylic monomer. this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as a 3D scaffold or for coating in biomedical applications. In this context. 2008 Abstract: Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran by the use of ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium. and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail. proliferation. but not dextran or PMMA. The obtained polymers were studied by solubility measurements. Letourneur* Inserm. Fourier transform infrared spectrometry. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion. and morphology after 5 days in culture on these gels. Universite! Paris 13. M. T. 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The effects of concentrations of dextran. France Received April 29. Indeed. Avramoglou. Derkaoui. Barbaud.

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Interestingly. and dextran) and conditions of solubilization allowed us to obtain 3D structures that are compatible with human cells with new hybrid thermomechanical properties. Derkaoui. Indeed. acrylic monomer. Barbaud.4 4.8 3.27-29 * To whom correspondence should be addressed.1 7. 9.2 resorbable implants. dextran. Avramoglou.4 1. France Received April 29. THF or a 20/80 (v/v) Mixture of Water and THF reagents solubility in dextran Ce(IV) MMA H2O/ copolymer (mol × (mol/L × (mol/L × yield THF -6 -4 -2 DM 10 ) 10 ) 10 ) (%) H2O THF 20/80 DM0 DM1 DM2 DM3 DM4 DM5 DM6 DM7 DM8 DM9 DM10 DM11 DM12 DM13 DM14 DM15 0 1. M. Letourneur* Inserm. 99 Avenue Jean-Baptiste Cle ´ ment. 2008. we used dextran for the graft copolymerization of an acrylic monomer with ceric ammonium nitrate as the initiator.7 3. E-mail: didier.3 and matrices for tissue engineering and coating of biomaterial surfaces.8 1.2 2.8 1. In conclusion.7 3. In this context. For coating purposes. and viscosimetric analysis.1021/bm800470z CCC: $40. we synthesized grafted amphiphilic copolymers and made homogeneous 3D structures endowed with viscoelastic properties.8-11 For instance. and Monomer (MMA) Concentrations on the Yield and Solubility of a Series of Copolymer DMs in Water. Indeed. the development of new biocompatible polysaccharide materials is still an intense area of research in the field of polymeric biomaterials.8 1. 93430 Villetaneuse. Other investigators have used this strategy with heparin. The obtained polymers were studied by solubility measurements. and ceric ions on the copolymerization yields were investigated in detail.8 1.8 1.7 1.0 1.24-26 In fact. acrylic monomer. Effects of Dextran.3 14.12-15 Among the wide family of polysaccharides.8 7. Institut Galile ´ e. Universite ´ Paris 13.2 2.0 3.8 1.3 2.4 4.1 drug delivery systems. T. but not dextran or PMMA.4-7 However.7 3. U698.0 1. proliferation.7 1.fr. Fourier transform infrared spectrometry.30-34 The different parameters (concentrations of initiator. combining the advantageous properties of natural and synthetic polymers is often a challenge because of the immiscible features of such polymers. both polyacrylate and polysaccharides are already used in preclinical or clinical applications.2 2. and D.7 3.7 3.2 2.75 © 2008 American Chemical Society Published on Web 10/01/2008 . In this study.7 3. the copolymer. such hybrid polymers must be stable and resist deformation.1 7.4 4. Indeed.10.2 2.0 1.7 0 13 18 17 15 19 11 23 21 19 25 48 37 21 15 11 + + + + + + + + + + + + - The present work describes a simple and reproducible method for synthesizing new amphiphilic materials that are suitable for biomedical applications.1 7.8 3.4 4. and morphology after 5 days in culture on these gels.0 1.8 1. We used an acrylic monomer for the hydrophobic structure and polysaccharide as a hydrophilic part. The aim of our study was to obtain hybrid materials in which the physicochemical and biological properties of the two components are well combined. the hydrophobic part of the polymer may act as drug carrier.7 3. 2008 Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. Fax: +33 1 49 40 30 08.letourneur@galilee.Biomacromolecules 2008. whereas the hydrophilic part ensures biological interactions.8 1. In this context. Introduction Polymers are widely used for their tailor-made properties and represent the largest class of materials for biomedical devices such as vascular grafts. Initiator. C.1 14.4 4. Bio-inge ´ nierie de Polyme ` res Cardiovasculaires.univ-paris13. a well-known acrylic monomer (methyl methacrylate) was polymerized and grafted onto the polysaccharide dextran by the use of ceric ammonium nitrate as a redox initiator in aqueous nitric acid medium.1 7. The cytocompatibility of the copolymer with human endothelial cells was evidenced by the normal cell adhesion. Table 1. The effects of concentrations of dextran.8 1. The thermomechanical properties of the resulting copolymer analyzed by differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis showed the occurrence of a single glass-transition temperature and a marked difference with the two homopolymers. it would be advantageous to combine hydrophilic and hydrophobic polymers to develop biomaterials for drug delivery. could be dissolved in water/THF (20/80 v/v). 10. 3033–3038 3033 Synthesis and Characterization of a New Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer for Three-Dimensional Hybrid Hydrogels S. Dextran also allowed easy chemical substitutions for the coupling to or the mimicking of biological molecules. or carrageenan. heparin16-19 and dextran20-23 have largely demonstrated interesting properties for use in biomaterials. we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties.3 14. Revised Manuscript Received August 22.1 7. this type of copolymer with hybrid properties of two biocompatible macromolecules could be of great interest as a 3D scaffold or for coating in biomedical applications.

all products were lyophilized twice with deuterium oxide (D2O).4 × 10-4 mol/L) and 2 mL of methyl methacrylate were simultaneously added to the reaction mixture. Homopolymer was extracted with acetone. Solvents were of the highest commercially available purity. and the flask was immersed in a thermostatted oil bath and was purged by nitrogen gas. Dextrans of different molecular weights (MW ) 10. Before use. Infrared spectra of polymers.35-38 The general experimental procedure was as follows: The reactions were carried out in a 1 L five-necked flask equipped with a stirrer and condenser. After the complete dissolution of the polysaccharide to form a homogeneous solution (10 min). The obtained copolymer was named dextran-graftpoly(methyl methacrylate) (DM).5 mg) were ground with KBr powder (150 mg) and were pressed into pellets for FT-IR examination. Then. 5 mL of solution of Ce(IV) (2. PMMA. A standardization curve was drawn (viscosity vs molecular weight) with dextrans of various molecular weights dissolved in DMSO. 11. 80. Table 2. (a) PMMA. 40. 13 C NMR spectra of copolymer DM in deutered DMSO. Infrared Spectral Analysis. and it was concentrated with a rotavapor. I: insoluble.3 mm diameter). The temperature was regulated at 25 °C by a circulating bath. . Dextran (70 kg/mol) was also used for synthesis (see below). and 264 kg/mol) were purchased from Sigma for molecular weight assessment. Water/THF mixtures are v/v. Pure copolymer was dried under vacuum and was weighed. Vol. at 80 °C under vacuum for 24 h. In the typical reaction. (b) dextran. the reaction product was allowed to cool at ambient temperature. NMR Analysis. Characterizations.3034 Biomacromolecules. followed by distilled water. and (c) copolymer DM. Graft Copolymerization. Experimental Section Products. and the reactor was placed in an oil bath at 40 °C. Dried samples (1. The infrared spectra of dextran. We prepared solutions by dissolving the copolymer in the same solvent (DMSO). Viscosity Measurements. 70.7.2 M). Methyl methacrylate monomers were obtained from Acros France and were purified by washing with 5% NaOH and 20% NaCl. Ammonium cerium(IV) nitrate (Acros France) was dried Figure 2. Figure 1. The mixture was raised to pH 8 by the addition of NaOH aqueous solution (10 M). The purified copolymer was frozen at -20 °C and lyophilized for 24 h. Tetramethylsilane (TMS) was used as an internal standard. and after 40 min. 13C NMR spectra of dextran. and copolymer DM were recorded by the use of a Varian Gemini 200 MHz spectrometer in deutered dimethyl sulfoxide-d6 at ambient temperature. Exactly 1. Omnic software was used for data acquisition and analysis. 70 kg/mol) was dissolved in 500 mL of nitric acid (0. No. 9. Solubility of the Studied Polymers in Various Solventsa polymer solvents water DMSO dichloromethane acetone chloroform dioxane THF water/THF 10/90 20/80 50/50 a dextran S S I I I I I I I I PMMA I S S S S S S I I I copolymer DM I S I I I I I I S I S: soluble.000 g of crude dried product was taken and extracted in a Soxhlet for 24 h to remove the homopolymers and the remaining products. We synthesized the copolymers by varying the concentrations of dextran and ammonium cerium(IV) nitrate and the concentration of acrylic monomer in the reaction mixture by radical polymerization with a ceric ion/nitric acid redox initiator in aqueous medium. Viscometric measurements were carried out by the use of an Ubbelohde capillary viscometer (0. It was dried in a vacuum oven at 60 °C for 24 h. followed by three washes with 50 mL of distilled water to remove cerium ions and the dextran that did not react. the product was poured into 200 mL of methanol to induce precipitation. 2008 Derkaoui et al. dry dextran (0. and copolymer DM were obtained from a PerkinElmer 1600 spectrometer.5 g. The particle suspensions were dialyzed under water for 48 h and were washed twice with 50 mL of EDTA (10-2 M). PMMA.

Preparation of Three-Dimensional Structures. Cells were cultured with DMEM (Gibco) with 4. two consecutive scans were carried out on each sample. respectively) in a humidified incubator. Results and Discussion Copolymerization Conditions for Dextran-graft-poly(methyl methacrylate) (DM). 9.5 g/L of glucose and 2% L-glutamine supplemented with 10% calf serum and 1% penicillin and streptomycin. Vol. storage modulus. All 3D structures were extensively washed with water before any biological and mechanical assays. the cell morphology on films was directly observed by conventional optical microscopy. HUVEC Cell Culture. The glasstransition temperature (Tg) of the polymers was taken as the midpoint in the shift of the heat flow baseline. The cells were incubated for 5 days at 37 °C in CO2/air (5 and 95%. A morphological analysis of the cross section of films was carried out by the use of a Leica S-440 scanning electron microscope (SEM). Copolymer DM was dissolved in 1 mL of THF/H2O (80/20) that was treated in an ultrasonic bath for 1 h. In each case. and (d) dextran + PMMA. For all cell cultures. DM) was analyzed with a Setaram DSC131 thermal analyzer operating in combination with the liquid nitrogen cooling accessory. the yield was quantified and the solubility of copolymer Figure 4. Dextran could not be used because this polymer gave any film. an amplitude of 5 µm. 2008 3035 Figure 3.035 mm3 were analyzed on the dynamic mechanical analyzer DMA Q800 (TA Instruments). For the study of graft polymerization. Dextran gave any 3D structures. (c) copolymer DM. The equipment was operated in a single cantilever bending mode at a frequency of 1 Hz. Human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) were obtained from ATCC. Dynamic Mechanical Analysis (DMA). Figure 5. No. and samples were passed in a temperature range of -50 to 200 °C at a heating rate of 10 °C/min. DSC thermograms of (a) dextran. With the transparency of 3D structures. PMMA. and tan δ of films that were obtained from PMMA as well as copolymer DM. DMA was used to analyze the loss modulus. solutions were poured in Petri dishes for 24 h at room temperature in a saturated atmosphere of THF and in the presence of CaCl2 to absorb water.Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer Biomacromolecules. To obtain discs. . (a) Morphology of DM disk after controlled evaporation and (b) SEM image (cross section) of a thin DM film. We prepared discs or films by using dried homopolymer PMMA (15 mg) solubilized in THF. Thin films were stripped from the mold and were dried in an oven at 30 °C. A simple mixture of dextran and PMMA was also used as control. Viscometric results obtained with copolymer DM in DMSO. films were sterilized by the exposure of each surface sample to UV light at 254 nm for 15 min. 11. They were seeded on either tissue culture plates or films at a cell density of 5 × 103 cell/cm2. and a heating rate of 3 °C/min from -100 to 200 °C. The furnaces were purged with nitrogen. Thermomechanical Analysis. Differential Scanning Calorimetry (DSC). (b) PMMA. Films of 15 × 5 × 0. The thermal behavior of polymers (dextran.

In contrast with dextran and PMMA. and the solubility of these compounds was not found (Table 1). a simple physical mixture of dextran with PMMA exhibited two distinct transitions (Figure 5d). as reported in the Experimental Section. (a) Storage modulus. In the case of natural evaporation. all peaks of dextran are located between 65 and 100 ppm. Physicochemical Characterizations of Copolymer DM. 0. The 13C NMR spectroscopy was also used to confirm the percentage of dextran in the copolymer quantitatively. Vol. THF) but was soluble in a mixture of water/THF (20/ 80). The extrapolation of the viscosity value for copolymer DM gave an apparent molecular weight of 140 kg/mol. and copolymer DM. and initiator have a significant effect on the polymerization with yields ranging from 10 to 50% (Table 1). A single Tg was obtained at 126 °C for copolymer DM (Figure 5c). (b) loss modulus. respectively. The thermograms are reported in Figure 5. The viscosity of copolymer DM (η ) 0. By increasing the dextran content (DM13. peak f is attributed to C-CH2 of dextran at 68 ppm. no polymer was formed. including 37 °C. the solution containing copolymer DM could be molded in Petri dishes after evaporation for 24 h at room temperature. the only common solvent (Table 2) for dextran. Copolymer DM exhibited a broad absorption band characteristic of hydroxyl groups of dextran at 3400 cm-1 and an additional band of carbonyl groups at 1730 cm-1 of acrylic polymer. In the absence of dextran. and peak j is attributed to the carbonyl groups (CdO) of PMMA at 180 ppm. dextran. Results showed that the weight of dextran. DM was tested. Interestingly. Scanning electron microscopy provided additional information on morphology. films presented microphase separation and became opaque and brittle. Then. As reported in literature. and copolymer DM. acetone. and copolymer DM are presented in Figure 1. The optimum conditions for DM11 were thus kept for the following study. The morphologies of dry DM films were influenced by the evaporation conditions. Dextran gave any film. We determined the reaction conditions that afford the maximum percentage of grafting of monomer onto dextran (0. In all other experiments. copolymer DM was insoluble in water. The optimum conditions for polymerization were 143. The spectra reported in Figure 2 for copolymer DM showed the characteristic peaks of PMMA and dextran. chloroform. We then confirmed the hybrid property of copolymer DM by solubility measurements (Table 2). we calculated that the copolymer contains 30% dextran. polymerization occurred after 10 min of addition of the Ce(IV) and monomers and led to the formation of suspensions of colloidal particles. Preparation of Three-Dimensional Structures. DM14 and DM15). Figure 4b evidenced the compact and homogeneous structure of a thin DM film. The Tg values of the two homopolymers dextran (Figure 5a) and PMMA (Figure 5b) were 152 and 118 °C. PMMA. This value is thus intermediate as compared with the homopolymers. and 37 mmol/L of dextran. and (c) tan δ as a function of temperature. In contrast. whereas in the case of controlled evaporation for both solvents (THF and water).48) was higher than the viscosity of the starting 70 kg/mol dextran (η ) 0. 2008 Derkaoui et al. 11. By comparing peak integrals assigned to dextran and PMMA (the a/j ratio) in copolymer DM.24.3036 Biomacromolecules. peak k is attributed to PMMA (O-CH3) at 55 ppm.2-4) × 10-4 mol/ L) and methyl methacrylate ((1. Figure 6. PMMA.2-3.37). In contrast with dextran.125 to 2 g/L) by varying the concentrations of ceric ammonium nitrate ((1. Semiquantitative analysis gave a 20-30% ratio of dextran in DM copolymer. the compounds DM1 to DM12 were found to be soluble in a mixture of water/THF (20/80 v/v). which is the working temperature . Thermomechanical Analysis of Copolymer DM. Dynamic mechanical spectra of PMMA (---) and copolymer DM (s). we obtained lower yields. Interestingly. The determination of the glass-transition temperature was carried out for dextran. homogeneous and transparent structures were obtained (Figure 4a). 9. monomer. Infrared spectra of pure PMMA. No. Ce(IV) and methyl methacrylate. Dynamic mechanical analysis enables the assessment of the mechanical behavior of the 3D structures over a large range of temperature. Figure 3 represents the intrinsic viscosity versus the known molecular weight of various dextrans in DMSO. dioxane. copolymer DM could be dissolved in a 20/80 mixture of water/THF (Table 2). the resulting films from copolymer DM were found to be insoluble in water (in contrast with dextran) even after days of immersion and were thus suitable for being tested in biomedical applications. copolymer DM was insoluble in most organic solvents (dichloromethane. In contrast with PMMA.7) × 10-2 mol/L). respectively. chemical shift a at 100 ppm is attributed to the anomeric carbon of the glucose unit of dextran. The polymerization yields are presented in Table 1. The 13C NMR spectra were recorded for the copolymer DM in deutered dimethyl sulfoxide-d6.

2008 3037 Figure 7. (DMSO is the only common solvent to dextran-PMMADM. which will be studied in detail for vascular biomaterial purposes. and DSC for copolymer DM as well as dynamic mechanical spectra evidenced a single Tg. in which the complex dissociates and gives rise to free radical sites onto oxygen of the polysaccharide. and (c) tan δ. we were able to obtain a compound with a peculiar behavior. The Figure illustrates three parameters: (a) the storage modulus (E′). (a) Dextran. The results in Figure 6 are reported for DM and PMMA because dextran gave any film.5×). The adhesion of cells to the transparent DM films was directly observed under the microscope. respectively. both polymers showed a continuous decrease in the storage modulus with increasing temperatures (Figure 6a). Vol. which induced changes in both the storage and the loss modulus. These results strongly suggested a high compatibility with human cells of these structures. as shown in Figure 7. Cell density strongly increased from sparse cells to an almost confluent layer on the DM surface after 5 days. No. which is the ratio (E′′/E′). and the . Studies were performed to evaluate the in vitro cytocompatibility of DM films with HUVECs. 9. Graft copolymerization of the acrylic monomer onto polysaccharide was carried out by the use of acrylic monomer and Ce(IV) as an initiator. The maximum signal of tan δ is related to the molecular mobility transition. Cell Biocompatibility. The proliferation of HUVECs was also studied until 5 days after seeding at low cell density. these results evidenced the hybrid properties of the resulting copolymer DM structures that are significantly different from the two corresponding homopolymers. such as the glass-transition temperature in DSC thermograms. the proposed mechanism for grafting is outlined in Figure 8. Indeed. and no morphological alterations were observed as compared with control cultures. and THF/water is only for copolymer DM. dextran and PMMA. All together. The loss modulus curve for copolymer DM was clearly shifted to higher temperatures as compared with that for PMMA (Figure 6b). The morphology of cells on DM films was normal. As expected.10 Copolymerization Scheme. Surfaces of DM films were not previously modified with cell adhesive proteins or peptides before cell cultivation. (b) dextran oxidation by Ce(IV) with the formation of free radicals. Adhesion studies demonstrated that human endothelial cells (HUVECs) adhere and proliferate on DM film (original magnification 12. Figure 8. (2) chain propagation. The temperature dependence of tan δ (Figure 6c) showed a maximum peak that was also used for the determination of the glass-transition temperatures of PMMA (109 °C) and DM (141 °C). as previously reported by others. 11. and (c) grafting of acrylic monomers on free radicals.Polysaccharide-graft-polymethacrylate Copolymer Biomacromolecules. (b) the loss modulus (E′′). (This representation does not imply that all glucosidic units are substituted. Schematic representation of the proposed polymerization process. Data indicated a storage modulus E′ at 37 °C of 4100 and 5700 MPa for DM and PMMA.30-38 By adjusting the different conditions indicated in the Experimental Section.) for biomedical materials. In contrast with a linear dibloc polymer.) Thermomechanical properties were also evaluated above. the solubility experiments evidenced a narrow range of solvents for copolymer DM. The differences with DSC values were attributed to the presence of water tightly associated with polymer. The overall mechanism of copolymerization would consist of three steps: (1) free radical formation in which the hydroxyl groups of dextran form a complex with ceric ions.

J. 177–184. 1163–1167. Sollott. Res. Kim. Ed. (9) Blondin. D. C... Carbohydr. A. T. G. A. Yoon. (15) Guo. R. Y. I. Polymer 2001. (28) Kirkpatrick. 5546–5553. C. K. Prog.. Jozefonvicz. W. Biomaterials 1989. A. 2007. 176–183. G. A. L. J. 2000. C. C. 519–527. Feldman.. D. D. H. S. G. G..... 1604–1609. 19.. 1451–1455... Shen. (22) Thomas. F. Letourneur.. Biomaterials 2000. Recent Pat. R.. F.. Peters. and IFR Paris Nord-Plaine de France. C. A. Michel.. 22. D. J. 2008 Derkaoui et al.. U. Nater.. C. Pharmacol. Van Luyn. 140–147. Bjorklund. M.. Immunol. Michel. Le Visage. K. Bunge. J. Sele ´ n. 2231–2238.. L. C. Hazer. A. Vasc. S. 3281–3293. A. F.. (8) Logeart. C.. Biomol. Jozefonvicz. 385–390. M.. 50. P. (21) Huynh. 2006. Patel. 75–83. Louedec. 2001. F. Otter. E. L. J.. Colliec-Jouault. 33. (20) Deux. A. J. G. 2001. F. S. 1–15.. Chaubet. Bioconjugate Chem. 61–67. T. Letourneur. B. E. 10. C. 9. Polymer 2004. J.. Ce ´ dric Lorthioir (CNRS Thiais. (12) Lee. (2) Kavanagh. Chaubet. 2289–2295. acrylic polymer chain propagates.. Bataille. A. 2005... Mix. Boudghene. K.. D. 16. D.. D. K. S. Chen. Ther. C. Mater.. A.. C. R. (3) De Groot. Autissier. D. 1995. D. J.. M. Polym. Y.. Black. Marchant. W.. R. G. (16) Christensen. Crit. Therefore. F. Polym. P.. (30) Yagci.. 47–62. Boudghene.. BM800470Z . C. F.. Sci. Sci..39 Materials with improved mechanical properties were thus obtained by the controlled reaction of dextran with acrylic monomer using ceric ammonium nitrate. L. F. J. 4846–4855.. M. W. hybrid polymeric materials that are obtained from copolymerization between a synthetic acrylic monomer and a polysaccharide such as dextran could provide new biocompatible materials with improved properties. Lechner.. 2002. (11) Pereira.. 35. Maillet. and (3) termination of the chain by the recombination of radicals.. K. Hruban. J. J. 3559–3567. 18. R. B. Hunt. D. 2001. 27.. Surg. Le Visage. 973–981. S. S.. France) for excellent technical assistance in DMA tests and E. Cadee. D. Vasc.. D. M. H.. Assoul. Int. Biomaterials 2005. Thromb. E. A. (36) Shah. N. Rappuoli. B. R. ReV. A 2008.. 6018–6027.. W.. I. S.. 669–697. Vilela-Silva. 331.. W. 39.. Letourneur. M. No. B. J. D. W. (13) Yang.. Hunter. Jozefonvicz.. Nilsson. R.. K. 23. 2008... (26) Thomas. 8. Gallagher.. S. Couvreur. 1996. F.. J. Polym. School of Medicine) for NMR spectra. Letourneur. J. 1999. Valente... Kazatchkine. Polym..: Mater. 2002. Durand.. F..... 1017–1022. M. Vauthier. Biomaterials.. Bareille. Kuo.......... Kligman. Lin. J. R. Guenin (University of Paris 13. L.. P. Froehlich. P. 511–516. M. the obtained copolymer DM formed 3D homogeneous and transparent structures such as thin films or discs and was very compatible with human endothelial cells. Conclusions The purpose of this work was to study the copolymerization of dextran with methyl methacrylate. Prigent-Richard. Keenan. Letourneur. I. Cheng. Avramoglou.. (7) Heldman.. 327–375. W. Bree. 1. H. A. Vauthier. Ferrarini. (18) Larsson. 79. 26. 211–217. S. Chaubet. A. 41. 27. Tissue Eng. J. (32) Bertholon. Unger.. D. Chang.. J. E. Maillet.. L. 1999. R. P. T. 1197–1203. A. Biomater.. Boisson-Vidal.. Macromolecules 2003. G. Polym. W. the morphological analysis indicated that graft copolymers were more stable than the homopolymers. Polym. P.. H. 1457–1466. 102... E. A. J. M. 2002.. J.. A. N. Kinsella. Xu. 1995. H. 2001. How.. Puvion. Vassy. P. R. (23) Bittoun. Jozefonvicz... A. 54. Letourneur.. Acknowledgment.. I. J. P. J. 103. (17) Pekna. Portes. F. Barratt. Kazatchkine. Henin. E. (33) Chauvierre. Rajendran. Larsson. E. Letourneur. M. M. Letourneur. the University of Paris 13. F. Biol. V. Pelle. M. H. K. J. Plantinga. Starch 2002. 17. J. R. Trivedi. Krump-Konvalinkova... C. E. Liu. J. Chen.. W. Meddahi-Pelle. This work was supported by Inserm. 247–255... Experiments are currently in progress to define the precise structure of this promising biocompatible copolymer definitively.. Macromolecules 2006. Carbohydr. Rochev. Abella.. 32. Biochem. A.. Brinker. 10. H. Consumi. (6) Larsen. Eur. Heller. C. B. Ware. Med. E. Jozefonvicz. D. Y. Biomaterials 2001. L. J. J. C. (5) Takahashi. C. J. Jozefonvicz. 2004. 1998. F.. Zohuriaan-Mehr. D. 74. 339–345.. S. Dulcy Evangelin.. M. (24) Baudys. J. Formgren.. 36. A.. J. Dawson. J. Yildiz.. Bittinger... R.. A. M... Otto. Cell Biol 1997. 45. L. Carbohydr. Feng.. 121–130. A. Biomater. K. Mol. T. H. B. We thank Dr. D.. Le Blanche. J. E. Prigent-Richard. P. N. 2000. F. Kottke-Marchant. Mourao. 14. D. J. 189–192.. H.. 203–208. Feldman. Elgue. 354–359.. (29) Thebaud. Mater. F. B. Huh.. Thermal and mechanical analysis evidenced intermediate properties between acrylic polymer and dextran. 42. W. Eur. F. D. H. 35. Emanuelsson. Fischer.. M. F. 5913–5921. Deval. P. Muthulakshmi. Magnani. Bordenave.. References and Notes (1) Feugier. Eng. (31) Ramana Reddy. Res. P. B. Res. 21. Carbohydr. P. Pierron.. Sci. Ther. D. Jenkins. P. Circulation 2001. Biomaterials 1993. Indeed. Arterioscler.19.. Kang.. (4) Barbucci.. 643–648.. Letourneur. Letourneur. Biomaterials 2001. 29–40. Jozefonvicz. U. Labarre. M. A. C.3038 Biomacromolecules. C. Lakatta. C. Biomacromolecules. H. Bataille. Grainger. 22.. Crepin. 9. C. B. P. Nordmeier. Fermandjian. K. Y. Larsson. 14. Res. Chaubet.. L. B.. (25) Passirani. D. (34) Pourjavadi. C. J. V. Biomaterials 2006. L. (35) Arslan.10. S. (39) Abed.. D. S. Labarre.. A. S. D.. Sci. S. 11. D. Vol. 119–125.. a peculiar solubility of the copolymer was found in mixtures of THF/H2O. F. d’Angelo. Kim. 349–355.. Labarre. 22. Hennink. (38) Mahner. 2007. S. These compounds were chosen to be model systems for copolymerization of polysaccharides with polyacrylates that are able to be included in bioartificial polymeric materials.. 332. S. (37) Huang. Drug Carrier Syst.. Furthermore... Larsson. V. M. H. 611–646.. W.. (10) Chaouat.. 337. (14) Deux.. 26. Logeart-Avramoglou. J. Biomaterials.. (27) Avramoglou. Eur. 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.

The biological and mechanical properties of the two components are well combined in these copolymers. Vascular Smooth Muscle Cells. Le revêtement d’endoprothèses vasculaires métalliques (stents) avec ces copolymères est uniforme et lisse. des monomères acryliques ont été greffés sur des polysaccharides à l’aide du cériumIV. Les résultats montrent que les stents métalliques enduits avec certains copolymères améliorent la prolifération et migration des cellules endothéliales et inhibent la prolifération de cellules musculaires lisses. characterization and biocompatibility Hybrid materials constituted by hydrophobic and hydrophilic biocompatible macromolecules are useful for biomedical applications. with neither cracks nor detachment after balloon expansion. in particular in the cardiovascular field. Results evidenced that a stent coated with some of these copolymers improved proliferation and migration of endothelial cell and inhibited proliferation of vascular smooth muscle cells. Polybutylmethacrylate. nous avons trouvé des conditions afin de réaliser des films minces transparents et homogènes ou des structures 3D avec les propriétés hybrides. Copolymer. we found conditions to form transparent and homogeneous thin films or 3D structures with hybrid properties. sans craquelure ni détachement après une expansion au ballonnet. Abstract Title: Bioactive coating for bare metal stent: Synthesis. Stent. Ces copolymères sont ainsi d’excellents matériaux innovants pour des applications biomédicales. . Endothelial Cells. Dans ce contexte. Proliferation and migration. Keywords Dextran. en particulier dans le domaine cardiovasculaire. Les copolymères obtenus combinent les propriétés biologiques des polysaccharides et les propriétés mécaniques des polyacrylates. De façon intéressante. These copolymers appear as excellent innovating materials for biomedical applications.Résumé Les matériaux hybrides constitués de macromolécules hydrophiles et hydrophobes sont d’un grand intérêt dans le domaine biomédical. The resulting coating of endovascular metallic prosthesis (stent) with copolymer was smooth and uniform. In this context. a well-known acrylic monomer was polymerized and grafted onto various polysaccharides using ceriumIV. Interestingly.