Universidade Federal do Rio de Janeiro Daniele Gabriel Costa

MELHORA DA DISFUNÇÃO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCÁRDIO APÓS TRATAMENTO COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Rio de Janeiro 2011

Daniele Gabriel Costa

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MELHORA DA DISFUNÇÃO VENTRICULAR INDUZIDA PELO INFARTO DO MIOCÁRDIO APÓS TRATAMENTO COM 3,4 METILENODIOXIBENZOIL-2TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294)

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Farmacologia e Química Medicinal).

Orientadores: Prof.a Dra. Gisele Zapata Sudo Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo

Rio de Janeiro 2011

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FICHA CATALOGRÁFICA

Costa, Daniele Gabriel. Melhora da disfunção ventricular induzida pelo infarto do miocárdio após tratamento com 3,4 metilenodioxibenzoil-2tienilhidrazona (LASSBio-294) /Daniele Gabriel Costa – 2011. 111 fl.: il Tese (Doutorado em Farmacologia e Química Medicinal) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, Rio de Janeiro, 2011. Orientadores: Gisele Zapata Sudo e Roberto Takashi Sudo. 1. LASSBio-294 2. Infarto do miocárdio 3. Remodelamento cardíaco 4. Fluxo de cálcio intracelular I. Zapata-Sudo, Gisele (Orient.). II. Sudo, Roberto Takashi (Orient.). III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal. IV. Título.

Aprovada em: 22 de fevereiro de 2011. Roberto Coury Pedrosa. Roberto Takashi Sudo. Gisele Zapata Sudo. Dra. Carlos Alberto Manssour Fraga. Dr. Dr. Faculdade de Farmácia/UFRJ _______________________________________________________________ Prof.4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294) Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Farmacologia e Química Medicinal).4 FOLHA DE APROVAÇÃO Daniele Gabriel Costa Melhora da disfunção ventricular induzida pelo infarto do miocárdio após tratamento com 3. Valéria do Monti Nascimento Cunha. Dr. Dra. _______________________________________________________________ Profa. Emiliano Medei. ICB/UFRJ (Orientador) _______________________________________________________________ Prof. IBCCF/UFRJ (Suplente) . José Hamilton Matheus Nascimento. Dr. IBCCF/UFRJ _______________________________________________________________ Prof. Dr. ICB/UFRJ (Revisora) _______________________________________________________________ Prof. HUCFF/UFRJ _______________________________________________________________ Profa. ICB/UFRJ (Orientadora) _______________________________________________________________ Prof.

Diogo Gabriel Costa e Débora Gabriel Costa.5 Este trabalho é dedicado aos meus pais. Aos meus irmãos. Aos meus tios. Rogério Pires de Mello Neto. Claudio Luiz Gabriel Costa e Tania Mara Gabriel Costa. À Daisy Ribas Carestiato. primos e amigos que me acompanharam nesta caminhada. . Ao Dr.

Bruno Pinheiro. Fernanda Antunes. Profa. Profa Dra. Profa. Rodrigo Fortunato. PhD. Daniele Leão Ignácio e Carlos Magno Ramos. Daisy Carestiato. Dr. Camile Costa Branco Pinheiro. Dra. Tatiana Fasolari e Bruna Baffa. PhD. Priscilla Martins Vidal. Dr. Paula Lima do Carmo. em especial meus pais. À revisora: Profa Dra Valéria do Monti Nascimento Cunha. Andrea Deslandes.6 AGRADECIMENTOS: À minha família. MSc. José Hamilton Matheus Nascimento e Prof. Dr. Dr. Tania Brum. Rogério Pires de Mello Neto. Fernando Monteiro Sabóia Pompeu. Carlos Alberto Manssour Fraga. Jaqueline Soares dos Santos. Prof. Luana Braga Pontes. . Aos membros da banca: Prof. Aos amigos do laboratório em especial MSc. Celso Caruso-Neves. Aos meus orientadores: Profa Dra Gisele Zapata-Sudo e Roberto Takashi Sudo. Luana Braga Pontes. Ao Prof. Dr. Prof. MSc. Prof. As técnicas do laboratório Marly e Silvania. Roberto Coury Pedrosa. Virgínia Lima. Dra. Dr. Dra. irmãos e tios. Thiago Lemos de Carvalho. Aos meus amigos Dr.

6 – isoforma 12. N'.2 – canal de cálcio tipo-L DMSO – dimetilsulfóxido dP/dt máx. N. N'.7 LISTA DE ABREVIATURAS α-actina – subtipo alfa da actina ACh – acetilcolina A(2) – subtipo 2 do receptor de adenosina A(2A) – subtipo 2A do receptor de adenosina A(2B) – subtipo 2B do receptor de adenosina ACDA – artéria coronária descendente anterior ADP – adenosina difosfato AHA – American Heart Association AMPc – adenosina monofosfato cíclico ATP – adenosina trifosfato Ca2+ .6 da proteína ligadora de imunossupressores FO – falso-operado GAPDH – gliceraldeído fosfato desidrogenase GDP – guanosina difosfato GTP – guanosina trifosfato HEPES – ácido N’-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanolsulfónico IC – insuficiência cardíaca ip – intraperitoneal IM – infarto do miocárdio .cálcio calmodulina cinase do tipo II Cav1. – relação da derivada da pressão e derivada do tempo máxima diastólica ECA – enzima conversora de angiotensina EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético EGTA – K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-éter)-N. – relação da derivada da pressão e derivada do tempo máxima diastólica dP/dtmin.íon cálcio CaCl2 – cloreto de cálcio CAMKinase II .ácido tetraacético FC – frequência cardíaca FKBP-12.

íon potássio LASSBio-294 – 3.4 metilenodioxibenzoil-2-tielnilhidrazona M2 – subtipo 2 do receptor muscarínico MyBP-C – proteína ligadora de miosina do tipo C MLC2 – subtipo 2 da cadeia leve da miosina MLP – proteínas LIM musculares NCX – trocador sódio-cálcio Na+ .8 ICa – corrente de influxo de cálcio IfNa+ – corrente de sódio de curta duração IL6 – interleucina 6 IL10 – interleucina 10 KACh – canais de potássio dependentes de acetilcolina KATP – canais de potássio dependentes de adenosina trifosfato K+ .íon sódio Na+/K+ ATPase – bomba de Na+/K+ NO – óxido nítrico iNOS – enzima óxido nítrico sintase induzível NYHA – New York Heart Association O2 – átomo de oxigênio PAS – pressão arterial sistólica PAD – pressão arterial diastólica PAM – pressão arterial média pCa – potencial de cálcio PDE – fosfodiesterase PDE1 – isoforma do tipo 1 da fosfodiesterase PDE3 – isoforma do tipo 3 da fosfodiesterase PDE7 – isoforma do tipo 7 da fosfodiesterase pH – potencial de hidrogênio PK – proteína cinase PKA – proteína cinase do tipo A PKC – proteína cinase do tipo C Pi – fosfato inorgânico PLB – fosfolamban PNA – peptídeos natriuréticos atriais .

cálcio ATPase da membrana plasmática PMSF – fluoreto de fenilmetilsufonila Proteína G – proteína trimérica ligadora de guanosina trifosfato Proteína Gi – proteína trimérica ligadora de guanosina trifosfato inibitória Proteína Gs – proteína trimérica ligadora de guanosina trifosfato estimulatória PVSFE – pressão ventricular sistólica final esquerda PVDFE – pressão ventricular diastólica final esquerda R2 – coeficiente de determinação RS – retículo sarcoplasmático Receptor α1A – subtipo 1A do receptor alfa-adrenérgico Receptor α1B – subtipo 1B do receptor alfa-adrenérgico Receptor α1D – subtipo 1D do receptor alfa-adrenérgico Receptor α2A – subtipo 2A do receptor alfa-adrenérgico Receptor α2B – subtipo 2B do receptor alfa-adrenérgico Receptor α2C – subtipo 2C do receptor alfa-adrenérgico Receptor β1 – subtipo 1 do receptor beta-adrenérgico Receptor β2 – subtipo 2 do receptor beta-adrenérgico Receptor β3 – subtipo 3 do receptor beta-adrenérgico RyR – receptor de rianodina RyR2 – receptor de rianodina do tipo II RAA – renina-angiotensina-aldosterona SERCA2a – subtipo 2a da cálcio ATPase do retículo sarcoplasmático Solução R – solução de relaxamento Solução W – solução de lavagem TNFα – fator de necrose tumoral alfa TGFβ1 – fator de crescimento transformador beta 1 Tris – tris(hidroximetil)-aminometano VEGF – fator de crescimento do endotélio vascular .9 PMCA.

O infarto do miocárdio (IM) é normalmente associado à hipertrofia cardíaca. Atualmente os tratamentos disponíveis ainda são insatisfatórios para impedir a evolução das complicações decorrentes do IM. A expressão .10 RESUMO COSTA. Melhora da disfunção ventricular induzida pelo infarto do miocárdio após tratamento com 3. LASSBio-294 aumenta significativamente a captação de Ca2+ em fibras cardíacas desnudas. O objetivo desse trabalho foi investigar o processo de remodelamento cardíaco e a função ventricular de corações submetidos ao IM após tratamento com uma nova tienilhidrazona: 3. Rio de Janeiro.100%) foi administrado diariamente por via intraperitoneal (ip) durante quatro semanas em ratos submetidos ao IM experimental e falso-operados. Tese (Doutorado em Farmacologia e Química Medicinal) – Instituto de Ciências Biomédicas. O volume de DMSO administrado em todos os animais variou entre 50 e 80 µl.4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294). reduz a dor inflamatória e promove vasodilatação na presença do endotélio íntegro em condições controles. Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2011. LASSBio-294 (2 mg/kg) ou veículo (dimetilsulfóxido / DMSO . A regulação de Ca2+ intracelular (captação e liberação) e a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ foram avaliadas através da determinação da resposta contrátil de fibras ventriculares desnudas provenientes de corações dos ratos infartados e falso-operados. Rio de Janeiro. Daniele Gabriel. O remodelamento cardíaco e a disfunção ventricular foram investigados através da análise histoquímica do tecido cardíaco e da determinação da pressão intraventricular esquerda. à redução da captação de Ca2+ pelo retículo sarcoplasmático (RS) e ao comprometimento do relaxamento cardíaco.4-metilenodioxibenzoil-2tienilhidrazona (LASSBio-294). 2011.

As modificações observadas na captação de Ca2+ parecem estar relacionadas com alterações na expressão da proteína SERCA2a. O IM reduziu a captação de Ca2+ pelo RS. foi parcialmente revertida pelo tratamento com LASSBio-294 para o valor de 5. O tratamento com LASSBio-294 também reduziu a densidade nuclear de 7. de 4.2 para 7.061 ± 255 núcleos/mm2 e a área percentual de colágeno de 4. No entanto. mas não modificou a liberação de Ca2+ nem a sensibilidade das miofibrilas a esse íon.0 ± 2.6 para 16.9 ± 1. a prevenção da disfunção cardíaca e o potencial desenvolvimento de insuficiência cardíaca (IC) decorrente do IM.2 ± 0. A elevação da pressão diastólica final do ventrículo esquerdo induzida pelo IM de 8.369 ± 1.3 mg/g.7 ± 0.11 protéica da isoforma SERCA2a foi verificada aplicando a técnica de western blot. LASSBio-294 restaurou a atividade de captação de Ca2+ pelo RS e aumentou a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.8 para 2.1 ± 0. LASSBio-294 parece ser um candidato promissor para a melhoria da regulação de Ca2+. A hipertrofia cardíaca que se desenvolveu quatro semanas após o IM.5 ± 0.3 mg/g.4 ± 2. . tanto em resposta ao IM quanto ao tratamento.3% nos ratos submetidos ao IM .1 ± 0.2 mmHg.5 mmHg foi revertida com administração ip do LASSBio-294 para 9.086 para 3.

2011. Daniele Gabriel. reduces inflammatory pain and promotes vasodilation in the presence of intact endothelium in control conditions. the available treatments are still unsatisfactory to prevent the development of the MI complications. reduced Ca2+ uptake by the sarcoplasmic reticulum (SR) and impairment of cardiac relaxation. Rio de Janeiro. The intracellular Ca2+ regulation (uptake and release) and the sensitivity of contractile proteins to Ca2+ were evaluated by determining the contractile response of denuded ventricular fibers from hearts of infarcted and sham-operated rats. Tese (Doutorado em Farmacologia e Química Medicinal) – Instituto de Ciências Biomédicas. LASSBio-294 (2 mg/kg) or vehicle (dimethylsulfoxide/DMSO . The cardiac remodeling and ventricular dysfunction were investigated by histochemistry analysis of cardiac tissue and determination of the left intraventricular pressure.4- methylenedioxybenzoyl-2- thienylhydrazone LASSBio-294 significantly increases Ca2+ uptake in denuded cardiac fibers.1 ± 0. Cardiac hypertrophy which developed four weeks after MI from 4. Myocardial infarction (MI) is usually associated with cardiac hypertrophy.2 to 7. The aim of this study was to investigate the process of cardiac remodeling and ventricular function of hearts subjected to MI after treatment with a new thienylhydrazone: (LASSBio-294). Melhora da disfunção ventricular induzida pelo infarto do miocárdio após tratamento com 3.3 mg/g was partially reversed by treatment with . Rio de Janeiro. 3.100%) was administered intraperitoneally (ip) every day during four weeks in rats subjected to experimental MI and sham-operated.5 ± 0. The volume of DMSO administered in all animals ranged between 50 and 80 µl.4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona (LASSBio-294).12 ABSTRACT COSTA. Protein expression of SERCA2a isoform was verified by western analysis. 2011. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Currently.

4 ± 2. The treatment with LASSBio-294 also reduced the nuclear density from 7. LASSBio-294 seems to be a promising candidate for improving the regulation of Ca2+.1 ± 0.086 to 3. MI reduced the uptake of Ca2+ by the SR but did not modify the Ca2+ or the sensitivity by myofibrils to this ion.3 mg/g. .2 ± 0.0 ± 2. However. The increase in end diastolic pressure of left ventricle induced by MI from de 8.9 ± 1.8 to 2.13 LASSBio-294 to 5.3% in rats submitted to MI .5 mmHg was reversed with ip administration of LASSBio-294 to 9. The changes observed in Ca2+ uptake seem to be related to alterations in SERCA2a expression in response to MI and treatment. LASSBio-294 restored the activity of Ca2+ uptake by SR and increased the sensitivity of contractile proteins to this ion.369 ± 1.061 ± 255 nuclei/mm2 and the percent collagen area from 4.2 mmHg. prevention of cardiac dysfunction and the potential development of heart failure (HF) due to MI.6 to 16.7 ± 0.

1 FISIOLOGIA CARDÍACA 1.4 MODELO EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCÁRDIO 2.5.4.1.5 Insuficiência cardíaca 1.1.7.2 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO DA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA 52 1.4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBIO-294) 1.1 Processamento e secção do material 2.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS E MECANISMO DE AÇÃO DE 55 3.4 OBJETIVOS 1.1.14 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1.1.1.5.1 Captação e liberação de Ca2+ pelo RS 65 66 .1 ANIMAIS 2.3 DESENHO EXPERIMENTAL 2.2 Mecanismo envolvidos no desenvolvimento da insuficiência 44 cardíaca decorrente do infarto do miocárdio 1.1.1.2 FÁRMACOS E REAGENTES 2.1.3 Relaxamento do músculo cardíaco 1.2 Organelas celulares 1.3 Mensuração da densidade nuclear e da área percentual de 64 fibrose 2.1 Objetivo geral 1.2 Objetivos específicos 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1.1.7 AVALIAÇÃO DA REGULAÇÃO DE Ca2+ INTRACELULAR 2.1 Definição e classificação da insuficiência cardíaca 16 18 18 18 23 25 31 36 37 41 41 1.4.2 Acoplamento excitação-contração do músculo cardíaco 1.1.6.1.2 Coloração do material 57 57 57 58 59 59 61 61 62 62 62 63 2.6.5 AVALIAÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA 2.6.1.4 Modulação da atividade contrátil cardíaca 1.1 Proteínas contráteis e estruturais 1.6 AVALIAÇÃO HISTOQUÍMICA 2.1 Estrutura e anatomia das células cardíacas e do coração 1.3 Organização macroscópica do tecido cardíaco 1.

1 Preparação dos homogeneizados 2.9 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMODINÂMICOS 2.8 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SERCA2a NO TECIDO CARDÍACO 2.2 Sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ 2.8.8.1 HIPERTROFIA CARDÍACA 3.7.3.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA 3 RESULTADOS 3.1 Regulação da captação e liberação de Ca2+ do RS 3.3 CONTRATILIDADE CARDÍACA E MOBILIZAÇÃO DE Ca2+ INTRACELULAR 3.15 2.2 DENSIDADE NUCLEAR E VOLUME DE COLÁGENO INTERSTICIAL 3.2 Relação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ 3.2 Análise da expressão protéica por western blot 2.3.5 PARÂMETROS HEMODINÂMICOS 4 DISCUSSÃO 5 CONCLUSÃO 6 REFERÊNCIAS 69 70 70 70 71 73 74 75 76 79 79 82 84 86 88 99 101 .4 EXPRESSÃODE SERCA2a NO TECIDO CARDÍACO 3.

16 _______________________________________________________________ 1 Introdução _______________________________________________________________ .

org/statistics). aproximadamente 450 mil pessoas morreram devido ao infarto do miocárdio (ADAMS et al.org/statistics). A epidemia que se alastra a cada ano ocorre principalmente devido ao aumento da incidência dos fatores de riscos envolvidos na gênese dessas doenças como: o tabagismo.americanheart. A mortalidade decorrente das doenças cardiovasculares é bastante elevada.americanheart.7 milhões de habitantes e o infarto do miocárdio (IM) acometendo 7. principalmente no que diz respeito a alimentação infantil. um em cada três americanos possui algum tipo de doença cardiovascular. totalizando 80 milhões de portadores (http://www. O gasto estimado pelo governo americano no ano de 2009 foi de cerca de 166 bilhões de dólares para o tratamento das doenças coronarianas. esses números ainda encontram-se longe do valor ideal. 2008).. a incidência de novos eventos cardíacos foi de 610 mil no ano de 2009 e de infartos recorrentes de 325 mil (http://www. Entre latinos e hispânicos.9 milhões de norteamericanos (http://www. o diabetes melitus e a síndrome metabólica (http://www.americanheart. Inúmeros esforços têm sido empregados na tentativa de desenvolver novas terapias que simplifiquem o tratamento das pessoas acometidas por doenças cardiovasculares.org/statistics). Somente nos EUA. Nesse sentido. Só no ano de 2005 nos EUA. Esses dados ratificam a preocupação da Organização Mundial de Saúde com o tratamento e principalmente com a prevenção dessas doenças. Dentre as disfunções mais proeminentes estão a insuficiência cardíaca (IC). bem como. equipes multidisciplinares trabalham para desenvolver e modificar os hábitos populacionais .17 ______________________________________________________________ As doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de morte nos Estados Unidos da América (EUA) e em todo mundo.org/statistics) com taxa de mortalidade em 2005 de 118 indivíduos para cada 100 mil habitantes (http://www.americanheart. a obesidade. bem como. acometendo 5.org/statistics). No entanto. na prevenção das mesmas. o sedentarismo. com o tratamento farmacológico e intervenções cirúrgicas é cada vez maior.americanheart. Esse gasto para pessoas com IC girou em torno 33 bilhões de doláres no mesmo período. Esta situação vem sendo melhorada devido a políticas preventivas implementadas pelo governo. O custo com internações hospitalares.

do grau de acometimento que o mesmo gera no sistema cardiovascular. tornando-o portanto mais eficaz.1. Seguindo essa proposta. a ingestão excessiva de álcool. o sedentarismo e o tabagismo.1.1 Proteínas contráteis e estruturais . as pesquisas farmacológicas estão voltadas para o desenvolvimento de novas substâncias que possam apresentar maior eficácia no tratamento simultâneo de diferentes sintomas. Atualmente. diferentes estratégias terapêuticas podem ser implementadas. BERGH et al. Isso se deve ao fato do desenvolvimento da doença e o aparecimento dos seus sintomas serem promovidos por uma série de disfunções de processos fisiológicos importantes no organismo. Atualmente. que envolve a administração de vários fármacos. reduzindo a necessidade do uso de inúmeros fármacos. O tratamento farmacológico dos pacientes que sofreram IM e desenvolveram IC é feito através de um esquema terapêutico amplo. Diferentes fármacos vêm sendo apresentados como novas alternativas para o tratamento da IC. o levosimendam e a espirolactona são fármacos que apresentam maior destaque no mercado para o tratamento da queda da contrtilidade cardíaca induzida pela IC. 2010).1 Estrutura e anatomia das células cardíacas e do coração 1.1. Essa condição permite uma maior adesão do paciente ao tratamento e reduz o seu custo.18 contemporâneos. Esse trabalho foi desenvolvido com intuito de se observar as consequências relacionadas à administração diária prolongada dessa substância em ratos submetidos ao IM experimental e observar a sua eficácia no tratamento dos sintomas apresentados. 2009. 1. e dos tipos de sintomas apresentados. apresentada por alguns pacientes e para inibição do remodelamento cardíaco. que se caracterizam pelo consumo de alimentos com altos índices calóricos. respectivamente (LI et al. dependendo da intensidade do evento. Assim..1 FISIOLOGIA CARDÍACA 1. esse trabalho testou o efeito de uma nova substância com propriedades inotrópica e lusitrópica positivas como possível alternativa futura para o tratamento dos efeitos deletérios induzidos pelo IM.

é composta por três unidades: troponina C. Figura 1. tropomiosina e actina (Figura 1). A primeira possui alta afinidade com íons cálcio (Ca2+). Esquema ilustrativo dos filamentos grosso e fino que compõem o sarcômero e suas proteínas representadas.19 O tecido muscular cardíaco é formado por proteínas contráteis. troponina. O filamento fino se une a estruturas conhecidas como linha Z (filamentos de α-actina) que delimitam os sarcômeros.unicamp. Acredita-se que a tropomiosina no estado de repouso. que organizadas dão origem a unidade funcional contrátil da célula conhecida como sarcômero. evento essencial para ativação da contração muscular. por sua vez. A presença da tropomiosina em seu estado conformacional de repouso inibe a ligação entre a miosina e actina. encubra os sítios ativos presentes nas moléculas de actina. Retirado de http://panatpat. troponina I e troponina T. Essa estrutura bifilamentar é envolta. impedindo o processo de contração e mantendo o músculo relaxado. pelas moléculas de tropomiosina e troponina. Moléculas de actina-G (globular) alinham-se para formar uma estrutura filamentar conhecida como actina-F. a segunda encontra-se ligada ao filamento de actina e a última ligada à tropomiosina. sendo o primeiro composto por moléculas de miosina e o segundo por troponina. . onde a concentração de Ca2+ intracelular é baixa.brmusnormal. Duas dessas estruturas se entrelaçam. que. Compondo o filamento fino encontram-se a actina. tropomiosina e compondo o filamento grosso observa-se a miosina.html/ Acessado em 21 de janeiro. ainda. assumindo um formato de α-hélice. O mesmo é constituído pelos filamentos grosso e fino. 2011.

dando origem à cauda da molécula. é composta por duas cadeias pesadas e quatro cadeias leves.. que conectadas à actina e ativadas com energia fornecida pela clivagem do ATP são capazes de se encurtarem através da movimentação de pontos conhecidos como “dobradiças” (Figura 2B). outros mecanismos estão envolvidos nesse processo e a importância dessa mudança para a redução da força contrátil ainda não está totalmente estabelecida. As cadeias leves. 2001). No entanto. 2001). predominante no tecido cardíaco de roedores (BRAUNWALD et al. a mesma. α.. por sua vez. predominante no tecido cardíaco humano.. . A cadeia pesada apresenta atividade ATPásica necessária para ativar o processo contrátil exatamente no bolsão onde a estrutura helicoidal se desfaz para dar origem à cabeça. . divididas em duas cadeias reguladoras (MLC2) e duas essenciais.20 O filamento grosso é formado principalmente por moléculas de miosina. Existem duas isoformas das cadeias pesadas de miosina: 1. aumentando consideravelmente a síntese da isoforma β. o que poderia em parte justificar a reduzida contratilidade observada em corações de roedores. As cadeias pesadas assumem o formato de α-hélice. encontram-se na parte terminal das cadeias pesadas e juntamente com essas formam a “cabeça” da miosina (Figura 2A). β. 2008). Doenças como a IC podem levar a mudança no padrão de expressão dessas isoformas. Parte do corpo e da cabeça da molécula de miosina formam. e na parte terminal se dividem para formar a parte da estrutura da “cabeça” da miosina (Figura 2A). 2. que apresenta atividade ATPásica mais lenta em relação à isoforma α (BARRY et al. as chamadas “pontes cruzadas”. região essa denominada de bolsão de ATP (BRAUNWALD et al.

2011. Essas proteínas.21 A B Figura 2. (B) Pontos de flexão da molécula denominados “dobradiças”. a proteína C ligadora de miosina (MyBP-C) e a própria α-actina.org/2007/issue4/motors/portuguese. essenciais para movimentação da molécula e encurtamento do sarcômero. Adaptado de http://www.scienceinschool. Esquema ilustrativo da molécula de miosina. 2006. (A) Estrutura molecular das cadeias leves e pesadas que compõem a molécula de miosina. Retirado de Guyton e Hall. Outras proteínas estruturais que não fazem parte do processo de contração também compõem o sarcômero como: a titina. apesar de não . Acessado em 21 de Janeiro.

2007). A mesma envolve verticalmente os dois filamentos. gerando mudanças nos parâmetros contráteis e elevando a cinética do desenvolvimento de força das células cardíacas. ativadoras do crescimento dos miócitos.. a célula cardíaca ainda é formada por proteínas do citoesqueleto membranar que também atuam na manutenção de sua forma e na modulação da expressão protéica. provavelmente através do aumento da atividade ATPásica (STELZER et al. A MyBP-C é responsável principalmente pela manutenção do alinhamento vertical dos filamentos fino e grosso. Além dessas estruturas.. A energia potencial gerada com o estiramento da titina também parece contribuir para o aumento da geração de força observado no mecanismo de “Frank-Starling” (BRAUNWALD et al.. 2009). 2001).22 possuírem participação direta na contração muscular exercem um papel importante na manutenção da estrutura da célula e sua unidade contrátil. A titina é uma proteína que une o filamento grosso à linha z e possui um papel fundamental na manutenção da estrutura do sarcômero e da tensão passiva gerada pela contração (Figura 3A). . Acredita-se que o estiramento excessivo dessa estrutura decorrente de uma desorganização estrutural do tecido pode levar à ativação e modificação no padrão de expressão protéica dos cardiomiócitos através da estimulação das proteínas LIM musculares (MLP: lin-11 e mec-3). formando a zona C região onde ocorre a sobreposição dos três filamentos (Figura 3B). podendo também indiretamente influenciar na contratilidade do músculo através da modulação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ e da síntese protéica (WALKER et al. A fosforilação da MyBP-C pode ainda modificar a taxa de expressão protéica.

(B) Proteína C ligadora de miosina (MyBP-C) que envolve verticalmente os filamentos fino e grosso formando a zona c. Modificado de Oakley e outros. as mitocôndrias e o retículo sarcoplasmático (RS). Retirado de Braunwald. por exemplo. A . Esquema ilustrativo das proteínas estruturais que compõem o sarcômero.1.2 Organelas celulares A célula cardíaca é composta por diferentes organelas e proteínas responsáveis pelo controle dos processos de contração e relaxamento da célula como. 1. (A) Filamento de titina que liga a o filamento grosso à linha Z. 2004.1.23 A B Figura 3. 2001.

mas em menor grau (BROOKS. modificando suas concentrações. FAHEY. prejudicando a ejeção sanguinea pelo coração. Esta para gerar ATP requer a presença do oxigênio (O2) como aceptor final de elétrons na formação de água. tanto luminal (RS) quanto citoplasmática. No músculo cardíaco. qualquer dano no processo que envolve a captação e/ou liberação de Ca2+. Os glicídios e seus derivados. O RS é uma organela envolvida nos processos de contração e relaxamento do músculo. BALDWIN. p. Essa difusão só é possível devido ao gradiente eletroquímico mantido entre o meio extracelular e intracelular (BRAUNWALD et al. Sua principal função é servir de reservatório intracelular dos íons Ca2+ para ativação da contração muscular. pode acarretar modificações no processo contrátil muscular. Portanto. Essa disfunção pode ser observada em diversas doenças cardíacas como na IC após IM.24 organela envolvida na síntese de energia no processo de contração do músculo cardíaco é a mitocôndria. A estrutura dupla formada por um túbulo-T e uma cisterna do RS é conhecida como díade e possui uma grande importância no processo contrátil (Figura 4). também servem como fontes de energia para contração muscular. O principal substrato responsável pela geração de energia no coração são os ácidos graxos provenientes das fontes lipídicas (KATZ. como o lactato. é necessário que o Ca2+ do meio extracelular se difunda para citoplasma e ative diretamente o receptor de rianodina (RyR). A produção de espécies reativas de O2 durante a síntese de ATP pela mitocôndria gera a ativação de mecanismos que podem induzir o remodelamento das células cardíacas e gerar problemas no funcionamento do coração. 2001. porém para que haja liberação a partir desse reservatório (RS). O RS forma uma rede de sarcotúbulos que envolvem os sarcômeros rodeando as miofibrilas (proteínas contráteis). . As partes terminais do RS formam cisternas que se justapõem com invaginações da membrana plasmática denominadas de túbulos-T. a principal fonte de ativação da contração é proveniente do Ca2+ contido no RS.71). As mitocôndrias se distribuem paralelamente aos sarcômeros.. 2001). permitindo a disponibilização instantânea de ATP à miosina. 2005).

as fendas entre o túbulo-T e o RS possibilitam que pequenas quantidades de Ca2+ sejam suficientes para ativação do processo.25 Túbulo-T RyR2 Ca 2+ Canal de Ca 2+ Tipo -L RS Figura 4. que menos energia seja gasta para sua desativação.1. Quando essas estruturas se desorganizam impedindo a justaposição entre as proteínas envolvidas na liberação e captação do Ca2+ pelo RS.3 Organização macroscópica do tecido cardíaco . Por serem bem estreitas e por isso permitirem a justaposição das proteínas envolvidas no transporte de Ca2+. Esquema ilustrativo da díade cardíaca e o microdomínio de membrana formado entre o túbulo-T e a cisterna terminal do RS. e por sua vez. A organização espacial dessa estrutura permite que o acoplamento excitação-contração do músculo ocorra de maneira eficiente e econômica.1. Os círculos em azul claro representam moléculas de + CA(2) . são observadas disfunções nos processos de contração e/ou relaxamento cardíaco. 1.

Figura 5. O coração possui quatro cavidades. 2006. Os átrios e ventrículos são separados por válvulas que permitem a passagem do sangue na direção átrioventricular e impedem o seu refluxo durante a contração dos ventrículos. A excitação de uma célula anterior induz a despolarização da célula seguinte com a qual possui junções intercomunicantes e discos intercalares. encontra-se a válvula mitral. presentes tanto no ventrículo direito quanto no esquerdo. Dando suporte a essas estruturas fibrosas estão os músculos papilares. A presença dessas estruturas confere ao tecido cardíaco a característica de um sincício funcional (Figura 5). Essa característica viabiliza a ativação rápida do tecido com um gasto energético mais baixo. salientando a presença dos discos intercalares. estriações formadas pelas miofibrilas e junções intercomunicantes. Retirado de Guyton e Hall. Esquema ilustrativo do músculo cardíaco. A válvula que separa o átrio direito do ventrículo direito é conhecida como tricúspide. No mesmo nível. duas superiores denominadas de átrios e duas inferiores chamadas de ventrículos. .26 As células musculares cardíacas diferentemente das esqueléticas possuem intercomunicações (canais juncionais) que permitem o fluxo de íons e pequenas moléculas (até 1 KDa) as células vizinhas. separando o átrio e o ventrículo esquerdos.

2001. este passa a atuar como parte do ventrículo direito.infoescola. entretanto. em casos onde a pressão ventricular esquerda encontra-se aumentada. prejudicando o bombeamento de sangue para circulação sistêmica (KATZ. 2011. Em condições normais o septo se comporta funcionalmente como parte integrante do ventrículo esquerdo.5).com/biologia/sistema-circulatorio/. as válvulas cardíacas e ainda os músculos papilares. Figura 6. p. Acessado em 21 de janeiro. .27 essenciais para manutenção da forma e da função das válvulas. demonstrando as cavidades átrios-ventriculares. mas funções idênticas (Figura 6). A válvula pulmonar separa o ventrículo direito da artéria pulmonar e a válvula aórtica separa o ventrículo esquerdo da artéria aorta. Retirado de http://www. Entre o lado esquerdo e direito dos ventrículos encontra-se o septo ventricular. uma parede muscular grossa no qual o impulso elétrico proveniente do átrio direito é conduzido até os ventrículos. Esquema ilustrativo do coração. Ambas possuem uma estrutura anatômica diferente das válvulas átrios-ventriculares.

respectivamente. 2001. são mais calibrosas e se organizam formando feixes (Feixe de His). O coração é circundado por uma membrana fibrosa na parte mais externa e serosa na parte mais interna. 115). para a manutenção das propriedades elásticas e mecânicas do tecido. HALL. p. Entre essas lâminas está a cavidade parietal que contém um líquido que permite fluidez entre essas duas estruturas (GUYTON. 2006. A função dessas células é retardar em alguns milissegundos o impulso elétrico gerado no nodo sino-atrial antes que o mesmo atinja os ventrículos. HALL. A parte interna da parede cardíaca é denominada de endocárdio. por sua vez. Outro conjunto de células encontra-se no nodo átrio-ventricular.4). O pericárdio fibroso se liga ao diafragma na parte inferior e continua nas paredes das artérias e veias que se ligam as cavidades cardíacas (Figura 7). 17).28 As fibras musculares cardíacas possuem características diferentes dependendo da região onde se encontram. 2001. o visceral (ou epicárdio) e parietal (na parte externa). 2006. 98). p. A característica principal desses cardiomiócitos é a presença reduzida dos discos intercalares e das junções intercomunicantes (KATZ. Essa organização anatômica é importante para a integração dos mecanismos de acoplamento excitação-contração. p. conhecidas como pericárdio fibroso e seroso. permitindo que os átrios se contraiam antes que os mesmos. p. responsáveis pela rápida condução elétrica e contração simultânea dos ventrículos após a passagem do impulso pelo nodo átrioventricular (KATZ. Essas correntes permitem que pequenas trocas iônicas produzam potenciais de ação periódicos que mantêm a atividade marca-passo do coração em funcionamento (GUYTON. assim como. Os cardiomiócitos da região do nodo sinoatrial se caracterizam por serem auto-despolarizantes devido à ampla presença de canais com baixo limiar de ativação que permite a ativação de correntes de influxo de sódio (Na+) de curta duração IfNa+. . As células do sistema de Purkinje. O pericárdio seroso é dividido em duas lâminas. As fibras musculares cardíacas e o coração são envolvidos por tecidos fibroso e seroso que auxiliam em sua manutenção estrutural.

p. Acessado em 21 de janeiro. Outras funções do sangue são: o transporte de substâncias como hormônios e fármacos para todo organismo. A principal função do coração é bombear sangue rico em O2 e nutrientes para os tecidos periféricos e em seguida levar o sangue rico em gás carbônico e catabólitos para serem eliminados pelos pulmões. Durante a diástole ventricular esquerda. HALL.php. atinge o átrio e o ventrículo esquerdos. participação na manutenção do equilíbrio ácido-base do corpo e ainda no processo de coagulação e cicatrização de tecidos entre outros (GUYTON.portalsaofrancisco.com. p.29 Figura 7. O sangue proveniente dos tecidos chega ao átrio direito através das veias cavas superior e inferior. HALL. Em seguida. 144). Ilustração das estruturas fibrosas e musculares que se encontram dispostas em camadas no coração. 2006. Sob uma pressão de 120 mmHg o sangue é ejetado através da artéria aorta para então ser distribuído para todo o organismo. o sangue flui através das artérias coronárias para irrigar o próprio . produzindo neste uma pressão ao final da diástole em torno de 5 mmHg. ao atingir o átrio direito com uma pressão diastólica final em torno de -5 a 0 mmHg o mesmo é bombeado para o ventrículo direito e em seguida para artéria pulmonar até chegar aos capilares alveolares onde ocorrem as trocas gasosas (GUYTON. 2011. Retirado de http://www. 130).br/alfa/corpo-humanosistema-cardiovascular/coracao-5. 2006.

2008). A obstrução desses vasos pode gerar isquemia e morte das células cardíacas. alteração da expressão protéica e ativação do sistema imunológico. fenômeno esse conhecido como IM. causando um infarto transmural (toda espessura da parede do miocárdio) de grande extensão e comprometendo o bombeamento de sangue para o organismo. LITTLE. Esses mecanismos vão desde a ativação de sistemas neuro-humorais. . Essa condição ativa mecanismos compensatórios para restauração do débito cardíaco e da pressão arterial (FUKUTA. p. gerando em um primeiro momento adaptações benéficas que em seguida sobrecarregam o sistema cardiovascular e induzem o processo de IC (LEHNART. MAIER 2009). O tecido subendocárdico apresenta maior suscetibilidade de enfrentar eventos isquêmicos por se tratar da parte mais interna do coração. Esta irrigação é feita principalmente através de quatro artérias coronárias: artéria circunflexa. coronária esquerda e coronária descente anterior (ACDA) (Figura 8). 2001. coronária direita. em casos onde ocorre o entupimento da artéria ACDA geralmente grande parte do ventrículo esquerdo não recebe o aporte de O2 necessário. reprogramação de genes inativos. gerando maior estresse da parede e dificultando o fluxo sanguineo pelas artérias coronárias (KATZ. 402). Portanto. A maior parte do ventrículo esquerdo é irrigada pela ACDA.30 tecido cardíaco. tal fato se intensifica em condições onde a pressão interna das cavidades aumenta.

1.misodor. 2006.2 Acoplamento excitação-contração do músculo cardíaco Os eventos que vão desde a despolarização do sarcolema dos cardiomiócitos até o encurtamento dos sarcômeros e a contração muscular são designados como processo de acoplamento excitação-contração do músculo cardíaco.31 Figura 8. HALL. 98). Acessado em 21 de janeiro. para em seguida induzirem a contração dos átrios e ventrículos. e por possuírem uma cinética de ativação rápida. 1. p. Como salientado na seção anterior. A despolarização da membrana ativa outro .com/CORACAO. Retirado de http://www. 2011. são responsáveis pela fase rápida do potencial de ação cardíaco (fase I).php. O processo de geração de potencial de ação de uma célula cardíaca se inicia através da abertura de canais de sódio voltagem-dependente presentes na membrana plasmática (GUYTON. Esses canais são responsáveis pela passagem seletiva dos íons sódio (Na+). Ilustração das principais artérias coronárias responsáveis pela irrigação do tecido cardíaco. a despolarização das células cardíacas tem início nas células do nodo sino-atrial que possuem atividade marca-passo.

que possui aproximadamente 12 nm de largura.98). 2006. devido à diferença no gradiente eletroquímico existente entre o meio intracelular e extracelular dos cardiomiócitos. e a manutenção desse estado aberto promove a hiperpolarização da célula. Os RyR2 respondem a uma série de moduladores químicos. Os mesmos são conhecidos como canais de Ca2+ tipo-L ou receptores de dihidropiridina (Cav1. A abertura dos canais de Ca2+ tipo-L permite que alguma quantidade de Ca2+ seja transportada passivamente para o interior da célula cardíaca. Esse pequeno influxo de Ca2+ no citosol (ICa) é suficiente para alcançar as cisternas do RS justapostas ao túbulo-T. o Ca2+. a cafeína. Os canais voltagem-dependentes permeáveis ao K+ e. Esses canais possuem uma cinética de ativação mais lenta em comparação aos canais de Na+ e são seletivos aos íons Ca2+ e. HALL. também são ativados durante a despolarização da célula muscular cardíaca. Os RyR são proteínas presentes na membrana do RS. Essa imunofilina é responsável pela estabilização do canal na conformação fechada. O efluxo dos íons K+ durante essa fase permite a repolarização da membrana celular (fase III). proteínas cinases (PK) e a imunofilina FKBP-12. na qual se encontra a maior parte dos aminoácidos que fazem parte da estrutura do canal. aos íons Na+ (GUYTON. 2000). em menor grau. quando ambos os canais de Na+ e Ca2+ já se encontram inativados. Segundo Lehnart e Maier (2009). quando o potencial vai a valores mais negativos que o potencial de repouso (fase IV).32 grupo de canais voltagem-dependentes. No coração a isoforma do receptor de rianodina predominante é a do tipo II (RyR2). ativando os RyR (BERRIDGE et al.. como a rianodina. Estes canais são responsáveis pela geração de um platô no potencial de ação através da manutenção do potencial positivo no interior da célula (fase II). principalmente pelo Ca2+ presente no lúmem . possuindo um total de 4967 aminoácidos e um peso molecular de 565 kDa. se abre tardiamente. a comporta de ativação desse canal presente na parte intracelular da membrana.6 kDa). p. a fenda entre a junção do RS e o túbulo-T. Segundo Priori e Napolitano (2005). No entanto. funciona como microdomínio que compartimentaliza trocas iônicas e facilitam o processo de acoplamento excitação-contração. Além de estar sujeito a modulação na sua parte externa. RyR2 é uma das maiores proteínas do organismo. o mesmo está sujeito à modulação interna.2) por serem antagonizados por substâncias dessa classe química.6 (12. de cinética ainda mais lenta.

Na ausência de calsequestrina essa probabilidade aumenta. causando problemas no ciclo contração-relaxamento celular (BLAYNEY. 2009). e é conhecido como mecanismo de Ca2+ induz a liberação de Ca2+ (Figura 9). F.33 do RS.I. 2009). Portanto.S.. A modulação do canal através desse mecanismo só ocorre em concentrações intermediárias de Ca2+ (10-7 > [Ca2+]i < 10-5). modificações na expressão dessas proteínas provocadas por doenças podem gerar distúrbios na cinética do canal. foi descrito por Fabiato. A elevada concentração do Ca2+ na parte interna do RS aumenta a probabilidade de abertura do RyR2 (LUKYANENKO et al. como calsequestrina. calreticulina. 1996. (1979) em ensaios com fibras desnudas. que está contido em altas concentrações no RS. para o citoplasma da célula. 2002). 1998). 1997. GYORKE. ou seja. GYORKE. possibilitando o vazamento de Ca2+ durante a diástole (BLAYNEY. 2009). A mudança conformacional do RyR2 em resposta ao aumento do Ca2+ na região das díades abre um poro no centro do receptor permitindo o efluxo de Ca2+. O mecanismo no qual o Ca2+ extracelular ativa a liberação do Ca2+ contido no RS. e Fabiato. triadina e junctina também influenciam a abertura do RyR2 (BLAYNEY. LAI. Outras proteínas presentes no lúmem do RS. o RyR2 encontra-se inativado tanto em baixas (< 10-8) quanto em altas concentrações de Ca2+ (> 10-2) (MEISSNER. SITSAPESAN. LAI. LAI. A. . WILLIAMS.

Ilustração do processo do fluxo de Ca durante a contração muscular. as pontes cruzadas encontram-se desligadas ou em estado de baixa ativação. LCC (canal de Ca tipo-L). SERCA (Ca ATPase do RS. Essa última ligada a tropomiosina desloca e libera os sítios ativos da actina antes encobertos pela tropomiosina no estado de repouso. Após a liberação dos sítios ativos da actina mediado pelo o aumento da concentração citosólica de Ca2+. Após a indução . Segundo Braunwald e outros (2001). RyR2 (receptor de rianodina tipo 2) 2+ A abertura de RyR2 aumenta consideravelmente a concentração intracelular de Ca2+ e permite que o mesmo se ligue às moléculas de troponina C presentes nos filamentos finos dos sarcômeros.34 Figura 9. Modificado de 2+ + Blayney e Lai. 2009. PLB (fosfolamban). Essa ligação promove uma mudança conformacional no complexo da troponina alterando as posições da troponina I e T. as cabeças da miosina entram em contato com os sítios da actina e a clivagem do ATP na cabeça da miosina é ativada. NCX (trocador Na / 2+ 2+ Ca ). gerando um estado de ligação mais forte das pontes cruzadas. em baixas concentrações de Ca2+.

irsc. Acessado. por sua vez.edu/FACULTY/TFischer/AP1/cross%20bridge%20cycle. 2011. induz o retorno do estado original de ligação fraca das pontes cruzadas. Esquema Ilustrativo dos mecanismos moleculares de um ciclo de contração. A geração de força muscular depende. ATP (adenosina trifosfato). janeiro. ADP (adenosina difosfato). gerando força e encurtamento dos sarcômeros.35 do estado de ligação forte pela atividade ATPásica da cadeia pesada da miosina. permitindo que um novo ciclo de encurtamento seja desenvolvido (Figura 10).jpg. a adenosina difosfato (ADP) e o fosfato inorgânico se desligam do sítio catalítico e em seguida ocorre a movimentação da cabeça da miosina. do número de pontes cruzadas que são “recrutadas” durante a contração e nada tem a ver com a velocidade de contração que é influenciada pela atividade ATPásica da miosina . A introdução de uma nova molécula de ATP na fenda catalítica. Pi (fosfato inorgânico). portanto. 21. Figura 10. Retirado de http://faculty.

. desativa o complexo troponina. 1. Assim. RS e o meio extracelular. Portanto. bloqueando o mecanismo contrátil descrito acima. que engloba as valências: força e velocidade de contração. Esse processo se inicia com a redução da concentração de Ca2+ do citosol que.36 (BRAUNWALD et al. é necessário que haja o relaxamento dos cardiomiócitos. Nessa fase. Por ser uma bomba de alta afinidade é mais sensível a ativação pelo Ca2+ intracelular. A Ca2+-ATPase da membrana plasmática (PMCA) é uma bomba de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade responsável pela extrusão de uma pequena parte do Ca2+ intracelular. A fosforilação de PLB por PK promovem o aumento da atividade da Ca2+ATPase e elevam a velocidade de relaxamento do músculo. o conceito de contratilidade ou estado contrátil do coração. 2002). o aumento da pressão gerado pela contração promove a ejeção de sangue presente nas cavidades do coração. é influenciado tanto pelo número de interações de pontes cruzadas quanto pela isoforma miosina ATPase presente no músculo. cada qual com um percentual diferente de contribuição.3 Relaxamento do músculo cardíaco Os processos de ativação das pontes cruzadas e geração de força ocorrem durante a sístole cardíaca. A diminuição de Ca2+ do citoplasma cardíaco é obtida através do transporte ativo e com gasto energético. que é capaz de bombear grande parte do Ca2+ citoplasmático para o lúmem do RS. Diferentes proteínas são responsáveis por esse processo. A SERCA também é um transportador de Ca2+ de alta afinidade e baixa capacidade. conclui-se que a contratilidade é reduzida tanto pela perda de proteínas contráteis quanto pela modificação da atividade enzimática das cadeias pesadas de miosina do músculo cardíaco. entre outros fatores. A outra Ca2+-ATPase encontra-se presente na membrana do RS e é denominada de Ca2+-ATPase do RS ou SERCA. por sua vez.. permitindo o preenchimento das câmaras antes da ejeção. Uma proteína ligada a SERCA conhecida como fosfolamban (PLB) é responsável pela modulação da atividade enzimática dessa bomba de Ca2+ (BERS. 2001). Para que o bombeamento ocorra de maneira eficiente.1. necessário para vencer os gradientes eletroquímicos existentes entre o interior da célula. efeito conhecido .

As terminações nervosas simpáticas aumentam o . o NCX carreia concomitantemente um íon Ca2+ para o meio extracelular e três íons Na+ para o citoplasma. pois promovem a ativação inversa do NCX (KATZ. No entanto.37 como lusitrópico positivo. funcionando através do mecanismo de contra-transporte. Tal fato prejudica o relaxamento muscular e aumenta a sobrecarga do sistema cardiovascular (LEHNART. 2009). MACKIEWICZ et al. O sistema de trocas iônicas do NCX se caracteriza por ser um contra-transporte de Na+ e Ca2+ modulado pela atividade da proteína Na+/K+ ATPase (bomba de Na+/K+). O restabelecimento da concentração de Na+ no meio intracelular é feito pela Na+/K+ ATPase presente na membrana plasmática. direciona a atividade do trocador durante o relaxamento. MAIER. 2009. Ao final da sístole quando a concentração de Ca2+ encontra-se elevada no interior da célula. Algumas doenças como a IC. Distúrbios eletrolíticos causados por algumas doenças podem induzir o mesmo efeito (GILMAN et al. quanto a atividade de SERCA2a (isoforma cardíaca). O NCX transporta simultaneamente três íons Na+ e um íon Ca2+ para faces opostas. 234). No entanto. A utilização de fármacos que inibem Na+/K+ ATPase como os glicosídeos digitálicos induzem o inotropismo positivo. p. em condições fisiológicas normais a função do NCX é reduzir a concentração de Ca2+ intracelular (Figura 9)..1. algumas situações exigem o ajuste tanto da freqüência quanto na força de contração para que a demanda de fluxo sanguíneo do organismo seja suprida. 1.. cardiomiopatias dilatadas e hipertróficas reduzem tanto a expressão.4 Modulação da atividade contrátil cardíaca A atividade marca-passo das células cardíacas é responsável pela geração dos impulsos elétricos que mantêm o coração em constante funcionamento. já que como mencionado acima. A função dessa bomba é também manter estável o ciclo contração-relaxamento da célula. O sistema nervoso autônomo é responsável por esse ajuste. gerando uma pequena despolarização da membrana da célula cardíaca. 2005). que também contribui para o retorno do gradiente eletroquímico do Na+. 2001. O trocador Na+/ Ca2+ (NCX) é outra proteína presente no sarcolema que também auxilia no processo de relaxamento da célula cardíaca.

que podem ainda ser subdivididos nos subtipos α1A. os receptores denominados adrenérgicos que estão acoplados à proteína G promovem principalmente o aumento da força contrátil quando ativados pela norepinefrina.38 inotropismo. não possuem grande importância no processo contrátil do músculo cardíaco. sendo mais relevantes na modulação da função contrátil do músculo liso vascular. No caso do sistema simpático. 1999). lusitropismo e cronotropismo cardíacos. β. Essas respostas são alcançadas através de receptores metabotrópicos presentes na membrana das células cardíacas. α1D α2A. através das terminações vagais. γ. β1 e β2 estão relacionados com o aumento da atividade contrátil muscular. Os receptores α-adrenérgicos. 2009). No entanto. o receptor β1 parece ser o principal responsável pela resposta simpática contrátil do tecido. o último β3 parece estar envolvido na redução da contratilidade cardíaca (ALBERTS et al. β2 e β3. α2B e α2C. Os receptores β1 sofrem "down regulation" e a expressão de β2 é elevada para tentar compensar a perda da sensibilidade à resposta neuro-humoral (BRODDE. são mais expressos no tecido cardíaco quando comparados com os receptores α-adrenérgicos. O sistema simpático atua através da liberação principalmente de norepinefrina dos neurônios pósganglionares e ativa os receptores acoplados a proteína G. Em condições normais a expressão dos receptores β1 nos ventrículos é bem maior que a dos receptores β2 (cerca de 4x).. o excesso da atividade neuro-humoral simpática pode causar um desequilíbrio dessa proporção (BRODDE. Isso promove a dissociação dessa subunidade das . A unidade α possui um sítio de ligação para o GDP que após a ativação do receptor pelo ligante sofre uma mudança conformacional ligando-se a uma molécula de GTP no lugar da anterior. MICHEL. MICHEL. em condições como na IC.. Os receptores adrenérgicos α e β são acoplados a proteína G que possui 3 subunidades que se mantêm unidas na ausência do ligante do receptor: α. que também podem ser subdivididos em receptores β1. demonstrando que em indivíduos sadios. Esses são divididos em duas classes: os receptores adrenérgicos α e β. Enquanto. 2009). 1999). Esses receptores possuem várias isoformas e estão relacionados com a amplificação da resposta advinda do exterior para o interior da célula cardíaca através de moléculas denominadas de segundos-mensageiros (ALBERTS et al. α1B. Já os receptores β-adrenérgicos. O sistema parassimpático. promovem efeitos inversos.

Os principais alvos da PKA são os canais de Ca2+ tipo-L cardíacos. PMCA e troponina I induzem aumento do relaxamento da célula (BRAUNWALD et al. A fosforilação dos canais de Ca2+ do tipo-L e RyR2 geram aumento da concentração de Ca2+ intracelular e da força contrátil. ativa ou inativa enzimas que são responsáveis pela síntese dos segundos-mensageiros. Essa ativa a enzima adenilato ciclase presente nos microdomínios da membrana cardíaca. sendo o muscarínico do tipo 2 (M2) mais expresso no tecido cardíaco e responsável pela resposta observada na ativação parassimpática. seus papéis são mais estudados em condições patológicas. A ACh reduz a freqüência cardíaca (FC) e a força de contração através da ativação de receptores muscarínicos. reduzindo o efeito da estimulação adrenérgica. 2009). Ao ser ativado. Essa molécula mensageira modula atividade de proteína cinase A (PKA) e ativa a fosforilação de uma série de proteínas intracelulares que participam do processo acoplamento excitaçãocontração do músculo cardíaco. No coração. A resposta ao aumento do ritmo de contração. Todos esses processos resultam no aumento das atividades inotrópica. as terminações do nervo vago encontram-se principalmente no nodo sino-atrial. elevando a síntese de adenosina monofosfato cíclico (AMPc). diminuindo a freqüência . PLB. Como já citado em seções anteriores. no entanto à isoforma Gi ou inibitória. 2001). o receptor dissocia a sua unidade α e esta inibe a adenilato ciclase. PMCA e proteínas contráteis como a troponina I. O receptor M2 também é um receptor acoplado à proteína G. . algumas proteínas também sofrem fosforilação pela PKA. No entanto.39 subunidades β e γ.. Além disso.. A proteína G dependendo do subtipo do receptor adrenérgico. modificando alguns padrões da atividade contrátil como: MCL2 e MyBP-C. lusitrópica e cronotrópica positivas. da força muscular e do relaxamento cardíaco é contraposta pelo sistema parassimpático através da liberação de acetilcolina (ACh) pelas terminações nervosas vagais. Esses receptores possuem cinco subtipos. RyR2. que atuam como subunidade regulatória do receptor (ALBERTS et al. os canais de potássio dependentes de ACh (KACh) e de ATP (KATP) são estimulados por Gi e esse efeito gera uma redução da voltagem intracelular. No caso dos receptores β1 e β2 a proteína G na qual eles se acoplam é a Gs (estimulatória). Já a fosforilação de PLB. mas os átrios e ventrículos também recebem sua inervação.

2001). Os efeitos moduladores do sistema nervoso autônomo. esse efeito é obtido através da ação de fosfodiesterases (PDE) que são responsáveis pela clivagem dos . Nesse último o NO aumenta a liberação de ACh intensificando o efeito do sistema parassimpático. Existem outras substâncias endógenas produzidas tanto localmente quanto sistemicamente que possuem ação no tecido cardíaco e podem de certa forma modular a contração. adenosina estimula da proteína Gi acoplada ao seu receptor do subtipo I (A(1)). 2001. Ambas as respostas permitem elevação do suprimento de O2 para o músculo cardíaco. Segundo Headrick e Laslie (2009). presente principalmente nos vasos sanguíneos. gerando um efeito vasodilatador. NO é principalmente produzido em situações de choque cardiogênico e séptico através da isoenzima NO sintase induzível (iNOS). sendo. Segundo Braunwald e outros (2001). A adenosina é sintetizada a partir do metabolismo da molécula de ATP que promove principalmente uma resposta cardioinotrópica negativa (ASAKURA et al. O NO produzido em diferentes tecidos do organismo é responsável pela redução do ritmo de despolarização das células cardíacas através da ativação da guanilato ciclase tanto nas células do coração quanto nos nervos vagos. p. 2009). expresso no músculo cardíaco e ainda o subtipo A(2). M2 possui um duplo mecanismo de ação em resposta a estimulação do nervo vago. 292).. O óxido nítrico (NO) também possui papel modulador principalmente do cronotropismo cardíaco. e ainda estimulam a liberação de ACh e inibem a liberação de norepinefrina dos terminais parassimpáticos e simpáticos. respectivamente. bem como o de hormônios e de fatores locais necessitam de regulação para que sejam cessados. portanto.. tornando-se um grande aliado para proteção contra doenças coronarianas devido a seu papel na redução da demanda e aumento do suprimento de O2 para as células do coração (Brauwald et al. A bradicinina e os opióides possuem efeito semelhante ao da adenosina podendo apresentar alguma função cardioprotetora (KATZ. No tecido cardíaco. Dessa forma. a estimulação da síntese de adenosina um mecanismo cardioprotetor importante durante eventos isquêmicos (HEADRICK E LASLIE. os receptores M2 ainda estimulam a produção de GMPc no tecido cardíaco. possuindo certo grau de efeito cronotrópico negativo. 2007). No caso dos nucleotídeos cíclicos.40 de despolarizações e logo a FC.

Assim. portanto um inibidor dessa enzima. ou fazêlo às custas de grandes pressões de enchimento.5. como por exemplo.1 Definição e classificação da insuficiência cardíaca A maioria das doenças do sistema cardiovascular evoluem para o desenvolvimento da IC. como por exemplo.1. e assim como outras enzimas e receptores podem servir de alvos terapêuticos para o tratamento de doenças cardiovasculares.. Segundo Fukuta e Little (2008).41 mesmos e inibição de suas respostas. muitas vezes o índivíduo desenvolve a doença sem necessariamente apresentar redução da fração de ejeção.1. 1. LITTLE. Existem diferentes isoformas de PDE com afinidade por um nucleotídeo específico. a IC apresenta maior prevalência e incidência na população de idade mais avançada. mas não apresenta queda no suprimento de sangue (FUKUTA. promove um efeito cardiotônico similar àquele observado durante a estimulação simpática. Trata-se de uma síndrome complexa de causas multifatoriais. a redução da resposta contrátil cardíaca. a IC pode ser designada como a condição onde o coração de um indivíduo não consegue manter o débito cardíaco suficiente para suprir as demandas exigidas pelo organismo. A inibição de PDE3 aumenta a atividade contrátil das células cardíacas. 2005). a hipertensão arterial e a estenose da vávula aórtica levam ao desenvolvimento de um fenótipo da doença onde o sistema cardiovascular encontra-se extremamente sobrecarregado. mesmo sob essas condições se a doença não for tratada e controlada com eficiência pode evoluir até o estágio . quando essa PDE clivar o AMPc. e pela característica de desenvolvimento lento e progressivo. já que essa enzima é seletiva ao AMPc. como a milrinona. No tecido cardíaco a isoforma predominante é a PDE3 (BERS. 2002). 2008). Por se estabelecer no estágio final de várias doenças cardiovasculares. As PDE também são alvo de modulação farmacológica. No entanto. Alguns tipos de condições.5 Insuficiência cardíaca 1. que apresenta uma variedade de sintomas. reduzem a qualidade de vida de um indivíduo e podem muitas vezes levar ao óbito. mas a PDE1 e a PDE7 também são expressas (DAS et al.

2010). levando à queda do débito cardíaco. Sintomas são desencadeados pela atividade física habitual. palpitações e fadiga). fadiga e palpitação durante o repouso. Tabela 1.. Atividade menor que a habitual causa sintomas. III IV NYHA: New York Heart Association. quando a IC é decorrente de uma sobrecarga de volume. . por exemplo. Os termos mais comuns usados para diferir os estágios da IC são eles: agudo e crônico (MA et al.Sintomáticos (dispnéia. Atualmente essa classificação é válida apenas para distinção dos sintomas e . ocorrendo às menores atividades físicas e mesmo em repouso.Assintomáticos em suas atividades físicas habituais. levando redução do débito cardíaco e ativação do SRAA. causando congestão pulmonar ou sobrecarga pressórica. a última a fase ou classe IV é aquela na qual as alterações da função cardíaca encontram-se bastante avançadas e os indivíduos apresentam os sintomas de dispnéia. a fase da doença e as modificações estruturais presentes no tecido. a IC recebe vários outros tipos de designações para diferir a gênese da doença. A New York Heart Association (NYHA) classifica a IC em quatro classes funcionais (Tabela 1): a primeira ou classe I é aquela que engloba os indivíduos que vivem sob influência dos fatores de risco mesmo sem apresentar qualquer sintoma ou alteração da função cardíaca. Assintomáticos em repouso. Entretanto. Classificação funcional da insuficiência cardíaca (NYHA) Classes Funcionais I II Pacientes . 2001. a terceira ou classe III se caracteriza pelo desenvolvimento dos sintomas anteriores e ainda pela redução da capacidade de realizar atividades físicas rotineiras. a segunda ou classe II é aquela em que os indíviduos apresentam alterações morfológicas e/ou hemodinâmicas e ainda dispnéia durante a atividade física.42 onde o coração não suporta a demanda exigida. e por fim. Utiliza-se a classificação de IC anterógrada e retrógrada para diferir a evolução dos sintomas. Assintomáticos em repouso. Modificado de Braunwald e outros. o funcionamento da atividade contrátil cardíaca.

Tabela 2. 660). 2001. (3) Função diastólica comprometida e fração de ejeção normal IC diastólica IC: Insuficiência cardíaca. por último. LITTLE. Suas características se encontram na Tabela 2 (FUKUTA. a insuficiência valvar.. 663. Essas diferentes classificações demonstram a complexidade da doença e a dificuldade de entendimento dos mecanismos envolvidos na sua gênese. A IC anterógrada se caracterizaria pelo aumento da pós-carga que induz a hipertrofia cardíaca concêntrica (deposição das proteínas em paralelo) e ativação o sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAA). artérias e veias) (KATZ. No modelo experimental de oclusão da ACDA de roedores. p. 2008). a hipertensão pulmonar e o diabetes mellitus. as modificações teciduais começam a aparecer logo após a lesão e a necrose celular. para distinguir algumas modificações da arquitetura tecidual e da funcionalidade cardíaca aplicam-se os termos IC diastólica e sistólica. aumento da pressão de enchimento e hipertrofia dilatada (deposição das proteínas em série). Ainda são usados os termos IC direita e esquerda para designar o ventrículo acometido (KATZ. pois na verdade a IC danifica todo sistema cardiovascular. Classificação baseada nas mudanças estruturais da insuficiência cardíaca Classificação IC sistólica Características (1) Dilatação ventricular. a cardiomiopatia hipertrófica. que especifica se a doença gera queda do débito cardíaco ou manutenção/aumento do mesmo (MEHTA. O extravasamento do conteúdo intracelular recruta . DUBREY.43 pode ser usada como guia de tratamento. 2001. quanto nos parâmetros hemodinâmicos. Dentre as causas mais comuns da IC estão: o IM. a estenose aórtica. ocorrem mudanças específicas tanto na estrutura tecidual. promovendo em estágio avançado ambos os sintomas incluídos nas classificações anterógrada e retrógrada (coração. (2) Hipertrofia excêntrica. HONG et al. levando a queda do débito sistólico. p. (2) Hipertrofia concêntrica. (3) Função diastólica e sistólica comprometidas (1) Manutenção ou redução do diâmetro ventricular. Outra forma de classificação usada é IC de baixo ou alto débito. 2010) e. Adaptado de Fukuta e Little. 2008. já a retrógrada se caracterizaria por aumento do estresse da parede. No caso do IM. a hipertensão arterial. 2009).

Se esta situação se estende por período prolongado. 2005).2 Mecanismos envolvidos no desenvolvimento da insuficiência cardíaca decorrente do infarto do miocárdio O IM é uma condição onde ocorre necrose das células cardíacas devido à redução do seu aporte de O2 e nutrientes para gerar energia. que tem como objetivo principal restabelecer a fração de ejeção que se encontra comprometida após o IM. que aliada à ativação de mediadores locais e centrais induz a hipertrofia das células cardíacas não infartadas.44 células do sistema imunológico que induz a síntese de tecido cicatricial no local do infarto (WEBER. O tecido cardíaco é altamente dependente do metabolismo oxidativo (principalmente da oxidação de lipídios) para a síntese de ATP e com isso sua função é bastante sensível à concentração desse gás no sangue arteriolar (BROOKS.1. BALDWIN. 2009). Segundo Mackiewicz e outros (2009). . as células acabam morrendo por falta de O2. a expansão da área de IM ocorre em média até duas semanas após a oclusão da coronária e a alteração da parede ventricular se prolonga durante um maior tempo e se estabiliza apenas após quatro semanas (SAKAI et al. Quando o aumento da demanda devido à elevação do trabalho cardíaco não é suprida pelo aporte de O2 necessário.. essa perda não consegue ser compensada pelo aumento da força contrátil individual das células promovida pela ativação do sistema simpático ou pela hipertrofia quando o IM é extenso.5.. 2004). os cardiomiócitos acumulam metabólitos e o pH intracelular aumenta. As causas mais freqüentes envolvidas com os eventos isquêmicos são algumas doenças vasculares como: a ateroesclorese que reduz a luz das artérias coronárias. Em humanos. 2009). No entanto. A hipertrofia cardíaca é um mecanismo compensatório. causando o seu entupimento. Esse processo pode ser evidenciado a partir da terceira ou quarta semana do mesmo (MACKIEWICZ et al. 2000). 1.. A perda de massa muscular reduz de maneira absoluta a geração de pressão sistólica e impõe uma elevada carga pressórica na parede ventricular. a perda global de tecido cardíaco aliada ao aumento da resistência vascular periférica induz a queda da função sistólica e do débito cardíaco logo após a primeira semana de IM (MACKIEWICZ et al. FAHEY.

algumas reações orgânicas compensatórias são ativadas para que ocorra a manutenção do funcionamento de órgãos vitais como o cérebro. 2008). Essas alterações são mantidas ao longo prazo. 1988. após esse ponto essa habilidade reduz com o aumento progressivo do volume ventricular (Figura 11). MIKI. em sua fase crônica essas mudanças promovem adaptações que geram maior sobrecarga no sistema cardiovascular. mantém a ativação dos mecanismos compensatórios que levam à queda progressiva da eficiência do bombeamento de sangue pelo coração (PFEFFER et al. 2009). o pulmão e também o próprio coração. e estabelece que até certo ponto de estiramento... A intensificação da sobrecarga no sistema. . dependendo da extensão da lesão que normalmente é irreversível.. MINICUCCI et al. 1979. Quando o IM não leva ao óbito..45 A primeira conseqüência da morte celular é a redução do débito cardíaco devido à perda da massa contrátil e às arritmias geradas em conseqüência do desequilíbrio químico e elétrico gerados após a lise dos cardiomiócitos. . Essas alterações imediatas normalmente restabelecem a queda do débito e a pressão arterial induzidos por morte celular significativa e.. 1979. por sua vez. com consequente redução da quantidade total de células cardíacas. portanto.. as células cardíacas são capazes de gerar maior força contrátil. Esse ciclo contínuo progride durante o desenvolvimento da doença até causar danos irreversíveis à função cardíaca. MACKIEWICZ et al. mas ao contrário da fase aguda. A primeira resposta à redução do débito sistólico é proveniente de uma característica intrínseca do tecido cardíaco conhecida como lei de “FrankStarling” (BRAUNWALD et al. Essa extensão também possui relação com o prognóstico da doença e com a taxa de mortalidade (MIURA. 2010). são consideradas como benéficas. 2001). Essa lei descreve a relação entre o desenvolvimento de pressão sistólica e a pré-carga ou volume diastólico final. RAYA et al. Inúmeros estudos relacionam a extensão do IM com a função sistólica e diastólica apresentada pelos pacientes e por animais submetidos ao IM em condições experimentais (PFEFFER et al. Esta condição pode levar a morte do indivíduo.

. 2001).46 Pressão Volume Figura 11. 2003). demonstrando o aumento do desempenho cardíaco promovido pela elevação volume intraventricular até certo ponto e queda do desempenho posteriormente (Mecanismo de “Frank-Starling”).. não é suficiente para manutenção da perfusão sanguinea adequada dos órgãos. permitindo que o ventrículo relaxe mais rapidamente e elevando o seu enchimento. 667. . Esse aumento estira as células cardíacas que permaneceram em perfeito estado e levam as mesmas a gerar mais força durante a contração. aumentando com isso o volume diastólico final do ciclo cardíaco seguinte. O sistema nervoso simpático responde rapidamente à queda de pressão. PINA et al. gerando um maior retorno venoso e aumento da pressão de enchimento (KATZ. Adaptado de Katz. direcionando o fluxo sanguineo para áreas vitais (PINA et al. O aumento da força em função volume visto no mecanismo de “Frank-Starling” é explicado pela elevação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ provocada pelo estiramento das células cardíacas (BRAUNWALD et al.. Todos esses fatores juntos induzem a melhora da capacidade de bombeamento sanguineo pelo coração e promove os ajustes dos distúrbios . Outros mecanismos são ativados para auxiliar nessa função. 2003). O mecanismo de “Frank-Starling”. porém. 2001. p. 2001. Os nervos simpáticos pós-ganglionares responsáveis pela regulação do fluxo sanguineo da pele e das extremidades induzem vasoconstricção. a redução repentina da força contrátil gerada pela necrose celular reduz imediatamente o volume sistólico final de uma contração. Curva pressão x volume do ventrículo esquerdo. Portanto. promovendo o aumento da força contrátil cardíaca. Sua ação ainda promove venoconstricção.

os canais de Ca2+ tipo-L. RyR2. Ca2+. coração. as PK que promovem a fosforilação das proteínas SERCA. 313). p. a manutenção da ativação desses processos leva a adaptações que induzem cada vez mais à queda da capacidade contrátil e à sobrecarga progressiva do sistema cardiovascular. Esses efeitos são basicamente obtidos através da ativação dos mecanismos de transdução envolvendo segundos mensageiros. Além da quantidade de proteínas expressas. ou a partir da ativação do sistema RAA (ZHANG et al. pulmão. entre outras. 1999). elevando a volemia e pressão arterial (CHIONG. p. os mecanismos compensatórios relatados acima permanecem sendo ativados na tentativa de manter os efeitos benéficos causados na fase aguda. como o AMPc . 2010). Essas mudanças podem entre outros fatores serem causadas pela ação da angiotensina II sintetizada localmente nos cardiomiócitos. A ativação do eixo RAA se dá tanto pela redução do fluxo renal decorrente da queda do débito cardíaco.. CHEUNG. Além disso. Mecanismos humorais também são ativados na tentativa de compensar os distúrbios hemodinâmicos causados pelo IM. 2001. HALL.47 hemodinâmicos causados pelo IM. Outro fator indutor da síntese protéica importante é a ativação do sistema .101). Como o efeito da perda das células cardíacas após o IM é irreversível e hiperplasia celular já não ocorre nesse estágio (KATZ. 2010). a qualidade também é alterada. A liberação de renina pelo córtex adrenal e a ativação do sistema RAA permite a retenção hídrica e de Na+. Todos esses efeitos agudos em conjunto reduzem os malefícios causados pela necrose das células e mantêm a perfusão e o funcionamento de órgãos vitais como o cérebro. 2006. quanto pela ativação simpática diretamente no córtex adrenal. a modificação da isoforma das proteínas permite a alteração do funcionamento das atividades enzimáticas intracelulares (SWYNGHEDAUW. Entretanto. mas também a sua expressão através da modulação das vias de sinalização responsáveis pela sua regulação. Já a liberação de epinefrina pela medula adrenal induz o inotropismo positivo (GUYTON. o efeito vasoconstrictor da angiotensina II auxilia o sistema nervoso simpático na elevação da pressão de enchimento. A ativação crônica dos receptores adrenérgicos através do sistema nervoso autônomo e da ação hormonal influencia não só a atividade das proteínas celulares envolvidas no processo de contração e relaxamento celular.

Outro mediador responsável pelas mudanças no padrão de expressão protéica é o Ca2+. As citocinas e fatores de crescimento comumente mais envolvidos na transcrição gênica são: fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). que além de estar em altas concentrações nas células adjacentes ao IM é liberado em grande quantidade durante a lise celular. Essas mudanças no padrão da expressão de proteínas tanto intracelulares quanto extracelulares induzem o processo de remodelamento cardíaco. interleucina 6 (IL-6). VON HAEHLING. O recrutamento de células imunológicas constituintes desse sistema vai promover liberação de fatores inflamatórios como citocinas.. fator de crescimento do endotélio vascular (VEFG). Esse alongamento produz um aumento exacerbado do diâmetro do ventrículo esquerdo e afinamento de sua parede. o que produz um maior estresse sobre a sua superfície (estresse da parede). 337). 1999). onde ocorrem a hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes. O remodelamento cardíaco ocorre também pela ativação de proteínas estruturais presentes no interior da célula que fazem parte do seu esqueleto e que mantém conexões com outras proteínas extracelulares. A lei de LaPlace que indica que o estresse da parede é diretamente proporcional ao raio do . permitindo a ativação de vias que regulam a expressão protéica de toda uma região tecidual. 2004). A necrose e a liberação do conteúdo citoplasmático no meio extracelular levam a ativação do sistema imune. Dentre algumas dessas proteínas estão as caderinas. p. integrinas. Além de participar da regulação da expressão protéica. interleucina 10 (IL-10) (ONO et al. a liberação de maciça de Ca2+ pode gerar cardiotoxicidade. ANKER. induzindo a ativação de apoptose celular e ainda causar arritmias cardíacas fatais (MACGOWAN. 1998). segundo a lei de LaPlace. LITTLE.48 imunológico. fator de transformação de crescimento (TGF-β1). titinas. 2001. 2009). o desenvolvimento de fibrose intersticial e a reorganização estrutural do tecido cardíaco (SWYNGHEDAUW. que modificarão a expressão protéica das células e principalmente levarão a formação de colágeno e desenvolvimento de tecido fibroso (cicatricial) no local do IM (BOLGER et al. O remodelamento cardíaco no IM promove a hipertrofia muscular em série (os sarcômeros sendo depositados longitudinalmente). induzindo a transdução dos sinais (KATZ. gerando um alongamento das fibras cardíacas (FUKUTA.. 2008). e as moléculas de adesão que agem em conjunto com as primeiras. 2002.

. demonstraram que a partir de quatro semanas de IM os animais já apresentavam redução da expressão de SERCA e da captação de Ca2+. Além disso.. NEARY et al. Uma das primeiras modificações em curso temporal que podem ser observadas é a redução da expressão de SERCA (MACKIEWICZ et al. 2009). O remodelamento pode também causar danos no processo de acoplamento excitação-contração. podendo gerar novos eventos isquêmicos. Outros estudos realizados em frações microssomais de RS demonstraram a mesma reposta (AFZAL. o relaxamento e o enchimento ventricular (KATZ. 1992. o aumento do estresse eleva a pressão ventricular diastólica final. difere da hipertrofia fisiológica gerada pelo exercício. aumenta o consumo energético e o requerimento de O2.. 2006). Além do dano na arquitetura tecidual.. SONG et al. 1998. HOLT et al. Esse é um . p. MACKIEWICZ et al. Portanto. sugerindo que este processo encontra-se ineficiente após o IM. 2001. p. A formação do tecido fibroso. 2009). 1991. A redução da capacidade de captação de Ca2+ pelo RS retarda o tempo de relaxamento (lusitropismo negativo) e contribui ainda mais para redução do enchimento ventricular e aumento da pressão diastólica final. A hipertrofia fisiológica não induz apoptose celular e muito menos sobrecarrega o sistema cardiovascular. são essenciais para eficiência desse processo (SCHAPER et al. 401). Yamaguchi e outros (1997) utilizaram fibras desnudas de ratos submetidos a oito semanas de IM e observaram redução da tensão isométrica gerada por uma concentração fixa de Ca2+ em diferentes tempos de carregamento. a modificação das proteínas do citoesqueleto e a ruptura tecidual decorrente do remodelamento promovem o desacoplamento do processo excitação-contração através da modificação da estrutura dos microdomínios na região onde se encontram as díades. bem como. ocorrem mudanças na expressão e no funcionamento dessas proteínas. DHALLA.49 ventrículo e inversamente proporcional a espessura do mesmo (KATZ.. dificultando o enchimento do ventrículo e aumentando ainda mais os sinais induzidos pela deformação das células cardíacas. 2005. Isso altera o posicionamento e alinhamento de estruturas protéicas envolvidas no processo contrátil que.. 2001. por sua vez. Mackiewicz e outros (2009).. SHAO et al. pelo desenvolvimento do estreitamento da parede e a presença de tecido fibroso que contribui para a redução da elasticidade do coração. Esse tipo de hipertrofia denominada dilatada. 2002.677).

Walker e outros (2009) demonstraram que MLC2. portanto. eleva a sua concentração intracelular e intensifica o funcionamento do NCX (LEHNART. a queda da função contrátil está relacionada com a variação global da concentração de Ca2+ (transiente de Ca2+). Além de contribuir para o a redução do lusitropismo cardíaco. Outra proteína de extrema importância para o processo contrátil e que se encontra hiperfosforilada em vários modelos de IC é a RyR2 (BLAYNEY. portanto. A expressão da bomba de Ca2+ de membrana PMCA também é reduzida após o IM no modelo de oclusão da ACDA (MACKIEWICZ et al. LEITE-MOREIRA. Essas modificações aliadas ao aumento da função. 1997. de restabelecer a fração de ejeção. 2009). 2009). LAM et al. Alterações nas proteínas contráteis também são observadas em vários modelos de IC (BODOR et al.. causando muitas vezes morte súbita (BLAYNEY.. LAI.. Segundo Wu e outros (2004).50 distúrbio hemodinâmico progressivo que agrava os sintomas da IC (FERREIRA-MARTINS. LAI. 2010). LI et al. 2007). 2009). O aumento da concentração de Ca2+ intracelular ainda promove a ativação da enzima Ca2+. A CAMkinase II e a ativação β-adrenérgica promovem a hiperfosforilação de proteínas envolvidas no processo de contração (CURRAN et al. A diminuição da captação de Ca2+ pelo RS e da extrusão desse íon pela PMCA. 1997. . contribuindo ainda mais para a redução da força contrátil. as quais resultam em um acometimento progressivo da doença. MyBP-C e troponina I estão hipofosforiladas logo após da indução do IM (dois dias) e que essa redução parece ocorrer na tentativa de aumentar a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ e. o aumento de sua concentração intracelular pode induzir taquiarritmias severas. da expressão do NCX reduz os estoques globais de Ca2+. bem como.calmodulina cinase do tipo II (CAMkinase II). os canais de CA2+tipo-L se encontram fosforilados nos tecidos cardíacos de pacientes transplantados e essa hiperfosforilação aumenta a probabilidade de abertura do canal. A hiperfosforilação de RyR2 resulta em uma mudança do estado de ativação do receptor que permite o vazamento de Ca2+ durante a diástole. tornando mais eficiente o mecanismo de Ca2+ induz a liberação de Ca2+. MAIER. quanto menor for o transiente de Ca2+ da célula menor será a reserva desse íon para ativação da contração muscular. 2010).. O resultado final dessas alterações são a perda da eficiência contrátil da célula e ainda sobrecarga do músculo cardíaco. 2009).. Segundo Pieske e outros (1995).

No tecido cardíaco humano essa é a isoforma predominante. por sua vez.. que possui atividade ATPásica rápida. Essas. Jideama e outros (2006). O remodelamento ainda envolve a reativação do programa de genes fetais que entre outros fatores causam a expressão da isoforma α da cadeia pesada da miosina que apresenta a atividade ATPásica mais lenta. demonstraram que a hipofosforilação de troponina I aumenta a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+. Por último. sugerindo que a hipofosforilação observada na fase aguda pode decorrer de uma tentativa rápida para o ajuste da fração de ejeção. outra alteração importante na expressão protéica ocorrida após o IM é o aumento da síntese de peptídeos natriuréticos atriais (PNA). De fato. já que esses peptídeos . desorganizando ainda mais a arquitetura celular cardíaca (GALLAGHER et al. portanto. Acredita-se que a liberação de PNA pelas células atriais pode ser atribuída a tentativa de proteger as células cardíacas após o IM. a ruptura das células cardíacas através da estimulação de metaloproteinases que são responsáveis pela degradação da matriz celular.. portanto a modificação do padrão da expressão protéica não altera a função contrátil das células.. 2002). na atividade contrátil do coração desses animais. 2006). no coração de roedores a isoforma predominante é a β. Outros fatores decorrentes do IM são de grande importância para o desenvolvimento da síndrome da IC. causando distúrbios em sua função e levando a apoptose celular (FRANGOGIANNIS et al. Apesar da alteração das cadeias pesadas sugerir a ocorrência de uma redução da contratilidade do músculo cardíaco de ratos. Além da expressão protéica do tecido cardíaco e da matriz celular. O desacoplamento energético e distúrbios na função metabólica das células cardíacas observados após o evento isquêmico induz a síntese de espécies reativas de O2. não se sabe ao certo o quanto a reprogramação dos genes fetais pode interferir na velocidade máxima da ATPase da miosina e. as citocinas liberadas sistemicamente por células imunológicas. promovem a nitrosilação de diversas proteínas. No entanto. e aquelas produzidas pelo próprio tecido cardíaco (FRANGOGIANNIS et al. as sintetizadas pelas células recrutadas.51 Eles ainda observaram que após dois meses de IM a troponina I encontra-se hiperfosforilada. podendo então aumentar a geração de força da célula. 2002) induzem.

a abordagem terapêutica da IC é bem ampla. visa-se melhorar a capacidade funcional. 2005). 1. sendo tratamento feito simultaneamente com diferentes fármacos. bem como. 2001). antagonistas dos receptores de aldosterona. Na classe I. inibidores de fosfodiesterases entre outros (GILMAN et al. Assim. As associações utilizadas. os principais objetivos são prevenir ou reverter a progressão do remodelamento e dos sintomas. hipertensão arterial.. evitando o aumento da extensão da área de IM (KISHIMOTO et al.. Com os pacientes da classe II além desse objetivo. 2004). As principais substâncias usadas no tratamento da IC são: diuréticos de alça e tiazídicos. Na classe III e na classe IV os objetivos são os mesmos com a principal preocupação da redução da mortalidade dos pacientes (BRAUNWALD et al. o exato propósito do aumento da síntese de PNA pós IM ainda precisa ser completamente elucidado. e por isso. com os pacientes da classe I. atualmente os níveis séricos desses peptídeos vêm sendo usados como marcadores do IM (ASAKURA et al... etc. betabloqueadores. a tentativa de reduzir o remodelamento se alcança através da redução dos fatores precursores da IC. o tratamento da angina pectoris. A concentração sérica dos PNA é correlacionada com a extensão da lesão causada por isquemia. a escolha do tipo de fármaco variam com o diagnóstico. inibidores da enzima conversora de angiotensina (ECA). como por exemplo. contra as hospitalizações. agonistas adrenérgicos. diabetes mellitus.2 TRATAMENTO FARMACOLÓGICO DA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA Por se tratar de uma doença multifatorial que acomete diferentes órgãos do corpo progressivamente. nitrovasodilatadores. incapacidades e a mortalidade. com o estágio no qual a doença se apresenta e o seu prognóstico.52 promovem o relaxamento da célula cardíaca e das artérias. glicosídeos cardíacos. antagonistas dos receptores de angiotensina. No entanto. Tais efeitos são obtidos com o uso dos inibidores de ECA e betabloqueadores principalmente . Dependendo do estágio no qual o paciente se encontra os objetivos principais do tratamento são diferentes. 2009). hidralazina.

Nesse caso. associada ao dinitrato de isossorbida (nitrovasodilatador não-seletivo) parece ser benéfica. e tem encontrado bons resultados no que diz respeito à redução da fibrose e hipertrofia (BING. requerendo maiores cuidados na sua administração (GILMAN et al. . aumentam o risco de ocorrência de arritmias taquiventriculares. ao mesmo tempo. Os diuréticos também são eficazes na redução da hipertensão arterial. Os diuréticos e a restrição da ingestão de sódio também são bastante eficazes nesses casos. 2001).53 (BRAUNWALD et al.. alguns trabalhos vêm investigando a utilização dos bloqueadores do receptor de aldosterona. Esse efeito não foi observado com o uso do candesartano (BRAUNWALD et al. 2001). No entanto. Alguns antagonistas do receptor de angiotensina como valsartano promoveram o aumento da mortalidade quando aliado à administração dos inibidores da ECA e os betabloqueadores. os inibidores da ECA e os betabloqueadores são os fármacos mais utilizados na tentativa de reduzir a mortalidade. A associação de um diurético tiazídico com um poupador de potássio também muitas vezes é utilizada para controle da retenção hídrica (KALRA et al. e ainda reduzem a formação de fibrose cardíaca. os antagonistas do receptor de aldosterona agem. Porém. permitindo a redução da mortalidade. No caso. bem como. Alguns fármacos inotrópicos positivos como a digoxina são eficazes em aumentar a capacidade funcional do paciente e podem ser utilizadas durante esse estágio. podendo reduzir o fator precipitante da IC. os diferentes inibidores do sistema RAA se mostraram bem mais eficazes que os bloqueadores β-adrenérgicos. Nos pacientes da classe III o índice de internações. 2001).. reafirmando a complexidade da síndrome da IC e do seu tratamento.. A utilização da hidralazina (vasodilatador arterial). 2005). 2010). e o tratamento visa principalmente reduzir esses índices. No estágio II. no qual seu representante principal é a espirolactona. . Esses resultados salientam a peculiaridade de cada fármaco integrante das classes e demonstraram que esses podem apresentar respostas terapêuticas diferentes.. a mortalidade se acentuam drasticamente. Esses dados também chamam a atenção no cuidado que se deve ter ao associar fármacos no esquema terapêutico. evitando a hipopotassemia que poderia agravar o quadro da IC.

. Portanto. 1994). milrinona. os pacientes do estágio IV possuem a função contrátil bastante comprometida. a varfarina é um coadjuvante importante. principalmente na IC decorrente de cardiomiopatias não isquêmicas. 2001. e o levosimendan que é considerado tanto um sensibilizador de Ca2+ quanto um fraco inibidor de PDE3 (BRAUNWALD et al. Segundo Nekooeian e Trabrizchi (1998). As arritmias podem ser tratadas com alguns bloqueadores de canais de Ca2+. porém... Alguns fármacos auxiliares também podem ser utilizados na tentativa de reduzir sintomas importantes decorrentes da IC. Outro sintoma importante a ser tratado é a tromboembolia.54 Por último. os cardiotônicos administrados que vêm demonstrando bons resultados são a dobutamina (agonista β-adrenérgico). Os antagonistas dos canais de Ca2+. Os tratamentos farmacológicos nesse caso são apenas paliativos e visam resguardar a função contrátil cardíaca do paciente até que haja a possibilidade da realização do transplante cardíaco. são um exemplo. Outro exemplo pode ser observado com agonistas dos receptores A(2). a administração aguda de CGS 21680 (agonista A(2A)) reduziu a progressão dos efeitos deletérios hemodinâmicos em ratos desenvolvidos oito semanas após o IM. um anticoagulante oral. assim a redução do avanço do remodelamento já é mais difícil. usando o mesmo modelo de IM. Alguns alvos farmacológicos importantes para o desenvolvimento da IC vêm sendo investigados em animais experimentais. 1993.. a utilização dos bloqueadores β-adrenérgicos já não é quase mais necessária. sendo nesse caso a varfarina. dopamina (agonista dopaminérgico). Portanto. GILMAN et al. os inibidores do sistema RAA ainda apresentam alguma eficácia embora ainda que reduzida. 2005). Sandmann e outros (2001). observaram que verapamil. Esses estudos confirmam a preocupação de pesquisadores com a busca de novos alvos terapêuticos que possam servir como alternativa para o tratamento da IC. o fármaco de escolha porque reduz significativamente o risco de tromboembolias. (MANSON. DOVAL et al. a amiodarona (bloqueador dos canais de K+ voltagem-dependentes) e o sotalol (antagonista β-adrenérgico). amlodipina e mibefradil reduziram o desenvolvimento do remodelamento cardíaco no mesmo modelo de IM com oclusão ACDA. Nesse sentido. enoximona (inibidores de PDE3).

Através de estratégias de simplificação molecular. demonstraram que essa substância . Benzodioxol (Safrol) O O O N H N Tiofenol S N-acilidrazona Figura 12. Representação estrutural do LASSBio-294. descreveram ação vasodilatadora dependente do endotélio em anéis de aorta.4 metilenodioxibenzoil-2-tienilhidrazona designada como LASSBio-294 (Figura 12) foi desenvolvida pelo Laboratório de Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro.4 METILENODIOXIBENZOIL-2-TIENILHIDRAZONA (LASSBio-294) A molécula 3. A utilização dessa subunidade (N-acilidrazona) na estrutura das moléculas se deveu ao fato desta ser muito similar a estrutura dos fármacos inibidores de PDE3 (BARREIRO. Retirado de Barreiro. obtiveram-se compostos com a subunidade N-acilidrazônica em suas estruturas.55 1. 2002.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS E MECANISMO DE AÇÃO DE 3. a partir de um esforço inicial para se obter novas substâncias cardioativas que pudessem ser utilizadas no tratamento da insuficiência cardíaca. 2002). características que conferiram a substância algumas propriedades bioativas específicas e importantes. LASSBio-294 tem como base a estrutura benzodioxola proveniente do safrol. componente químico do óleo de Sassafrás. dentre elas o LASSBio-294. e a presença do substituinte 2-tiofênico na insaturação imínica da função N-acilidrazona. Silva e outros (2002). Já Sudo e outros (2001).

eles observaram que LASSBio-294 aumentava a força isométrica das fibras cardíacas através da elevação da captação de Ca2+ pelo RS. a ativação desses receptores diminui o desenvolvimento da fibrose e ainda restaurou a resposta contrátil cardíaca induzida por adrenérgicos. pois promoveria o aumento do inotropismo positivo e melhoraria da função diastólica cardíaca. já que os que são usados na clínica. et al. Assim. que em um estágio avançado da IC tem sua síntese reduzida devido a “downregulation” dos receptores β-adrenérgicos. o que em tese seria uma grande vantagem para o tratamento da IC.238) na data 15 de agosto de 2006. (ASAKURA et al. 1991. ou possuem uma janela terapêutica muito estreita. Estudos da literatura demonstraram que a ativação dos receptores A(2A) induzia a redução de diversos sintomas da IC em diferentes modelos da doença (HORI. não havia sido descrito ainda para nenhuma substância que apresentasse atividade inotrópica positiva. não demonstrando alterações significativas promovidas pela mesma em doses bem a cima da dose terapêutica (SUDO et al. A substância apresentou ligação em torno de 57% ao receptor A(2A) que é acoplado a proteína Gs e. apresentam baixa eficácia. KITAKAZE. Segundo Asakura e outros (2007). até aquele momento.091. 2007). Essa característica peculiar gerou o depósito de uma patente na USA Patent (SUDO et al.091. Mais recentemente. um estudo encomendado ao CEREP pelo LASSBio promoveu a investigação dos possíveis alvos farmacológicos do LASSBio-294 (TANG..56 apresenta atividade inotrópica positiva decorrente de um mecanismo diferente do apresentado pelos digitálicos. USA Patent. ativa a síntese de AMPc. No 7. solidificou ainda mais hipótese de que a substância poderia apresentar algum efeito benéfico no tratamento da IC decorrente do IM. A investigação toxicológica de LASSBio-294 ratificou a segurança da substância.. 2005). e com isso trazerem benefícios terapêuticos.. 2008). como é o caso dos digitálicos (GILMAN et al. No 7. portanto. 2006). Em tese agonistas desses receptores poderiam modular todos os mecanismos regulados pela molécula de AMPc. .238. 1993). descoberta de que LASSBio-294 possuía afinidade de caráter agonista por A(2A). KITAKAZE.. Tal fato conferiu mais uma vantagem ao LASSBio-294 perante os outros inotrópicos positivos no tratamento da IC. Utilizando o modelo de fibras quimicamente desnudas. Tal mecanismo.

(Técnica de western blot) 5. 1. Avaliar os processos de captação e liberação pelo RS e sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ em fibras cardíacas quimicamente desnudas (Técnica de skinned fibers). Investigar os parâmetros hemodinâmicos (Pressões arteriais. promoveria efeito inotrópico positivo e reduziria o remodelamento cardíaco.4 OBJETIVOS 1. Quantificar a expressão da proteína SERCA2a no tecido cardíaco ventricular esquerdo.57 Levando em consideração todas essas informações supracitadas. . Avaliar a hipertrofia cardíaca (Avaliação da razão peso do coração/ peso corporal).2 Objetivos específicos 1. 2. 4.1 Objetivo geral Avaliar os efeitos terapêuticos decorrentes da administração prolongada por via ip de LASSBio-294 no sistema cardiovascular de ratos submetidos ao IM experimental. 3. o presente estudo testou a influência do tratamento com LASSBio-294 na redução das complicações induzidas após quatro semanas de IM.4.4. ventriculares e taxa de contração e relaxamento) in vivo. podendo ainda modificar as vias de sinalização envolvidas com a síntese de proteínas controladas por Ca2+ e AMPc. Quantificar o infiltrado celular e a área de fibrose do tecido cardíaco (Análise histoquímica). levantando a hipótese de que a melhora da função diastólica. 1.

58 __________________________________________________________ 2 Materiais e Métodos _______________________________________________________________ .

59 _____________________________________________________________ 2. 2+ (livre de Ca 2+ nominal) usada durante os Substância NaCl CaCl2 KCl MgCl2 NaH2PO4 NaHCO3 Glicose Concentração (mM) 130. 2. Composição da solução Ø Ca experimentos com fibras desnudas. seguindo um ciclo diurno-noturno de 12/12h.0 5.0 1.0 1. Tabela 3.25 5. .2 FÁRMACOS E REAGENTES Para a execução dos experimentos foram utilizados os seguintes reagentes e soluções: A tabela 3 mostra a composição da solução desprovida de Ca2+ usada para dissecção de feixes ventriculares.5 24. Esses animais foram alocados em caixas de acrílico forradas com maravalha e colocadas em ambiente constantemente refrigerado à temperatura de 20oC.6 As concentrações estão expressas em mM.0 0.1 ANIMAIS Ratos Wistar machos pesando inicialmente entre 150-200 gramas foram utilizados no presente estudo. Todos os experimentos seguiram as normas do comitê de uso de animais de experimentação da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Ração e água foram oferecidas à vontade aos animais.

0 As constantes de associação utilizadas para obtenção da relação entre K2EGTA/CaK2EGTA e outros ligantes foram as mesmas utilizadas por Orentlicher e outros (1974) e Fabiato. USA) e o substrato ECL®-plus (Enhanced Chemiluminescence) foi obtido da Amersham Biosciences (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. (1979). Composição da solução W e R usadas durante os experimentos com fibras desnudas. NJ. ácido propiônico. Os reagentes. EGTA = K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-éter)-N. cloreto de magnésio. LASSBio-294 foi dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO. Tween-20. N'.0 5. Cafeína. os anticorpos primários monoclonais antiSERCA2a. (Billerica. N. N'ácido tetraacético (EGTA). RJ. sirius red.0 5. Louis. N'. DMSO e bálsamo de entelam foram obtidos da MERCK & Co. USA). K2-etileno glicol-bis (2-amino-etil-éter)-N. e Fabiato. Saponina. imidazol. ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA).0 5. ácido pícrico e ácido clorídrico foram comprados da VETEC QUÍMICA FINA LTDA (Duque de Caxias. O .5 10.5 10. Triton X-100.0 As concentrações estão expressas em mM. MA.0 2. N'. ácido N’-2-hidroxietilpiperazina-N’-2- etanolsulfónico (HEPES). xileno.0 2. paraformaldeído. USA). F. e secundário anti-mouse conjugado com peroxidase provieram da Sigma Co. NJ. pH = 7. ácido fosfomolíbdico. tris(hidroximetil)-aminometano (Tris). A.0 Concentração de R (mM) 185. BR).60 A composição das soluções de lavagem (W) e a solução de relaxamento (R) encontram-se na tabela 4 descrita abaixo. Substâncias Propionato de potássio Acetato de magnésio Potássio EGTA K2NA(2A)TP EGTA Concentração de W (mM) 185. (St. USA). Piscataway. MO. fluoreto de fenilmetilsufonila (PMSF). Inc. (Whitehouse Station.ácido tetraacético. N. 100%) com uma concentração estoque de 50 mM. Tabela 4. O anticorpo monoclonal anti-gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) foi adquirido na Millipore Co.

infartado tratado com o veículo (IM . Aplicou-se ventilação artificial quando necessário até a recuperação de consciência completa dos ratos.3 DESENHO EXPERIMENTAL Os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais: 1. 2. O volume de DMSO (100%) administrado com LASSBio-294 ou puro variou de 50 à 80 µl em todos os animais incluídos nesse estudo. Utilizou-se o volume correspondente do veículo para o tratamento dos grupos controles. Infartado tratado com LASSBio-294 (IM LASSBio-294). Os ratos foram mantidos em decúbito dorsal e uma incisão para-esternal esquerda foi feita seguida de dissecção dos músculos peitoral maior e menor. 4.LASSBio-294). falsooperado tratado com LASSBio-294 (FO .0). exteriorizou-se o coração entre o quarto e quinto espaços intercostais através de compressão manual do hemitórax direito. Os ratos do grupo falso-operados (FO) foram submetidos aos mesmos procedimentos descritos anteriormente. confirmou-se o IM através da observação da onda Q (> 1mV) no . BR). porém não sofreram a ligadura da artéria coronária. falso-operado tratado com o veículo (FO . 6. LASSBio-294 (2 mg/kg) foi administrado diariamente por via intraperitoneal (ip) com início no dia da realização da cirurgia e até quatro semanas depois. e semanalmente as doses foram ajustadas de acordo com as mudanças ponderais dos animais.DMSO).DMSO). Após a dissecção.61 sevoflurano e pentobarbital sódico foram gentilmente doados pela Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda. SP. Imediatamente após este procedimento. o coração foi rapidamente recolocado na cavidade torácica e em seguida suturaram-se a pele e os músculos com intuito de fechar a incisão e facilitar a respiração do animal. 2. 3. Após vinte e quatro horas da cirurgia. A oclusão total da artéria coronária descendente anterior foi obtida através da sua ligadura com fio de seda (Ethicon.4 MODELO EXPERIMENTAL DE INFARTO DO MIOCÁRDIO Os animais foram anestesiados com sevoflurano e a cirurgia experimental do IM realizada em condições assépticas e de forma indolor. 2. (São Paulo.

A retirada da parafina das lâminas foi realizada durante duas horas na estufa aquecida e banhadas em xilol para em seguida serem coradas. então incluídos em blocos de parafina.1 Processamento e secção do material Após a fixação com formaldeído (10%). 2.. II. 95%. III durante o mesmo tempo cada. O mesmo foi estocado em recipientes contento fixador paraformaldeído a 10% em solução-tampão fosfato.6 AVALIAÇÃO HISTOQUÍMICA Após o sacrifício dos animais. . os tecidos foram infiltrados três vezes durante uma hora em parafina líquida aquecida na estufa (Biopar Eletro-eletrônicos Ltda. 2. por um período mínimo de sete dias. 50%. 100%. os tecidos foram desidratados da seguinte forma: exposição sequencial ao etanol . RS) a 56oC para serem. 100% durante uma hora cada e em seguida feita a clarificação com xilol I. Porto Alegre. 2. Apenas o ventrículo esquerdo foi utilizado para o processamento histológico. Os blocos foram seccionados em fatias de quatro a sete micra utilizando micrótomo (Lupe Indústria e Comercio Ltda.5 AVALIAÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA A hipertrofia cardíaca foi determinada indiretamente através do cálculo da relação entre peso do coração e peso corporal dos animais após as quatro semanas (peso do coração/ peso do animal).6. As fatias foram colocadas em banho à ± 37oC e em seguida suspensa em lâminas de vidro.62 eletrocardiograma (derivação I) e quando a mesma não ocorria os ratos eram descartados (YAMAGUCHI et al. SP). 70%. os corações foram retirados e colocados sobre placas de pétri para separação dos ventrículos através de um corte longitudinal no coração à direta do septo ventricular. 85%. Após a remoção do xilol. Cambuci.. 1997).

85% e 70%) Água corrente Hematoxilina + Água corrente Eosina Etanol (85 %) Etanol (95%) 2 x Etanol (100%) Etanol (100%) Duração 10 minutos cada 2 minutos + 10 minutos 5 minutos cada 5 minutos 20 minutos cada 1 minuto 1 mergulho 3 minutos 10 minutos 15 minutos Os diferentes reagentes Xilol I. Em seguida. . permitindo a observação de estruturas aniônicas como: os núcleos (hematoxilina) e o citoplasma (eosina). III Etanol (100%) + Etanol (100%) Etanol (95%.II. mais uma desidratação foi realizada para completar o processo. II.6. que reagem com estruturas celulares. Reagentes Xilol I. Nesse estudo usou-se o seguinte protocolo para coloração do tecido cardíaco (Tabela 5). para só então serem aplicados os corantes. Essa coloração demonstra os núcleos das células em azul e o citoplasma em rosa. O mesmo ocorre quando as mesmas concentrações de etanol são utilizadas seguidamente.63 2.2 Coloração do material Como os corantes não se misturam com xilol os cortes foram hidratados com concentrações decrescentes de álcool. Tabela 5.II eram compostos iguais e foram assim designados apenas para ratificar a necessidade do uso de recipientes diferentes. A hematoxilina e eosina são corantes básicos e ácidos. e possibilita uma análise geral das estruturas teciduais. respectivamente. Coloração do tecido cardíaco com hematoxilina e eosina.

III Duração 15 minutos cada 2 minutos + 10 minutos 3 minutos cada 5 e 10 minutos cada 1 minuto 5 minutos 90 minutos sem luz 2 minutos 45 segundos 5 minutos cada 10 minutos cada Os diferentes reagentes Xilol I. obteve-se a média da quantidade de núcleos celulares de seis campos distintos de uma lâmina usando uma objetiva de 40x. 2. O protocolo utilizado para esta coloração encontra-se descrito na Tabela 6.II. e em seguida calculou-se a média de dez lâminas diferentes (10 animais diferentes) em cada grupo experimental (MONDEN et . 100%) Xilol I. Após o processo de coloração.64 A coloração picrosirius permitiu a observação do depósito de colágeno (formação de fibrose) em vermelho no tecido cardíaco e as células musculares cardíacas em amarelo. 95% e 90%) 2x Água Ácido fosfomolíbdico Água Pícrosirius Ácido clorídrico Etanol (70%) Etanol (95%.II eram compostos iguais e foram assim designados apenas para ratificar a necessidade do uso de recipientes diferentes. O mesmo ocorre quando as mesmas concentrações de etanol são utilizadas seguidamente. Para o cálculo. Tabela 6.3 Mensuração da densidade nuclear e da área percentual de fibrose O infiltrado celular no tecido cardíaco foi avaliado através da medida da densidade nuclear (núcleos/mm2). 100%. II. Coloração do tecido cardíaco com picrosirius.6. III Etanol (100%) + Etanol (100%) Etanol (100%. II. as lâminas foram montadas com bálsamo de entelam. Reagentes Xilol I.

65 al. como acontece. Esta técnica. Isso possibilita a manutenção das estruturas intracelulares. KUBOTA et al.. todos os núcleos foram incluídos na contagem para análise e quantificação do infiltrado celular. 2007. correlacionando-a com a mobilização de Ca2+ e viabilizando análise do estado contrátil da célula. Os corações de ratos infartados e FO foram submetidos à análise dos processos de captação e liberação de Ca2+ pelo RS e da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ através de três protocolos experimentais. que foi usada para calcular uma média final de um total de dez lâminas (10 animais diferentes) para cada grupo experimental. Em seguida. F. através da análise da resposta contrátil de fibras cardíacas é capaz de inferir a variação da concentração Ca2+ citoplasmático na fibra cardíaca desnuda. KUBOTA et al. sem que seja necessário desmembramento do maquinário contrátil. A técnica de fibras desnudas ainda oferece a vantagem de possibilitar a avaliação direta da força de contração exercida pelo tecido. primeiramente proposta por Fabiato. no isolamento de frações do RS. a presença de fibrose foi feita com a marcação de colágeno com o corante picrosirius (MONDEN et al. por exemplo. Como a distinção entre os núcleos de células inflamatórias.. (1979). de células musculares e fibroblastos é complexa. 2000).. A. reduzindo possíveis distorções na interpretação dos mecanismos moduladores que podem ocorrer quando as estruturas são isoladas. seis campos distintos de uma lâmina foram avaliados para obtenção de uma média. Assim como anteriormente.. 2007. Feixes de fibras ventriculares quimicamente desnudas foram utilizados para investigar a regulação da mobilização de Ca2+ intracelular após o IM e a influência do tratamento com LASSBio-294 sobre essa resposta.7 AVALIAÇÃO DA REGULAÇÃO DE Ca2+ INTRACELULAR A avaliação da regulação do Ca2+ intracelular foi feita através da técnica de fibras desnudas. e Fabiato. A área percentual de colágeno foi obtida através da medida da área de fibrose marcada em vermelho em função da área total do tecido (objetiva de 20x). com o do corante hematoxilina e eosina. 2000). Os animais de cada grupo experimental foram sacrificados sob anestesia com éter e em . 2.

85 µM ou pCa 4. Em todos os experimentos.4 (0. onde uma delas encontrava-se conectada a um micromanipulador (Narishige mod. 2. Feixes de aproximadamente 10 mm de comprimento e 250–350 µm de diâmetro foram então removidos do sub-endocárdio do ventrículo esquerdo a temperatura ambiente e posicionados em uma cuba experimental de 1 ml de volume interno. Após a lavagem das fibras com a solução W. Em seguida. esvaziou-se o RS com cafeína (20 mM) diluída em solução R durante um minuto. as fibras foram estiradas para 120% do seu comprimento inicial através da visualização em estereomicroscópio binocular (Zeiss) provido de uma escala na ocular. A tensão máxima desenvolvida pelas células cardíacas desnudas foi determinada através da exposição à solução contendo CaCl2 (15.7. Em seguida.0 ± 0. a permeabilidade e a integridade das proteínas contráteis foram avaliadas através do registro da resposta contrátil máxima (P0) induzida por uma solução de pCa 4. 7400).5% v/v) durante cinco minutos. As extremidades dos feixes foram presas a duas garras localizadas horizontalmente. As Figuras 13A e 13B demonstram o esquema ilustrativo de uma cuba experimental e os processos reguladores do fluxo de Ca2+ intracelulares a serem avaliados.04 µM Ca2+) durante três minutos. Para permeabilização da membrana celular e consequentemente livre acesso das substâncias do meio extra para o intracelular. Após o carregamento induziu-se uma contratura . O sucesso do desnudamento foi confirmado comparando-se a amplitude da contratura em reposta à exposição do feixe ao CaCl2 antes e após uso da saponina.85 µM Ca2+). a viabilidade do RS foi analisada como demonstra a Figura 14.5 oC. os feixes foram submetidos ao tratamento com saponina diluída em solução R (0.8). 3) e a outra a um transdutor de tensão isométrica (Grass. a temperatura da cuba foi continuamente monitorada e mantida a 22. modelo FT03). em seguida o carregamento do RS foi obtido através da exposição das fibras a uma solução de pCa 7.8 (15.1 Captação e liberação de Ca2+ pelo RS Antes do início de cada protocolo. O registro da tensão isométrica foi feito em polígrafo (Grass mod.66 seguida seus corações retirados e mergulhados em solução nominalmente livre de Ca2+. preenchida com solução de relaxamento (solução R contendo EGTA).

Modificado de Bers. 2002. PLB = fosfolamban. Sarcolemma = sarcolema. T-tubule = túbulo-T. (B) Ilustração dos mecanismos intracelulares 2+ envolvidos na regulação de Ca e contração cardíaca. 2+ . Myofilaments = miofilamentos. O relaxamento da fibra tanto após a contratura induzida por Ca2+ quanto pela cafeína foi induzido com a aplicação da solução R na cuba experimental.67 com uma solução de cafeína (20 mM) diluída em solução W e a integridade do RS foi aceita caso a tensão isométrica gerada fosse ≥ 60% do P0. A Transdutor de Tensão Cuba Experimental B Haste Fixa Figura 13. Avaliação da mobilização de Ca intracelular através da técnica de fibras desnudas. ATP = adenosina trifosfato. RyR = receptor de rianodina. (A) Esquema ilustrativo da cuba experimental. NCX = + 2+ trocador Na /Ca .

2+ . Representação gráfica do protocolo para avaliação da captação de Ca pelo RS. A captação de CA2+foi investigada através da avaliação da curva de tensão isométrica em função dos tempos de carregamento do RS com Ca2+. Ao final do protocolo experimental. 3. + R 1 min.4 – Figura 15).8 Figura 15. da integridade das proteínas contráteis e do RS. Após 2+ as contraturas induzidas por Ca e cafeína a solução R foi adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. uma nova contratura com solução de pCa 4. 2. Diversos ciclos de contração-relaxamento foram obtidos em cada feixe de fibras musculares.8 min.5 . 2+ Após as contraturas induzidas por Ca e cafeína a solução R foi adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. Cafeína W W (20 mM) pCa 4. Diferentes tempos de carregamento foram utilizados e a resposta isométrica analisada. pCa 7.8 foi gerada para garantia da integridade das células. Caso a resposta contrátil fosse menor que 70% do P0 inicial. Representação gráfica do ciclo de contração aplicado para avaliação da permeabilização do feixe de fibras cardíacas.4 W W Cafeína 0. 1. 5 e 8 minutos) com o valor fixo de Ca2+ (pCa 7.5% (20 mM) (20 mM) 3 min.68 R R Saponina pCa 4. 5 min. usando-se tempos crescentes de carregamento (0.4 0. R R Cafeína W W (20 mM) + R 1 min.5. o experimento era descartado. Figura 14.8 Cafeína W W pCa 7.

as fibras que apresentaram ao final do experimento.2. Da mesma forma.5.0. Representação gráfica do protocolo para avaliação da liberação de Ca pelo RS. Da mesma maneira que anteriormente. R R Cafeína W W (20 mM) + R 1 min. obteve-se uma curva da resposta contrátil em função de diferentes concentrações de cafeína (0. Em seguida.2 Sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ A avaliação da interação das proteínas contráteis com o Ca2+ foi realizada em fibras cardíacas desnudas sem o RS funcional. 5. Dessa maneira. Após as contraturas induzidas por Ca e cafeína a solução R foi adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. resposta ao pCa 4.0.8 (0. este protocolo consistiu na geração de uma curva de tensão isométrica em função de concentrações crescentes de Ca2+ (pCa 7. 2. tanto o valor da concentração de Ca2+ (pCa 7. Cafeína W W pCa 4.6. destrói o RS sem alterar o funcionamento das proteínas contráteis. 6. avaliou-se a resposta das fibras na presença de cafeína após o uso do Triton X-100 e a ausência de resposta garantia a ruptura completa da membrana do RS.4 3 min. 5. no entanto. estas foram excluídas (Figura 16). Nesse protocolo. A exposição prévia de Triton X-100 (2%) durante quinze minutos.4) quanto o tempo de carregamento do mesmo para o RS foram fixos (3 minutos).0.6.8). 0. as fibras foram submetidas ao protocolo de avaliação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.8 menor que 70% do P0 inicial. 5. pCa 7.2.7. Como pode ser observado na Figura 17.2. 5. após o primeiro teste de contração.2 . 4. 6.4. 10 e 20 mM). 2+ 2.69 A liberação de Ca2+ do RS foi avaliada de maneira similar a captação. . ao final do experimento.4. 5.4.20 mM) Figura 16. 6. Diferentes concentrações de cafeína foram aplicadas com um tempo fixo de carregamento e a 2+ resposta isométrica analisada.

Utilizou-se apenas o sobrenadante para determinação da quantidade protéica. O tecido ventricular muscular esquerdo foi separado do tecido fibroso através de dissecção macroscópica. Após as contraturas induzidas por 2+ Ca a solução R foi adicionada à cuba experimental para induzir o relaxamento das fibras. 2. A concentração de proteínas presente nas amostras foi dosada através do método de Lowry. Os corações foram homogeneizados em tubos envoltos por gelo utilizando-se um ultraturrax. O RS foi destruído com Triton x-100 e diferentes concentrações de 2+ Ca foram aplicadas para análise da resposta isométrica.1 Preparação dos homogeneizados Após o sacrifício dos animais.6) 10 mM. os corações foram retirados e colocados em solução resfriada contendo sacarose 250 mM.70 as fibras que apresentaram redução da resposta ao pCa 4. sendo este último em seguida descartado.8. (20 mM) 15 min.8.4 W W pCa 7. Após esse processo.8 abaixo de 70% do P0 inicial foram descartadas.0 W W pCa 4. + R 1 min. o material foi igualmente diluído para conter uma concentração de 30 µg de proteína. os homogeneizados foram centrifugados em 9.686 x g a 40C durante vinte minutos.8 AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DE SERCA2a NO TECIDO CARDÍACO 2. R R R R Triton W W Cafeína W W pCa 7. Representação gráfica do protocolo para avaliação da sensibilidade das proteínas 2+ contráteis ao Ca . pCa 7.2 Análise da expressão protéica por Western blot Após a dosagem protéica.8 Figura 17.4 – 5. 2. usando sacarose como veículo de . A medida foi obtida por espectrofotometria com absorbância de 450 µm. EDTA 2 mM e 1 mM do inibidor de protease PMSF. HEPES–Tris (pH 7. aplicando-se o reagente folinfenol e albumina bovina sérica como padrão.4 Cafeína W W 2% (20 mM) 3 min.

resultavam em distúrbios nos parâmetros hemodinâmicos dos animais. Cada poço foi carregado com a mesma quantidade de proteína e a corrida feita em gel de poliacrilamida (10%). Para obtenção dessas medidas. usando como substrato o e ECL®-plus através da (Enhanced exposição Amersham Biosciences) radiográfica. A densitometria foi calculada da razão entre SERCA2a/GAPDH para então serem obtidas as médias dos diferentes grupos experimentais.05% de tween 20 (TBS-T) em temperatura ambiente. Chemiluminescence. os mesmos foram preparados para a eletroforese com um tampão de amostra contendo SDS-PAGE (9%). ao final das quatro semanas os ratos foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg) e após a perda dos reflexos sensitivos uma tricotomia na região cervical seguida de separação dos tecidos musculares foi realizada para se ter acesso à artéria carótida direita (Figura 18).71 diluição. As membranas então foram incubadas a 4oC durante vinte e quatro horas com anticorpo monoclonal anti-SERCA2a (1:1000) e em seguida com anticorpo secundário conjugado com a enzima peroxidase (1:10000). .9 AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS HEMODINÂMICOS Os parâmetros cardiovasculares in vivo foram obtidos com o intuito de averiguar se as mudanças observadas in vitro. seja na plasticidade tecidual ou na funcionalidade celular. Posteriormente. 2. Terminada essa fase. as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose e bloqueadas durante uma hora em leite desnatado diluído (5% p/v) em Tris-tampão salina contendo 0. A expressão das proteínas foi detectada através do ensaio de quimioluminescência. Como controle interno usou-se anticorpo monoclonal anti-GAPDH (1:4000).

O cateter conectado a um transdutor de pressão (ADInstruments model MLT884.. AU). .0. o mesmo foi introduzido até o ventrículo esquerdo para as medidas das pressões ventriculares esquerdas: sistólica final (PVSFE) e diastólica final (PVDFE). O registro do eletrocardiograma foi feito em uma derivação (I). utilizando-se o software LabChart (ADInstruments. (A) Animal anestesiado com eletrodos fixados para o registro do eletrocardiograma (B) Artéria carótida direita dissecada. O sinal obtido pelo transdutor de pressão e pelos eletrodos foi amplificado e digitalizado (Powerlab. Após a dissecção da artéria. Bella Vista NSW. Bella Vista NSW. Através dele foi possível obter os valores das derivadas máxima e mínima da pressão em função da derivada do tempo ou os valores da dP/dt máx. versão 7. ADInstruments) para posterior análise. Fotos ilustrativas da preparação de um animal para a medida dos parâmetros hemodinâmicos. e dP/dtmin. Em seguida. AU) registrou as pressões: arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) e arterial média (PAM). um cateter de polietileno (PE50) foi introduzido para registro da pressão arterial. respectivamente (Figura 19).72 A B Figura 18.

Análise de regressão linear e o coeficiente de determinação foram obtidos entre a resposta isométrica observada no tempo de carregamento de trinta segundos e a expressão de SERCA2a para os diferentes grupos. 2.05. X a concentração das substâncias ou o tempo de carregamento. considerando-se y o percentual da tensão isométrica. Os valores foram comparados através da análise de variância de um fator (ANOVA One-way) e Post Test de Tukey. As curvas da tensão isométrica em função das crescentes concentrações de cafeína e CA2+foram ajustadas através da equação: Y= Ymáx + (Ymáx – Ymín) / {1+10 [(LogEC50 .10 ANÁLISE ESTATÍSTICA Todos os dados foram expressos através da média ± EPM. Fotos ilustrativas (A) da aparelhagem utilizada o para o registro dos parâmetros hemodinâmicos e (B) dos registros de pressão arterial. e min de obtidos de um animal.73 A B Figura 19. eletrocardiograma. freqüência cardíaca e dP/dt máx. A diferença entre as médias foram consideradas significativas quando P < 0. e LogEC50 o logaritmo das concentrações de Ca2+ ou do tempo de carregamento necessários para atingir 50% do efeito máximo. . n o coeficiente de Hill. quando necessário.X) n] }.

74 _______________________________________________________________ 3 Resultados .

* P < 0. O peso corporal foi de 286.3 ± 5.75 Durante todo tratamento os ratos tratados com LASSBio-294.0 ± 8. (A) Peso corporal dos animais e (B) Relação peso do coração/peso corporal.4 g.9 ± 0.2 g (FO – DMSO) para 6.05 comparado ao grupo FO – DMSO.8 g após quatro semanas de IM (IM – DMSO).LASSBio-294 IM .DMSO IM .0 g para os grupos FO – DMSO. † P < 0. A relação entre peso do coração e peso corporal aumentou de 4.DMSO FO . O tratamento com LASSBio-294 não alterou a .9 g e 269. 280.5 ± 7.3 ± 11.DMSO FO . ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.1 AVALIAÇÃO DA HIPERTROFIA CARDÍACA Os valores do peso corporal e da relação peso do coração/ peso corporal podem ser observados na Figura 20.05 comparado ao grupo IM .LASSBio-294 8 6 4 2 0 Peso coração/ Peso corporal (mg/g) Peso corporal (g) * *† 300 200 100 0 Figura 20. FO – LASSBio-294.DMSO. Análise da hipertrofia cardíaca quatro semanas após o IM.DMSO IM . 278. tanto falso-operados quanto infartados. Nota-se que nenhuma mudança significativa no peso dos animais ocorreu entre os quatro grupos experimentais em todo o período de observação. 3. não apresentaram mudança comportamental aparente que pudesse inviabilizar o tratamento e os experimentos.LASSBio-294 IM .6 g.LASSBio-294 400 B FO .5 ± 0. IM – DMSO e IM – LASSBIO-294. A FO . Os valores representam média ± EPM de 15 .20 animais. respectivamente.

. fibroblastos e células musculares. Por causa da dificuldade na diferenciação entre os núcleos de células inflamatórias. os animais infartados submetidos ao tratamento com LASSBio-294 durante quatro semanas apresentaram o valor da relação de 5.2 DENSIDADE NUCLEAR E VOLUME DE COLÁGENO INTERSTICIAL A densidade nuclear representada como o número total de núcleos em função da área de tecido cardíaco foi usada com o objetivo de avaliar e quantificar a presença de infiltrado celular no tecido cardíaco dos diferentes grupos experimentais. Qualitativamente. o valor de 7369 ± 1086 núcleos/mm2 apresentado pelos ratos infartados e tratados com DMSO aumentou significativamente em relação ao grupo dos animais FO e tratados com DMSO após 4 semanas. observa-se que a presença de núcleos (corados em roxo) encontra-se mais elevada no coração do animal submetido ao IM e tratado apenas com DMSO em comparação ao animal FO tratado com o mesmo. constatou-se que o grupo FO – DMSO apresentou uma média de 3325 ± 201 núcleos por mm2. Na avaliação quantitativa (Figura 22).2 g. 3. todos os núcleos presentes foram incluídos na contagem. encontram-se secções de tecido cardíaco coradas com hematoxilina e eosina. Em contra partida.2 g semelhante ao grupo FO – DMSO. No entanto. apresentando valor semelhante de 3235 ± 377 núcleos/mm2.76 relação peso do coração/ peso corporal nos animais falso-operados. a média de 3061 ± 255 núcleos/mm2 obtida como valor da densidade nuclear. No entanto. o animal infartado submetido ao tratamento com LASSBio-294 possui uma distribuição de núcleos bem semelhante a do FO tratado com o veículo. permaneceu semelhante ao grupo FO – DMSO. Na Figura 21. que foi significativamente menor que os animais não tratados (IM – DMSO).7 ± 0. Posteriormente ao IM e tratamento com LASSBio-294. enquanto que o grupo FO tratado com LASSBio-294 não alterou a densidade nuclear.6 ± 0. ficando o valor 4. O tecido do animal FO tratado com LASSBio-294 não apresenta alterações representativas do número de núcleos em comparação ao animal do grupo FO – DMSO.

LASSBio-294 Densidade Nuclear (núcleos/mm 2) * 7500 5000 † 2500 0 Figura 22. Cortes histológicos dos corações de ratos dos quatro grupos experimentais corados com hematoxilina e eosina. 2 Numa etapa seguinte.LASSBio-294 IM . As setas brancas indicam os núcleos celulares. 10000 FO . * P < 0. Quantificação da densidade nuclear (núcleos/mm ).DMSO.05 comparado ao grupo FO – DMSO. avaliou-se a presença de colágeno no tecido cardíaco.10 animais. Os valores representam média ± EPM de 8 .DMSO FO .05 comparado ao grupo IM . ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.77 Figura 21. já que as células inflamatórias estão envolvidas no processo de desenvolvimento de fibrose tecidual através da indução da liberação de citocinas e quimiocinas responsáveis pela síntese de colágeno. Para isso. analisou-se a área de colágeno presente no coração dos diferentes grupos . † P < 0.DMSO IM .

2 ± 0. o músculo cardíaco do rato tratado com DMSO apresentou intensa marcação para a presença de colágeno. onde a área de colágeno pode ser evidenciada em vermelho. Figura 23. que por sua vez também foi semelhante ao valor apresentado pelo grupo FO – DMSO. Cortes histológicos dos corações de ratos dos quatro grupos experimentais corados com picrosirius.3%. De acordo com o esperado. As setas pretas indicam presença de colágeno. Nota-se que após o IM. Na Figura 23. seria possível que a substância pudesse estar atuando na diminuição da formação de fibrose no tecido cardíaco. O tratamento com LASSBio-294 após o IM reduziu significativamente esse volume para 2.78 experimentais.3 %. Já o tecido do animal do grupo IM – LASSBio-294 apresentou marcação semelhante a dos ratos dos grupos FO – DMSO e FO – LASSBio-294.1 ± 0. observam-se as imagens ilustrativas de corações dos quatro grupos experimentais corados com a coloração picrosirius.8% bem superior ao grupo FO – DMSO que foi de 1. o grupo IM – DMSO apresentou um valor de volume de colágeno de 4. A quantificação do volume de colágeno nos diferentes grupos pode ser observada na Figura 24.2 ± 0. Caso essa resposta seguisse o mesmo padrão das respostas observadas na avaliação da densidade nuclear. Os resultados também indicam que LASSBio-294 não alterou a estrutura tecidual dos . que apresentaram marcação compatível com a presença de matrix intercelular.

FO .05 comparado ao grupo FO – DMSO.3.LASSBio-294 IM . que por sua vez.1 Regulação da captação e liberação de Ca2+ do RS As respostas entre a relação da contratura induzida por cafeína e o tempo de carregamento podem ser observadas na Figura 25.DMSO.LASSBio-294 Área de Colágeno (%) 6 * 4 † 2 0 Figura 24. 3.05 comparado ao grupo IM . Quantificação da área de colágeno (%). ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey. 3.10 animais. * P < 0. Os valores representam média ± EPM de 8 . Os protocolos experimentais aplicados buscaram avaliar a captação e liberação de Ca2+ do RS e ainda.79 corações de ratos falso-operados (FO – LASSBio-294).DMSO IM . agindo apenas quando houve necrose das células cardíacas. determina os processos de contração e relaxamento do músculo cardíaco.3 CONTRATILIDADE CARDÍACA E MOBILIZAÇÃO DE Ca2+ INTRACELULAR Neste trabalho utilizou-se a técnica de fibras cardíacas desnudas com o intuito de avaliar se o tratamento prolongado com LASSBio-294 provocaria mudanças nos mecanismos celulares moduladores do fluxo de Ca2+ intracelular. a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+. † P < 0.DMSO FO . Nota-se que a tensão .

32. em comparação ao grupo IM – DMSO que apresentou os valores de 18.0 ± 6. A resposta obtida com o tratamento de LASSBio-294 após o IM foi também maior que aquela observada no FO – DMSO de 22.6 ± 5.4 ± 5. .2 ± 7. 50.8% após 5 e 8 minutos de carregamento.1 ± 5. respectivamente.9 ± 7.5%. respectivamente. 41.DMSO de 41.7%.4%.8 ± 8. cinco e oito minutos.2 ± 5.2 ± 5.1%. fato evidenciado através da diminuição do desenvolvimento da tensão isométrica pelo grupo FO. 18.1 ± 5.1%.8%. um.4 ± 5. 57. 22.6 ± 5. 48.0 % da resposta contrátil máxima.2 ± 7.4 ± 6. O IM reduziu a captação de Ca2+.2%.3 ± 6.80 isométrica gerada por uma concentração fixa de cafeína aumentou em função do tempo de carregamento. um.4% nos mesmos tempos de carregamento. no tempos de trinta segundos.1%. Já nos tempos de carregamento de trinta segundos.2%. dois e três minutos. o valor do tempo de carregamento necessário para se alcançar 50% da tensão isométrica máxima pode ser usado como parâmetro comparativo da função de captação de Ca2+ pelo RS entre os grupos experimentais (Tabela 7). O tratamento com LASSBio-294 após o IM elevou a resposta da tensão para 61. que por sua vez. a resposta isométrica foi de 22. 52.4%.9%.0%.9%. o menor tempo de carregamento avaliado.7 ± 7.6 ± 7. foram significativamente maiores que os valores observados no grupo IM – DMSO de 13. nos tempos de carregamento de três.0%. A tensão isométrica máxima gerada pelo grupo FO – DMSO foi alcançada aos oito minutos de carregamento sendo esta de 52. 29.9%.9%.5% e 61. Isto se deve ao fato de que um maior tempo de exposição da fibra a uma concentração baixa de Ca2+ (insuficiente para ativar a contração) permite que mais íons sejam transportados para o RS e liberados após ativação dos canais de RyR2 com cafeína. Segundo Sudo e outros (2001). 15.2 ± 8. 17.2 ± 6. 55.4%. os valores da tensão obtidos pelo mesmo grupo (IM – LASSBio294) foram respectivamente de 47.7%.9 ± 5.9 ± 6. 26. dois e três minutos. Em trinta segundos.4 ± 6.

* P < 0.05 comparado ao grupo IM . Captação de Ca para o RS de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO.9 * † FO – DMSO = falso-operado tratado com DMSO.LASSBio-294 60 † 40 20 0 * * † † *† † † * * * 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tempo de Carregamento (min) 2+ Figura 25. Os valores representam média ± EPM de 6 .1 ± 0.DMSO. † P < 0.8 animais. † P < 0. A liberação de Ca2+ pelo RS foi avaliada através da relação da resposta isométrica e as concentrações crescentes de cafeína no tempo de carregamento de três minutos (Figura 26).05 comparado ao grupo FO – DMSO. Tempo de carregamento necessário para atingir 50% da tensão isométrica máxima obtida. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.DMSO. ± 2.DMSO IM .81 Tensão Isométrica (% resposta máxima) 120 100 80 FO . . IM – LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294. Grupos FO – DMSO IM – DMSO IM – LASSBio-294 Tempo (minutos) 1.0 * 2.8 animais. IM – DMSO = infartado tratado com DMSO. Tabela 7.9.05 comparado ao grupo FO – DMSO. * P < 0. ANOVA OneWay seguido do teste de Tukey.4 6.DMSO IM .05 comparado ao grupo IM .3 ± 0. Os valores representam média ± EPM de 6 .

a administração de LASSBio-294 nos animais que sofreram IM elevou significativamente a interação das proteínas contráteis ao Ca2+ em comparação ao grupo não tratado. 2+ Neste gráfico.8 animais.82 Tensão Isométrica (% resposta máxima) 120 100 80 60 40 20 0 0 FO . 3. ANOVA OneWay seguido do teste de Tukey.DMSO IM . Para isso as fibras foram expostas a concentrações crescentes de Ca2+ após a destruição do RS com detergente Triton X-100. Essa alteração ocorreu nas concentrações mais baixas onde no grupo IM – LASSBio-294 as respostas . Liberação de Ca do RS de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO. Os resultados demonstram que o IM não alterou a sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.LASSBio-294 4 8 12 16 20 [Cafeína] mM Figura 26. Observa-se na Figura 27 a resposta contrátil induzida pelo Ca2+ nos diferentes grupos experimentais. nota-se que a resposta da liberação de Ca2+ não foi alterada após o IM e nem com o tratamento com LASSBio-294. Os valores representam média ± EPM de 6 . visto o deslocamento significativo da curva do grupo tratado para esquerda.DMSO IM .3. Entretanto.2 Relação da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ Avaliou-se também a interação das proteínas contráteis com o Ca2+.

6 ± 2. Essa resposta também pôde ser confirmada através da comparação dos valores de pCa50 (Tabela 8) FO .4 ± 0. 19. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.4%. † P < 0.5 5.8 animais. IM – LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294.97 ± 0.DMSO.4.66 ± 0. n = 6 .5 4.4.7 ± 5.LASSBio-294 Tensão Isométrica (% resposta máxima) 120 100 80 60 40 20 0 7. † P < 0.DMSO IM .0 ± 9.7 ± 3. 2+ Tabela 8. Grupos FO – DMSO IM – DMSO IM – LASSBio-294 pCa50 6.DMSO IM .26 † 2+ FO – DMSO = falso-operado tratado com DMSO.DMSO.5% nos pCa 7. Enquanto no grupo IM – DMSO as respostas obtidas nas mesmas concentrações foram: 33. IM – DMSO = infartado tratado com DMSO. 50.9%. .05 comparado ao grupo IM . Os valores representam média ± EPM de 6 .20 5. Potencial de Ca ou logaritmo negativo na base dez da concentração molar dos íons CA2+necessária para atingir 50% da tensão isométrica máxima obtida (pCa50).5 † † † pCa Figura 27. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.8 animais por grupo.1%.8 e 6.9%. 25.83 obtidas foram: 1.5 6. Sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca de ratos falso-operados e infartados tratados com LASSBio-294 ou DMSO.05 comparado ao grupo IM . 6.86 ± 0.13 6. 4. respectivamente.5%.7 ± 5.

Observa-se neste gráfico que a expressão de SERCA2a reduziu após quatro semanas de IM e que LASSBio-294 elevou essa expressão não somente em relação ao grupo IM – DMSO mas também em relação a grupo controle FO . Como esperado. Para investigar se a mudança na captação de Ca2+ relacionava-se com alterações na expressão da Ca2+-ATPase do RS. mas que o tratamento com a substância em ratos submetidos ao IM impediu esse efeito. O coeficiente de determinação (R2) se propõe a definir em termos percentuais. A avaliação semi-quantitativa da expressão de SERCA2a confirma esta hipótese (Figura 28B). IM – DMSO e IM – LASSBio-294 demonstram boa associação entre a resposta contrátil das células e a expressão da proteína responsável pela captação de Ca2+ para o RS. Nota-se que o IM reduziu a expressão de SERCA2a. . IM – DMSO e IM – LASSBio-294. encontra-se a microfilmagem da expressão de SERCA2a feita em homogeneizados do tecido cardíaco nos grupos FO – DMSO.DMSO. observados no tempo de carregamento de trinta segundos. Apesar de não se poder estabelecer uma relação direta de causa e efeito com essa análise. os valores obtidos permitem sugerir que a expressão SERCA2a seria proporcional à resposta isométrica obtida em trinta segundos de carregamento. Na figura 28A.84 3. permitiu a avaliação da correlação entre os dois fenômenos. o quanto a expressão de SERCA2a varia juntamente com a resposta isométrica. os R2 observado nos grupos FO – DMSO. A análise de regressão entre os valores da expressão de SERCA2a e os valores da tensão isométrica. quantificou-se a expressão de SERCA2a através dos ensaios de immunoblotting.4 EXPRESSÃODE SERCA2a NO TECIDO CARDÍACO O ensaio funcional com fibras desnudas permitiu a observação de que a captação de Ca2+ foi comprometida pelo o IM e ainda que o tratamento com LASSBio-294 foi capaz de induzir uma resposta inotrópica positiva do tecido cardíaco tanto através do aumento da captação quanto da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+.

* P < 0.0 0.DMSO IM .6 0. ANOVA One-Way seguido do teste de Tukey.DMSO IM .DMSO.0 Figura 28. Expressão de SERCA2a no tecido cardíaco de ratos.DMSO IM . Os valores representam média ± EPM de 6 . . * 0.05 comparado ao grupo IM .8 0.LASSBio-294 Expressão de SERCA2a (Unidade Arbitrária) 1. † P < 0.8 animais.4 *† .05 comparado ao grupo FO – DMSO.85 A FO . (A) Microfilmagem da expressão de SERCA2a no tecido cardíaco de ratos dos três grupos experimentais e (B) avaliação semi-quantitativa da expressão.2 0.DMSO IM – LASSBio-294 PM B FO .

2 0. (X) . Análise de regressão linear entre tensão isométrica no tempo de carregamento de trinta segundos (0.5 0. (X) . 3.77 20 0.4 Expressão de SERCA2a (Unidade Arbitrária) 80 IM – LASSBio-294 C Tensão Isométrica (% resposta máxima) 60 40 Y = 59.1 0.3 0.87 B 40 Tensão Isométrica (% resposta máxima) IM .0 .7 R 2 = 0.0 0.5 1.4 0.DMSO 50 Tensão Isométrica (% resposta máxima) 40 30 20 10 0 0.6 .143.0 Expressão de SERCA2a (Unidade Arbitrária) Figura 29. (A) Grupo FO – DMSO.5 minutos) x expressão de SERCA2a no tecido cardíaco de ratos. (C) IM – LASSBio-294.21. (B) Grupo IM – DMSO.5 PARÂMETROS HEMODINÂMICOS A função cardíaca in vivo foi investigada com o objetivo de avaliar se as modificações na contratilidade observadas in vitro anteriormente poderiam promover alterações hemodinâmicas nos animais. Para isso.0 0.86 A FO .6 Expressão de SERCA2a (Unidade Arbitrária) Y = 394.9 R 2 = 0.DMSO 30 20 10 Y = 162. (X) . um catéter acoplado a um transdutor de pressão foi inserido na artéria carótida direita e .5 .9.2 R2 = 0.68 0 0.5 2.0 1.

1 86. A função sistólica do VE foi comprometida após quatro semanas de IM observada pela queda da dP/dtmáx. derivada da pressão sistólica/derivada do tempo.2 ± 10.1 ± 7.0 ± 5.2 ± 5.. seguido do teste de Tukey. Não houve alterações significativas na FC e nas pressões arteriais dos animais dos diferentes grupos. FO – DMSO = falso-operado tratado com DMSO.6 ± 12.4 ± 5.LASSBio-294 309 ± 20 101. Distúrbios na captação levam a queda do lusitropismo induzindo o aumento do estresse e da pressão interna da parede ventricular. .5* -1018.9 ± 5. 3 ± 6. aumento da dP/dtmin e da dP/dtmáx.1 ± 11804. n = 15 animais por grupo * P < 0. dP/dtmáx e dP/dtmin.1 ± 5. IM – LASSBio-294: infartado tratado com LASSBio-294. derivada da pressão diastólica final/derivada do tempo.8 ± 456.5 ± 3. dP/dtmin. pressão sistólica final no ventrículo esquerdo.8 6812.1 * IM . PAS.DMSO. Características corporais e parâmetros hemodinâmicos dos grupos falso-operados e infartados. PVDFE.3 IM – DMSO 315 ± 21 1 00.9 * 16.8 ± 355. O tratamento de LASSBio-294 no grupo FO também aumentou significativamente a contratilidade cardíaca em relação ao grupo FO .2† -4464.87 em seguida no ventrículo esquerdo dos animais para a análise da FC.1 95.6 FO .1 99. PVSFE.7 ± 678.LASSBio-294 346 ± 12 107.05 comparado ao grupo IM .4 ± 2..2 82. FO – LASSBio-294 = falso-operado tratado com LASSBio-294.LASSBio-294 nota-se uma diminuição significativa da PVDFE.8 4. bem como.3 ± 9. IM – DMSO = infartado tratado com DMSO.6 -3765.0 ± 2.DMSO.1† PVSFE.1 89. PAD. pressão diastólica final no ventrículo esquerdo.6 .7 5349.4641.6 ± 299. PAM. PVDFE.9 79.2 78. Os resultados da Tabela 9 demonstram que o IM promove aumento da PVDFE e redução da dP/dtmin.5† 9.9 ± 1.2 94.0 ± 6.9 ± 5.2 110 ± 7.1 85.3 ± 5.05 comparado ao grupo FO – DMSO.1 104.6 ± 965.4 ± 10. No grupo IM .1 88. FO – DMSO Frequênciacardíaca(bpm ) Pressão arterial sistólica (mm Hg) Pressão arterial diastólica(mm Hg) Pressão arterial média(mm Hg) PVSFE (mm Hg) dP/dtmax (mm Hg/s) PVDFE (mm Hg) dP/dtmin (mm Hg/s) 335 ± 15 113. dP/dtMax.1 ± 373.2 7310.2 ± 5.9 8. Tabela 9. ANOVA One-Way. † P < 0.2 2218.9 ± 165.

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4 Discussão

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Este trabalho teve como objetivo principal a avaliação dos efeitos promovidos pelo tratamento com LASSBio-294, uma tienilhidrazona derivada do óleo de sassafrás (BARREIRO, 2002), sobre as adaptações no sistema cardiovascular decorrentes do IM. Tais adaptações apresentam uma progressão temporal que evolui para IC, quando não tratadas adequadamente. Atualmente, os principais fármacos utilizados no tratamento dos distúrbios promovidos pelo IM são: os bloqueadores β-adrenérgicos, diuréticos, inibidores da ECA, antagonistas dos receptores de angiotensina, antagonistas dos receptores de aldosterona (GILMAN et al., 2005). Em casos mais avançados são usados fármacos inotrópicos positivos e cardiotônicos como: glicosídeos cardíacos, agonistas β-adrenérgicos, sensibilizadores de Ca2+, inibidores de PDE, entre outros (LEHTONEN; PODER, 2007; GILMAN et al., 2005). Normalmente a administração de vários fármacos em um tratamento exige a aplicação de um esquema terapêutico mais elaborado, podendo aumentar a incidência de interações medicamentosas, de reações adversas, e ainda elevar o custo do tratamento. Tais fatores podem, por sua vez, comprometer a adesão do paciente à terapia e com isso contribuir para o aumento do número de internações hospitalares, intervenções cirúrgicas, e também o número de óbitos. Neste cenário, a busca de novas substâncias que permitam tornar o tratamento da IC mais abrangente torna-se de grande importância para o aprimoramento da sua eficácia e a obtenção de um melhor prognóstico para os pacientes. A IC é uma doença multifatorial que resulta da alteração e ativação de diferentes mecanismos em resposta a queda da fração de ejeção e do débito sistólico (SUN; WEBER, 2000; BING, 2001; STRUTHERS, 2005; FUKUTA; LITTLE, 2008; TROIDL et al., 2009). O desenvolvimento desse trabalho foi baseado em resultados anteriores que demonstraram que LASSBio-294 possuía um perfil promissor para a melhora destas alterações como: o de aumentar a captação de Ca2+ pelo RS (SUDO et al., 2001, 2006), induzir a vasodilatação (SILVA et al., 2002) e possuir uma ligação significativa ao receptor A(2A), podendo se comportar como uma substância agonista desse receptor (TANG, 2008). Esses resultados geraram a hipótese de que o

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tratamento crônico com a substância seria capaz de impedir o desenvolvimento dos distúrbios adaptativos promovidos pelo IM. O envolvimento dos receptores A(2) na proteção cardíaca contra a isquemia no fenômeno de pré-condicionamento já vem sendo estudado há algum tempo. Até o momento uma parte desse mecanismo já foi estabelecida, e parece envolver a ativação da PKC (proteína cinase C) com concomitante redução da síntese de espécies reativas de O2 no modelo de isquemia e reperfusão (BRAUNWALD et al., 2001). No entanto, pouco se conhece sobre os efeitos da ativação crônica dos receptores A(2) na IC que em roedores começa a se estabelece a partir da quarta semana após o IM

(SWYNGHEDAUW, 1999; MACKIEWICZ et al., 2009). Alguns resultados demonstraram que agonistas do receptor A(2) reduzem a fibrose cardíaca, através da inibição da proliferação de fibroblastos (DUBEY et al. 1997, 1998; VILLARREAL et al., 2003; EPPERSON et al., 2009). Outra substância da mesma classe também melhorou parâmetros hemodinâmicos alterados pelo IM (a resistência vascular periférica, débito cardíaco e a capacitância venosa) quando administrada uma única vez através de infusão intravenosa (NEKOOIAN; TABRIZCH, 1998). Porém, nenhum estudo até o presente momento havia analisado a resposta cardiovascular ao tratamento prolongado com uma substância agonista A(2) no IM crônico, onde começam a aparecer os primeiros sintomas da IC (quatro semanas) como: modificações estruturais no tecido cardíaco, desenvolvimento de hipertrofia cardíaca e alterações hemodinâmicas. Para observar tais respostas, nesse trabalho foi utilizado o modelo experimental de IM onde é feita a oclusão da ACDA. Esse modelo gera alterações semelhantes ao IM causado por placas de ateroma, ativando os mesmos mecanismos fisiológicos do IM “natural” (KLOCKE et al., 2007). Como o modelo experimental exige uma incisão torácica que gera um processo inflamatório, foram usados como controles animais falso-operados com objetivo de evitar falsas interpretações dos resultados. Essa estratégia permite que as alterações moleculares e funcionais observadas nos ratos sejam apenas aquelas provocadas pelo IM e/ou pelo tratamento, excluindo a influência das complicações cirúrgicas. Assim, esses animais foram tratados diariamente durante quatro semanas com 2 mg/kg de LASSBio-294 ou com o volume

2009). DMSO. Observou-se também que o tratamento com LASSBio-294 no grupo FO não causou alteração significativa da hipertrofia cardíaca. MACKIEWICZ et al. por via ip A escolha do tempo de tratamento foi baseada em estudos já citados anteriormente. SWYNGHEDAUW. Portanto. No entanto. o que poderia ser justificado pela dose utilizada no estudo. tal hipótese não pode ser descartada. mostrando que a substância não alterou a morfologia do coração não infartado. No mesmo estudo piloto. não é possível afirmar que doses mais elevadas de LASSBio-294. foram testadas doses menores da substância e escolheu-se a dose mais baixa capaz de promover mudanças significativas na hipertrofia cardíaca e na captação de Ca2+ para dar prosseguimento ao trabalho.91 correspondente do veículo. a hipertrofia cardíaca. Esses dados estão de acordo com os achados de Leosco e outros (2008). Um estudo piloto feito para essa tese realmente demonstrou que após duas semanas de IM não se observou o desenvolvimento significativo de hipertrofia cardíaca e de síntese de colágeno (dados não publicados). Porém. O resultado no grupo IM demonstrou que o tratamento com a substância (grupo IM – LASSBio-294) foi capaz de reduzir significativamente a hipertrofia cardíaca em relação ao grupo IM – DMSO. Esse dado é de grande importância. 1979. 1999. corroborando com os resultados dos outros investigadores.. já que não seria interessante obter uma substância que interferisse no processo de crescimento das células normais. e Mackiewicz e outros (2009) que encontraram valores muito similares. principalmente ao observar os resultados do estudo-piloto (não publicados) que demonstram que uma dose inferior da substância (1 mg/kg) não promoveu benefício algum ao animais submetidos ao IM. também aumentariam a eficácia do tratamento. encontrava-se elevada no grupo dos ratos que sofreram IM e foram tratados apenas como veículo. baseado no princípio da relação dose-efeito dos fármacos é possível que doses . esta ainda apresentou-se mais elevada que o grupo controle (FO – DMSO). gerando a hipertrofia cardíaca e a IC por si só. Os resultados demonstraram que após quatro semanas. avaliada através da relação do peso cardíaco e peso corporal. que demonstraram que o IM foi capaz de induzir o remodelamento cardíaco e gerar a IC quatro semanas após a isquemia induzida experimentalmente (PFEFFER et al. Por enquanto..

LASSBio-294 é um ligante seletivo do receptor A(2A) (TANG. aumentando a fibrose e gerando ruptura cardíaca (WEBER. Os resultados demonstram que o tratamento dos ratos submetidos ao IM com LASSBio-294 reduziu a presença de infiltrado celular e da fibrose tecidual. De fato. e com picrosirius usado para marcação de colágeno. 2007).287. 2008).92 mais elevadas promovam resultados de maior intensidade que as observadas com a dose atual. 2005). O crescimento das células cardíacas após o IM ocorre devido a diversos fatores. bem como da pós-carga eleva o estresse da parede.. Epperson e outros (2009) demonstraram que os receptores A(2A) e A(2B) estão expressos nos fibroblastos cardíacos durante a IC e respondem à presença de adenosina. 2010). A ativação crônica do sistema nervoso simpático leva a ativação das vias de proliferação relacionadas à proteína G. ativando vias de sinalização envolvidas na hipertrofia celular através da modulação das MAPkinases (AGABITI-ROSEI et al. SWYNGHEDAUW et al. 2001. Esses e outros mecanismos estão relacionados com o desenvolvimento do remodelamento cardíaco na IC e podem servir como alvo do LASSBio-294. O aumento da pressão de enchimento. e . Da mesma forma o aumento da síntese de angiotensina II está envolvido no processo hipertrófico. podendo ser um agonista do mesmo.. Os valores sugerem que a presença de colágeno nesse tecido foi muito semelhante àquela apresentada pelos ratos pertencentes ao grupo FO – DMSO. usados para a contagem do número de núcleos por área. Caso essa hipótese seja verdadeira LASSBio-294 poderia reduzir o processo cicatricial e a formação da fibrose cardíaca. 2004). que tem como alvo a PKA que fosforila fatores de transcrição (KATZ. 2001. A sobrecarga de Ca2+ também gera ativação do crescimento. STRUTHERS. 348. e o processo inflamatório modula o “turn-over” de colágeno. BING 2001. p. O efeito na redução da hipertrofia cardíaca levou à investigação dos possíveis mecanismos nos quais a substância poderia interagir para promover tal efeito. é a redução da proliferação de fibroblastos na IC. Essa reposta segundo Chen e outros (2004). assim como a aldosterona (KATZ. p. Para investigar se a substância promoveria reduzir a síntese de colágeno e o desenvolvimento de fibrose foram avaliados cortes histológicos do ventrículo esquerdo corados com hematoxilina e eosina.

. provavelmente pela ativação dos receptores de adenosina presentes nas células do tecido conjuntivo. sugerindo que LASSBio-294 aprimorou a captação de Ca2+ pelo RS. que não só a desestruturação tecidual. O efeito inotrópico foi observado também em células intactas dos músculos . entre outros. Esses resultados sugerem que LASSBio-294 reduz a fibrose tecidual. não se pode desconsiderar que outros mecanismos. atuação do sistema RAA. Sudo e outros (2001).93 condizente com a presença de matriz extracelular. podendo então desacelerar o processo de desenvolvimento da IC e reduzir o aparecimento de distúrbios hemodinâmicos característicos do processo de remodelamento pós IM. geram a ativação de mecanismos hipertróficos. impedindo que a reversão da hipertrofia seja completa. os ratos FO. com os resultados da hipertrofia cardíaca observa-se.. No entanto. modificações da expressão de proteínas intracelulares. Confrontando esses dados. como por exemplo. (BRAUNWALD et al. 2001). fomos avaliar se o mesmo resultado seria reproduzido in vivo com o tratamento prolongado dos animais. A partir dessas respostas. LITTLE. porém. a ativação do sistema nervoso simpático gerando o aumento da pressão de enchimento. que a magnitude da sua redução é menor que aquela observada nos valores de volume de colágeno. mantendo a elasticidade e a estrutura cardíaca normais. continua-se observando hipertrofia nos corações após o tratamento. 2009). portanto não serem modulados pela substância e se contraporem à sua ação protetora. Visto que LASSBio-294 apresentou efeito na modulação de CA2+intracelular in vitro (SUDO ET AL. 2001). contribuindo com a redução do remodelamento cardíaco. Isso explicaria porque os valores de fibrose retornam próximos ao controle e ainda assim. 2007) e o desacoplamento do processo excitaçãocontração (LEHNART. que 100 µM da substância aumentou a geração da força isométrica das fibras cardíacas de ratos normais. mais experimentos são necessários para confirmar a atuação dos receptores de adenosina nesse processo. foi possível formular a hipótese da atuação do LASSBio-294 na redução da proliferação da matriz extracelular. Da mesma forma. Esses mecanismos podem. não apresentaram alterações significativas nos valores de volume de colágeno do tecido. tratados com a substância. observaram em ensaios de fibras desnudas. MAIER. Isto impediria o aumento do estresse em torno da parede do coração (FUKUTA. Entretanto.

é provável que o aumento da captação de Ca2+ pelo RS induzido pela administração de LASSBio-294 em . comprovando a acessibilidade da substância ao meio intracelular com a membrana plasmática íntegra. um estudo que mensurou o transiente de Ca2+ em células intactas e estimuladas eletricamente. Portanto. Esses fatores podem ter contribuído para a redução da captação de Ca2+ pelo RS observada no presente estudo. e a angiotensina II através da ativação de PKC (TAKEISHI et al. O mecanismo da ação inotrópica proposto para LASSBio-294 por Sudo e outros (2001).. 2009). Esses resultados comprovam a hipótese anterior de que o tratamento modula a mobilização de Ca2+ da mesma forma que in vitro. NEARY et al. DHALLA. a hiperatividade do sistema nervoso simpático interfere na expressão de SERCA2a. Os resultados demonstraram que a redução da captação de Ca2+ pelo RS decorrente do IM. pois a cinética enzimática da SERCA2a in vivo é mais rápida e o tempo de relaxamento ventricular dos corações de roedores são bem menores do que os valores encontrados no ensaio de fibras desnudas (ex-vivo). cinco e oito minutos de carregamento do RS... Dados semelhantes foram observados por diferentes pesquisadores (AFZAL. No entanto. Normalmente esses fármacos ou não possuem grande eficácia ou tem uma margem de segurança pequena.94 papilares. 2009). 1999). A técnica usada por Mackiewcz e outros (2009) possui maior sensibilidade que a desse trabalho. como também a elevou além dos valores normais nos menores tempos de carregamento do RS. Segundo Inesi e outros (2008). o IM reduziu significativamente a captação de Ca2+ induzida pela SERCA2a (MACKIEWCZ et al. porque elevam a concentração citoplasmática de Ca2+ e tendem a gerar arritmias cardíacas mais facilmente (digitálicos). Os resultados deste trabalho com as fibras desnudas revelaram que a captação de Ca2+ estava reduzida após o IM. Esses dados sugerem que em condições fisiológicas a redução da captação de Ca2+ pelo RS após o IM não deve ocorrer. ocorreu nos tempos de três. demonstrou que após quatro semanas. é diferente daqueles apresentados por fármacos inotrópicos positivos e cardiotônicos.. 1992. através da ativação da proteína Gs. MACKIEWICS et al. usados na clínica até o momento. por se tratar de uma medida direta da mudança de concentração de Ca2+. 2002. Os resultados com as fibras desnudas ainda revelaram que o tratamento não só restaurou essa captação de Ca2+ comprometida pelo IM.

95 ratos submetidos ao IM aqui demonstrada. reduziriam seus estoques no RS e. Segundo Lehnart e Maier (2009). da amplitude dos “Ca2+ sparks” e em alguns casos no aumento da probabilidade de abertura de RyR2. MAIER. Essa redução seria decorrente do concomitante aumento da liberação de Ca2+ do RS. Yamaguchi e outros (1997). que se encontra comprometida na IC (BLAYNEY. e que a fosforilação de outras proteínas juntamente com a de RyR2 pode resultar no aumento da sensibilidade de ativação do receptor (RyR2). por conseguinte. da redução da captação de Ca2+ pelo RS e ainda aumento da expressão do NCX. promoveriam a queda da liberação de Ca2+. 2009). No entanto. que RyR2 encontram-se hiperfosforilados na IC. uma possível explicação para este fenômeno seria a redução dos estoques globais intracelulares de Ca2+. em fases avançadas da IC a liberação de Ca2+ do RS encontra-se reduzida. LAI. apesar dos RyR2 permanecerem hiperfosforilados. essas mudanças ocorrem como uma tentativa de tornar o acoplamento excitaçãocontração mais eficiente e de facilitar a geração de força. Segundo esses autores. mesmo com a queda na captação após o IM. não ocorrendo modificações significativas até quatro semanas após IM. Não foram obtidas mudanças significativas nos resultados que avaliaram a liberação de Ca2+ pelo RS nos grupos IM (IM – DMSO e IM – LASSBio-294). Esses resultados sugerem uma relação temporal para a disfunção do processo de liberação de Ca2+. Pirkko e outros (2007). haja visto. Blayney e Lai (2009) demonstraram numa extensa revisão. reforçando os resultados aqui encontrados. observaram queda da liberação de Ca2+ em ratos após 8 semanas de IM. Dessa forma essa mudanças poderiam ser encaradas como mecanismos compensatórios que mantém a resposta de RyR2 em função da presença de cafeína. que após a IC induzida pelo IM as proteínas envolvidas na mobilização de Ca2+ também estão hiperfosforiladas (LEHNAR. não notaram mudança na expressão de RyR2 até quatro semanas após o IM. Isso . A sensibilidade das proteínas contráteis foi avaliada e observou-se que o LASSBio-294 aumenta a sensibilidade das proteínas plasmáticas das fibras dos ratos infartados. No presente trabalho as mesmas respostas podem estar ocorrendo. 2009). da sincronização. do estado de subcondutância do mesmo. assim como observado nesse estudo. o que juntos aumentariam a extrusão celular de Ca2+. possa também ser observada em condições fisiológicas.

No entanto a sua atividade sensibilizadora de Ca2+ só ocorre em concentrações abaixo daquelas observadas fisiologicamente que varia de >10-7 a 10-5<. com certo efeito na vasodilatação e resistência vascular periférica. portanto a administração de LASSBio-294 pode facilitar o enchimento do ventrículo. responsável por ativar os receptores β. não se pode descartar a sua utilidade nos estágios mais avançados da doença onde os estoques absolutos de Ca2+ encontram-se reduzidos. sem o aumento na concentração de Ca2+ intracelular. LITTLE. ou seja. Além disso. A vantagem desse mecanismo é que na IC. Pode ser que durante essa fase o efeito do LASSBio-294 sobre a sensibilização das proteínas contráteis ao Ca2+ se torne fisiologicamente importante para o aumento da força de contração das células cardíacas.96 poderia contribuir ainda mais com efeito inotrópico da substância sem elevar as concentrações de Ca2+ intracelular. 2008). não sendo incomum a ocorrência de arritmias cardíacas decorrente de sua administração. provocar arritmias cardíacas e ainda induzir a apoptose das células (TISSIER et al. através desse último mecanismo a substância eleva o lusitropismo na fibra muscular. podendo gerar espécies reativas de O2. No entanto. A queda na concentração citosólica do Ca2+ provavelmente propiciada pela ação da substância na fase diastólica também é uma característica muito importante. o seu uso implica um grande risco. Atualmente. promovendo um efeito inotrópico positivo semelhante aos digitálicos nas fibras intactas remanescentes do coração infartado. contribuindo para redução da pressão de enchimento (FUKUTA. mas também o seu relaxamento. Outro inotrópico positivo utilizado na clínica é a dobutamina. 2007. 2008). Sabe-se que a sobrecarga de Ca2+ no citosol é altamente tóxica para a célula. sua eficácia nem . No entanto. pois parece elevar a força contrátil da fibra por um mecanismo duplo. pela sensibilização das proteínas contráteis e aumento da captação de Ca2+. os glicosídeos digitálicos são os fármacos que apresentam a maior eficácia nos pacientes da fase IV. no entanto.. o que em tese excluiria o efeito da substância. O LASSBio294 surge como um agente promissor para o tratamento da IC. Esses resultados demonstram que LASSBio-294 age como modulador da força contrátil por um mecanismo completamente diferente dos já vistos na clínica atualmente. não só a função sistólica cardíaca encontra-se acometida. A faixa terapêutica dos digitálicos é muito pequena quando comparada a de outros fármacos.

Alguns inibidores das fosfodiesterases.97 sempre é satisfatória. principalmente pelo fato dos receptores não estarem tão responsivos por causa do efeito crônico da ativação adrenérgica (LEINEWEBER. os valores dos coeficientes de determinação (R2) obtidos entre a expressão de SERCA2a em função da tensão isométrica no tempo de carregamento de trinta segundos.. 1997. como a milrinona. Além disso. 2009). seus efeitos no remodelamento ainda são pouco conhecidos. já que experimentalmente comprovou-se que o LASSBio-294 propicia o ajuste da função sistólica e diastólica. O levosimendan vem demonstrando resultados muito positivos como cardiotônico nos pacientes com IC avançada. quantificou-se a expressão da SERCA2a em homogeneizados de tecido ventricular esquerdo para observar os efeito de LASSBio-294 na síntese dessa proteína. 2009). 2008). são utilizados também em casos graves de IC. A dopamina também pode ser usada como inotrópico positivo. juntamente com os dados in vitro observados anteriormente (SUDO . porém seus efeitos no sistema nervoso central limitam o uso contínuo sendo usado apenas em fases descompensadas (GILMAN et al. 2006) ainda revelam que a substância não apresentou efeito tóxico em uma dose correspondente dez vezes mais alta que a concentração eficaz observada no estudo in vitro (100 µM) por Sudo e outros (2001). YANG et al. Esses fatores parecem garantir certa vantagem do LASSBio-294 sobre o mesmo.. E ainda seu uso ser mais restrito ao tratamento ambulatorial na IC descompensada. MAIER. 2005). mas o seu uso não demonstrou resultados satisfatórios. Os dados obtidos revelam que LASSBio-294 elevou a expressão de SERCA além do valor controle. Os dados obtidos na patente (SUDO et al. No entanto... e ainda do remodelamento cardíaco. Como muitos artigos demonstram que a queda da captação de Ca2+ pelo RS é devido a redução da atividade e/ou da expressão de SERCA (YAMAGUCHI et al. como observado nos resultados dos experimentos funcionais de captação com fibras desnudas. sua ação via inibição de PDE3 também é um fator importante para o tratamento do decréscimo da força contrátil decorrente da IC (ENDOH. Fato que eleva a sua vantagem sobre os digitálicos. 2009. HEUSCH. LEHNART. O levosimendan é o sensibilizador de Ca2+ mais importante descoberto até o momento. Endoh (2008) ainda indica uma possível desvantagem deste fármaco por provocar distúrbios na função diastólica.

Esses resultados ratificam a credibilidade dos dados que sugerem que a substância elevou tanto o inotropismo e lusitropismo positivos. PAD e PAM) e a PVDFE se eleva.1979). assim como a PVSFE de todos os grupos experimentais. dificultando o enchimento ventricular e elevando a pós-carga (NEKOOEIAN. entanto a PVDFE aumentou significativamente no grupo IM – DMSO em relação ao grupo FO – DMSO. De um modo geral observou-se que o tratamento com LASSBio-294 (2 mg/kg) parece ter reduzido os efeitos deletérios induzidos pelo IM após quatro semanas. sendo estabilizada logo em seguida (PFEFFER et al.98 et al. Aliado a isso. TRABIZCHI. queda da dP/dtmáx e elevação da dP/dtmin após o IM. No. demonstrando o efeito benéfico da substância em reparar o distúrbio hemodinâmico apresentado. Em contrapartida o grupo IM – LASSBio-294 apresentou valores mais baixos. como proposto na hipótese do trabalho. Nesse estudo observou-se que as pressões arteriais mantiveram-se constantes. que por sua vez. similares ao controle. as pressões arteriais reduzem (PAS.. dados na literatura indicam que tanto a resistência venosa e a arterial elevam após o IM (XU et al.. 2001) não descartam a hipótese de que a atividade enzimática da proteína (SERCA) também pode ser aumentada pela administração de LASSBio-294.. além disso. ou via ativação dos receptores A(2A) e ainda através da modulação direta através de uma ligação à estrutura da SERCA. na resistência periférica total. que geram mais sobrecarga no sistema cardiovascular até a falência completa da bomba cardíaca. 2009). Apesar de não podermos afirmar tal hipótese sem a medida da resistência arterial. por exemplo.. 1979. MACKIEWICZ et al. ou seja. Essa função poderia ser via modulação direta de PKA e CAMKinase II. induzem adaptações deletérias. quanto com outros ajustes hemodinâmicos como. . normalmente ocorre a queda intensa do débito cardíaco devido à perda de massa muscular. 1998). O fato de não ter sido observada uma redução da PAS pode ter relação tanto com a área de IM obtida nos ratos (PFEFFER et al. Os distúrbios moleculares que ocorrem durante a evolução e instalação da IC acarretam problemas hemodinâmicos. Observa-se que. Quando o IM é transmural e extenso (> 50%). 2009). os dados da contratilidade e relaxamento sistêmicos do presente trabalho estão de acordo com os achados anteriores. melhorando o funcionamento do sistema cardiovascular.

99 _________________________________________________________ 5 Conclusão _______________________________________________________________ .

LASSBio-294. 2010 __________________________________________________________ . LASSBio-294 contratilidade parece ter outra função a importante captação e de direta Ca2+ na e cardíaca. aumentando possivelmente impedindo a sobrecarga citosólica do mesmo. acredita-se que o LASSBio-294 é um excelente candidato para integrar futuras pesquisas no desenvolvimento de um novo fármaco para o tratamento da IC.Esses dados foram publicados na revista American Journal of Hypertension em Nov de 2010:. como por exemplo. O aumento da sensibilidade das proteínas contráteis ao Ca2+ também contribui para a melhora da contratilidade reduzida pelo IM. 23 (11):1220-1227. . Kümmerle AE. do remodelamento tecidual e da sobrecarga hemodinâmica observada após o IM.. Fraga CA. O aumento da captação de Ca2+ para o RS também poderia impedir a redução do estoque celular do mesmo modo que ocorre numa fase avançada do IM. O aumento da contratilidade promovido pelo tratamento com LASSBio294 após o IM pode em parte ser justificado pela maior expressão da SERCA. da Silva JS.100 ______________________________________________________________ 1. a redução da formação da fibrose cicatricial. Caruso-Neves C. 2. 3. a força contrátil também se eleva devido a liberação de Ca2+ pelo RS decorrente de uma maior estocagem do mesmo. Consequentemente. Am J Hypertens. As funções do LASSBio-294 observadas nesse estudo sugerem a atividade condizente a de uma substância agonista do receptor A(2). Landgraf SS.Costa DG. decreases cardiac remodeling and improves Ca²(+) influx into sarcoplasmic reticulum after myocardial infarction. A compound with inotropic and lusitropic activity. de Lacerda Barreiro EJ. Baseado nos efeitos apresentados. Sudo RT. que por sua vez explicaria o aumento da captação de Ca2+ pelo RS observado no ensaio de fibras desnudas. Zapata-Sudo G.

101 ______________________________________________________________ 6 Referências _______________________________________________________________ .

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