You are on page 1of 5

Labjournaal proef 1A

Thema 1 Koen van Breugel en Bart van Dorpel 5 september 2013

het analyseren van het DNA wat gevonden was op het tentamen. vervolgens werd het DNA geamplificeerd waarbij gebruikt werd gemaakt van een PCR machine.v. Naast het feit dat deze sequenties bekend zijn.b. Binnen de proef was het ook nog de bedoeling dat er een aantal negatieve en positieve controles waren ter bevestiging van de uiteindelijk verkregen resultaten. Het gebruik van PCR is binnen deze proef ook meteen een manier van selecteren van het gewenste DNA aangezien er gebruik wordt gemaakt van specifieke primers. een gel elektroforese begint deze proef met het isoleren van het DNA uit het wangslijmvlies van de verdachte persoon(tijdens het practicum waren wij dit zelf). onder andere Chelex en Proteinase K.v. Dit deden we m. Deze stukjes DNA bestaan uit korte sequenties die constant herhaald achter elkaar voorkomen.v. Zo waren er als positieve controles dat er bijvoorbeeld een bekende template gebruikt was bij de PCR waarvan de resultaten dus al voorspelbaar waren. Het DNA wat voor ons interessant is bij zo’n onderzoek zijn de zogenoemde short tandem repeats(STR’s). In principe was ons doel voor deze proef dus om DNA te isoleren uit cellen en het vervolgens te analyseren en het te vergelijken. Vervolgens moet het DNA geamplificeerd worden aangezien je redelijk grote hoeveelheden moet hebben om een juiste analyse te maken.b. Bij de negatieve controle zou je bijvoorbeeld geen template kunnen toevoegen tijdens de PCR waardoor je er zeker van bent dat er geen resultaten zichtbaar moeten zijn tijdens de gel elektroforese. Ook kan je de proef in duplo uitvoeren zodat je kan kijken of je 2x dezelfde DNA analyse krijgt. Inleiding Om te kijken of het aangetroffen DNA op een tentamen een match geeft met direct verkregen DNA van de verdachte is het nodig om het DNA eerst te isoleren uit de cellen van de verdachte of van de cellen aangetroffen op het tentamen. Het is namelijk zo dat er geen genexpressie plaatsvind op deze STR’s waardoor ze dus sterk onderhevig zijn aan mutaties. Vervolgens kan je het DNA dan analyseren om het te vergelijken. Een andere positieve controle die toegepast zou kunnen worden op de originele vraagstellen waarbij er dus fraude geleegd was tijdens het tentamen is om bijvoorbeeld ook het DNA van de surveillant te matchen met het tentamen aangezien dit zeker aanwezig moet zijn op het tentamen papier. Dit zorgt ervoor dat het aantal STR’s per individu uniek zijn waardoor er dus onderscheid gemaakt kan worden tussen verschillende individuen. .Doel De vraagstelling vooraf aan de proef was hoe we erachter konden komen of iemand fraude had gepleegd tijdens een tentamen m. zijn er nog een aantal factoren bij deze STR’s die gunstig zijn voor het analyseren. wat gunstig is voor het onderzoeken.b. Maar voordat we aankomen bij het aantonen van het aantal STR’s m.

Werkwijze Voor de exacte omschrijving van de proef willen wij graag verwijzen naar het protocol wat dat voor deze proef was opgesteld. Bij de start van de proef werd er met een tandenstoker wat wangslijmvlies weg geschraapt aan de binnenkant van de wang om de benodigde cellen de verkrijgen waar vervolgens DNA uit geïsoleerd kon worden.v. Dit werd gedaan door na toevoeging de oplossing 10 minuten te incuberen bij een waterbad van 57 graden Celsius. maar hier zijn we tijdens de proef vanaf geweken voor meer zekerheid. Chelex bestaan uit kleine glaspareltjes die er m. Nadat zowel de PCR als de gelen klaar waren konden we beginnen aan de gel electroforese.v.b. Wel zal er hier omschreven worden waarom bepaalde stappen uitgevoerd worden en waarom bepaalde producten gebruikt worden om de benodigde resultaten te verkrijgen. gel elektroforese moest het eerst geamplificeerd worden waarbij gebruikt werd gemaakt van PCR. In de onderste laag was toen nog Chelex aanwezig samen met andere cellulaire componenten.75% agarose gel gemaakt die ethidium bromide bevatte voor de gel electroforese. In het protocol staat dat de proteinase K 15 minuten in het waterbad moet voor inactivatie. Daarna werden de cellen overgebracht in een epje met 100µl water waarbij gebruik gemaakt is van de vortex machine en de centrifuge om de cellen van de tandenstoker te verwijderen. In de tijd dat de PCR bezig was met het amplificeren van het DNA werd er een 0.b. waardoor er meer zekerheid is dat alle eiwitten in de oplossing zijn afgebroken. Daarna werd er aan de oplossing proteinase K toegevoegd wat er voor zorgt dat alle eiwitten in de oplossing worden afgebroken. De exacte tijden en bijbehorende temperaturen die zijn gebruikt tijdens de PCR staan in het protocol. Vervolgens werd er een marker in de gel geplaatst met achtereen volgens het DNA van mij en dat van Bart. Dit zorgt ervoor dat proteinase K irreversibel inactief wordt zodat deze proteinase niet de eiwitten afbreekt die aanwezig zijn tijdens de PCR die nog moest volgen. Aan het geamplificeerde DNA werd orange loading dye toegevoegd zodat zichtbaar was wanneer het DNA onder aan de gel was. Vervolgens werd de oplossing 20 minuten in een waterbad van 95 graden celcius geplaatst. Hieraan werd toen Chelex toegevoegd. de vortex voor zorgen dat de cellen kapot gaan de mechanische krachten. Bij deze temperatuur werkt proteinase K optimaal. Het ethidium bromide bindt in de gel met het aanwezige DNA en licht dan op zodra je er met UV-licht op schijnt. Toen de loading dye onder aan de gel was werd de stroom stop gezet en werden er vervolgens foto’s ontwikkeld met daarop het aangetoonde DNA. . Na inactivatie van proteinase K werd de oplossing nogmaals gecentrifugeerd zodat er 2 lagen ontstonden waarvan de bovenste laag het DNA bevatte wat nodig was voor de analyse. Om het geïsoleerde DNA vervolgens te kunnen analyseren m.

2e en 3e laantje) niet veel zichtbaar. Om beginnen is het nodig om te weten dat de primers die gebruikt zijn bij de PCR 150 basenparen lang zijn. Daarna moet je daar 150 vanaf halen (lengte van de primer) en het vervolgens delen door 16 ( lengte van 1 repeat). dat we een marker hebben gebruikt van 10 Kb en dat de repeats 16 basenparen lang zijn. Helaas is dat bij ons niet mogelijk aangezien er op de afbeelding bij onze laantjes geen duidelijke bandjes zichtbaar zijn. tabel 1 (amplificatie gegevens). Om het aantal repeats te berekenen zijn de volgende gegeven essentieel.b. Zo zie je bij meerdere personen duidelijk een streepje wat je dus kan linken aan het aantal STR’s m.v.Resultaten Zoals zichtbaar in de afbeelding hieronder is er bij onze laantjes (linker gel. maar voor deze proef is gekozen voor langere repeats. maar het principe zal toch even worden toegelicht . Het getal wat daar dan uitkomt geeft aan hoeveel repeats van die specifieke STR je in je DNA hebt. Nu deze gegevens bekend zijn is het mogelijk om het aantal repeats van een individu te bepalen.b. Afbeelding 1 / tabel 1 . Om te beginnen moet je m. de marker bepalen uit hoeveel basenparen jou sequentie bestaat die bij het bandje hoort dat zichtbaar is op de foto van de gel elektroforese. Maar als we naar de resultaten kijken als groep in zijn geheel dan is er wel degelijk wat zichtbaar.v. Meestal zijn de repeats van de STR’s tussen de 4 en de 8 basenparen lang.

maar omdat het in zo’n sterke mate aanwezig was heeft het toch gezorgd voor wat kleuring waardoor er een wit vlak ontstaan is. Het kan namelijk zo zijn dat deze niet volledig is gedeactiveerd waardoor het de eiwitten heeft afgebroken die aanwezig zijn tijdens de PCR. Een andere verklaring voor de matige resultaten zit in de eerste paar stappen van het protocol.Conclusie en discussie Hoewel er uit onze eigen resultaten helaas weinig te concluderen valt is er wel degelijk iets te concluderen uit de resultaten van de groep in zijn geheeld. Het kan namelijk ook zo zijn dat er in eerste instantie te weinig weefsel is weg geschraapt uit de mondholte of dat er te kort gebruik is gemaakt van de vortex waardoor het weefsel is blijven hangen aan de tandenstoker. Voor hetgeen dat er zo weinig DNA zichtbaar is op de foto zijn ook een aantal mogelijke verklaringen die een rol zouden kunnen spelen tijdens de proef en daarmee de uiteindelijke foto op een negatieve manier kunnen beïnvloeden. De meerdere bandjes die soms bij een enkel individu zichtbaar zijn. Te weinig Chelex zorgt er ook voor dat er niet genoeg mechanische krachten op de cellen komen waardoor deze niet kapot gaan en het DNA dus beschermt blijft. Dit is overigens niet erg waarschijnlijk omdat er maar weinig Chelex werd gebruikt in verband met de kosten van dit materiaal. Wat nou de uiteindelijke reden is of wat de uiteindelijke redenen zijn is helaas onbekend. dus dan zou het nog steeds niet zichtbaar zijn om de afbeelding. Hierdoor zou er niet genoeg DNA aanwezig zijn in de oplossing. De laatste mogelijke verklaring ligt bij het proteinase K. Voor het witte vlak zichtbaar op de bovenste helft van afbeelding 1 is ook een verklaring. Het is namelijk zo dat het ethidium bromide dat in overmaat aanwezig was in de gel na een tijdje naar boven komt. Deze laatste verklaring is overigens niet erg waarschijnlijk aangezien het ethidium bromide alleen bind aan het DNA en niet aan andere mogelijke eiwitten in de oplossing. . De wat wazige veeg rechtsonder in de afbeelding van de linker gel is veroorzaakt door een scheur in de gel. Normaal gesproken zou dit niet zichtbaar zijn op de foto aangezien het niet gebonden is met DNA. Dit heeft dus ook niks te maken met mogelijke fouten die gemaakt zijn tijdens de proef. Een mogelijke verklaring is bijvoorbeeld dat er teveel of te weinig Chelex is gebruikt. kunnen bijvoorbeeld verklaard worden door hetgeen dat iemand heterozygoot is. Teveel Chelex zou ervoor zorgen dat de pareltjes niet meer goed kunnen bewegen waardoor er niet genoeg mechanische kracht wordt uitgeoefend op de cellen. Zo is er bijvoorbeeld wel zichtbaar dat er tussen verschillende personen ook verschillen zitten in het aantal STR’s wat dus betekend dat deze proef ook gebruikt zo kunnen worden om een match aan te tonen tussen het gevonden weefsel op bijvoorbeeld een tentamen en de verdachte persoon. Dat er te weinig Chelex is gebruikt is daarin tegen wel mogelijk en ook een stuk aannemelijker. Ook zou het zo kunnen zijn de het proteinase K niet goed is geactiveerd waardoor er nog eiwitten aanwezig zijn die de proef hebben verstoord.