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La centrifugacin

La centrifugacin es una tcnica de separacin que se utiliza para aislar o concentrar partculas suspendidas en un lquido aprovechando la diferente velocidad de desplazamiento segn su forma, tamao o peso al ser sometidas a una fuerza centrfuga. La fuerza centrfuga es la que se ejerce sobre un cuerpo cuando ste gira alrededor de un eje. Esta fuerza, cuya magnitud es directamente proporcional a la masa del cuerpo, el radio de giro y la velocidad de giro (o angular), es perpendicular al eje y tiende a alejar el cuerpo del mismo. La fuerza centrfuga puede acelerar el proceso de sedimentacin de partculas que tienen tendencia a hacerlo espontneamente (densidad superior a la del lquido), o en aquellas que tienden a flotar (densidad inferior a la del lquido). En la centrifugacin existen dos fases claramente distintas se forman en el recipiente durante la centrifugacin: El sedimento: Generalmente no tiene una estructura uniforme. El centrifugado o el concentrado: es el lquido flotante, a menudo claro o algunas veces nublado, debido a la presencia de las partculas coloidales muy finas que no se depositan fcilmente. Sin embargo puede tambin contener varias fases si el lquido intersticial de las mezclas contiene el elemento con diversas densidades, tales como aceites, por ejemplo.

INSTRUMENTAL Para el proceso de centrifugacin se utiliza el siguiente instrumental: 1. Tubos de ensayo: De vidrio o plstico. Resistentes qumicamente (disolventes, reactivos) y fsicamente (tensin a las velocidades elevadas que se emplean). Diversos tamaos y formas. Plsticos especiales para altas velocidades. 2. Centrifugadores: Los centrifugadores se encargan de la separacin de las partculas mediante fuerza de aceleracin gravitacional que se logra gracias a una rotacin rpida. Este proceso puede provocar la sedimentacin o suspensin de las partculas o puede conseguir la fuerza necesaria para la filtracin a travs de algn tipo de filtro. La aplicacin ms comn es la separacin de sustancias slidas a partir de suspensiones altamente concentradas. 3. Rotores: Existen dos tipos: Rotor angular o fijo:

Rotor basculante:

MODALIDADES Las modalidades de la centrifugacion las podemos clasificar en: 1. Segn la velocidad: a) Centrifuga de baja velocidad: Tambien llamadas de sobremesa o clinicas, de pequeo tamao y sin refrigeracin. Alcanzan una velocidad mxima de 5000 rpm. Son tiles para la separacin de partculas grandes como clulas o precipitados de sales insolubles. Las centrfugas micrfugas son una variante de las anteriores que permiten llegar a velocidades de ms de 10.000 rpm. Los volmenes de trabajo son muy pequeos. Son tiles en el campo de la biologa molecular. b) Centrifugas de alta velocidad: Alcanzan velocidades de entre 18.000 y 25.000 rpm. Son refrigeradas y algunas tienen sistema de vaco para evitar el calentamiento del rotor a causa del rozamiento con el aire. Son tiles en la separacin de fracciones celulares, pero insuficientes para la separacin de ribosomas, virus o macromolculas en general. c) Ultracentrifugas: Superan las 50.000 rpm, por lo que tienen sistemas auxiliares de refrigeracin y de alto vaco. Hay ultracentrfugas analticas que permiten la obtencin de datos precisos de propiedades de sedimentacin (coeficientes de sedimentacin, pesos moleculares), y preparativas, tiles para aislar partculas de bajo coeficiente de sedimentacin (microsomas, virus, macromolculas). 2. Segn el proposito: a) Centrifugacion Analitica: Tiene como objetivo medir las propiedades fsicas de las partculas que sedimentan, tales como su coeficiente de sedimentacin o su masa molecular. Especialmente en la variante de ultracentrifugacin analtica. Las molculas se observan mediante un sistema ptico durante la centrifugacin. Los tubos de centrfuga deben ser de cuarzo para dejar pasar la luz visible y ultravioleta. Rotor basculante, observacin en vertical. b) Centrifugacion Preparativa: Es la de uso mas comn y tiene como objetivo aislar partculas, clulas o molculas para su anlisis o utilizacin posterior. En general, se emplea mayor cantidad de muestra que en la analtica. 3. Segn el medio en que se centrifuga y la forma como se aplica la muestra:

a) Centrifugacion diferencial: Tambin llamada de frontera mvil. El tubo se llena con muestra y
se centrifuga. El comportamiento de cada componente de la muestra depende de su forma,

tamao, densidad y, lgicamente, de las condiciones de centrifugacin. Se obtienen slo 2 fracciones: sedimento y sobrenadante. Una aplicacin tpica es el fraccionamiento subcelular (separacin de los distintos componentes de una clula, principalmente de los orgnulos) empleando sucesivas centrifugaciones a velocidad creciente.

b) C entrifug acin zonal o de velocida d de sedime ntacin: La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de centrifugacin, que es un gradiente de densidad. Bajo la fuerza centrfuga, las partculas sedimentan a travs del gradiente concentrndose en zonas o bandas discretas. Su velocidad de avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende de su tamao, forma y densidad; todos estos parmetros se combinan en el coeficiente de sedimentacin.
La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las partculas separadas llegue al fondo del tubo. Los componentes separados se recogen individualmente aspirando con mucho cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo del tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae. El gradiente de densidad se crea mediante un gradiente de concentracin: concentraciones crecientes, al bajar en el tubo, de un componente adecuado. Se usan para ello sacarosa, cloruro de cesio, albmina, suero fetal, bovino..., o medios comerciales como Ficol (Ficollpaque) un polisacrido sinttico- Percoll, metrizamida. Se puede preparar: Un gradiente discontinuo o escalonado, manualmente. Un gradiente continuo, empleando un dispositivo formador de gradientes. Un gradiente continuo autoformado, si se crea mediante centrifugacin, normalmente a la vez que se fracciona la muestra.

Con esta tcnica se consigue, por ejemplo, separar todos los tipos celulares sanguneos, purificar espermatozoides viables, separar clulas viables y no viables de tejidos desagregados y muestras con clulas en suspensin, etc.

c) Centrifugacion isopicnica o de equilibrio de sedimentacion: Separa las partculas en un


gradiente de densidades en funcin de la densidad de las mismas. Las partculas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de stas y la del gradiente son idnticas (de aqu el nombre de isopcnico). En este caso, es condicin fundamental que la densidad mxima del gradiente final ha de exceder siempre a la densidad de las partculas. Por este motivo la sedimentacin final no se produce si se controlan las condiciones de centrifugacin, ya que las partculas flotan sobre un "colchn" de material que posee una densidad superior a la de stas. Esta tcnica se utiliza, por ejemplo, para separar partculas similares en tamao pero de diferente densidad. En este sentido, la centrifugacin isopcnica es un mtodo adecuado para separar cidos nucleicos o diferentes orgnulos celulares.

d) Metodo de Barrera: Mtodo rpido, tpico por ejemplo en la obtencin de leucocitos de sangre
circulante libres del resto de clulas sanguneas. Se trata de una centrifugacin a travs de un medio de densidad constante (se podra considerar como un gradiente escalonado de una sola etapa). La densidad de este lecho debe ser intermedia entre la de los tipos celulares que se quieren separar. Se emplean para ello medios comerciales como FicollPaque, Lymphoprep y otros muchos, formados generalmente por mezclas de Ficoll (un polisacrido sinttico) y metrizamida (un compuesto sinttico yodado). TIPOS DE CENTRIFUGADORES Los centrifugadores de sedimentos fueron inventados para la separacin entre lquidos y slidas y para los slidos no manejables. Pronto se lleg a la conclusin de que este tipo de sistemas tiene una gran cantidad de aplicaciones adicionales desde la separacin de slidos e impurezas, hasta la separacin de slidos en lquidos. La mayora de los centrifugadores rotan gracias a algn tipo de fuerza motriz. El tipo de centrifugadores para la sedimentacin incluyen: 1) Hidrociclones: La manera ms simple de utilizar la fuerza centrfuga para la separacin son los hidrociclones. En realidad no es un centrifugador: ya que la separacin centrifuga se producida por el movimiento del lodo, inducido por la inyeccin del material de alimentacin

de manera tangencial. El principio de operacin se basa en el concepto de velocidad terminal de sedimentacin de una partcula slida en un campo centrfugo. El flujo de entrada entra tangencialmente (inlet) en la seccin cilndrica del hidrocicln que seguir un camino circular con un flujo revertido de fluido desde afuera al eje del vrtice (vortex finder).El campo centrifugo generado por las velocidades tan altas de circulacin creara un cono de aire en el eje que normalmente se extiende hasta la apertura gua (spigot or apex) en la base de la seccin cnica (air core) a travs del vrtice (vortex finder) y hasta la seccin de reborde o rebosamiento en la parte superior (overflow).Para que esto ocurra la fuerza centrfuga debe ser mucho mayor que la gravitacional. Las partculas que caen dentro del campo centrifugo tendern a moverse hacia afuera en funcin de la mayor densidad. Las mayores, y ms pesadas migran rpidamente a las paredes de fuera de la seccin cilndrica y posteriormente forzadas a caer al interior de la pared cnica. Las partculas pequeas, sern sin embargo atradas hacia dentro por el fluido a medida que se mueven hacia el vrtice (vortex finder). La

separacin slida ocurrir durante la suspensin a lo largo del recipiente del hidrocicln, de manera que genera lodo denso en la pared ms externa, que permite el flujo continuo del hidrocicln en la boquilla de retraso. 2) Campana tubular centrifuga: La campana tubular centrifuga ha sido usado durante mucho tiempo antes que otros sistemas de centrifugacin. Se basa en simple geometra: su diseo consiste en un tubo, cuyo largo es de varias veces su dimetro que rotan entre apoyos a cada lado. El flujo del proceso entra en el fondo del centrifugador (feed suspension) y altas fuerzas centrifugas separan los slidos que se adhieren a las pareces de la campana, mientras la fase liquida sale en la parte superior del centrifugador. Debido a que este sistema carece de rechazo de slidos, los slidos solo se pueden eliminar parando el funcionamiento del aparato, desmontndolo y arrastrando o lavando los slidos manualmente. Estos centrifugadores campana tubular tienen capacidad de deshidratacin, pero capacidad limitada de separacin de slidos. La espuma generada puede suponer un problema a no ser que se utilicen skimmer especiales o bomba centrpeta.

3) Cmaras/campanas de centrifugacin: Las cmaras- campana de centrifugacin consiste en un nmero de campanas tubulares organizadas de manera coaxial. Consiste en una campana principal que tienen divisiones cilndricas insertadas que separan el volumen de la campana en una serie de cmaras anulares que operan en serie. El flujo de alimentacin entra en el centro de la campana y la suspensin pasa a travs de las distintas cmaras, que van aumentado la distancia del eje. Los slidos sedimentan en las partes externas en las paredes de las cmaras y el lquido limpio se extrae mediante rebosamiento en la cmara de mayor dimetro. El sistema tambin supone una clasificacin de slidos en suspensin: las partculas principales se depositen en la cmara interior y las partculas finas en las cmaras subsecuentes. La eliminacin de los slidos sedimentadles necesita la parada de la rotacin para su limpieza manual.

4) Centrifugador de cesta no perforada: Se usa cuando el contenido de slidos en suspensin es muy alto. Consiste simplemente en una cesta o campana tambor, que normalmente rota en torno a un eje vertical. Los slidos se acumulan y comprimen debido a la fuerza centrfuga pero no son deshidratados. El lquido residual drena al parar la rotacin. la capa de slidos se remueve manualmente mediante cepillado o retirada con pala. La descarga se puede conseguir mediante un skimmer y tubera para remover el lquido residual y despus mediante la aplicacin de una pala-cuchillo para cortar el slido formado. Esto evita la parada del sistema para su limpieza. 5) Separador de discos: El diseo ms limpio se basa en una cmara cerrada que contiene una pila de discos, donde cualquier slido recogido en la parte externa de la cmara, desde donde se retiraran manualmente al parar la rotacin. Los slidos son extrados de la cmara mediante una serie de mtodos incluidos las boquillas, que se abren continuamente, y que permiten la retirada de lodo denso. En otros diseos ms complicados boquillas con vlvulas se abren automticamente cuando la profundidad del slido en la amara alcanza cierto valor, y luego se cierra cuando los slidos han sido extrados. El diseo ms complicado, consiste en una cmara abierta: donde las carcasas de la cmara se separan de manera circunferencial durante un corto periodo de tiempo, en donde esta apertura tambin viene condicionada por la profundidad de los slidos en la cmara.

6) Decantador: El decantador centrifugo es el nico decantador que ha sido preparado para el manejo de concentracin de solidos significativa en la suspensin de alimentacin. Al mismo tiempo alcanza altos niveles de clarificacin del concentrado lquido. Aunque es una mquina de diseo complicado est basado en un principio bsico. Consiste en una cmara cilndrica horizontal (1) que rota a alta velocidad, con un tornillo helicoidal de extraccin (2) situado coaxialmente. El tornillo se ajusta perfectamente al contorno de la camara, de manera que solo permite agua clara entre la camara y el rotador. La velocidad diferencial entre el tornillo y el rotador es lo que provoca un movimiento de arrastre para la recogida de los solidos, que se acumulan en las paredes de la camara. El producto a ser tratado (3) se introduce axialmente en la unidad mediante un distribuidor apropiado (4). Es propulsado en el espacio anillo (5) que se forma en la superficie interna de la camara y el cuerpo del rotador. El proceso de rotacion tiene lugar dentro de la seccion cilindrica de la camara. La velocidad relativa del rotador empuja los productos sedimentados (6) a lo largo de la camara. El arrastre de los solidos en la longitud del cono permite los sedimentos pasar fuera de la fase liquida clarificada. Mientras la entrada de agua sea continua se establece un nivel liquido (7) en la unidad siguiendo la superficie cilindrica que constituye la superficie externa del anillo liquido. Una vez han pasado los solidos fuera del anillo liquido la seccion restante del cono produce el drenaje final hasta el eyecor o expulsor: esta seccion se conoce como zona de secado (8). El liquido clarificado (9) se colecta al otro extremo de la camara mediante un flujo dentro de un limite ajustable (10), que limite el anillo de liquido de la unidad. Una tapa permite la coleccion del lquido clarificado y los sedimentos y protege el rotor. El decantador opera principalmente mediante la sedimentacin causada por la separacin de slidos en suspensin en funcin de la densidad del lquido donde se encuentran suspendidos. Si la diferencia de densidad es mayor que la gravedad esto provoca una fuerza motriz suficiente para la separacin en un tiempo razonable. Si la densidad es pequea, o el tamao de las partculas es pequeo, entonces la separacin por gravedad se produce durante mucho tiempo y la fuerza de separacin debe aumentarse mediante fuerzas centrifugas mayores que la gravedad.

1. Cono cilindro cnico 2. Tornillo Extraccin helicoidal (rotador) 3. Alimentacin

4. Distribuidor 5. Espacio entre anillos 6. Producto de sedimentacin 7. Nivel liquido 8. Zona de secado 9. Liquido clarificado 10. Limite ajustamiento Cromatografa Es una serie de mtodos fsicos que permiten la separacin de una mezcla de solutos en base a su diferencia de desplazamiento, a travs de una fase mvil que se mueve por un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, permite identificar y determinar los componentes de la muestra y para ello es necesario jugar con una serie de factores. Se caracteriza por ser de gran utilidad en mezclas complejas y es influenciada por dos efectos contrapuestos, y son: Retencin: efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase estacionaria, que puede ser un slido o un lquido anclado a un soporte slido. Desplazamiento: Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una fase mvil, que puede ser un lquido o un gas, como ejemplo se puede tomar el agua. Tiene dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente: 1. Medir la cantidad de los distintos componentes de la mezcla (finalidad analtica). Ocurre especialmente cuando hay muestras pequeas. 2. Separar los componentes de la mezcla para obtenerlos de forma ms pura, que se puedan reutilizar posteriormente, en caso dado.

Historia Respecto a su etimologa, proviene del griego y se traduce chroma color y graphos escribir. Mijal Tsweet (Mikhail Semenovich Tsweet, 1872 1919) fue un botnico ruso que acu por primera vez el trmino cromatografa, para definir un mtodo mediante el cual separ distintos tipos de pigmentos vegetales, usando columnas de adsorcin de lquidos. Las disoluciones se hacan

pasar a travs de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna. Por otro lado, los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo veinte (20). Del mismo modo la cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) se empez a desarrollar en 1960, ganando ms importancia con el paso de las dcadas, hasta el punto de convertirse en la tcnica cromatogrfica mas utilizada. Mikhail Tsweet, considerado el padre de la cromatografa

Diagrama de un cromatgrafo de gases

en columna

Cromatogrma El grafico en el que se representa el resultado de la cromatografa se le conoce como cromatogrma, se establece en funcin del tiempo una vez que la muestra es inyectada a un sistema cromatogrfico. Se establece en una grafica de planos cartesianos, donde el eje X representa el tiempo transcurrido desde el momento en que empieza el proceso cromatogrfico, por otro lado el eje Y representa una respuesta por parte de distintos analitos presentes en la muestra. En caso de que el sistema sea optimo, la seal es proporcional a la concentracin de los analitos. Cromatogrma 1 Cromatogrma 2

En los anteriores cromatogrma se aprecian picos que corresponden a la separacin de los componentes de la mezcla, en el primer grafico se aprecian picos resueltos que sealan una cromatografa exitosa, por otro lado el segundo grafico se aprecian picos no resueltos que puede

significar que la polaridad del disolvente no es el correcto. Clasificacin Existen muchas maneras de clasificar los distintos mtodos cromatogrficos y se pueden destacar los siguientes: Segn el mecanismo de retencin-separacin: es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografa de reparto, de adsorcin y de exclusin. Segn la forma de contacto entre las fases: se denomina de columna o superficie plana. Segn el tipo de fase mvil utilizada: Cromatografa gaseosa y cromatografa liquida y cromatografa de fluidos sper crticos. Tambin se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala fsica y gradientes. Tipos de cromatografas Cromatografa Plana Es la ms sencilla y se le suele llama de capa fina o en capa delgada, La cromatografa plana se basa en la preparacin de una capa de papel u otro material slido, uniforme de un absorbente mantenido sobre una superficie, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte, la fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. La mezcla a analizar se deposita a una pequea distancia del borde inferior de la placa y se introduce en una cubeta que contiene la fase mvil, que asciende a lo largo de la placa por capilaridad, desplazando a los componentes de la mezcla a diferentes velocidades, lo que provoca su separacin. Cuando el frente del disolvente se encuentra prximo al extremo superior de la placa esta se saca y se visualiza. La bsqueda del eluyente requiere probar con varios disolventes de diferente polaridad o con mezclas. Para compuestos poco polares, que se desplazan con mucha facilidad, se debe utilizar un disolvente apolar como el hexano y en el caso de compuestos de polaridad media, mezclas de hexano y acetato de etilo. La mayora de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que permite la visualizacin de los componentes activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de componentes que no absorban a la luz ultravioleta, la visualizacin requiere utilizar un agente revelador. El revelador reacciona con los productos proporcionando productos coloreados.

Cromatografa de exclusin

Tambin se llama de exclusin molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma o carga entre las molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamao. En este caso, se la llama tambin cromatografa de exclusin por tamao, de filtracin en gel, de permeacin en gel o de tamiz molecular.

Cromatografa

preparativa

Es un mtodo utilizado ms para la purificacin de muestras que para anlisis, forma parte de los mtodos estndar habituales en un laboratorio. La cromatografa preparativa se lleva a cabo en placas de gel de slice de 1-2 mm de espesor sobre un soporte de vidrio. Se utiliza para la separacin y aislamiento de los componentes de una mezcla en cantidades comprendidas entre 100-200 mg. En la superficie del adsorbente (gel de slice), mediante una pipeta Pasteur, se traza una lnea continua con la muestra disuelta y se introduce la placa en posicin vertical en una cubeta. Durante la elucin debe permanecer tapada para evitar la evaporacin del disolvente. Una vez se han separado los productos que componen la muestra, se marca con una cuchilla el contorno del compuesto a aislar y con ayuda de una esptula se desprende del soporte de vidrio el gel de slice con el compuesto adsorbido. Una vez transferido a un erlenmeyer se aade un disolvente en el cual sea soluble el producto, se filtra el gel de slice y una vez eliminado el disolvente tenemos el producto puro. Cromatografa en columna. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de compuestos orgnico a escala preparativa, es una tcnica de purificacin por que permite aislar los compuestos de una mezcla. La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio que termina con una placa porosa que impide su paso y en un estrechamiento con una llave. La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria mientras que la fase mvil atraviesa el sistema. Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen en fracciones, los ms polares quedan ms retenidos y para que salgan generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente. El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama tiempo de retencin. El adsorbente ms utilizado para cromatografa de columna es gel de slice, aunque tambin se puede emplear almina y florisil. La elucin de la cromatografa puede realizarse por gravedad o mediante presin (Flash chromatography), la diferencia en ambos casos est en el tamao de las partculas de gel de slice (0,063-0,200 nm, slice de columna, 0,040-0,063 nm, slice flash). Debido a que la disminucin del tamao de las partculas de adsorbente conduce a una separacin ms eficaz, la cromatografa a media presin (flash) proporciona mejores resultados, adems de ser ms rpida.

Las variables que ms influyen en la eficacia de la separacin en cromatografa de columna y utilizando gel de slice como adsorbente son las siguientes; a) Dimetro de la columna y cantidad de gel de slice. La altura del adsorbente est relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de la mezcla. El dimetro de la columna con la cantidad de producto a separar. b) Eleccin del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena separacin de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizndose en muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elucin en gradiente. Una de las mezclas ms utilizadas es hexano/acetato de etilo.

Cromatografa de gases Es probablemente la tcnica de separacin con ms amplia utilizacin; ninguna tcnica analtica puede ofrecer su capacidad de separacin o su sensibilidad a la hora de analizar compuestos voltiles. Por otra parte el hecho de que en esta tcnica las fases las mezclas sean separadas en fases gaseosas, establece los lmites de su utilizacin, que estarn marcados especialmente por estabilidad trmica de los compuestos a separar. Por lo general la utilizacin de cromatografa de gases se restringe a la separacin de compuestos con peso molecular no mayor a 1000 a una temperatura mxima de trabajo de 400 C. Dentro de estos lmites , como ya se ha mencionado, la nica limitacin existente ser la estabilidad termina de la muestra. Para realizar una separacin mediante cromatografa de gases, es necesario inyectar una pequea cantidad de la muestra en una corriente de gas inerte a elevadas temperaturas, esta corriente atraviesa una columna cromatogrfica que separar los componentes de la mezcla por medio de mecanismo de particin o de adsorcin (en muchos casos

haciendo uso de ambos). Los componentes de la mezcla emergern de la columna a intervalos discretos y pasaran a travs de algn sistema de deteccin, o a dispositivo de recogida.

Cromatografa liquida de alta eficacia (HPLC) Tambin llamada de alta presin, alta resolucin o simplemente cromatografa liquida, es la ms amplia y utilizada, este trmino engloba cierta variedad de procesos con ciertas caractersticas, como la cromatografa de fase normal, de fase inversa y de intercambio inico. Se caracteriza por hacer uso de una fase estacionaria liquida en algunos casos como gel de slice o alminas de intercambio inico, y es una tcnica que en parte est en desuso, pero que an guarda terreno en los laboratorios de bioqumica, ms que todo como una tcnica analtica. Se divide en las siguientes modalidades. a) Cromatografa en fase normal: La fase estacionaria est constituida por un lquido de carcter polar. Como fase mvil se emplean mezclas de disolventes apolares (hexano, pentano), con disolventes polares (cloroformo, diclorometano, T.H.F., etanol, metanol o acetonitrilo). Se utiliza para la separacin de compuestos muy polares que quedaran demasiado retenidos en una cromatografa slido-lquido. En este tipo de cromatografa el orden de elucin est gobernado por interacciones de tipo polar: los solutos ms polares quedan ms retenidos, igual que en la cromatografa de adsorcin b) Cromatografa en fase reversa: La fase estacionaria est constituida por un lquido de carcter apolar. Como fase mvil se emplean mezclas de agua con disolventes polares miscibles, como metanol o acetonitrilo siendo la fase mvil ms polar que la fase estacionaria. Se emplea para la separacin de mezclas de compuestos de polaridad baja, que se retienen muy poco en una cromatografa slido-lquido, y para la separacin de compuestos de una misma serie homloga. La retencin se explica en base a una adsorcin preferencial del disolvente menos polar de la fase mvil a la superficie de las cadenas apolares que constituyen la fase estacionaria, de manera que se establece un mecanismo complejo que supone una combinacin de equilibrios de solubilidad (particin) de la mezcla que se cromatografa entre la fase lquida adsorbida a la fase estacionaria y la fase mvil. La separacin ocurre como consecuencia de las diferencias en la superficie apolar de los componentes de la muestra, los compuestos menos polares sern ms solubles en la fase estacionaria que los ms polares. Por tanto, al contrario que en la fase normal, los compuestos ms polares estarn menos retenidos que los menos polares. Los tiempos de retencin disminuyen cuando menor sea la proporcin de agua, cuando menos polar sea el disolvente empleado. Proceso de cromatizacin de una muestra lquida con gel de slice.

c) Cromatografa de intercambio inico: la cromatografa de intercambio inico (cromatografa inica), puede definirse como cromatografa de particin tambin, es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que se inyecta es usualmente llamada muestra y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad. Este tipo de cromatografa se basa en el equilibrio de intercambio inico entre una fase slida que contiene grupos sulfnicos o carboxlicos (para la separacin de cationes) o grupos amino cuaternarios, ternarios o secundarios (para la separacin de aniones) y los iones presentes en la fase mvil

Aplicacin de la cromatografa en la bioqumica La cromatografa ms que un proceso fsico o qumico est muy asociado a la bioqumica, siendo as que es aplicado en cierto nmero de procesos para la separacin de protenas como la inmunoelectroforesis, la cromatografa de intercambio inico e interviene en la reaccin en cadena de la polimerasa, lectura del VPH. Adems se presta para poder hacer observaciones de los distintos pigmentos de las plantas, mas para un proceso de aprendizaje.

Definiciones importantes Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografa. Eluyente: es un solvente que se utiliza como fase mvil para que la muestra atraviese la fase estacionaria

Tiempo de retencin: el tiempo que transcurre despus de la inyeccin de la muestra para que el pico del analito alcance el detector. Tiempo muerto: es el tiempo para que la muestra no retenida alcance el detector Masa molecular: tambin conocido como peso molecular, es la suma de los componentes atmicos que componen la formula molecular de cierto compuesto. Fase estacionaria: es la sustancia que est fija en una posicin en el procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografa en capa fina. Gel de slice: es una forma granular y porosa de dixido de silicio fabricado sintticamente a partir de silicato sdico. A pesar del nombre, el gel de slice es slido.

Electroforesis
La electroforesis es una tcnica de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Fue empleada por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse en los aos cincuenta, cuando fue introducida gracias al qumico Arne Tiselius; aunque este trmino se limito originalmente al anlisis de coloides y partculas su microscpicas, se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular. Esta tcnica consiste en cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las molculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el nodo (el polo positivo). Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza. qE = fv q: carga E: intensidad del campo f: coeficiente de friccin v: velocidad de molcula

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada molcula, esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las molculas grandes y asimtricas poseen un mayor coeficiente de friccin que las pequeas y compactas. La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica. Tipos Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis: 1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera con el disolvente. 2. Zonal: Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son tiles para lograr la separacin de mezclas complejas La muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que soporta a ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los componentes de la muestra. 3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso. Tecnicas Especiales 1. Isoelectroenfoque: Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel.

2. Electroforesis bidimensional: Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos de cada

muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra muestra similar pero conocida.

3. Inmunoelectroforesis: Combina una separacin electrofortica con una deteccin por inmunodifusin.

Medios de Soporte La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores de forma y tamao adquieren una alta relevancia en la separacin. Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa. Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados. Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida. Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.

Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia. Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud en aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

Modos de Disposicin Horizontal En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas, y en soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para protenas. En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente para cidos nucleicos. Casi siempre el tampn cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente), denominndose por ello electroforesis submarina. Soporte impregnado de disolucin tampn por capilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contacto elctrico. Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador especfico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el gel.

Vertical Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao. El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre 2 placas rectangulares.

Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos del nodo y ctodo. La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente diferente).

Equipos para electroforesis El aparato para electroforesis consiste de:

Fuente de poder adecuada que administre una corriente constante directa y aditamentos para indicar y controlar tanto el voltaje de suministro como el consumo de corriente, se puede adicionar un circuito que estabilice la salida de corriente (regulador de voltaje). Ensamble electrofortico con aditamentos especiales para soportar las placas electroforticas. Para las electroforesis donde se utilice papel, gel de agar, gel de agarosa-almidn o acetato de celulosa como soporte electrofortico, el ensamble consiste en un tanque con tapa de vidrio o de algn otro material que permita el cerrado hermtico. El tanque contiene aditamentos de seguridad los cuales desconectan la fuente de energa cuando la tapa se quita, adems dos dobles canales en cada extremo provistos de una parte divisoria central. A lo largo del fondo de los compartimentos de cada doble canal se encuentra un electrodo de platino conectado por medio de cables aislados y sellados a las paredes del tanque, al cable externo conectado a la fuente de poder. Los canales se llenan con la suficiente cantidad del electrolito especificado en la monografa, para asegurar la inmersin completa de los electrodos. El contacto entre el compartimiento interno y el externo de cada doble canal puede ser por medio de un puente de papel electrofortico o bien mediante pequeas perforaciones de la parte central divisoria. Para electroforesis en gel de agar y en gel de agarosa-almidn el tanque est diseado para permitir cierta ventilacin y evitar la condensacin de la humedad o que la capa del medio slido se seque. Para electroforesis en gel de poliacrilamida el ensamble consiste en dos recipientes de polimetilmetacrilato para la solucin reguladora, conteniendo cada uno un electrodo de platino. El recipiente superior est montado arriba verticalmente del inferior y su altura es ajustable. En su base, tiene una serie de soportes de hule equidistantes del electrodo. Ejemplos de Electroforesis Separacin de protenas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico. Separacin de ADN en gel de agarosa. Aplicaciones La electroforesis se usa en una gran mayora en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Suele usarse para la tincin de protenas y acidos nucleicos, pues, tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a las molculas separadas en el gel. Tambin encuentra aplicacin para la separacin de otras sustancias bioqumicas tales como la insulina, histonas, fibringeno, lipoprotenas, enzimas, entre otros. Es muy importante para la secuenciacin de cidos nucleicos.

La bioqumica es una ciencia experimental que tiene un presente y un futuro prometedor, en el sentido, que se yergue como base de la biotecnologa y la biomedicina. Al ser una ciencia experimental la bioqumica requiere de numerosas tcnicas instrumentales que posibilitan su desarrollo y ampliacin, algunas de ellas se usan diariamente en cualquier laboratorio y otras son muy exclusivas.

Tcnicas radioisotpicas
El marcado radioisotpico es una tcnica para seguir el paso de una muestra de sustancia a travs de un sistema. La sustancia es "marcada" al incluir radionclidos en su composicin qumica. Cuando estos decaen, su presencia puede ser determinada al detectar la radiacin emitida por ellos. El marcado radioisotpico es un caso especial de marcado isotpico. Para estos propsitos, un tipo particularmente til de decaimiento radiactivo es la emisin de positrones. Cuando un positrn colisiona con un electrn, libera dos fotones de alta energa que viajan en direcciones diametralmente opuestas. Si el positrn es producido en un objeto slido, har esto antes de viajar ms de un milmetro. Si ambos fotones pueden ser detectados, la localizacin del evento de desintegracin puede ser determinado con mucha precisin. En un sentido estricto, el marcado radioisotpico incluye slo los casos donde se introduce artificialmente la radioactividad por los experimentadores, pero algunos fenmenos naturales permiten que se les realice un fenmeno similar. En particular, la datacin radiomtrica usa un principio cercanamente relacionado Aplicaciones actuales de las tcnicas radiosotpicas en la patologa endocrinologa 1. Tiroides La patologa nodular del tiroides es bastante comn, con una prevalencia clnica del 4-7% y una incidencia anual del 0.1% De estos ndulos, el 4-5%son malignos ndulos no palpables son an ms frecuentes. La frecuencia es mayor en mujeres, y se incrementa con la edad, asocindose a deficiencia endmica de yodo e historia de exposicin a radiaciones ionizantes (2-4).

Actualmente se utiliza el Tecnecio-99m, cuyas caractersticas fsicas son ideales para imgenes con gama-cmara y su comportamiento como anin es similar al yoduro, ya que es captado por la clula tiroidea por mecanismo de transporte activo 2. Paratiroides Debido a su pequeo tamao (40 mg de peso) las glndulas paratiroides son de difcil evaluacin no invasiva. Se ubican frecuentemente en relacin con los polos tiroideos, aun cuando pueden estar tambin en mediastino y regin cervical inferior. Marcado con Tecnecio-99m, presenta un comportamiento farmacocintico particular; inicialmente es captado tanto por clulas tiroideas como paratiroideas y posteriormente permanece por ms tiempo en las clulas paratiroideas. Por lo tanto, la obtencin de imgenes precoces (20 minutos post inyeccin) y tardas (2 horas) permiten demostrar claramente la captacin de MIBI en glndulas paratiroides hiperfuncionantes o aumentadas de tamao. El mtodo es especialmente sensible para la localizacin de adenomas y tiene menor rendimiento en glndulas hiperplasticas. 3. Glndula suprarrenal 3.1 Corteza suprarrenal En la corteza suprarrenal se sintetizan hormonas esteroidales, utilizando como precursor el colesterol. Los anlogos de colesterol marcados con Yodo-131, Esto posibilita localizar tumores funcionantes productores de hormonas, como cortisol (Sndrome de Cushing), aldosterona (Enfermedad de Conn) y evaluar tumores no funcionantes que en general son encontrados como hallazgo en estudio de imgenes no invasivas por otra causa (incidentalomas). 4. Tumores neuroendocrinos Los tumores neuroendocrinos ms frecuentes son: tumores carcinoides, gastrinomas,

glucagonomas, insulinomas, paragangliomas y vipomas. Tambin se incluyen el carcinoma medular del tiroides y el tumor pulmonar de clulas pequeas. El aspecto ms conocido es el uso de radio yodo(Yodo-131) en el tratamiento del hipertiroidismo y del cncer diferenciado del tiroides. Se basa en la emisin beta del Yodo-131, de alta energa y corto alcance, laque, al ser incorporada a la clula tiroidea, produce su destruccin sin mayor dao sistmico.

Uso de radioistopos en bioqumica Ventajas: - Tcnica de alta sensibilidad - Las mediciones se hacen de manera acumulativa (bajos niveles de radioactividad pueden medirse con exactitud usando tiempos ms largos de anlisis) Se complementa con tcnicas como cromatografa o electroforesis. - Pueden usarse como marcadores al investigar o monitorear un proceso. Desventajas: -Su uso implica ciertos riesgos (radiaciones), lo que ha llevado a reemplazarlos en muchos casos por otras tcnicas. Clasificacin de radiaciones Radiaciones ionizantes: Son radiaciones de alta energa que al incidir en una molcula la ionizan (prdida de un electrn).Rayos gama, rayos x, partculas alfa y beta, neutrones. Producidas por materiales radioactivos y ciertos aparatos (ciclotrones, reactores nucleares, etc.) Radiaciones no ionizantes: Son radiaciones de menor energa, capaces de excitar una molcula, pero sin la energa suficiente para que pierda un electrn. Ondas electromagnticas de mayor longitud de onda. Producidas por lasers, microondas, radios, TV, etc. Palabras Claves: Tiroides: Glndula endocrina de color rojizo situada por delante de los primeros cartlagos de la trquea, en la regin anterior del cuello. Est formada por dos lbulos unidos por la parte anterior mediante un istmo. Su principal funcin es segregar internamente dos hormonas: la tiroxina (T4) y la triyodotironina (T3) cuya funcin es incrementar el metabolismo basal, Paratiroides: Glndula de secrecin interna de las situadas en torno al tiroides, de muy pequeo tamao y cuya lesin produce la tetania. Suprarrenal: Se aplica al rgano o parte del cuerpo que est situado encima de los riones:

Tumores neuroendocrinos: Tumor que se forma en las clulas que liberan hormonas a la sangre como respuesta a una seal del sistema nervioso. Tecnecio-99m: es un istopo trazador radiactivo, ampliamente utilizado en Medicina Nuclear. Yodo-131: mide qu cantidad de yodo radiactivo es absorbido por la glndula tiroides en un perodo de tiempo determinado. MIBI: Metoxi-isobutil isomitrilo. Complejo catinico que se incorpora en el tejido miocrdico sano de forma proporcional al flujo sanguneo. MIBG: Es un tipo de examen imagenolgico en el que se utiliza una sustancia radiactiva (llamada marcador) y un escner especial para encontrar o confirmar la presencia de tumores que afectan el tejido nervioso.

Neuroblastoma: Tumor maligno que deriva de la cresta neural. Hipercortisolismo: Es una enfermedad que ocurre cuando el cuerpo produce demasiada hormona cortisol. Hiperaldosteronismo: El hiperaldosteronismo es el trastorno clnico producido por el exceso de secrecin de la hormona aldosterona por las glndulas suprarrenales.

Tcnica PCR Actualmente la Biologa Molecular a travs de la Tcnica de PCR se ha convertido en una herramienta de valor para diagnosticar enfermedades infecciosas que son difciles de diagnosticar con tcnicas convencionales como cultivos, citologas, etc. La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (del ingls Polymerase Chain Reaction) (PCR) desarrollada en 1987 por Kary Mullis, es una tcnica cuyo objetivo principal es aprovechar la capacidad que posee la enzima polimerasa en fabricar fragmentos de ADN con la ayuda de iniciadores (Primers). La PCR es una tcnica altamente sensible que amplificara solamente regiones especficas del DNA o RNA propio del patgeno o microorganismo causante de la enfermedad infecciosa, lo que hace a esta tcnica no solo sensible sino muy especfica para el diagnstico. La PCR no solo sirve para deteccin e identificacin en el diagnstico de enfermedades causadas por virus o bacterias sino tambin para la deteccin de fallas a nivel de expresin de genes que originan otro tipo de enfermedades ejemplo de ello el estudio del gen BCR-ABL en Leucemia Mieloide Crnica y el gen 825Y que predispone a la Obesidad, etc. Los avances tecnolgicos, la bsqueda de innovaciones en el quehacer diagnstico y los resultados de las ltimas investigaciones, hacen del diagnstico molecular una herramienta til, debido principalmente a la rapidez en la obtencin de resultados, adems de poseer una sensibilidad y especificidad muy parecida al aislamiento viral, considerada esta ltima como la prueba de oro para la deteccin y seguimiento de algunas enfermedades, la Reaccin en Cadena de la Polimerasa en Tiempo Real conocida por sus siglas como rRt-PCR, se encuentra reconocida por la OMS y es utilizada por todos los laboratorios de referencia, comenzando a ser empleada en muchos pases del mundo.

Las tcnicas moleculares poseen varias caractersticas que las hace ser de gran utilidad para este diagnstico; son tcnicas que poseen una alta sensibilidad, son rpidas (el diagnostico se obtiene en pocas horas) y los tiempos de cada ciclo fueron los definidos por el laboratorio de referencia. Debido a estas ventajas, la RT-PCR (convencional) o de punto final y la rRT-PCR (tiempo real) permitir as realizar una temprana deteccin de la enfermedad, mucho antes que este se pueda aislar en los laboratorios con los mtodos convencionales. La tcnica de la reaccin en cadena de la Polimerasa, consiste bsicamente en la amplificacin de un segmento especfico del genoma. Este segmento especifico, como se menciona, debe ser seleccionado como nico y caracterstico para cada que se quiera diagnosticar, de esta manera, estaremos trabajando con una tcnica que contara con una alta sensibilidad y especificidad para el diagnstico de una enfermedad. Componentes de la PCR Enzima termoestable (Polimerasa) que acelera el proceso de formacin de la copia de ADN, dependiente del patrn original. Par de secuencias sintticas (oligonucletidos Primers), que permitan crear el fragmento de ADN en estudio. Deoxynucleotidos Trifosfatos (dNTPs), necesarios para proporcionar las bases nitrogenadas en la construccin del ADN. Cationes Divalentes, cofactor importante para generar la reaccin enzimtica en el proceso de formacin del ADN. Solucin amortiguadora, permite mantener el equilibrio acido-base en la PCR. ADN Molde en cadena sencilla o doble, proporciona las secuencias necesarias para amplificar la regin especfica de inters.

Generalidades de la Tcnica de RT-PCR Una vez identificada la regin o segmento a amplificar, se deben disear los partidores o en ingles primers, que establecern el marco de accin de esta amplificacin, el desarrollo de este diseo es importantsimo y fundamental para la obtencin de un resultado apropiado. El resto de los reactivos que requiere la reaccin, consisten bsicamente en un buffer o solucin tamponada en presencia de sales de Magnesio y di nucletidos de los 4 tipos: Adenina (A) Citosina ( C) Guanina (G) Timina (T)

Como tambin inhibidores de ARNasas, agua y la enzima polimerasa. La reaccin en s, consiste en tres etapas, desnaturalizacin de la hebra, anillamiento con los partidores e hibridacin, estas tres etapas ocurren en varios ciclos (usualmente entre 30 y 40) en tres distintas temperaturas, para este efecto se emplean equipos que se denominan aparatos de termo ciclado o termocicladores, que permiten calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la

temperatura necesaria para cada etapa. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Una vez finalizada la reaccin, se debe visualizar o detectar si se amplifico el segmento deseado, esto, en el caso que se trate de PCR convencional, el producto de la reaccin de PCR es sacado del termociclador, cargado en un gel de agarosa, corrido en una cmara de electroforesis y visualizado en un transiluminador ultravioleta. Etapas de la reaccin: Desnaturalizacin: Se somete el ADN a temperaturas altas alrededor de 94C para as desnaturalizar la doble hlice. Hibridacin: la cadena se somete a bajas de temperaturas con el fin de que los cebadores hibriden o se unan. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60C. Elongacin o Extensin: por medio de una enzima (Taq polimerasa) se unen nucletidos para sintetizar una cadena complementaria. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; utilizando Taq polimerasa la temperatura de elongacin suele ser de 72C.

Al finalizar el ltimo ciclo, la muestra se incuba durante 5 minutos a 72C con el fin de completar los extremos que sobresalen de los productos recin sintetizados.

Tipos de Muestras de ADN Sangre entera (EDTA). Plasma (EDTA) o suero, generalmente en virologa. Clulas aisladas (Mononucleares, en cultivo) Tejidos. (Congelar en nitrgeno lquido lo ms rpido posible para evitar la degradacin del RNA o DNA). Lquidos biolgicos tales como: Orina o exudado cervical (C. trachomatis o C. gonorrhorae). Lquido amnitico para diagnstico prenatal. LCR. Lquido pleural para el diagnstico de metstasis cancerosas o enfermedades linfoproliferativas. Muestras de pared bucal, para obtener muestras de DNA. Mdula sea, para diagnstico de enfermedades linfoproliferativas o la deteccin de metstasis cancerosas. Esputo, para la deteccin de Mycobacterium tuberculosis. Pus, estudio de bacterias. Tejidos parafinados o fijados. Muestras de sangre en papel Guthrie. Tipos de PCR PCR en tiempo real: (rRT-PCR) o PCR cuantitativa, no solo tiene las bondades de la PCR convencional sino que adems cuantifica la carga viral del paciente infectado (la cuantificacin viral es necesaria en paciente diagnosticado con HIV, Hepatitis entre otras). Una de las ventajas de la PCR a tiempo real es la rapidez con que se obtienen los resultados. La reaccin en cadena de la polimerasa en directo (en tiempo real) (RT-PCR) es un mtodo que permite la cuantificacin de cidos nucleicos con gran exactitud y fiabilidad. Est basada en la monitorizacin de la PCR usando tcnicas de fluorescencia. Esto permite la visualizacin en directo del perfil completo de amplificacin de la diana dentro de un amplio rango de magnitud. El anlisis de la curva de fusin del producto, posibilita adems la caracterizacin del fragmento amplificado por su temperatura de fusin (Tm). Esta tcnica ofrece una gran cantidad de aplicaciones al ser capaz de cuantificar de manera absoluta o relativa molculas molde de DNA o RNA. De este modo, la RT-PCR cuantitativa se usa para determinar la carga vrica, el ttulo de grmenes y contaminantes en la comida, sangre u otro tipo de muestras, la expresin gnica en distintos tejidos, tratamientos o estadios del desarrollo, la discriminacin allica, y el grado de amplificacin de los genes. Adems, la RT-PCR tiene aplicaciones clnicas muy importantes, como el diagnstico de tumores, la respuesta a medicamentos en cnceres humanos y el perfil de citocinas en la respuesta inmune. Tambin el genotipado de muestras se puede realizar a travs de la cuantificacin y diferenciacin de alelos y la deteccin de polimorfismos, llegando incluso a detectar los SNP (polimorfismos mononucleotdos, del ingls single nucleotide polymorphism). Por ltimo, la validacin de los resultados de experimentos con microordenamientos (microarray) de DNA se suele realizar mediante RT-PCR.

Para el anlisis cuantitativo del producto, se analiza la curva de amplificacin, la cual est constituida por al menos tres fases distintas: 1) fase de latencia (lag) donde la acumulacin de producto no se puede detectar, 2) fase exponencial y 3) fase de saturacin.

PCR Mltiple: Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para amplificar una secuencia especfica, la PCR Mltiplex utiliza mltiples pares de cebadores para amplificar muchas secuencias simultneamente. La presencia de muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como el aumento de la formacin de productos de PCR con errores de cebado, dmeros de cebadores y la discriminacin de la amplificacin de fragmentos ms largos de ADN. Para este tipo de amplificacin por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de hibridacin similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser favorece la amplificacin de la diana ms corta respecto a la ms larga, lo que implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte, los tampones de PCR Mltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que reduce la competencia entre ampliaciones y la discriminacin de fragmentos ms largos de ADN durante la PCR Mltiplex. Los productos de la PCR Mltiplex pueden seguir hibridndose con una sonda especfica del gen con fines de verificacin. PCR Transcripcin Reversa: Su aplicacin es usada para amplificar secuencias especficas de cidos ribonucleicos (ARN), tales como ARN mensajero (ARNm) o ARN viral. El mtodo empleado abarca la utilizacin de enzimas que permitan crear el ADN complementario mediante el proceso de transcripcin reversa. Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin por PCR.La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodologa PCR. Los pasos de la RT-PCR son: 1. Transcripcin reversa: Unin del primer a la secuencia de RNA objetivo. 2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del primer mediantela incorporacin de nucletidos complementarios. 3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA.

4. PCR. En este caso, la nica diferencia es que lo primers, en vez de converger, divergen desde un punto. Es decir que en caso de ser DNA lineal de doble hebra, los productos sern 2 hebras que no necesariamente se complementaran. En cambio si se lleva a cabo en un plsmido, si se podra llegar a un producto DNA de doble hebra. PCR Anidada: Consiste en una PCR convencional, con la diferencia de presentar una segunda ronda de amplificacin, empleando pares de secuencias sintticas diferentes a las usadas en la primera ronda. La primera amplificacin da 2 fragmentos resultantes. La segunda reaccin trabaja sobre los fragmentos obtenidos en la 1ra reaccin. Este modo es ms especfico, ya que cuando la Taq trabaja con grandes cantidades de DNA, su fidelidad disminuye. En cambio con este mtodo, se trabaja con fragmentos cortos desde la segunda reaccin, lo que hace ms efectivo el proceso.

Al momento de realizar esta tcnica es necesario tener: Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP): sustratos para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores: (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos (normalmente de dieciocho a veintids), que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Estos deben estar enfrentados y a no mucha distancia haciendo que se delimite la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar. Iones divalentes: Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes: como el potasio. Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq). ADN molde: que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Termociclador: el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Previa a la realizacin de la amplificacin se debe tomar en cuenta si el virus es de tipo ARN, si es as, se debe convertir este material en ADN para poder ser amplificado, esta etapa se realiza con la ayuda de la enzima Transcriptasa Reversa que copia este ARN a un ADN copiado o cDNA, una vez finalizada esta etapa, se puede comenzar a realizar la PCR. Una gran mayora de amplificacin es visualizada en la pantalla del computador y por tal motivo esta reaccin es monitoreada en Tiempo Real. Se debe tener bastante precaucin cuando se trabaja con material gentico, con el fin de evitar la presencia de inhibidores de ARN o ADN, principalmente enzimas que destruyen cidos nucleicos, es por esta razn que trabajan con materiales libres de ARN-ADNasas. Se deben cambiar de guantes con frecuencia y se deben tener algunos equipos de uso exclusivo para cada etapa, es decir, para la extraccin, amplificacin y etapa de post-amplificacin (en el caso de la PCR convencional).

Equipos e Instrumentos: Cmara de Flujo Laminar Clase II, con luz germicida UV. Gabinete de trabajo para preparacin de mix de reactivos (Zona Limpia) Refrigerador (2C 6C) Freezer (-70C) Centrifuga refrigerada con rotores para tubos eppendorf y rotor para placas. 7300 o7500 plus Real Time PCR System Vortex. Manifold y sisterma de vacio Micropipetas de 1,0 ml, 50-200 micro litros, 10-100 micro litros y de 0.5 -10 micro litros. Placa Magntica Ambion.

Centrifuga refrigerada con rotores para tubos eppendorf y rotor para placas

Vortex

Aplicaciones: Diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas Deteccin de enfermedades causadas por virus o bacterias. Deteccin de fallas a nivel de expresin de genes. Experimentos de ingeniera gentica Estudios de expresin gentica Secuenciacin directa de secuencias amplificadas Deteccin de mutaciones Identificacin de restos biolgicos.

Inmunoprecipitacin
Es un procedimiento utilizado para aislar y concentrar una protena (antgeno proteico) especfica de una solucin que contiene muchas ms, usando un anticuerpo que se adhiera a esta, generalmente la Inmunoglobulina. Explcitamente, es un estudio serolgico que permite demostrar la existencia de anticuerpos con la capacidad de provocar la precipitacin de sus correspondientes antgenos cuando ambos reactivos se encuentran en soluciones lquidas o semi-slidos (geles), tomando en cuenta que la mayora de las protenas se difunden libremente a travs de poros de un gel. Respecto a esto Jos A. Armengol y Francisco J. Miano, (1995), refieren: La Inmunoprecipitacin es el mtodo ms rpido y eficaz para identificar y aislar una protena siempre que se disponga de anticuerpos monoclonales y policlonales monoespecficos de alta afinidad. Este procedimiento se aplica generalmente a extractos marcados radiactivamente a los cuales se les aade un anticuerpo especfico. (p. 457)

El procedimiento de Inmunoprecipitacin es utilizado principalmente para identificar y/o cuantificar inmunoglobulinas u otras protenas, identificacin bacteriana, en el estudio de las estructuras enzimticas, hormonales, as como identificar compuestos antignicos que podran ser sustanciales en la patogenicidad de una enfermedad. Es importante agregar que las pruebas de Inmunoprecipitacin no pueden ser realizadas a menos que se trate de antgenos hidrosolubles. Tcnicas de Inmunoprecipitacin Inmunoprecipitacin lquida Segn Roca, Oliver y Rodriguez, (2003): Es posible detectar y medir antgenos solubles precipitndolos de manera selectiva con anticuerpos. Para ello, es necesario que los antgenos sean de gran tamao y tengan mltiples determinantes antgenos. (p. 203) Debido a que las inmunoglobulinas son tambin protenas, es posible preparar anticuerpos conducidos haca ellas mismas, que pueden ser utilizados para su cuantificacin, la precipitacin de un antgeno soluble por un anticuerpo provoca turbidez en la solucin, este grado de turbidez es proporcional a la cantidad de antgeno unida al anticuerpo. Esta relacin es la base de los mtodos turbidomtricos (Medicin de la disminucin de la intensidad de luz cuando atraviesa una solucin) o nefelomtricos (Medicin de la luz dispersada a diversos ngulos por una suspensin particulada) de cuantificacin. La reaccin se realiza en solucin acuosa en presencia de un exceso de anticuerpo y la curva de calibrado se prepara utilizando las medidas de una serie de soluciones estndar de antgeno. Para conseguir la mxima sensibilidad, la solucin a utilizarse debe tener gran afinidad por el antgeno y debe usarse a concentraciones muy bajas.

Inmunoprecipitacin en gel Es una tcnica que combina la electroforesis y la inmunodifusin, permite diferencias sustancias de movilidad electroforctica semejante a travs de de reacciones de precipitacin especficas. La inmunoelectroforesis implica el uso de anticuerpos para fijar el antgeno en el gel e identificarlo, la mezcla de protenas es aplicada al gel de electroforesis y, una vez finalizada, el gel se cubre con un anticuerpo especfico, as, el anticuerpo en su difusin, se rene con el antgeno, dando lugar a la formacin de complejos antgeno-anticuerpo, lo que provoca la aparicin de arcos de precipitacin.

Western blot (Inmunoblot)

Es una tcnica muy importante que posibilita revelar la presencia, cantidad y calidad de un antgeno en una mezcla compleja, consiste en la rotura de las clulas o tejidos en un tampn apropiado, se pueden romper las clulas incluso en el tampn de muestra de la electroforesis en SDS (se produce la desnaturalizacin inmediata de las protenas). Tiene la ventaja de no haber proteolsis porque degrada todo incluso las proteasas. Se usa aplicando corriente elctrica. Tipos de Inmunoprecipitacin Directa Gran parte de las protenas poseen dos o ms eptopos. Los anticuerpos pueden, con sus partopos idnticos, originando un puente con dos molculas de antgeno; los anticuerpos contra diferentes eptopos pueden, as edificar una prolongada red que no es soluble en medio acuoso y de esta manera se forma el precipitado. Indirecta La Inmunoprecipitacin indirecta es la ms utilizada en investigacin experimental, para esta, es usada la protena A del Estafilococo ureo (Staphylococcus aureus) que une aunticuerpos. Para ello se fija la protena A sobre una bolita de gel cargada con una IgG (inmunoglobulina) especfica y entonces se incuba con una mezcla de antgenos. El anticuerpo especfico se une a su respectivo

antgeno y, por acto de centrifugacin las bolitas cargadas de antgeno se separan de las protenas no unidas. Por consiguiente, se destruye el inmunocomplejo y por electroforesis se puede analizar la protena deseada.

De cromatina Es utilizada para precisar la localizacin en el genoma de histonas modificadas y otras protenas. Consta de los siguientes pasos: 1.- Se tratan clulas vivas con formaldehido, que rpidamente media uniones cruzadas entre los grupos amino e imino y los grupos amino de las bases cercanas en un radio de -2 angstrom, en primer trmino los de la adenina y la citosina, a la vez que se preserva la estructura de la cromatina. 2.- Las clulas se lisan y la cromatina con uniones cruzadas se transforma en fragmentos manejables por sonicacin aunque pueden usarse tambin enzimas de restriccin. 3.- Los fragmentos de cromatina se tratan con anticuerpos contra la protena de inters (que puede ser una histona con una modificacin especfica, como una acetilacin o una metilacin en un sitio particular). Despus la mezcla se absorbe en cubetas con gel de agarosa a las que se les agrega protena A, la protena A se une a los anticuerpos, pero solo cuando estn unidos a sus antgenos diana; de esta manera es posible aislar solo los fragmentos de la cromatina en los que el ADN se cruz con la protena capaz de unirse al anticuerpo. 4.- El ADN se libera de la protena con la que est unido por acidificacin, que es capaz de revestir la reaccin de cruzamiento del formaldehido y se asla del ADN. 5.- El ADN se identifica por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), por medio de iniciadores especficos o hibridacin con micromatrices de ADN; de esta manera se revelan los segmentos de ADN a los que se unen las protenas de inters. Procedimiento y Muestras Lavar las clulas dos veces con PBS a temperatura ambiente, resuspendiendo en aproximadamente 5x105 cells/ml (aproximadamente 2x107 clulas totales). Aadir formaldehdo hasta obtener una concentracin final del 1% e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Parar las reacciones de cross-linking mediante la adicin de glicina a una concentracin final de 0.125 M. Precipitar las clulas (2.000 RPM, 5 minutos) y lavar una vez con PBS frio. Resuspender las clulas en 6 ml de Tampn de Lisis (sc-45000) mezclando suavemente. Recoger el extracto nuclear mediante centrifugacin a 2.000 RPM, 5 minutos Lavar otra vez con PBS. El Pellet puede ser congelado o el proceso puede continuar:

a) Resuspender el pellet en ~1.9 ml de Tampn de Lisis Altamente Salino (sc-45001) y transferir a un tubo de mifrocentrifugacin de 2 ml para el paso de sonicacin. b) Las condiciones de la sonicacin deben de ser optimizadas ya que los resultados pueden variar con sonifiers diferentes. Las siguientes condiciones fueron establecidas usando un Sonics VC130 con una punta de sonda de 3 mm. c) Sonicar en hielo con una potencia de salida = 5-6, modo continuo, 4 veces a intervalos de 30 segundos. d) Centrifugar el extracto durante 15 minutos, 10.000 RPM a 4: C y guarda el sobrenadante (cromatina). e) Determinar la concentracin de protena del sobrenadante. f) Para el paso de IP recomendamos usar 100-500 g de protena y 0,1-1 &mu:l reactivo TransCruz (0,2-2 g). Preaclara la solucin de cromatina con 50 l de Protein A/G PLUSAgarosa (sc-2003) e incubar 30 minutos a 4 C. Centrifugar a velocidad mxima 5 minutos a 4 C. Aadir el anticuerpo primario al sobrenadante e incubar durante la noche a 4 C. Aadir 50 l de Proteina A/G PLUS-Agarosa (sc-2003) e incubar 2 h a 4 C. Recoger las partculas mediante centrifugado a 12.000 rpm durante 20 segundos y colocar el tubo en hielo. Lavar las partculas dos veces con 1mL de Tampn de Lisis de Alta Salinidad (sc-45001). Lavar el pellet 4 veces con el Tampn de Lavado (sc-45002). Suspender las partculas en 400 l de Tampn de Elucin (sc-45003). Revertir los enlaces cruzados incubando el tubo en un bao de agua a 67 C, durante 2h. mezclando ocasionalmente. Eliminar las partculas por centrifugado y continuar la incubacin del sobrenadante a 67 C durante la noche. Centrifugar 3 minutos a 10000 para eliminar cualquier partcula residual y guardar el sobrenadante. Para aislar el ADN, extraer el sobrenadante una vez con 500 fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1), vortex cuidadosamente y separar las fases por centrifugacin durante 3 minutos a 14000 rpm. Guardar la fase acuosa, y extraer de nuevo la fase orgnica con 100 l de 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 (TE) y mezclar las fases acuosas.

Extraer la mezcla de fases acuosas con 600 l de cloroformo/ alcohol isoamlico. El DNA puede concentrarse con kits comerciales disponibles.

Aplicaciones Gracias a la Inmunoprecipitacin, es posible hoy en da, analizar y modificar postraducciones de una protena como en las fosforilacin, probar si la protena A se una a la protena B por coexpresin de las protenas dentro de la misma clula, es decir, aumenta el efecto en el estudio de las interacciones entre protenas, para el seguimiento de la evolucin de la cantidad de antgeno: induccin, represin, clculo de la vida media, en los cultivos de bacterias aadiendo Metionina marcada. En las auto radiografas permite observar cmo se degrada la protena y en el estudio de interacciones protena-protena (uniones) que pueden confundirse con el ruido de fondo. QUE ES ELISA? ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. Los lectores ELISA fueron diseados para pruebas de anticuerpos. Trabajan tan bien que las mquinas se han adaptado a sus propsitos. Los investigadores los usan para el anlisis de protenas y enzimas. Tambin se usa para la deteccin del HIV y la cuantificacin de cidos nucleicos. Los lectores ELISA o lectores de micro placa hacen espectrofotometra; emiten luz en una longitud de onda y miden la cantidad de luz absorbida y reflejada por un objeto tal como una protena. Un espectrofotmetro mide la luz ultravioleta y visible. Adems, los lectores pueden leer la fluorescencia y la luminiscencia. Las tinturas qumicas fluorescentes o emiten un color o longitud de onda cuando se exponen a la luz. La cantidad de reflexin, absorcin y la identidad del color se usan para medir la cantidad de sustancia. Para usar un lector ELISA, la molcula debe estar dusuelta en solucin. Un espectrofotmetro requiere entre 400 micro litros y cuatro mililitros, dependiendo del fabricante y modelo. Un lector de placa ELISA necesita de dos a 100 micro litros; los lectores de placa usan menos muestra par

obtener un resultado. Los lectores de placa ELISA miden ms muestras por unidad de tiempo. Un espectrofotmetro mide de una a seis muestras por vez. Tpicamente, una placa ELISA mide 96 veces ms. APLICACIN Debido a que el ELISA se puede realizar ya sea para evaluar la presencia de antgeno o la presencia de anticuerpos en una muestra, que es una herramienta til para determinar las concentraciones de anticuerpos en suero. Tambin se ha encontrado aplicaciones en la industria alimentaria en la deteccin de posibles alrgenos de alimentos, como la leche, cacahuates, nueces, almendras y huevos. ELISA tambin se puede utilizar en la toxicologa como una pantalla preliminar con rapidez, para ciertas clases de medicamentos. El ELISA fue la primera prueba de deteccin ampliamente utilizado para el VIH debido a su alta sensibilidad. En un ELISA, suero de una persona se diluye 400 veces y se aplic a una placa a la que estn unidos los antgenos del VIH. Si los anticuerpos del VIH estn presentes en el suero, que se pueden unir a estos antgenos del VIH. La placa se lava a continuacin para eliminar todos los otros componentes del suero. Un "anticuerpo secundario" especialmente preparado - un anticuerpo que se une a otros anticuerpos - A continuacin se aplica a la placa, seguido de otro lavado. Este anticuerpo secundario se une qumicamente con antelacin a una enzima. Por lo tanto, la placa contendr enzima en proporcin a la cantidad de anticuerpo secundario unido a la placa. Se aplica un sustrato para la enzima, y la catlisis por la enzima conduce a un cambio en el color o la fluorescencia. ELISA resultados se expresan como un nmero, el aspecto ms controvertido de esta prueba es determinar el punto de "corte" entre un positivo y un resultado negativo. Un punto de corte se puede determinar mediante la comparacin con un estndar conocido. Si una prueba de ELISA se utiliza para la deteccin de drogas en el lugar de trabajo, una concentracin de corte, 50 ng/ml, por ejemplo, se establece, y una mues tra que contiene la concentracin estndar de analito ser preparado. Desconocidos que generan una seal ms fuerte que la muestra se conoce son "positivos". Aquellos que generan seales dbiles son "negativos". PERPARACION PARA UN ELISA Principios bsicos: Un ELISA utiliza antgenos que son absorbidos a los pozos de placas de microtitulacin de plstico, los cuales luego se bloquean utilizando un agente para cubrir cualquier superficie restante en el pozo. El probador coloca un anticuerpo primario para adherirse especficamente al antgeno y luego aade un anticuerpo secundario, combinado con una enzima reactiva, para enlazarse con el anticuerpo primario. El probador luego agrega un sustrato que cambia de color para visualizar la concentracin del antgeno. El color del sustrato aumenta junto con la concentracin del antgeno. Reactivos: Los protocolos descritos en "Mtodos de Biologa Molecular" requieren los siguientes reactivos para cualquier tipo de ELISA: tampn de revestimiento de bicarbonato; PBS que contenga

albmina de suero bovino y Tween 20; tampn de fosfato; tampn de citrato, solucin de parada; solucin de lavado PBS y perxido de hidrgeno. Los protocolos describen adicionalmente composiciones especficas y porcentajes para cada reactivo. Antgeno: Un antgeno es cualquier sustancia extraa que el sistema inmunitario reconoce y ataca. Por ejemplo, el virus VIH es un antgeno que ataca directamente el sistema inmune. Anticuerpos: Los anticuerpos vienen en muchas formas, muchos de ellos son fabricados en respuesta a los antgenos especficos para ayudar en el ataque contra dicho antgeno. Por ejemplo, los anticuerpos del VIH son realizados contra el virus del VIH en los individuos expuestos.

FACES DE UN ELISA 1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgeno-enzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. En esta etapa es muy importante controlar los factores tiempo y temperatura de incubacin para evitar la aparicin de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15 minutos, no ocurrir la interaccin antgeno-anticuerpo y el color no ser evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la temperatura de incubacin es muy baja, la formacin del complejo antgeno-anticuerpo tampoco se completar en el tiempo establecido, mientras que si es muy alta, las protenas (antgeno y anticuerpo) se desnaturalizan y por tanto disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos negativos. 4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra.

TIPOS DE ELISA ELISA directo: Aade tampn carbonato a cada pozo de una placa de microtitulacin seguido por antgeno diluido en un tampn de revestimiento de bicarbonato. Incuba a temperatura ambiente durante dos horas o durante la noche. Lava la placa y deja secar a temperatura ambiente. Aade rbano picante conjugado con peroxidasa a cada pozo, diluido a una concentracin apropiada, y permite que se incube a temperatura ambiente durante dos horas adicionales. Aade el amortiguador de bloqueo y lava cada pozo con solucin de lavado. Aade tampn de citrato a cada pozo y permite que se desarrolle el color. Despus de 10 minutos, detn la reaccin con tampn de parada. Mide la absorbencia utilizando un espectrofotmetro. ELISA sndwich: Basndose en el trabajo de Munro y Lasley (1988), el ELISA Sandwich utiliza una liga peroxidasa de rbano picante, antisuero y normas comerciales en una placa de microtitulacin de 96 pozos. Los pozos de la placa estn recubiertos con antisuero diluido en tampn de revestimiento de bicarbonato. Sella las placas con cuidado e incuba durante 12 horas a 4 grados centgrados. Diluye el conjugado de enzima en un tampn de fosfato. Elimina el exceso de anticuerpo con solucin de lavado y deja secar a temperatura ambiente. Dispensa el tampn de fosfato en cada pozo seguido de solucin de conjugado que contiene las normas o muestras. Cubre las placas durante dos horas. Lava las placas y deja secar a temperatura ambiente. Aade tampn de citrato a los pozos y deja que se desarrolle el color. Despus de 60 minutos, detn la reaccin con una solucin de parada. Mide la absorbencia con el espectrofotmetro. ELISA directo, prueba de antgenos: En esta prueba, un tubo de ensayo pequeo est recubierto con anticuerpos que reconocern el antgeno en la muestra (suero del paciente); cualquiera en ella se unir a los anticuerpos que cubren el tubo. Despus del lavado, se aade otra muestra que contiene anticuerpos llevando una enzima reportero, estos anticuerpos se unirn al antgeno ya ligado al primer anticuerpo de modo que cuando un sustrato para la enzima sea aadido, un cambio de color se observar (resultado positivo). ELISA indirecto, prueba de anticuerpos: El ELISA indirecto es similar al del mtodo directo, la diferencia principal es que el tubo es revestido con el antgeno y la muestra aadida es probada para anticuerpos. Este tipo de ELISA es utilizado comnmente en las pruebas de VIH. Resonancia Magntica Nuclear La resonancia magntica nuclear (RMN) es una prueba diagnstica con la que se obtienen imgenes del interior del cuerpo (rganos y tejidos). Se basa en el procesamiento de ondas de radio que pasan por el paciente, el cual es sometido a un potente campo magntico. A diferencia de la tomografa axial computarizada (TAC) o de las radiografas simples no usa radiaciones ionizantes (rayos X). Permite obtener imgenes muy detalladas del cuerpo, en dos y en tres dimensiones, y desde cualquier perspectiva. Puede aportar informacin sobre patologas, si se presenta alguna lesin, enfermedad o condicin anormal que no se vean con otras tcnicas de imagen como en la ecografa o el TAC. Tambin se utiliza cuando estn contraindicadas otras pruebas de imagen, como por ejemplo en caso de alergia al contraste iodado que se usa en el TAC. El trmino resonancia magntica nuclear procede del hecho de que los ncleos estn en resonancia con la radiofrecuencia

o la radiacin. Es decir, los ncleos pasan de un estado de espn a otro como respuesta a la radiacin a la que son sometidos. Descubrimiento La resonancia magntica nuclear fue descrita y medida en rayos moleculares por Isidor Rabi en 1938 Ocho aos despus, en 1946, Flix Bloch y Edward Mills Purcell refinan la tcnica usada en lquidos y en slidos, por lo que compartieron el Premio Nobel de Fsica en 1952. Purcell haba trabajado en el desarrollo del radar y sus aplicaciones durante la Segunda Guerra Mundial en el Laboratorio de Radiacin del Instituto Tecnolgico de Massachusetts. Su trabajo durante tal proyecto fue producir y detectar energa de radiofrecuencias, y sobre absorciones de tales energas de por la materia, procediendo a su codescubrimiento de la resonancia magntica nuclear. Ellos se dieron cuenta de que los ncleos magnticos, como 1H (protio) y 31P, podan absorber energa de radio frecuencia cuando eran colocados en un campo magntico de una potencia especfica y as lograban identificar los ncleos. Cuando esa absorcin ocurre, los ncleos se describen como estando en resonancia. Diferentes ncleos atmicos dentro de una molcula resuenan a diferentes frecuencias de radio para la misma fuerza de campo magntico. La observacin de tales frecuencias resonantes magnticas de los ncleos presentes en una molcula permite al usuario entrenado descubrir informacin esencial, qumica y estructural acerca de las molculas. El desarrollo de la resonancia magntica nuclear como tcnica de qumica analtica y de bioqumica fue paralelo con el desarrollo de la tecnologa electromagntica y su introduccin al uso civil. Aplicaciones de la Resonancia Magntica Nuclear a la investigacin biomdica Las aplicaciones bioqumicas de la Resonancia Magntica Nuclear probablemente comenzaron en 1972 cuando por espectroscopia de carbono se sigui el metabolismo de la glucosa, marcada con dicho istopo, en una suspensin. En base a los resultados se concluy que esta tcnica poda ser enormemente til en el estudio de procesos bioqumicos. Pronto la Resonancia Magntica Nuclear se utiliz para determinar el pH intracelular en una suspensin de eritrocitos y posteriormente en un msculo. Casi simultneamente se obtuvo la primera imagen de RMN. La enorme versatilidad de aproximacin de esta tcnica permite la investigacin de aspectos tan diversos como la estructura tridimensional y dinmica de macromolculas biolgicas, el estudio de la anatoma normal y patolgica en seres humanos y modelos animales, o el seguimiento in vivo de rutas metablicas y su regulacin. No obstante, la Imagen de Resonancia Magntica es la vertiente ms conocida a nivel popular dada su cada vez mayor implantacin en el diagnstico clnico. Adems, como resultado de los avances tecnolgicos, las tcnicas de adquisicin rpida de imagen han permitido abordar reas que tradicionalmente se crean incompatibles con la Resonancia Magntica, como estudios dinmicos, imagen cine, imagen 3D de alta resolucin, angiografa y estudio funcional del cerebro. Todas estas caractersticas abren un enorme campo de posibilidades que han conducido a que tanto la imagen como la espectroscopa de RMN se apliquen cada vez ms en multitud de reas y lneas de investigacin dentro de casi cualquier rea de la ciencia, permitiendo el estudio de numerosos aspectos de una manera que no abordable por ninguna otra tcnica.

Cmo funciona? La base de funcionamiento de la resonancia magntica consiste en la generacin de un campo electromagntico mediante el empleo de un imn de gran tamao y la emisin de ondas de radio por parte de un escner; estas ondas y el campo electromagntico excitan a los protones (ncleos de los tomos de hidrgeno) que se encuentran en los tejidos que deseen ser estudiados provocando que se alineen unos con otros. Cuando la radiacin electromagntica deja de emitirse los protones se liberan y regresan a su posicin inicial liberando energa en forma de ondas de radio que otorgan a estas seales caractersticas especficas que sern recogidas por el escner y enviadas a un ordenador para su procesamiento en forma de imagen radiolgica que se muestras en "rodajas" o "rebanadas" muy claras de los tejidos y que se pueden ver en cualquier orientacin y posteriormente ser estudiada por el especialista. El examen por resonancia magntica nuclear, no produce dolor, y los campos magnticos no producen ningn dao conocido a los tejidos. A veces, el aparato de RMN puede hacer ruidos fuertes como de martilleo, golpeteo u otros tipos de ruidos, durante el procedimiento; El paciente se podr comunicar con el tecnlogo o el radilogo en todo momento a travs de un intercomunicador u otros medios. La mquina de resonancia magntica nuclear, cuenta con un espectrmetro que es un aparato capaz de analizar el espectro de frecuencias caracterstico de un movimiento ondulatorio y sirve para medir las propiedades de la luz en una determinada porcin del espectro electromagntico. La aplicacin fundamental de la espectroscopia en la resonancia magntica es la determinacin estructural, ya sea de molculas orgnicas, organometlicas o biolgicas. El espectrmetro de resonancia magntica, consta de 4 partes: Un imn estable, con un controlador que produce un campo magntico preciso. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas. Un detector para medir la absorcin de energa de radiofrecuencia de la muestra. Un ordenador y un registrador para realizar las grficas que constituyen el espectro de RMN.

Para qu se utiliza y porque es importante? La resonancia magntica nuclear, es el procedimiento preferido para diagnosticar un gran nmero de posibles problemas o condiciones anormales en diferentes partes del cuerpo ayuda a detectar y tratar precozmente una enfermedad. Proporciona informacin detallada, rpidamente y puede reducir la necesidad de ciertas cirugas de diagnstico. Por lo general, el mdico solicita una resonancia magntica para ayudar a diagnosticar: Lesiones traumticas; Trastornos del cerebro y del sistema nervioso; Cncer; Problemas musculares u seos. En general, la resonancia magntica nuclear, crea imgenes que pueden mostrar diferencias entre tejidos sanos y no sanos. Los mdicos usan la resonancia para examinar el cerebro, la columna vertebral, las articulaciones (ejemplo: rodilla, hombro, cadera, mueca y tobillo), el abdomen, la regin plvica, los senos, los vasos sanguneos, el corazn y otras partes del cuerpo. Riesgos para la salud La mayor parte de efectos negativos que puede tener sobre la salud, un examen de resonancia magntica nuclear, provienen de los efectos directos que el campo electromagntico puede ejercer sobre materiales conductores de la electricidad o ferro magnticos o sobre dispositivos electrnicos. Generalmente no se puede someter a una resonancia magntica si un cuerpo tiene; un implante de un dispositivo electrnico, como marcapasos, clips quirrgicos, alguna vlvula cardaca artificial o implantes auditivos metlicos y/o un objeto de metal que contenga hierro. En un futuro se podr utilizar sin riesgos para personas con marcapasos, pues se est investigando en la elaboracin de anti-imanes, que permiten ocultar ciertas zonas del campo magntico generado,

como por ejemplo en el corazn, para evitar el campo magntico en instrumentos electrnicos. En medicina se suele utilizar un anlisis de riesgo-beneficio para valorar si un paciente debe someterse o no a un examen de resonancia magntica. En el caso de que el riesgo inevitable sea mayor que el normal, el examen solo se realizar si es absolutamente necesario. Por ejemplo; en el caso de mujeres embarazadas ya que no se conoce los efectos que podra generarle al feto. Los efectos de exposiciones prolongadas podran derivar efectos como calentamiento del cuerpo, alergias y corrientes en el interior de los tejidos, o podran resultar efectos no conocidos que, a largo plazo, causaran enfermedades mortales tales como cncer. En el da de hoy no existe ninguna evidencia que sostenga esta ltima afirmacin y la mayora de los estudios que la apoyan no presentan una correlacin estadsticamente significativa entre campos; energa magntica y cncer. Forma en la que se realiza el examen Para realizar el examen, el paciente es ubicado adentro de la mquina de resonancia magntica nuclear, que por lo general es un aparato con forma de tnel o dona abierto en ambos extremos. Para la aplicacin, se solicitara que se use una bata de hospital o prendas de vestir sin broches metlicos (como pantalones de sudadera y una camiseta). Ciertos tipos de metal pueden causar imgenes borrosas. Algunos exmenes requieren de un tinte especial (medio de contraste). La mayora de las veces, el tinte se administra a travs de una vena (IV) en la mano o el antebrazo antes del examen. Este medio de contraste ayuda al radilogo a observar ciertas reas ms claramente. Se pueden colocar pequeos dispositivos, llamados espirales, alrededor de la cabeza, el brazo o la pierna u otras reas que se vayan a estudiar. Estos ayudan a enviar y recibir las ondas de radio y mejoran la calidad de las imgenes, El rea del cuerpo que se someter a una resonancia magntica debe estar en el centro del tnel o cilindro donde se encuentra el imn. Durante la resonancia magntica, la persona que opera la mquina vigilar al paciente desde otro cuarto. El examen dura aproximadamente de 30 a 60 minutos, pero puede demorar ms tiempo.

Espectrmetro de Masas El primer espectrmetro de masas, desarrollado en la dcada de 1920 por el ingls Francis William Aston, fsico y qumico britnico nacido en Harborne (Birmingham, Gran Bretaa) el 1 de septiembre de 1877 y fallecido en Cambridge (Cambridgeshire, Gran Bretaa) el 20 de noviembre de 1945, profesor de la universidad de Cambridge. Aston se ocupaba en especial durante la Primera Guerra Mundial, en la influencia de los factores meteorolgicos sobre los aviones. Obtuvo un Premio Nobel en qumica en 1922 por sus investigaciones sobre las masas atmicas y por el descubrimiento de los istopos de los elementos no reactivos. Aston interpret que su descubrimiento sealaba la existencia de dos tipos diferentes de tomos de nen. Ambos deban poseer el mismo nmero de protones, puesto que todas las formas de nen contienen siempre el mismo nmero de protones, pero un nmero diferente de neutrones y, en consecuencia, sus masas atmicas deban ser diferentes. Los trabajos de Aston proporcionaron as la primera prueba experimental de la existencia de istopos, es decir, de formas de un mismo tomo con un nmero igual de protones pero con un nmero diferente de neutrones. Aston invent el espectrmetro de masas como dispositivo experimental que permite separar las partculas cargadas en funcin de su masa, donde logr el descubrimiento de la existencia de un total de 212 istopos

antes desconocidos. El cientfico britnico describi sus descubrimientos en obras como Los istopos (1922) y Espectros de masa e istopos (1933). El espectrmetro de masas es un artefacto que permite analizar con gran precisin la composicin de diferentes elementos qumicos e istopos atmicos, consta de un generador de iones, una cmara de vaco donde estos se aceleran bajo la accin de una diferencia de potencial, un campo electromagntico que desva las partculas en funcin de su masa sobre carga elctrica (m/z) y un colector que funciona como detector elctrico o placa fotogrfica. De los resultados sobre el espectrmetro de masas, Aston pudo descubrir y enunciar la regla del nmero entero, segn la cual "las masas atmicas de todos los istopos son nmeros aproximadamente enteros, por lo que, cuando hay masas fraccionarias, es debido a que el elemento en cuestin es una mezcla de istopos. El espectrmetro utiliza para medir (m/z) introduciendo una muestra de material ya sea por el mtodo directo o indirecto. Por el mtodo directo, se introduce la muestra directamente en la fuente iones por medio de una varilla metlica, que lleva en la punta un capilar conteniendo la muestra, la muestra se calienta en el capilar, bien directamente por medio de una resistencia externa, la varilla se introduce en la fuente iones por medio de un sistema de vlvulas para evitar alterar el vacio que se mantiene en el interior del aparato. La introduccin indirecta en este sistema, utiliza un baln de vidrio o de metal esmaltado interiormente que se mantiene a una temperatura elevada, la vaporizacin de la muestra se realiza en un recipiente externo al espectrmetro. Las superficies en el interior del baln deben ser cuidadosamente evitadas para prevenir la catlisis en la muestra, este mtodo aplica para analizar gases y lquidos. Una vez evaporizada la muestra el dispositivo permite el escape de vapor a una escala molecular y permite tener un flujo constante de molculas hacia la fuente de iones. La introduccin de la muestra a partir de un cromatgrafo de gases, se realiza directamente en forma gaseosa y el cromatgrafo realiza la separacin de los diversos componentes de la mezcla. El espectrgrafo o espectrmetro consta esencialmente, de tres partes: la camarada de ionizacin, la cmara de desviacin, y el detector.

Cmara de ionizacin Los tomos de la sustancia que se pretende identificar reciben una energa de excitacin que les hace perder electrones. A veces dicha energa se consigue simplemente calentando la muestra. Como consecuencia de la prdida de electrones, los tomos se convierten en partculas cargadas positivamente que reciben el nombre de cationes. Cuando el gas entre los electrodos se ioniza por algn motivo, los iones se mueven hacia los electrodos de signo opuesto, creando as una corriente de ionizacin, que puede ser medida por un electrmetro. Luego de ser ionizados estos se aceleran al pasar entre dos placas con cargas opuestas. Cmara de desviacin Est sometida a un campo magntico intenso. Cuando el flujo de iones positivos (cationes) atraviesa la cmara, la trayectoria de cada uno de ellos experimenta una desviacin por efecto del campo magntico; en lugar de atravesar la cmara en lnea recta, lo hacen siguiendo una trayectoria circular. El radio de la trayectoria depende de la relaciona entre la carga y la masa (es decir, z/m). Los iones con menor relacin z/m describen una curva con mayor radio que los iones que tienen una relacin z/m mayor, de manera que se pueden separar los iones con cargas iguales pero distintas masas. La masa de cada ion se determina por la magnitud de su desviacin. Al salir de la cmara de desviacin, los iones positivos chocan con una placa fotogrfica, o un elemento similar, instalada en el detector. Detector Registra una corriente para cada tipo de ion. La cantidad de corriente que se genera es directamente proporcional al nmero de iones, dado que cada elemento y cada tomo poseen una masa y una carga caractersticas, la lectura del registro recogido por el detector permite identificar los tomos presentes en la muestra, de modo que se pueda determinar la abundancia relativa de los istopos.

La espectrometra de masas es una tcnica microanaltica usada para identificar compuestos desconocidos, cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades qumicas de las molculas. Requiere cantidades pequeas de la muestra y obtiene informacin caracterstica como la masa. Al determinar las masas de las partculas que forman parte de una muestra, con el objeto de identificarlas, la espectrometra de masas ha tenido y tiene aplicaciones innumerables. Actualmente, por ejemplo, se emplea para identificar los vestigios de sustancias hallados en lugares donde se ha cometido un delito, cuando las cantidades encontradas son demasiado pequeas para ser identificadas de otra manera. Ley de Lambert- Beer Relaciona la cantidad de luz que se absorbe con la concentracin de la sustancia que absorbe la luz se utiliza un haz de luz enfocado de manera precisa para penetrar el elemento del procesado. Una clula fotoelctrica de silicio mide la intensidad resultante de luz. La alteracin de la

intensidad de la luz, causada por la absorcin esta explicada por esta ley.

La Ley Lambert Beer afirma que la cantidad de luz que sale de una muestra es disminuida por tres fenmenos fsicos: 1) La cantidad de material de absorcin en su trayectoria (concentracin). 2) La distancia que la luz debe atravesar a travs de la muestra (distancia de la trayectoria ptica). 3) La probabilidad de que el fotn de esa amplitud particular de onda sea absorbido por el material (absorbencia o coeficiente de extincin) Esta relacin puede ser expresada como: A = bc A = Absorbencia = Coeficiente molar de extincin b = Distancia en cm c = Concentracin molar