Universidad Complutense de Madrid Facultad de Farmacia Departamento de Microbiologa

Tesis Doctoral

il-LACTAMASAS PLASMIIMCAS DE ESPECTRO AMPLIADO EN

Enterobacteriaceae

Rafael MB Cantn Moreno

Madrid, 1994

HOSPITAL RAMON Y CAJAL

AREA SANITARIA 4 28034 MADRID

%%INSALUD

D. Fernando Baquero Mochales, Jefe del Servicio de Microbiologa del Hospital Ramn y Cajal de Madrid y D. Jess Martnez Beltrn, Jefe de Seccin del Servicio de Microbiologla del Hospital Ramn y Cajal de Madrid,

CERTIFICAN:

Que el presente trabajo titulado B-lactmnasas plasnildicas de espectro ampliado en Enterobacteriaceae realizado por D. Rafael M~ Cantn Moreno, Licenciado en Farmacia por la Universidad Complutense de Madrid, se ha desarrollado bajo nuestra direccin para optar al ttulo de Doctor en Farmacia. Y para que conste y surta los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Madrid a quince de Enero de mil novecientos noventa y cuatro.

Li
D. Fernand Baquera Mochales Dr. en Medicina y Ciruga O. Jesds Martnez Beltrn Dr. en Farmacia

A M4 Paz y Rafael, A mis padres.

Agmdecfsnientos. Siempre resulta difcil acordarse de todas las personas que a lo largo de un trabajo tan dilatado han colaborado y participado para que ste llegue a su fin. A todas ellas mi ms sincero agradecimiento. Agradezco al Dr. Femando Baquera, Jefe del Servicio de Microbiologa del Hospital Ramn y Cajal, su confianza en mi; como maestro de la Microbiologa y del mundo de los antimicrobianos, su entusiasmo y brillantez de ideas han influido decisivamente en mi formacin como microbilogo. El trabajo durante estos aos ha hecho crecer la admiracin por mi parte y, creo, la amistad mutua. Como Director de esta Tesis, su estimulo y orientacin han resultado imprescindibles. Agradezco a] Dr. Jess Martnez-Beltrn, Jefe de la Seccin de Antibiticos del Servicio de Microbiologa del Hospital Ramn y Cajal, su amistad y apoyo desde mi entrada en el Laboratorio de Antibiticos, primero como residente y luego como compaero; compartir la tarea diaria del laboratorio siempre resulta enriquecedor y excitante. Como Director de esta Tesis, su rigor y conocimientos quedan plasmados en el presente trabajo. Agradezco al Profesor Csar Nombela, Director del Departamento de Microbiologa de la Facultad de Farmacia, su aceptacin como ponente de esta Tesis. Su orientacin y consejos a lo largo de mi carrera profesional fueron siempre acertados. Agradezco a los Ores. Elena Loza y Luis de Rafael su amistad, colaboracin y valiosos consejos, al Dr. Manuel Martnez-Ferrer su generosidad desde el comienzo del presente trabajo, y al resto de mis compaeros por su paciente espera y estimulo permanente. Agradezco al Dr. Jos Claudio Prez-Diaz su ayuda y disposicin, que permiti me iniciara en el mundo de la Gentica, al Dr. Jess Blazquez su valiosa colaboracin cientfica y tcnica y al resto de los componentes del Laboratorio de Gentica por su continua disposicin. Agradezco al Dr. Antone Medeiros del Miriam Hospital, Brown University en Rhode Island haberme facilitado su coleccin de cepas con 3-lactamasas patrones y su inters en la discusin de los resultados del presente trabajo. Agradezco a las Oras. Marisa Morosini y Cristina Negri su compaa y ayuda a lo largo de tantas horas de trabajo compartidas en el laboratorio.

Agradezco a mis compaeros de residencia Alberto Len, Matilde Elia, Juan Antonio Reguera, Elena Rdenas y al resto de residentes y becarios su amistad y estmulo. Agradezco a Felisa Almaraz, Francisco Soriano, Isabel Soler, Amparo Gallego, Montserrat Gallego y dems personal tcnico de nuestro servicio su colaboracin y ayuda tcnica imprescindible en la consecucin del presente trabajo. Agradezco al Dr. Daniel Boixeda, Adjunto del Servicio de Gastroenterologla y Coordinador de Docencia del Hospital Ramn y Caja], su amistad, confianza y ayuda que han resultado decisivas en mi carrera profesional. Agradezco a Domingo Snchez su paciente y minuciosa revisin de los datos numricos. Agradezco al Dr. Francisco ZaragozA, Catedrtico de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Alcal de Henares, su amistad, honestidad y dedicacin en mi etapa como becario en la Universidad donde comenz mi inters por la investigacin. Agradezco al Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social por el inters demostrado en este proyecto mediante la concesin de una Beca de Ampliacin de Estudios en el ao 1991. Agradezco, finalmente, a todas aquellas personas que durante mis aos de formacin en la Universidad y posteriormente en el mundo hospitalario han contribuido a mi formacin personal y cientfica. A mis padres por el cario y la educacin recibida, y en especial a M3 Paz, mi esposa, por su profunda generosidad en el tiempo robado durante tantas horas de trabajo, mi ms sincero agradecimiento.

INDICE

Indice

1..- INTRODUCCION
1.8-LACTAHASAS:

1 2

PERSPECTIVA HISTORICA Y CLASIFICACION GENERAL DE ESPECTRO AMPLIADO

2.- 5-LACTAMASAS PLASNIDICAS

2.1. Aproximacin conceptual 2.2. Caractersticas bioqumicas y genticas 2.3. Clasificacin de las J3lactamasas plasmidicas de espectro ampliado 2.3.1. De clase A: oxiiminofllactamasas cefalosporinasas 2.3.2. De clase 3: carbapenemasas 2.3.3. De clase C: cefamicinasas 2.3.4. De clase D: oxacilinasas de espectro ampliado 2.3.5. 13lactamasas plasmdicas de tipo TEM con resistencia a inhibidores de Blactamasas 3. BASES QENETICAS Y MOLECULARES DE LAS 2-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO 3.1. Alteraciones de la secuenciabase 3.2. configuracin estructural de la protena 3.3. Localizacin de los genes 3.4. Genes de resistencia asociados 4. EXPEESION DE LAS 8-LACTAItASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. 4.1. Aspectos genticos 4.2. Aspectos bioqumicos 4.3. Fenotipos de resistencia 4.4. Influencia de la permeabilidad 5.- IDENTIFICACION Y CAPACTERIZACION DE LAS B-LACTM4ASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO 6.- EPIDEMIOLOGIA AMPLIADO 6.1. Distribucin y prevalencia 6.2. Repercusin clnica DE LAS 8-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO y oxiimino

9 9 12 16 18 18 20 21

22 22 27 28 31 32 32 33 35 39

...

41

45 46 48

II.

OBJETIVOS

51

Indice
III.- MATERIAL

Y METODOS

52 52 52 52 52 53 53 54 SS 55 55 55 56 56 57 57 57 57

1. MICROORGANISMOS 1.1. Aislamientos clnicos 1.2. cepas con 13lactamasas plasmdicas de espectro ampliado 1.2.1. Procedentes de muestras clnicas 1.2.2. Procedentes de portadores fecales 1.3. Cepas de referencia 2.- AJITIMICROBIANOS 3.- PRUEBAS DE SENSIBILIDAD 3.1. Mtodo de difusin con disco 3.2. Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI). 3.2.1. Mtodo de dilucin en agar 3.2.2. Mtodo de microdilucin 3.2.3. Mtodo del EpsilonTest 3.3. Estudio con inhibidores de 13lactamasas 3.3.1. Prueba de doble difusin con discos 3.3.2. Sinergia con inhibidores de 3lactamasas 3.4. Puntos crticos de resistencia 4.- CARACTERIZACION DE LAS S-LACTAIASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO 4.1. Obtencin del extracto crudo enzimtico 4.2. Determinacin del punto isoelctrico 4.3. Determinacin de la actividad enzimtica especfica 4.3.1. Determinacin del contenido de protenas 4.3.2. Actividad 3lactamasa 4.4. Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn 4.5. Hibridacin en colonia con sondas de ADN 4.5.1. Preparacin y lisis de las colonias 4.5.2. Preparacin y marcado de las sondas 4.5.3. Hibridacin y autorradiografa 5.- ESTUDIOS GENETICOS 5.1. Extraccin del ADN plasmidico 5.1.1. Lisis clara 5.1.2. Lisis alcalina 5.1.3. Purificacin del ADN plasmidico 5.1.4.- Electroforesis en geles de agarosa 5.1.5. Medida del tamao molecular de los plsmidos

58 58 59 59 59 59 60 61 61 61 62 62 62 62 63 63 64 64

TI

Mice
III. MATERIAL Y METODOS (continuacin).
5.2. Transferencia de la resistencia 5.2.1. conjugacin y frecuencia de conjugacin. 5.2.2. Transformacin 5.2.3. Transformacin por electroporacin 5.3. Extraccin del ADN cromosmico
6. RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS NO 8-LACTAHICOS EN Eflterobacteriaceae CON -LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO

64 64 65 66 66

67 67 68 68 69 69 69 70 70 70 70

6.1. Resistencia a aminoglicsidos: enzimas modificantes 6.1.1. Actividad acetiltranaferasa 6.1.2. Actividad nucleotidiltransferasa 6.1.3. Actividad fosfotransterasa 6.2. Resistencia a quinolonas: mutaciones en gyrA 6.3. Resistencia a tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y tos f omi cina
7.- ANALISIS EPZDEMIOLOQICO 7.1. Datos microbiolgicos 7.2. Pacientes y factores epidemiolgicos asociados 8.- >~TODOS ESTADSTICOS

IV.

RESULTADOS Y EVOLUCION DE LA SENSIBILIDAD-RESISTENCIA A

71

1. INCIDENCIA ANTIBIOTICOS

13-LACTANICOS EN Enterobacteriaceae (19871992)

71 72 73 73 74

1.1. Esoherichia coil 1.2. Salmon ella Spp 1.3. Proteus mirabilis

1.4. Riebsiella pneumoniae y ltZebsiella oxytoca. 1.5. Proteus vulgaris 1.6. Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes. 1.7. Citrobacter treundil 1.8. Morganella morganhl 1.9. Serra ta marcescena
2.- ANALISIS DE LOS FENOTIPOS DE SENSIBILIDADRESISTENCIA A

.75
75 75 .77 77

ANTIBIOTICOS

i3-LACTAJ4ICOS EN Enterobacteriaceae (19871992)

101

2.1. Escherichia coil, Salmonella spp. y Proteus mirabilis 2.2. Elebsiella pneumoniae y Riebsiella Oxytoca

101 103

III

Mice
IV. RESULTADOS <continuacin>. 2.3. Proteus vulgaris 2.4. Enterobacter cloacas, Enterabacter aerogenes, Citrobacter freundil, Morganella morganii, y Serratia marcescens
3.DEFINICION B-LACTAMASAS DE FENOTIPOS PLASNIDICAS CONFERIDOS DE POR PROTOTIPOS DE 106

103 104

ESPECTRO

AMPLIADO

3.1. Diferenciacin de grupos fenotipicos

108 110 112

3.2. Estudio comparativo de las tcnicas de difusin por disco, dilucin y EpsilonTest 3.3. Influencia de mutaciones en las protenas de membrana externa <ompr) 4. ESTUDIO Y CARACTERIZACION DE LAS 8LACTANASAS PLASNIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO (ElPEA> EN Znterobacteriaceae (19871992) 4.1. Identificacin inicial 4.2. caracterizacin por isoelectroenfoque 4.3. Grupo 1. I3PEA de pI 7,6: Fenotipos SHV2 y SHV6 4.3.1. Perfil de sensibilidad y sinergia 4.3.2. Actividad enzimtica especfica 4.3.3. Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn 4.3.4. Transferencia de la resistencia y frecuencia de conjugacin 4.3.5. Anlisis plasmdico e hibridacin en colonia 4.4. Grupo 2. I3lPEA de pI 5,9: Fenotipos TEM6/8 y TEM4 4.4.1. Perfil de sensibilidad y sinergia 4.4.2. Actividad enzimtica especfica 4.4.3. Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin 4.4.4. Transferencia de la resistencia y frecuencia de conjugacin 4.4.5. Anlisis plasmidico e hibridacin en colonia 4.5. Grupo 3. BlPEA de pI 5,4 4.5.1. Perfil de sensibilidad y sinergia 4.5.2. Actividad enzimtica especfica 4.5.3. Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn 4.5.4. Transferencia de la resistencia y frecuencia de conjugacin 4.5.5. Anlisis plasmdico e hibridacin en colonia

lis 115 117 120 120 128 129 129 132 134 134 136 137 142 142 143 143 145 145 147 147

IV

Indice
IV. RESULTADOS (continuacin>.

5.- RESISTENCIA A AMTIBIOTICOS NO B-LACTAI4ICOS EN Enterobacteriaceae CON 8-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO 5.1. Enzimas modificantes de la resistencia 5.2. Resistencia de aminoglicsidos por mutaciones y cotransferencia 151 en gyrA 154 150

a quinolonas

5.3. Resistencia a tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y fosfomicina 6. EPIDEMIOLOGA DE LAS BXPEA Grupo 1. J3lPEA de 6.2. Grupo 2.- i3lPEA de 6.3. Grupo 3. I3lPEA de 6.4. Portadores fecales de I3lPEA
6.1.

154 155

pI pI pI de

7,6: SHV-2 y SEV6 5,9: TEM6/8 y TEM4 5,4 Entero.bacteriaceae productoras

158 159 161 161

Y. DISCUSION
1.- EVOLUCION DE LA SENSIEILIDAD Y FENOTIPOS DE RESISTENCIA A

164

ANTIBIOTICOS 8LACTANICOS EN Znterobacteriaceae <19871992)

164

1.1. Escherichia cali, Balmonella spp. y Proteus mirabilis 1.2. Rlebsie.Zla pneumoniae y Riebsiella oxytoca 1.3. Proteus vulgaris 1.4. Enterobacter cloacae, Enterobacter serogenes, Citrobacter freundil, Morganella morganii, y Serratia marcescena
2. INDENTIFICACION Y AGRUPAMIENTO FENOTIPICO DE LAS i3-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO 3.5-LACTAMASAS PLASNIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO EN

164 173
176 179

....

184

Bnterobacteriaceae

EN EL HOSPITAL RANON Y CASAL (19871992).

188

VI.-

CONCLUSIONES

202

VII.

BIBLIOGRAFIA

205

1.- INTRODUCCION

Introduccin

Transcurridos 65 aos desde que Fleming (173) observara la inhibicin del crecimiento de Saphylococcus aureus por colonias de Penidlllum notatum y propiciara el descubrimiento de la penicilina, son ya ms de 50 las penicilinas, 70 las cefalosporinas, 3 los monobactams y 3 los carbapenems desarrollados por la industria farmacutica y utilizados teraputicamente. Este ingente nmero de compuestos ha estado determinado por la gran capacidad de adaptacin de los microorganismos que, progresivamente, han hecho ineficaces los sucesivos antibiticos introducidos en la prctica clnica. Sin embargo, la aparente versatilidad de las bacterias se limita a la adquisicin de un nmero reducido de mecanismos de resistencia: modificaciones en los procesos de entrada del antibitico, produccin de enzimas que comprometen la viabilidad del antibitico y alteraciones de los lugares diana o de actuacin del antibitico. La inactivacin enzimtica, y en concreto las fi-Jactamasas, constituyen el mayor xito estratgico de los microorganismos en su esfuerzo por contrarrestar el efecto de los antibiticos filactmicos desarrollados por el hombre. La diseminacin de los genes productores, frecuentemente asociados a transposones y plsmidos transmisibles, entre distintos microorganismos ha dado lugar a una alta prevalencia de la resistencia a los B-lactmicos clsicos. Una nueva generacin de enzimas il-lactamasas plasmdicas de espectro ampliado derivadas de otras ya conocidas y con mayor
-

espectro hidroltico que sus predecesoras, ha determinado que, en la actualidad, no exista un solo antibitico fi-lactmico que escape a su accin hidrolitica. Estas enzimas son fruto de un proceso adaptativo que incluye mutaciones, recombinaciones e integraciones de elementos cromosmicos en los antimicrobianos la principal condicin de seleccin. Las 8-lactarnasas plasmdicas de espectro ampliado se han descrito en Enrerobacreriaceae y
plsmidos, constituyendo el amplio uso de

excepcionalmente en Psewlomonas aeruginosa, pero es slo cuestin de tiempo su sntesis por microorganismos hasta la fecha carentes de ellas.

Introduccin

1.- 0-LACTAMASAS: PERSPECTIVA HISTORICA Y CLASIFICACION GENERAL. Las 8-lactamasas son enzimas que hidrolizan el enlace amida del anillo Il-lactama de penicilinas, cefalosporinas y otros antibiticos 8-lactmicos, dando lugar a compuestos sin actividad antibacteriana (213,559). Estos enzimas constituyen, en la actualidad, el principal determinante de resistencia a los antibiticos B-lactmicos de la mayora de las bacterias patgenas (362,508). Fleming (173) en 1929, un ao despus del descubrimiento de la penicilina, observ que bacterias del grupo coli-tifoidea no eran inhibidas por la penicilina. Aos ms tarde, en 1940, Abraham y Chain () confirmaron por vez primera la existencia de estas enzimas al demostrar que extractos de cultivos de Escheric/zia coil eran capaces de inactivar la penicilina, recibiendo por este motivo, el nombre genrico de penicilinasas. Posteriormente, en 1944, Kfrby (277) constat que su sntesis no era exclusiva de microorganismos gramnegativos, ya que aislamientos de Staphylococcus aureus que presentaban resistencia a la penicilina, producan tambin estas enzimas. La seleccin y diseminacin fue rpida; en 1948 un 50% de las cepas de S. aureus producan penicilinasa (56) y aos ms tarde esta cifra era cercana al 80% (462). Una posible explicacin de este hecho fue planteada en 1963 por Novick (419) al demostrar que el gen que codifica la produccin de penicilinasa en S. aureus era de naturaleza plasmidica. Asimismo, Datta y Kontomichalou (139) comunicaron en 1965 que la sntesis de penicilinasa (TEM-l) en Emerobacreriaceae era codificada por genes de resistencia contenidos en plsmidos. Ese mismo ao, el Comit de Nomenclatura de Enzimas definid las penicilinasas como penicilil amido B-lactam hidrolasas EC 3.5.2.6. (559). A partir de 1972 se incluyeron las
-

cefalosporinasas, enzimas que presentan una mayor afinidad por substratos derivados del cido 7aminocefalospornico (502), dentro del apartado EC 3.4.2.8. La confusin generada por la diversidad de enzimas encontradas y las diferentes denominaciones que recibieron condujo en 1979 a la unificacin de criterios, clasificndose todas las enzimas capaces de hidrolizar el enlace amida del anillo 8-lactama dentro del grupo EC 3.5.2.6.
(213).

En los aos 70 se describen un gran nmero de nuevas B-lactamasas, tanto plasmidicas como cromosmicas, e incluso se especula sobre la posibilidad, adelantada por Smith y Hamilton-Miller en 1963 (2J3) de que, a] menos en grainnegativos, la produccin de -lactamasa cromosmica fuese especfica de cada gnero o especie. En la dcada de los 80 Saino y cok. (497,498), Amicosante y coAs. (oa ), Matthew y Harris (357) y Marre y Aleksic (351), estudiando las 8-lactaniasas en funcin de sus caractersticas bioqumicas y moleculares y no por su origen bacteriano, demostraron 2

Introduccin

que un mismo microorganismo poda producir diferentes tipos (o,1,497,4n) o variedades de 8lactamasas cromosmicas (357,351). Los primeros intentos de clasificacin de las numerosas 8-lactamasas identificadas fueron abordados por Ayliffe en 1963 (24), Sawai y cois. en 1968 (ss) y Jack y Richmond en 1970 (247), utilizando como dnico criterio diferenciador la capacidad hidrolftica sobre distintos substratos. Unos aos ms tarde, en 1973, Richmond y Sykes (485) establecieron la que sera una de las primeras y ms aceptadas clasificaciones de las Il-lactamnasas, cuya nomenclatura sigue siendo an utilizada en la mayora de los trabajos de investigacin. Sus diferentes clases, cinco, se establecieron en funcin del origen, plasmidico o cromosmico; produccin, constitutiva o inducible; perfil de substrato y accin de algunos inhibidores de 8-lactamnasas. La primera clase, clase 1, engloba enzimas cromosmicas activas principaimente sobre cefalosporinas que demuestran una inhibicin competitiva por cloxacilina y carbenicilina pero no por el cido clavulnico. Poseen un peso molecular entre 24.000 y 48.000 daltons, pudiendo distinguirse cuatro subclases, la, Ib, Ic, y d, de expresin inducible, excepto las de tipo Ib. Las subclases la y Id incluyen enzimas de los gneros Enrerobacrer, Serrara, Morganella, Citrobacrer y Fseudomonas. Poseen una gran repercusin clnica (306,502,504) ya que en sus estados inducido y desreprimido confieren resistencia a las cefajosporinas de 3a generacin y monobactams De menor entidad clnica son las enzimas de la subclase lc, que agrupa a un nmero reducido de Il-lactamasas, oxiiminocefalosporinasas inducibles, cuyo representante ms genuino es
(306,307).

la 8-lactamasa de Proreus vulgars (231,503,51 s) tambin denominada cefuroximasa. Enzimas similares sehan descrito en Proteuspenneri (98), Pseudomonas cepacia (230,231), Pseudomonaspseudomalle (312) y Xanrhomonas maltophila (497,498). Estas 8-lactaniasas constituyen la excepcin de la clase 1, ya que son inhibidas por el cido clavulnico, por lo que algunos autores definieron una nueva clase (Clase VI) (36,403). Esta ltima incluye tambin algunas de las enzimas encontradas con posterioridad en Racreroides spp. (76,427,562,620). Por otra parte, la subclase lb define las 8lactamasas cromosmicas de E. cot y Shgella, cuya expresin, generalmente de bajo nivel (261), puede modificarse, sintetizndose de forma constitutiva cantidades elevadas de enzima
(58,15 1,261,417,426).

La clase II agnipa enzimas cromosmicas, predominantemente activas sobre penicilinas que se inhiben de forma competitiva por la cloxacilina pero no por la carbenicilina. Son de un tamao inferior a las anteriores, 25.000-30.000 daltons y se diferencian por su movilidad electrofortica. Su relevancia clnica es nula, circunscribindose, casi exclusivamente, a 8-lactamasas raramente encontradas en E. cot, Proteus mirabits, Pseudomonas y Vibrio parahaemolyrcus (36,403). 3

Introduccin

de la clase 111 se incluyeron las 8-lactamasas plasmidicas de amplo espectro TEM-l y TEM-2, que poseen actividad penicilinasa y cefalosporinasa, son sensibles a la inhibicin por la cloxacilina, cido clavulnico, sulbactani y tazobactanx y resistentes a la inhibicin por carbenicilina
Dentro

(pCMB) (213,248,314). Esta definicin permiti con posterioridad la inclusin en este grupo, entre otras, de las 8-lactamasas SHV-1, HMS-1 (359), OHIO-1, ROB-1 (366), LXA-1 (s) y TLE-1 (365), que poseen caractersticas bioqumicas similares y un peso
y p-cloromercurobenzoato

molecular aproximado de 17.000 a 29.000 da]tons. Estas 8-lactamasas, de marcada transcendencia clnica, han sido descritas y encontradas en numerosos gneros y especies: E. col!, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Haemophilus, Netsseria gonorrhoeae y Pseudomonas (3,254,304,356,
363.366,492,603,607).

La clase IV engloba B-lactamasas cromosmicas constitutivas de amplio espectro con un perfil muy parecido al anterior pero sensibles al pCMB y resistentes a la inhibicin por cloxacilina. Su peso molecular oscila entre 18.000 y 25.000 daltons, diferencindose entre si por la movilidad electrofortica. En este grupo se encuentran algunas de las 8-lactamasas de Moraxella catarrhalis y Bacteroidesfragilis, si bien las ms estudiadas son las 8-lactamasas de Klebsiella (36,403). Estas, al igual que las de clase Ic, son inhibidas eficazmente por los inhibidores de 8-lactamasas cido clavulnico, sulbactam y tazobactam y poseen un amplio rango de pI, entre 5,3 y 9,2 (358,478,503).
-

En Xiebsiellapneumoniae es mayoritaria la poblacin con 8-lactamasas de pI de 7,1 correspondiente a la 8-lactamasa LEN-1 (4). En Klebsella oxytoca se agrupan en torno a los pI 7,8, 5,3 y 6,5, coincidente este ltimo con la B-lactamasa denominada Kl que muestra un perfil hidrolitico que afecta tambin a oxiiminocefa]osporinas y al aztreonam, excluyendo las cefamicinas, la ceftazidima y el moxalactam (90,93,Iss,265,337). La clase V est integrada por enzimas plasmidicas de arnpio espectro con actividad principalmente penicilinasa, con resistencia al pCMB e inhibidas por el cido clavulnico, sulbactam y tazobactam. Esta clase de enzimas, que poseen un peso molecular entre 24.000 y 46.000 daltons, se subdivide a su vez en cuatro subclases. Las dos primeras, Va y Vb, hidrolizan la cloxacilina y se encuentran generalmente enEnrerobacteriaceae; OXA-l ,2,3. .9 (3,78,356,s,492,6o3,607) y PSE. .

2 (OXA-lO) (366,607), mientras que las otras dos, Vc y Vd son poco activas sobre cloxacilina y tampoco se inhiben por este compuesto, sintetizndose en su mayora por el gnero Pseudomonas: PSE-1,3 y 4 y CARB-3 y 4 (184,305,356,363,366,454,607). la clasificacin de Richmond y Sykes un esquema diseado para las 8-lactamasas de microorganismos gramnegativos, no incluye las de grampositivos. Estas quedan prcticamente representadas, por su mayor prevalencia (607), por las 8-lactamasas de Sraphyococcus, si bien se
Por ser

Introduccin

han descrito en otros grampositivos: Badillus (90,91), Closrridium (219), Nocardia (593) y Enserococcus (317,388,389). Atendiendo a criterios cinticos, serolgicos y de perfil de substrato, en Staphylococcus se han clasificado cuatro tipos de 8-lactamasas (A,B,C y U) codificadas por plsmidos (321,484). Su accin hidrolitica afecta a todas las penicilinas naturales y semisintticas y con mucha menor eficacia a la meticilina, oxacilina y cefa]osporinas, siendo inhibidas por el cido clavulnico, sulbactam y tazobactam. Todas ellas son extracelulares y, excepto las del tipo O, inducibles por antibiticos B-lactmicos (150,321,362). El esquema de Rchmond y Sykes no fue nico y surgieron en aos sucesivos otros muchos que, con mayor o menor suerte, recurran a criterios inmunolgicos, moleculares (peso molecular,
punto isoelctrico, secuencia de aminocidos, caractersticas del centro activo) y cinticos (perfil de

substrato, Vt,m, Km, eficiencia hidroltica), carcter inducible o constitutivo, localizacin intra o extracelular o localizacin del gen productor (s,59,24o,2o,356,362,363,3e,378,429,46o,5o3). Entre los esquemas que confieren mayor importancia a la naturaleza proteica de las 8-lactamasas que a la expresin gentica o las caractersticas cinticas, destaca la clasificacin de Ambler (a) de 1980, que fe completada posteriormente por Jaurin y Gundstrom en 1981 (260) y Bergstrom y cols. (59) en 1982. Esta nueva propuesta es el resultado de la aplicacin de las tcnicas de secuenciacin de aminocidos y nucletidos y establece 3 clases distintas. La clase A est formada por aquellas il-lactamasas penicilinasas que poseen un resto de serma en su centro activo y tienen un peso molecular aproximado de 28.000-30.000 daltons. A este grupo pertenecen las 8-lactamasas cromosmicas de Bacillus, Srrepromyces y Klebsiella y las plasmdicas de tipo TEM y SHV de gramnegativos, as como la enzima PCl de 5. aureus, incorporndose muy recientemente algunas B-lactamasas caracterizadas en Bacteroides (436). A pesar de presentar una relativa homologa entre ellas, sus pI se sitan en un amplio rango de pH (5,4>9,5). Asimismo, su espectro hidroltico se ha visto ltimamente ampliado por la incorporacin de 8-lactamasas cromosmicas que confieren resistencia a la cefoxitina o al imipenem y menor sensibilidad a cefalosporinas de 3a generacin, manteniendo sensibilidad a la accin de los inhibidores de 8-lactamasas. Entre stas la enzima NOR-l (pl 6,9) caracterizada en Enrerobacrer cloacae (390,414) presenta similares caractersticas a las carbapenemasas descritas en Serrara
marcescens (619).

2+. Poseen un peso molecular variable (22.000-120.000), son inactivadas por agentes quelantes como el EDTA, no se
La clase B est constituida por metaloenzimas dependientes de Zn

inhiben por el cido clavulnico y poseen, en general, actividad carbapenemasa (91 .310). Al igual que
la clase anterior incluye tanto 8-lactamasas cromosmicas
-

Bacllus cereus (2), Aeromonas (352),

Introduccin

It malrophilia (498), Flavobacreriwn odorwum (sis), Legionella gorman!) (176), B. fragilis ( 18) como plasmidicas P. aeruginosa (595), E. fragilis (25)
-.

Por ltimo, la clase C, cuyo prototipo es la 8-lactaniasa AmpC de E. col!, la conforman cefalosporinasas con un peso molecular elevado (aproximadamente de 39.000 daltons). Poseen un resto de serma en su centro activo pero no tienen homologa secuencial con las 13-lactamasas de clase. A (260). A este grupo pertenecen las enzimas cromosmicas de Shigella, Enrerobacter, Serratia, Morganella y Pseudomonas. En esta clase deberan incluirse las enzimas plasmidicas CEP-1 (69) y CEP-2 (292) que muestran homologa con AmpC de E. col! e hidrolizan cefalosporinas preferentemente. La primera posee un pI de 8,7 y no es inhibida por el cido clavulnico, mientras que la segunda, con un pl de 8,1, es sensible a la accin de los inhibidores de il-lactamasas. Asimismo, dentro de este grupo han de clasificarse las Il-lactamasas plasmidicas de clase 1, recientemente descritas, CMY-l y -2 (40,45), MIR-1 (435), BIL-l (us), MOX-1 (236), LAT-1 (577) y FOX-1 (n).
-

Los trabajos de Oulletey cok. en 1987 (429) y Huovinen y cok. en 1988 (240) completaron esta clasificacin al definir un nuevo tipo de enzimas, clase D, que acoge las B-lactamasas OXA-], OXA-2 y PSE-2 (OXA-lO) con posibilidad de ampliarse al resto de las oxacilinasas. Estas filactamasas muestran una gran homologa entre si pero no con las enzimas de tipo TEM (Clase A) o AmpC (Clase C)(240) El esquema de clasificacin molecular de Ambler, que adems establece relaciones filogenticas, parece ser el modelo a desarrollar. Los continuos avances en la biologa molecular permitirn una mayor definicin de sus grupos, la adscripcin a ellos de 8-lactamasas ya conocidas y la estructuracin de nuevas clases. En su defecto y por el momento se han de utilizar
caractersticas bioqumicas que aseguren una adecuada diferenciacin y simultneamente un

de 8-lactamasas afines. En esta lnea de pensamiento, Bush en 1988 (87) estableci las bases de una novedosa y ambiciosa clasificacin, en apariencia ms compleja, que publica definitivamente en 1989 (90,91).
agrupamiento

En esta nueva clasificacin, por el momento el ltimo esquema propuesto, se recurre al perfil de substrato y a la inhibicin por los inhibidores de 6-lactamasas (cido clavulnico) para agrupar las enzimas de tal forma que puedan incluirse en la misma categora aquellas 8-lactamasas relacionadas entre si. En este sentido, se establecen cuatro grandes grupos todos ellos homogneos constituidos por un solo subgrupo, a excepcin del grupo 2 que se divide en 6 subgrupos atendiendo fundamentalmente al patrn hidrolitico (TABLA 1). 6

Introduccin

TABLA 1.- Clasificacin de las 8-lactamasas (modificada de K. Bush - 1989 -)

8 Clase molecular

Grupo Inhibicin Subtitulo Substrato~ CLV EDTA 2 CE?N CE?

pI

fluiaas representativas ra.Ib,Id<rqs,b CEP1

bacteria

LOcalizacidn Cr pl Cr Cr/?1

5.29,6

.D,terohacteriaceae .P. an-uginosa P. mirabilis P. aerupinosa Staphy]ococcus Bacillus Stteptoaycn

2. PEN?

YEN

5.O$.O

PCI 1,!!:

2 1DBY

YEN CE?

5,39,3

TEN1,2 SN%/i L~terobacteriaceae. 01<201 ROBl... Haemophilus LENl IV(R/S) Xl absi ella TENa.. .26 SNV2, . .6 Kl PSE1,3.4 CARE3,4 EROl.2.3 ?SE2 OXAl.. .9 Ic<RiS> L2 Netaloenzimas It. Li Entero.Sacteriaceae X. oxytoca frterobacteriaceae F. eruginosa N. ctarrhalis frterobacteriaceae P. eruginosa F. vulgaris X. maltophilia .9. coreus X. uItophiIi

Pl Cr pl

2>9 BBSy

YEN CEP<CTX) ATN YEN CARI

S.28.9

2c CAR?

4.37,1

Pl

2d CLX? 2e CEPY
3 #IETN

YEN CLOX CE?

6.1SA

Pl

4,79,2

Or

Variable (IKP
YEN

6.110,5

Cr

PEMN

ti

4.46,5

LCRl

Aacteroides P. copada P. eruginosa

Cr Pl

YEN:

penicilinas; CE?: cefalosporinas; CTX: cefotaxima; Am: monobactasa; CARI: carbenicilina; CI-OX: cloxacilina; IMP: carbaperseas; CLV: cido clavulnico a. clases moleculares de la clasificaci6n de Ambler (I9SO~. 3.urin y Gundstrom tIqS), lergatros y cola. <1982>, Oullete y cola. <1987> y Huovinen y cola. <1988>. Clases enzimticas dc la clasificacidn de Richsond y Sykes (1973>.

El ~ruuo 1 CEP-N est formado por B-lactaniasas cromosmicas de gramnegativos que hidrolizan preferentemente las cefajosporinas y no son inhibidas por el cido clavulnico. Este grupo se conelaciona con las clases la, lb y Id de Richmond y Sykes que confieren, con la excepcin del grupo Ib, en su estado inducido o desreprimido resistencia a las cefalosporinas de P generacin.
-

El ~ruoo2, sin duda el ms heterogneo, se subdivide en 6 subgrupos y est constituido por il-lactamasas que se inhiben por el cido clavulnico. El ~g~p~..La
.7
-

PEN-Y

recoge las

Introduccin

penicilinasas clsicas de grampositivos donde se incluyen las enzimas de 5. aureus, Bacillus y

Srrepromyces y las descritas recientemente en Emerococcus (317,388,389). El sub2runo 2b, BDS-Y

-

lo integran las 8-lactamasas de amplio espectro de gramnegativos, representadas por TEM-1, TEM-

2 y SHV-l y las B-lactamasas cromosmicas de Klebsiella. En el sub2runo 2b EBS-Y se amplia hidrolitico del grupo anterior, afectando no slo a penicilinas y cefalosporinas clsicas sino tambin a cefotaxima, ceftazidima y aztreonam, siendo igualmente inhibidas por el cido clavulnico. Este grupo, creado para las il-lactamasas plasmdicas de espectro ampliado (BIPEA) objeto de este trabajo, incluye tambin algunas enzimas cromosmicas con similares caractersticas, Kl de K. oxytoca (93,9o,Iss,265,337) y PER-l de 1>. aeruginosa (415). El mibgnw~.2~ CAR-Y y
el espectro
-

snbgmpQl4 CLX-Y agrupan, respectivamente, las carbenicilinasas (PSE-1,3,4, CARB-3,4,5, BRO-l,2,3, AER-l y SAR-l) y las oxacilinasas (PSE-2, OXA-l,2,3....9) que inactivan, respectivamente, carbenicilina y cloxacilina, siendo las primeras inhibidas de forma ms eficaz por el cido clavulnico que las segundas. Por ltimo, el ~jjkgnjp~~ CEP-Y reune a las
-

oxiiminocefalosporinasas de codificacin cromosmica. Clasificadas por Ricbmond y Sykes dentro

del grupo Ic, su ms genuino representante es la cefuroximasa de P. vulgaris. Esta enzima o grupo de enzimas son inhibidas por el cido clavulnico y en estado inducido o desreprimido pueden
inactivar la cefotaxima y en menor medida la ceftazidima.

El ~runo 3 MET-N incluye las B-lactamasas que precisan de un in metlico para ejercer su actividad enzimtica (metaloenzimas). Pertenecen a la clase B de la clasificacin molecular de
-

Ambler y, al igual que el siguiente y ltimo grupo, generalmente no son inhibidas por el cido
clavulnico. El 2runo 4 PEN-N
-,

poco definido desde el punto de vista molecular, est constituido

por un nmero reducido de penicilinasas de escasa repercusin clnica que han sido descritas en

Bacreroides, P. cepacia, Alcaligenesfaecalis y Closrridium buryricum. A excepcin de la enzima plasmidica LCR-l encontrada en P. aeruginosa (366), todas son de codificacin cromosmica. Esta clasificacin de Bush, comnmente utilizada en los trabajos de investigacin, permite acoger nuevas 8-lactamasas descritas con posterioridad a su publicacin. Sirvan de ejemplo las BIPEA que, recluidas inicialmente dentro del grupo 2b, han expandido su localizacin. En la actualidad estas enzimas pueden tambin encuadrarse, como veremos posteriormente, dentro de los grupos 1
-

CEP-N -(cefamicinasas) (40,45,192,236,435,445,577,611), 2d

-

CLX-Y

(oxacilinasas de
-

espectro ampliado) (211,313), 2e CEP-Y -(oxiiminocefalosporinasas plasmidicas) (590,596) y 3 MET-N (carbapenemasas plasmidicas relacionadas con las metaloenzimas) (25,595). Si las primeras BIPEA (2b) se encontraban dentro de la clase molecular A de la clasificacin de Ambler, cada una de estas nuevas posibilidades se enniarca dentro del resto de las clases establecidas: las
-

carbapenemasas en la clase B, las cefamicinasas en la clase C y las oxacilinasas de espectro 8

Introduccin

ampliado, recientemente caracterizadas, en la clase molecular D (z ). Una ltima posibilidad, esbozada como hiptesis por Bush (89) y no incluida en este esquema, es la sntesis de enzimas que, derivando de B-lactamasas del grupo 2b, demuestran resistencia a los inhibidores de B-lactamasas, cido clavulnico, sulbactam y tazobactam (66,569,584). Esta situacin obligara a la estructuracin de nuevos grupos o a una definicin mas flexible de los grupos ya existentes.

2.- il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. 2.1.- Aproximadn conceptual. Las 8-lactamasas plasmdicas de espectro ampliado DIPEA son un grupo de nuevas enzimas de codificacin plasmdica derivadas de otras B-lactamasas bien conocidas y ampliamente diseminadas entre las bacterias patgenas que, adems de afectar a los antibiticos 8-lactmicos
-

clsicos, hidrolizan los 8-lactmicos de Y generacin incorporados al arsenal teraputico a partir de 1980 cefotaxima, cefiazidima y aztreonam (89,252,253,438). Recientemente esta definicin se
-

ha ampliado, incluyndose aquellas enzimas de codificacin plasmdica que hidrolizan metoxi-Blactmicos cefoxitina (252,441) y carbapenems imipenem y meropenem (252,310) y aquellas que demuestran resistencia a los inhibidores de 8-lactamasas cido clavulnico, sulbactam y tazobactam (66,569,584). Estas enzimas constituyen, una vez ms, la demostracin del proceso adaptativo de las
-

bacterias para contrarrestar el efecto de los antibiticos B-lactmicos sintetizados por el hombre y sucesivamente introducidos en la prctica clnica. 2.2.- Caractersticas hioquimicas y genticas. Bush y Sykes en 1986 (96) y posteriormente Bush en 1989 (se) marcaron el camino a seguir para la caracterizacin de las B-lactamasas. El amplio nmero de enzimas descritas determina que el estudio de nuevas 8-lactaniasas debe ser especialmente cuidadoso con el fin de obtener una adecuada individualizacin. Es necesaria la aplicacin de diversas tcnicas que nos proporcionen informacin de las caractersticas fsicas del enzima y de los aspectos inniunolgicos, cinticos y genticos caractersticos de cada B-lactamasa. Asimismo, es interesante conocer, entre otras propiedades, el carcter inducible o constitutivo de su sntesis o la codificacin por plsmidos O por el cromosoma bacteriano Entre las caractersticas fsicas el peso molecular y, sobre todo, el punto isoelctrico (pI) son las de mayor relevancia. El primero de ellos, poco utilizado en la actualidad, aunque til cuando 9

Introduccin

Su determinacin es laboriosa por cuanto requiere el ensayo de diversas concentraciones de antibitico. Apane de estos valores, es frecuente la determinacin del perfil de
hidrlisis (V,~/Km).

inhibicin, o respuesta de las f3-lactamasas a compuestos que inhiben su actividad hidrolitica. Los resultados se expresan utilizando la ~Ci, constante de equilibrio, o la l~<>, concentracin de inhibidor requerida para inhibir al 50% la actividad enzimtica. Debido al incremento del nmero y clases de BIPEA descritas, adems de los inhibidores suicidas, cido clavulnico, sulbactam y tazobactam, es necesario el ensayo de otros inhibidores: quelantes de iones metlicos, modificadoresde aminocidos (pCMB), cloruro sdico, e incluso antibiticos de baja respuesta hidrolitica (cloxacilina, cefoxitina, moxalactam, aztreonam)(96). El mtodo basado en la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn, especficamente diseado por Papanicolaou y Medeiros (434) para el estudio de las BIPEA, parece de mayor utilidad. Esta tcnica emplea extractos crudos sonicados sin purificar, exigiendo la presencia de una nica 8-lactamasa. Cada enzima presenta un perfil de inhibicin caracterstico para cada substrato o inhibidor, que se utilizan a una concentracin fija determinada. El perfil de inhibicin, el porcentaje mximo de inhibicin y el valor de la pendiente o incremento negativo de la inhibicin, se correlaciona a juicio de los autores, con el pl y la secuencia de aminocidos, reflejando alteraciones en la configuracin del centro activo. RIPEA inducibles, el ensayo de induccin debe ser incluido ya que algunas de las BIPEA descritas derivan de cefaiosporinas cromosmicas (40,45,236,
Aunque por el momento no existen

carcter de inducibilidad es un parmetro diferenciador. La induccin puede cuantificarse por espectrofotometra despus de hacer crecer los microorganismos en presencia de substratos B-lactmicos o por la tcnica del doble disco (503,507).
435,445,577) para las que el

La utilizacin de antisueros tuvo cierta relevancia en la identificacin de 8-lactamasas (484) y en la diferenciaciacin de enzimas pertenecientes a la misma clase (363). Sin embargo, la obtencin de 5-lactamasas altamente purificadas y la separacin de antisueros especficos limita su posible utilidad en el campo de las BIPEA. Mencin aparte merecen los mtodos genticos utilizados en la caracterizacin de las 8lactamasas, y en panicular de las BIPEA, ya que junto a la determinacin del pI, estudio cintico y perfil de sensibilidad, se han convenido en la piedra angular para la diferenciacin de estas enzimas. En este sentido, las sondas de ADN, las tcnicas de oligotipado y la secuenciacin de nucletidos y aminocidos han supuesto un avance relevante tanto para la identificacin de las BIPEA como para su caracterizacin. 11

Introduccin

ADN marcadas con radioistopos o acopladas a reacciones enzimticas hibridan con el ADN extrado de las cepas objeto de estudio, pennitiendo la localizacin cromosmica o plasmidica del gen productor de la 8-lactamasa (268,567). Asimismo, la hibridacin con colonias lisadas previamente Qiibridacin en colonia) detecta rpidamente la presencia de alguna enzima concreta (242). En 1990, Mabilat y Courvalin (322), utilizando sondas de tan solo 17
La sondas de nucletidos, describieron la tcnica del oligotipado, que facilita la deteccin de mutaciones puntuales

un nico aminocido en la secuencia de la protena. El empleo de este mtodo en combinacin con las modernas tcnicas de ingeniera gentica, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)(42) y de la ligasa (LCR)(3o), facilitarn en un futuro la caracterizacin y clasificacin de las BIPEA.
o cambios de

2.3.- Clasificacin de las 8-lactamasas plasmdicas de npectro ampliado. Inicialmente, las IIIPEA recibieron denominaciones que hacan referencia a su origen (TEM, 51-1V), fenotipo de resistencia (CTX, CAZ, FUR) o al lugar, hospital o pas donde fueron descubiertas (RMH, MGH, MIR), numerndose correlativamente por orden de aparicin o descripcin en el tiempo. Con posterioridad, se pudo comprobar que un mismo enzima habla recibido denominaciones diferentes. Los primeros esquemas de clasificacin de las BIPEA no se publicaron hasta 1991 (252,438), ocho aos despus de que Shah y Stille (523) y Knothe y cols. (280) describieran en Alemania un fenotipo nuevo y transferible en Enrerobacteriaceae que conferfa resistencia a cefalosporinas de 3a generacin y monobactmicos. Estas primeras clasificaciones, publicadas por Payne y Ainyes (438) y Jacoby y Medeiros (252) ya incluan, aunque en grupos pocos definidos, las BIPEA que confieren resistencia a cefamicinas y a carbapenems. Payne y Amyes (438) basndose en los datos de hidrlisis (V,~) o eficiencia relativa de hidrlisis Ynn~m) de la cefotaxima y ceftazidima establecieron 4 grupos que recogan las BIPEA descritas hasta la fecha de su publicacin. El mnaPQi comprende aquellas enzimas con baja eficiencia de hidrlisis para la ceftazidima y cefotaxima. En la mayora de las ocasiones la hidrlisis de esta ltima es ms eficiente, si bien, la menor capacidad de penetracin en el espacio periplsmico de la ceftazidima (410), determina un valor de CMI superior al de la cefotaxima (251). Representantes de este grupo serian TEM-E1, E2 (CAZ-3), E4 y CAZ-lo (TEM-11). El ~ que recoge las 8-lactamasas TEM-E4, 6, 9, 10, CAZ-7 (TEM-16) y CAZ-hi, est formado por aquellas enzimas que poseen una mayor eficiencia hidrolitica para la ceftazidima que para la cefotaxima, obtenindose unos valores de CMI para la ceftazidima de 32 a 128 veces ms altos que para la cefotaxima (251,438). Por el contrario, el naDQ.i comprende aquellas Il-lactamasas que hidrolizan ms eficientemente cefotaxima que ceftazidima, subdividindose, en funcin de su origen 12

Introduccin

gentico en tres subgrupos. El subgrupo 3a deriva de TEM-1 y TEM-2; TEM-3, 4, 5, CAZ-2 (TEM-8) y CAZ-6 (TEM-24), el subgrupo 3b incluye las enzimas derivadas de SHV-1; SHV-2, 3, 4, y 5 y el subgrupo 3c FEC-1 y DJP-1 de origen desconocido, que en la actualidad se relacionan con las 8-lactamasas cromosmicas de K. oxytoca (355,440).
-

Por ltimo, Payne y Aniyes (438), establecieron una cuarta clase, IJJDQA~ con un nico representante, BIL-l, que define las il-lactaniasas que confieren resistencia a las cefalosporinas de 3 generacin y, a diferencia de las anteriores, no son inhibidas por el cido clavulnico. En este grupo, se albergaran las enzimas plasmidicas CMY-I,2 (40,45), MIR-1 (435), MOX-l
(236),

LAT-I

(577) y FOX-l (92) relacionadas con las 8-lactamasas cromosmicas de la clase 1 de Rydimond y Sykes (485) que confieren resistencia a las cefaniicinas y se denominan genricamente cefamicinasas La aplicacin de tcnicas genticas de hibridacin y el anlisis de la secuencia nucleotidica. permiti obtener, pese a sus limitaciones metodolgicas, una valiosa informacin en el conocimiento de las distintas familias de enzimas y sus relaciones epidemiolgicas (322). Aplicando estos criterios, Jacoby y Medeiros (252) revisan las BIPEA y establecen grupos segn el origen de las mismas y su fenotipo de resistencia: derivadas de TEM, derivadas de SHV, aquellas que confieren resistencia a las cefamicinas y las metaloenzimas plasmidicas que confieren resistencia a los carbapenems. Paniendo de estos grupos y con el conocimiento actual podemos establecer una nueva clasificacin, utilizando como criterios diferenciadores las clases moleculares de Ambler (s) y el fenotipo de resistencia (TABLA 2). En este sentido, diferenciaramos 4 grupos de BIPEA referidos a las 4 clases de 13-lactamasas conocidas, A, B, C y 13 cada una de ellas con un espectro hidrolftico panicular (8,59,240,260,429). Las BIPEA de clase A hidrolizan oxiimino-B-lactmicos y constituyen el grupo ms numeroso con ms de 50 enzimas caracterizadas; las de clase B, metaloenzimas con actividad carbapenemasa; las
-,

de clase C o cefamicinasas, relacionadas con AmpC y las de clase D u oxacilinasas de espectro ampliado, recientemente identificadas (zi ).

13

Introduccin

TABLA 2.-

Clasificacin de las 8-lactamasas plasmidicas de espectro ampliado.

1- lactamasa

Microorganismo

Psis de origen

Mo

pI

CMI fn/aH CAZ AIX ctx

Referencia

1.

IlPEA de CLASE A:

la. OXIIKXNO.-flIACTAJ<ASAS. TSEderivadas. Pr anc la

Francia Francia 1984a 6.3 5.9 5.55 5.9

TD<3 TYM4 TEN5 TEN6

<crx>
(CAZ1)

L. preumonlee
E. cali 1. pneumoniae

64
32 128 128 64 32

IDE?
TEN8 TEN9

E. ccli CX fl-eundii <TEfl201> E. ccli

<CAZ2> (RENl) Y. pneumoniae 1. pneumoniae Y. pneumoniae

196Ta
1987c 1988v 1 988v 1989c

Alemania
Francia Francia

5.41 5.41
5.9

64
64 128

Francia
Inglaterra

195Ta
1987v

6,0
5.5 5,57 5.5 5.55 5,6 5,7 5.25

16 16 8 64 2 1 8 8

TENlO

Y. pnsumoniae <MGH1) 1. pneumcniae (TENE3) E. cloacae <31<51) Y. pneumoniae TENli (CAZlo) Y. pneumcniae TEN-12 E. ccli (TENlOl> E. ccli <YOU2) Y. pneumoniae IDEls 1<. morganii TEJE-14 1. pneumoniae TENlS Y. pneumoniae TEN-16 Y. pneuaoniae (CAZ?) Y. pneuzoniae TEN-17 Y. pneumoniae TENlB Y. pneuaoniae TEN 19 E. ccli TEN 20 Y. pneuacniae TENU Y. pneumoniae TEN- 22 Y. pneuacnie TEN2 3 E. ccli TEN2 4 <cAz6) x. pn.umonThe Y. pnetiWoflit TEN- 26 <you r. pneumoniae TENEl E. ccli TENE2 Y. oxytoca CCAZ3) Y. pneumoriiae TEN-E 4 E. zarcescens CAZE Y. pnetiftoniae CAZId Y. pneuabniP MRK1 Y. pneumoniae CTX2 E. a.bandak en Y. pneumoniae *71 E. cloaca. un Y. pneumoniat en E. ccli un Y. pneumoniae Y. pntuaoniat ST, un Y. pneusoniae en Y. pneuuoniae en F. aira,bili, en F. mirabilia un Y. pneuaoniae un Y. prwutOnit Sn P. mirahiIis

EEUU
EEUU Inglaterra EEUU Blgica EEUU EEUU

1988v
196ta

64
512 128 R 4

128 32
64 32 0.2 0.2 0,2 8

1989v
1991v 1 989v 1987v

32 32 4 1 0.5 0.06 1 4 2 1 2 1 0.06 0,06 0,06 0.5

80
437 450 42 206

206
324 533 552

472
253 443 578

590
599 206 481 322 322 322 322 131 322 322 322 53 53

s
b
b
b Francia b

1988v 1988a 1 990a 1990v 1 990v 1990v 1 qEsa 1990v

1990c

5.3
5.2 5,6 6.3

4 4 64

6.0
6.3

6.3 5.9 6.3

5.4 5.4 6.4 6.3 5.58 6.5 tse 5.57 5.4 5.3 5.3 5.6

256

64

b
Tnez Tnez Francia Francia

1990v
1986a 1 988a

1952c
1992v 19 88a 1989a 19 88a

2 E 32

1
4 256 64 128 R 32

4
8 6

128
512 R 256 32 32 16 16 R 32 R

4
8

18 585
129

Erancia
EEUU EEUU

401
481
442

Blgica
Inglaterra

196Ta
1982a 198 7 a 19 8 7 a 1992v 1989v 1990v 1990a 198k fl86a 19ESa 19 ESa 193Ra 1987 a 1992v 19BBc 1992v 1991v 1989v 1992c 1992v

0.1
1 1 1 8

Francia
Blgica Francia It igl va EEUU

1 0.1 0.2 0.1 Si 0.2

444
533

438
287

5.6
6.5

5.4
5.3 5.2 5.75.9

5
1

3
8

Francia
EEUU

4
>64 16 R R R R

590 470 467

541 115 364 364

>64

SO.5
0,5

Inglaterra
EEUU EEUU EEUU EEUU EEUU

5.1
5.2 5.35

7
5,95 5.8 >5,3

5 3 3 3

3 3 3 3
0,5 >512 128

364
364 5.73 115

E
32 >1024 128 >128

Inglaterra
Francia

Argentina Argentina Pranv 1 a Francia

5.4
6,0 6.4

157 489
105

330
32 256 16 158

6.4

14

Introduccin

TABLA 2.-

(Continuacin).
Pata de CMI (iac/mI) Afio pI CAZ A~ CTX FOX IMP Referencia

8lactama*a 1w

Microorganismo

origen

UPU de CLASE A: Y. Y. Y. Y. Y.

a. OflININOILACTMASAS. 8EVderivado. Alemania Pranvia Francia Chile Francia 1983a 1986a 1987a 1987a 1991v 7.6 6.98 7.75 8.2 7.6 32 32 128 128 32 32 32 256 256 4 64 64 64 8 0.5 2 4 4 4 2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 279 406 85 205 17

SEV2 SHV3 SEV4(cAZ5> SHVS(CAZ4) SHV6

ozaenas pneumoriiae pneuaoniae pneumoniae pneumoniae

Ib.- OXIIMINOCEFALOSPORXNASAS FPN1 FECl KM NENl P. E. Y. E. mirabiIis coi~ pneuaonie ccli .Iapdn .Iapdn Suecia Francia 1986a 1968v 1987a iQEga 7.2 8.2 5.25 8,4 0.39 25 0.5 32 200 >16 25 200 1 28 6,2 4 0.1 <0.2 0.5 596 355 613 60

Iv. No diferenciadas (sin caracterizar definitivamente) NJl N12 en FUR en D3P1 CTXM2 CTXN Y. C. Y. Y. Y. Y. Y. S. Y. oxytcca aaalonaticus pneumcniae pneumoniae pneuaoniae pn.irncniae pneuboniae typhiaurium pneuroniae Francia Francia EEUU EEUU Blgica EEUU India Argentina Alemania 1988v 5,35 <0,5 1988c 5,55 1988a 6.86,9 198k 7,07,8 3 1989a 7.5 16 1988a 7,65 E 1990c 7,9 1991v 7.9 32 1989a 8,9 4 3 16 R 4 64 3 2 3 4 128 3 4 3 4 3 0.2 3 143 143 364 364 590 364 440 39 41

d. Derivadas de TB4 con resistencia a inhibidores de Blavtamasas. TRIl TRI2 TRC1 TRT3 un E. E. E. E. E. coli cok voli coli coil Francia Francia Escocia Eapatia Francia 1989a 5,2 iSEqa 5,2 1992v 5.25 1992a 5.4 1992v 5.25,5 1993v 0.12 0.12 0,25 0.06 0,03 0,03 0.03 0,03 0,03 0,03 32/2k 0.06 64/2 0,03 32/16 64/32 R 584 584 569 66 79,535 225

II. BLPEA de CLASE E: en un

CAREAPflIASAS. Japdn Francia 1988a 9.0 >400 1990a 4.3S.l 3 128 >64 12.5 128 595 466

P. aeruginosa E. fragilis

III. 1PtA de CLASE C: CMY1 SIL: MIRl MDX: LAT1 FoX1 Y. Y. E. Y. Y. Y. 1.

C~AMICINASAS. Corea Sur Grecia Pakistn EEUU Japdn Grecia Argentina 1989v 8.0 4 1990v 8.1 128 1989a 8.8 64 IQBa 8.4 128 1991a 8.9 64 1993v 9,4 >128 ISSSa 6.87,2 16 16 64 64 128 32 64 64 32 16 64 512 >128 64 256 256 >64 >256 128 32 0.2 0,2 0.5 1 0.5 2 3 40 43.45 445.611 435 236 517 192

pneumoniae pneumoniae coIl pneumoniae pneumoniae pneuaonie pneumoniae

Xv. 21PtA de CLASE t OXACILTNASAS DE ESPECTRO AMPLIADO. OXAl .P. aeruginosa Turqua 1991a 6.4 1024 32 32 2 211
a: AMo de aislamiento; b: las cepas se aislaron en Francia. Blgica. In

2laterra, chile o Alemania. No se especfica el origen exacto; y: Aho de vomunicacidn; : origen animal; ~ CMI de amoxivilina/cido clavulnivo; e: mutante de laboratorio; ant sin nombrar;

CAZ: ceitazidima;

ATN: aztreonae;

CTX: cefotaxima;

FOX: cefoxitina;

IMP: imipenea;

15

Introduccin

2.3.1.- Dc clase A:

oxiimino-B-Iactamasas y oxiiminocefalosporinasas.

Constituyen en la actualidad el grupo ms amplio de BIPEA (TABLA 2). Hidrolizan penicilinas, cefalosporinas de ]t 2~ y 32 generacin y los antibiticos monobactmicos (94). No incluyen en su espectro a las cefamicinas, el moxalactam y los carbapenems y son inhibidas por los inhibidores de 8-lactamasas (451,453). Conforman, por su espectro hidrolitico y por ser eficazmente inhibidas por el cido clavulnico, el grupo 2b de la clasificacin de Bush de 1989 (90). En ocasiones, la presencia de estas BIPEA confiere un nivel de resistencia bajo con halos de inhibicin y concentraciones mnimas inhibitorias en el rango de lo clasificado como sensible por diversos organismos internacionales (398,399,400). No obstante, cierta prdida de sensibilidad a cefotaxima o ceftazidima, expresada por CMI entre 0,2 y 1 gg/m] y halos de inhibicin inferiores a 30 mm (discos de 30 ~g),la observacin en los antibiogramas de un halo de inhibicin ampliado para las cefalosporinas de Y generacin o monobactams frente a discos con inhibidores de filactamasas (prueba de doble difusin en disco) (259), y la sensibilidad a Il-lactmicos provistos de un grupo metoxi en C6 C7 y a carbapenems, facilitan su identificacin presuntiva (252).
Con la excepcin de TEM-12 que puede poseer localizacin cromosniica (599), las BIPEA estn codificadas por plsmidos de elevado tamao (40-300 Kb) (255), que determinan con
frecuencia, y de forma simultnea, resistencia a aminoglicsidos (101,451). En algunas ocasiones estas

enzimas estn codificadas por transposones (227,325) facilitando su diseminacin en diferentes replicones (263,532). Por el momento las BIPEA han sido identificadas solo en Enterobacieriaceae

y aunque es en el gnero Klebsiella y en E. cdi donde con ms profusin se han descrito; tambin se han caracterizado en Enterobacter, Citrobacter, Morganella, Serrario, Salmonella (252,451) e incluso y ms recientemente en el gnero Proteus (63,157,158,489).
(252),

Dentro

de ellos

de este grupo podemos establecer, atendiendo a su origen dos subgrupos; el primero oxiimino-B-lactamasas derivadas de TEM-1, TEM-2 y SHV-1, y el segundo, las
-

relacionadas con las oxiiminocefa]osporinasas de P. vulgaris y las 8-lactamasas de K. oxyroca. Las oximino-fi-lactamasas derivan por mutacin de las bien conocidas TEM-1 y TEM-2

y SHV-l. Un pequeo cambio en la secuencia aminoacidica, que no afecta a ms de 5 aminocidos

(252,322),

no solo determina importantes variaciones en el perfil de substrato y en la afinidad del

(94,438),

enzima, ampliando el espectro hidrolitico

sino que tambin incide en las caractersticas de

la protena, obtenindose en general una actividad especfica menor (89,94) y un pI diferente (zsz).

Hasta la fecha se han identificado ms de 40 enzimas derivadas de TEM (TABLA 2), poseen un 16

Introduccin

pI cido que oscila entre 5,1 y 6,5, agrupndose fundamentalmente en torno a 5,4, 5,55 y 5,9. La

Usa relativa de hidrlisis de la mayora de estas enzimas es mayor para cefotaxima que para ceftazidima (94), sin embargo las CMI muestran con frecuencia una relacin inversa, probablemente por la mejor penetracin de la cefotaxima en el espacio periplsmico (410). Las enzimas derivadas de SHV-I conforman un grupo ms reducido, habindose diferenciado hasta el momento 5 8lactamasas con pI alcalinos que oscilan entre 6,9 y 8,2. Su eficiencia hidrolftica es mayor para
cefotaxima (438) y, con la excepcin de SHV-6, comparativamente con las derivadas de mM, muestran unas CMI ms elevadas para ceftazidima, aztreonanl y cefotaxima (TABLA 2).

El segundo grupo de BIPEA de clase A esta constituido por las oxilminocefalosporinasas plasmdicas relacionadas con las 8-lactamasas cromosmicas de P. vulgaris subgrupo 2e de Bush (91) y de K. oxy:oca subgrupo 2b de Bush (90). Las primeras comprenden las enzimas FEC-1 (355) y FPM-I
(5%),

que hidrolizan eficazmente, al igual que las cefuroximasas de 1. vulgaris

(9.231,378,5o3,ss), la cefuroxima y cefotaxima y en menor medida la cefrizoxima y ceftazidima. Son inactivadas por el cido clavulnico e imipenem pero no por la cloxacilina o el aztreonam. La

enzima FEC-l, de origen animal, posee un pl de 8,2 y un peso molecular de 48 Kd siendo algo
inferior el de PPM-1, pl de 7,2 y peso molecular de 26 Cd. Es de resaltar que esta ltima se caracteriz en una cepa de P. mirabilis, especie en donde son escasas las BIPEA descritas
(63457,158,489).

Aparentemente, ambas enzimas se expresan de forma constitutiva y la frecuencia de

conjugacin es relativamente elevada; 4,9 x 10~6 a 2,5 x

101

Recientemente, se han caracterizado dos enzimas, MEN-l (6<>) y KH (612,613), que aunque con diferentes pI, 8.4 y 5,25, se relacionan con las 8-lactaniasas cromosmicas de K. oxytoca. La enzima MEN-1 posee un perfil hidroltico cefotaximasa y un fenotipo de resistencia similar al generado por la hiperproduccin de la 8-lactamasa cromosmica de Klebsiella (478). Asimismo, su secuencia N-aminoterminal tiene una alta homologa con la 8-lactaniasa de K. oxyoca (15,480). Por otra parte, la enzima CH, muestra una actividad hidrolftica elevada para la cefuroxima, cefotaxima

y aztreonam, similar a la encontrada para la Kl de K. o.xytoca (90,93,155,265,337). Se ha descrito un fenotipo idntico en cepas de esta misma especie con 8-lactamasas croniosmicas de igual pI (478). Con independencia de las oxiimino-8-lactamasas y oxiiminocefalosporinasas, existe un nmero relativamente importante de enzimas (QIPEA de clase A no diferenciadas) con un fenotipo de sensibilidad superponible al de estos dos grupos (TABLA 2). Hasta el momento no se dispone de suficientes datos de actividad hidroltica o no estn secuenciadas. Entre ellas se encuentran algunas que, por sus pl cidos, se relacionaran con las enzimas de tipo TEM; MJ-l, MJ-2 (143) y con algunas de las Il-lactamasas descritas en el gnero Klebsiella (3M). Por el contrario FUR (590),
17

Introduccin

CTX-M (40), CTX-M2 (39) y DJP-1 (440) poseen pi alcalinos que permitiran relacionarlas con las de tipo SHV. Los escasos datos de actividad hidrolitica disponibles las acercarla a las oxiiminocefa]osporinasas. Sern necesarios estudios de secuenciacin para su clasificacin definitiva. 2.3.2.- De clase B: carbapenemasas.
La descripcin inicial en Enerobacreriaceae de metaloenzimas de codificacin cromosmica capaces

de hidrolizar el imipenem

(619)

supuso una sorpresa relativa inferior a la que desat la descripcin

por Watanabe y cols. (595) en 1991 de una carbapenemasa transferible en P. <eruginosa. Supona la primera BIPEA que hidrolizaba imipenem y la primera BIPEA descrita en 1. aeruginosa. La alarma inicial ante lo que poda ser un hecho de marcada trascendencia clnica por la amplsima limitacin teraputica que determina y el carcter plasmdico que la distingue, ha sido relativizada por la ausencia de nuevos aislamiento con idnticas caractersticas. No obstante, recientemente y aunque no excesivamente documentado, se ha comunicado el aislamiento de 4 cepas de P. aeruginosa en Alemania con resistencia transferible al imipenem (243) y la aparicin en Inglaterra de la primera cepa de E. col con resistencia a este antibitico (78). Estos hallazgos estn adn por confirmar. La primera carbapenamasa plasmdica, descrita por Watanabe y cok. (595) en 1991, se caracteriz en Japn en 1988 en un aislamiento de 1. Qeruginosa. Tiene un pI de 9,0 y esta codificada por un plsmido del grupo de incompatibilidad P-9, que transfiere a P. aeruginosa pero no a E. cot. Confiere resistencia al imipenem (CMI 50 ~gIm])y meropenem (100 gg/m]), as como a la carbenicilina, ceftazidima, cefoperazona, cefsulodina y moxalactam (>400 gg/ml); por el contrario se muestra ms sensible a la piperacilina y el aztreonam (25 gglm]). No es inhibida por los inhibidores de B-lactamasas pero si por EDTA y pCMB. En estos dos dtimos casos la inhibicin revierte con la adicin de Zn2~ al medio, por lo que puede adscribirse al grupo de las metaloenzimas, siendo muy similar a otras enzimas previamente descritas en E. fragilis (620). Es de resaltar, que en esta ltima especie se han descrito tambin metaloenzimas transferibles que confieren resistencia a los carbapenems (25) cuando participa un elemento de insercin (466). 2.3.3.- De clase C: cefamicinasas. La incorporacin en plsmidos de genes cromosmicos que codifican il-lactamasas relacionadas con AmpC, que hidrolizan substratos 8-lactmicos con un grupo metoxi en la posicin 6 de penicilinas temocilina y 7 de cefalosporinas -cefamicinas y moxalactam ha determinado la aparicin de una nueva clasede BIPEA. Estas, a las que denominaremos cefamicinasas, en clara referencia a su perfil
-

18

Introduccin

hidrolitico, o 8-lactamasas plasmidicas de clase (adaptando la terminologa a la clasificacin de Rychmond y Sykes), constituyen las BIPEA de clase molecular C.

Las primeras descripciones de B-lactamasas cromosmicas de clase C codificadas por genes incorporados en plsmidos corresponden a las enzimas CEP-1 y CEP-2 (2n). La primera de ellas, considerada como una fi-lactamasas plasmdica de Clase 1 de E. col (69) no parece ser tal, ya que el plsmido supuestamente responsable, regulara nicamente la sntesis de la 8-lactamasa cromosmica sin producir enzima alguno. CEP-2, descrita inicialmente como cefalosporinasa (292), presenta un perfil hidrolitico ms amplio (90) y ha sido clasificada por Bush dentro del grupo 2b, 8-lactamasas de amplio espectro (90). Es en 1989 cuando Bauerfeind y cols. (40) describen por primera vez una BIPEA que hidroliza cefoxitina y otras cefamicinas. Esta il-lactamasa, CMY-1, de pI 8,0 fue caracterizada en una cepa de FC. pneumoniae aislada en Sel y posee similares caractersticas a la CMY-2, de pI 8,1, identificada en una cepa de K. pneumoniae aislada en Grecia (45). Ambas enzimas confieren resistencia a cefoxitina, cefotetan, cefmetazol y moxalactam, adems de todos los nuevos B-lactmicos con la excepcin de imipenem y meropenem. Solamente e] nivel de sensibilidad a la ceftazidima parecen diferenciarlas (TABLA 2). Los inhibidores de 8-lactaniasas retienen algo de actividad, dependiendo de la combinacin a considerar, hecho que las individualiza del testo de las cefaniicinasas descritas en las que los inhibidores se muestran ineficaces. Recientemente, ha quedado demostrado la elevada homologa de la enzima CMY-2 con AmpC de C. freundii
(43).

Las enzimas BIL-1 (445) y MIR-]

pneumoniae

(435)

caracterizadas, respectivamente, en E. cot y K.

y consideradas como prototipos de las fl-lactamasas plasnildicas de clase 1(441), poseen

un fenotipo de resistencia que incluye las amino y carboxipenicilinas, las cefalosporinas de 12 2 y 3 generacin y asociaciones de 8-lactmicos e inhibidores de 8-lactamasas, escapando nicamente los carbapenems a su accin hidroltica. La enzima BIL-1, dep1 8,8 se caracteriz en Inglaterra en una cepa de E. coil de un paciente procedente de Pakistn, tratado previamente con cefotaxima y amicacina (611). Tiene un perfil de substrato, eficiencia relativa de hidrlisis y perfil de inhibicin similar al de la 8-lactamasa cromosmica de E. cloocae (us). La enzima MIR-1 constituye una excepcin desde el punto de vista epidemiolgico al ser la nica cefamicinasa implicada en una epidemia o brote nosocomial (435). Se identific en cepas de FC. pneumoniae aisladas en Providence (EEUU) entre septiembre de 1988 y junio de 1989. Procedan de 11 pacientes en su mayora quirrgicos tratados con cefalosporinas de V generacin o cefoxitina con una hospitalizacin prolongada. La secuenciacin de un fragmento de 150 pares de bases del gen responsable de la sntesis de la enzima MIR-l demostr una gran homologa (>90%) con ampCde E. cloacae. Este gen se alberga en plsmidos transferibles de un tamao relativamente grande, 40-60 kb, con
19

Introduccin

diferentes perfiles de restriccin aunque pertenecientes todos al mismo grupo de incompatibilidad

N. Este hecho, indicarla un posible origen comn y posterior dispersin entre las diferentes cepas de FC. pneumoniae. Muy similar a estas 5-lactamasas es la enzima MOX-1 (236) identificada en 1991 en una cepa de FC. pneumoniae en Japn. Confiere, al igual que MIR-1, mayor grado de resistencia al moxalactam que al resto de las cefamicinasas y su pI, 8,9, es muy cercano al de la BIL-1. Su expresin, como la de sus predecesoras se realiza de forma constitutiva. A diferencia de ellas, parece estar relacionada con la 8-lactamasa cromosmica de P. aeruginosa ya que el gen bloMox no hibrida con arnpC de E. col! y su regin N-amino terminal posee una alta homologa con AmpC de 1. ceruginosa
(315).

En contraposicin a las anteriores cefamicinasas, cuyos genes responsables se albergan en plsmnidos transferibles (40,45,236,435,445), se encuentra la B-lactaniasa LAT-1 (577). Esta enzima, identificada en una cepa de FC. pneumoniae aislada en Grecia, se alberga en un plsmido de pequeo tamao (5,3 MDa) no transferible pero que se moviliza a travs de otro plsmido de la misma cepa de mayor tamao (72 MDa) y que, curiosamente, sintetiza la enzima SHV-5. El fenotipo de resistencia y su perfil de substrato (577) es similar al de las 8-lactamasas cromosmicas de clase 1, aunque no existe reaccin positiva a] hibridar con una sonda intragnica del gen ampC de E. ctoacae. Por ltimo, la enzima FOX-l, identificada en una cepa de 1< pneumoniae aislada en 1989 en Argentina (91) y caracterizada por Gonzlez-Leiza (92) en nuestro laboratorio, posee dos variantes moleculares con diferente pI, 6,8 y 7,2, pero con idntico perfil de substrato, similar al de las cefalosporinasas de clase 1
(503).

Esta enzima, que tambin confiere resistencia a cefoxitina

(91), presenta una homologa en la secuencia de nucletidos del 43% con ampC de Serrata y 49% con el de 1>. aeruginosa (>92). 2.3.4.- De clase 1): oxacilinasas de espectro ampliado. Un alto nivel de resistencia a la ceftazidima (512 gg/ml) en comparacin con la cefotaxima (64 ~gIml) y la resistencia a penicilinas, aztreonam y meropenem, pero no al imipenem, permiti la deteccin e identificacin de una nueva B-lactamasa OXA-] 1 en una cepa de P. aeruginosa de origen clnico (21 Aislada en Turqua en 1991 de un hemocultivo, presenta un plsmido transferible a 7. aeruginosa pero no a E. col! que codifica una B-lactamasa de expresin constitutiva dep1 6,4. Este valor es cercano a las BIPEA derivadas de TEM pero a diferencia de ellas el enzima
).

20

Introduccin

se comporta como una potente oxacilinasa. La secuenciacin del gen que la codifica permiti establecer una estrecha relacin de esta con la PSE-2 (OXA-lO), diferencindose en tan solo 2

aminocidos. Asimismo, el promotor est muy distanciado del habitual en su ancestro y es parecido a] de Pse udomonas pulida. La reciente caracterizacin de esta oxacilinasa de espectro ampliado, BIPEA de clase D ha permitido completar el esquema, unindose a las ya descritas BIPEA de clase A, B y C. La existencia de este fenotipo parece ser un problema local en Turqua (211) por lo que su trascendencia clnica es menor que la de otras BIPEA. 2.3.5.- 0-lactamasas plasmdicas de tipo TEM con resistencia a inhibidores de 8-lactamasas.
Dentro de las RIPEA es posible considerar a aquellas enzimas, caracterizadas hasta la fecha

iinicamente en E. cot, que confieren resistencia a ]os inhibidores de fl-]actamasas (cido clavulnico, sulbactani y tazobactam) y que al igual que las oxiindno-B-lactamasas derivan por mutacin de TEM1 (66.584). Sin embargo, a diferencia de las IIIPEA derivadas de TEM, no confieren resistencia a las cefalosporinas de Y generacin e incluso las cepas de E. ccli que las albergan tienen la particularidad de ser ms sensibles a la cefazolina que las cepas que codifican la propia TEM-l (su). Su presencia fue anticipada en hiptesis por Bush en 1989 (89) y confirmada ese mismo alio en mutantes in vitro por Oliphant y Struhl (424). Posteriormente Manavathu y cois. (332,333,3M) y Delaire y cok. (141) obtuvieron mutantes con similares caractersticas, confirmando que era suficiente la modificacin de un solo aminocido en la secuencia de la 8-lactamasa TEM-l para obtener una prdida de actividad de los inhibidores de 8-lactamasa. Los primeros ejemplos clnicos se obtuvieron en dos cepas de E. col! aisladas en Francia en 1991 por Belaaouaj y cols. (48) caracterizndose dos 8-lactamasas distintas, TRI-l y TRJ-2, ambas con un pl de 5,2, en donde la arginina de la posicin 241 se substitua por cisteina y serma, respectivamente (49,584). Este caso no parece ser una situacin aislada ya que recientemente se ha comprobado que la incidencia de este tipo de cepas procedentes de infecciones urinarias es elevada tanto en el medio hospitalario (14,7%) presentando una mayor variedad de enzimas en cuanto a sus pI, 5,2, 5,3, 5,4 y 5,5 (79.535). Asimismo, en Escocia Thomson y Amyes (569) identificaron en E. col! una 8-lactamasa dep1 5,25 (TRC-1) resistente al cido clavulnico y otros inhibidores de B-lactamasas que al ser expuesta a concentraciones de 512 pg/nii de anioxicilina revierte la mutacin
como en el extrahospitalario
(25,1%)

(ns),

a TEM-1 (570). Es de resaltar que estos mismo autores obtienen la misma 8-lactamasa TRC-1 al exponer una cepa de E. col! con una TEM-1 a concentraciones subinhibitorias de

21

Introduccin

amoxicilina/clavulnico (su). De nuevo se corrobora la aparicin de nuevas 8-lactamasas por la presin selectiva ejercida por los antibiticos 5-lactmicos. En Espaa, la primera cepa de estas caractersticas se obtuvo en 1992 de un paciente con infeccin urinaria adquirida en la comunidad y que habla sido tratado durante dos semanas cori amoxicilina/cido clavulnico (s). En este caso, la 8-lactamasa implicada IRT-3, posea una doble mutacin: metionina de la posicin 67 por isoleucina (cambio responsable de la resistencia a los inhibidores) y metionina de Ja posicin 180 por treonina, siendo el pl igual a] de TEM-1 (66). La denominacin de esta 8-lactamasa como IRT (inhibitors-resistant TEM 8-lactamases) corrige la denominacin anterior TRI (TEM-resistant to 8-lactamase inhibitors) (584) ya que exista una publicacin previa de una 8-lactamasa TRI que hace referencia a la resistencia a ceftriaxona (71). Por el momento no existen ejemplos clnicos de enzimas derivadas de SHV con resistencia a inhibidores de 8-lactaniasas. Sin embargo, esta posibilidad no est lejos de ser una realidad, ya
que Bonomoy cok.

obtuvieron mutantes de la enzima 01410-1, 13-lactamasa de amplio espectro relacionada filogenticamente con las de tipo 514V (529), con resistencia al cido clavulnico,
(71)

sulbactam y tazobactam.

3.- BASES GEN?ETICAS Y MOLECULARES DE LAS il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. 3.1. Alteraciones de la secuencia-base.
Las bases genticas de las BIPEA se han ido dilucidando progresivamente. Poco despus del hallazgo

de SHV-2 y TEM-3 (CTX-l) se demostr por tcnicas de hibridacin que ambas enzimas derivaban, respectivamente, de SHV-l y TEM-2 (279,548). Son suficientes pequeas modificaciones en la secuencia nucleotidica para producir cambios importantes en las caractersticas enzimticas de la filactamasa. Un cambio en un solo aminocido en la posicin 236, glicina por serma, en la secuencia de SHV-1 determina la aparicin de la enzima SHV-2 y 2 mutaciones a partir de la secuencia de TEM-2, lisina por glutmico en la posicin 102 y serma por glicina en la posicin 236, la BIPEA
TEM-3.

Estos cambios aminoacidicos no solo afectan al pI del enzima, sino que tambin influyen en
la estructura terciaria del mismo y por lo tanto en el acceso de los substratos a su centro activo. En

consecuencia, varian las propiedades cinticas del enzima: perfiles de substrato e inhibicin y 22

Introduccin

eficiencia hidrolitica (94.288,551). Aunque esta demostracin constituy un hallazgo de capital importancia supuso una sorpresa relativa. En 1976 Hall y Knowles (210) por seleccin qumica con N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina obtuvieron un mutante de TEM-1 con mayor eficiencia hidrolitica sobre la cefalosporina C. Aos ms tarde, Healey (ni) demostr que se trataba de un mutante que posea un residuo de alanina en la posicin 237. Asimismo, Sigal y cok. (530) y Dalbadie-McFarland y cok. (38) obtuvieron en 1982 mutantes relacionados con las Il-lactamasas de tipo TEM que afectaban directamente al centro activo. La demostracin fehaciente de que estas il-lactamasas derivan de otras enzimas conocidas estuvo determinada por la seleccin in vitro de mutantes con idnticas caractersticas a las BIPEA y obtencin de estas mismas enzimas por mutagnesis dirigida. En este sentido, en 1985 Kliebe y cok. (279) obtuvieron enzimas derivadas de SHV-l con idnticas caractersticas que SHV-2 y Payne
y cok. en 1989 (443) obtuvieron, partiendo de cepas de E. cot con TEM-l, en medios selectivos

con ceftazidima (0,7 ~gIml),mutantes resistentes a este antibitico. Estos tenan 8-lactamasas dep1 5,3 y 5,41 con caractersticas cinticas y un perfil de resistencia coincidente con BIPEA ya descritas (438,442,444). Con respecto a la mutagnesis dirigida, son diversos los trabajos que confirman esta hiptesis; Schultz y Richards (519) modificaron la posicin 69, adyacente al centro activo de serma de la enzima TEM-l y Healey y cois. (ni) la posicin 235. SougakofT y cok. (547) abordaron en 1988 la construccin de enzimas con modificaciones dobles; lisina por glutamina en la posicin 102 y serma por glicina en la posicin 236 de TEM-1. Ms recientemente, Sowek y cols.
(55!)

Blzquez y Baquero (65) partiendo de TEM-1 y conociendo la secuencia de diversas J3IPEA han reproducido por mutagnesis dirigida las enzimas de origen clnico. Hasta el momento se conoce, total o parcialmente, la secuencia de 20 BIPEA de tipo TEM y 4 derivadas de SHV [Tabla 3, la numeracin de los residuos aminocidos se ha realizado siguiendo el esquema de SutclifTe para la TEM-l(55s)]. En el anlisis de su secuencia se observa que tan slo unas pocas posiciones, 8 en las derivadas de TEM y 3 en las de tipo SHV, se ven afectadas. Adems, los cambios en cada posicin se producen por un aminocido concreto, con la nica excepcin de la arginina en la posicin 162 que puede ser substituida por serma o histidina. De no ser as, las posibilidades serian infinitas y numerosas las 8-lactamasas. Esta posibilidad queda, sin duda, limitada por la estabilidad de la propia molcula y la viabilidad a nivel de seleccin (65,551). TEM-12,17,19 y SHV-2 tienen una sola mutacin; TEM-6,7,lO,13,15,18,23,26, SHV-3 y 5, dos cambios aminoacidicos; TEM-4,8,9 y 14, tres y TEM-24, cuatro mutaciones (TABLA 3).

23

Introduccin

TABLA 3.- Base molecular de las 8-lactamasas plasmidicas de espectro ampliado: TEM y SHV.

Referencia TEH-1 TE>l2 TEM3 TEM4 TEM5 TEM6 TE$7 TEH8 TEW9 TENlO TENIi TEM12 TEN13 TEN14 TENlS TEH16 TEN17 TENlB TEM19 TEH23 TEM24 TEM26
SHVl SMV2 S1{V3 SI4V4 SNV5

5.4 5,6 6.3 5.9 5.55 5.9 5,41 5,9 5.5 5.57 5,7 5.25 5.6 6.3 6,0 6,3 5,9 6,3 5,4 5,58 6.5 5,58
7.6 7,6 6,98 7,75 8,2

Leu

Gin 14s 1.ys

Glu 14s Lys Lys

Arg

Gn

Ala

Gly Ser Ser

Glu

Thr

PIte 14s Lys Phe 14; Lys Lys 1.75 Li; Li;

I4et 1.ys

14s Lys

Ser His Ser Ser Ser Ser lii; Ser

Thr

Ser Het 1.7; 7 Ser Ser Net Het

Lys 14; Lys Lys Li; Li. Lys

isp

lii;

Ser Ser Ser Ser

Arg Arg Leu Leu

mr

Li; Li;

558 33 548 323 549 323 111 324 323 289 323 323 323 323 323 323,129 323 323 323 585 129 401 34 31 406 446 62

GUi

Ala

Gui Ser Ser Ser Ser

Glu

Le,a

Lys Li;

a: los residuos asinoacId~co se numeran segn lo establecido por Sutcliffe (5581 para la enzima TEMl. La numeracin de las enzimas de tipo 511V es similar pero con dos unidades ms.

La enzima TEM-1 difiere de TEM-2 en tan solo un aminocido (9); mediante un cambio en la posicin 37, lisina por glutamina, que no confiere incremento en los valores de CMI de la ceftazidima y cefotaxima (251). Teniendo en cuenta esta substitucin, 9 de las BIPEA poseen este cambio y podra postularse que derivan de TEM-2 (TEM-3,7,8, 11,13,14,16,18 y 24), mientras que el resto derivaran de TEM-1 (TEM-4,5,6,9, 10,12,15,17,19,23 y 26). El hecho de que existan tantas IIIPEA derivadas de TEM-2, pese a la baja incidencia de sta (363,w7), podra estar en relacin con la mayor eficacia del promotor de TEM-2 (547) que determinara una mayor capacidad de seleccin de las BIPEA derivadas de TEM-2. La substitucin de la metionina por treonina en la posicin 261 no afecta el espectro hidrolftico; por ello TEM-13, que presenta esta substitucin, adems de la lisina por glutamina en la posicin 37, posee unas caractersticas similares a TEM-2 (322). Esta circunstancia explicara que esta 8-lactamasa se halla detectado solamente en una cepa de M.

24

Introduccin

morganii (3zz) e, incluso, que alguna de las enzimas de pI 5,6 identificadas como TEM-2 se trate realmente de TEM-13, en alguna cepa concreta. Los dos cambios anteriormente referidos en las posiciones 37 y 261 no afectan a las caractersticas fenotipicas del enzima a no ser que se acompaen de otras substituciones en otro lugar de la protena (65). Este hecho queda, asimismo, demostrado al comparar la secuencia aminoacidica de TEM-3 y TEM-4; ambas presentan cambios en los residuos 102 (lisina por glutamina) y 236 (serma por glicina) (547,549), diferencindose tan solo en la substitucin que tiene TEMA en la posicin 261 (metionina por treonina) y TEM-3 en la posicin 37 (lisina porglutamina). Su fenotipo de resistencia es comn (251) y presentan similares caractersticas cinticas (94,437). Adems TEM-4 (549), al igual que TEM-9 (322), presenta una substitucin criptica en la posicin 19 (fenilalanina por leucina) que corresponde a la regin del pptido lder lejos del centro activo de la enzima, y que es segregado en el proceso de exportacin de la protena al periplasma (453). El anlisis de los diferentes residuos por SougakolTy toEs.
(547)

y Collatz y toEs

(iii)

y los

trabajos de mutagnesis de Sowek y toEs. (ss) han demostrado que el cambio a nivel de las posiciones 102 y 162 afectan a la hidrlisis de la ceftazidima y los monobactmicos (547,551), mientras que la substitucin del aminocido 236 a la de cefotaxima (547). Es por ello que las enzimas con modificaciones en los residuos 102 162 y 236, TEM-3,4 y 8 muestran valores de CMI elevados para ambos antibiticos. Las substituciones en la posicin 102 sin modificaciones en el aminocido 236, como sucede en las enzimas TEM-6 y TEM-26, confieren mayor resistencia a la ceftazidima que a la cefotaxima. Por el contrario, los cambios en el residuo 236 en ausencia de modificaciones en la posicin 102 afectan en mayor medida a la CMI de la cefotaxima; ejemplos de ello son las enzimas derivadas de SHV-l (239,290) que presentan unos valores de CMI algo ms elevados para la cefotaxima que los de la ceftazidima (TABLAS 2 y 3). La numeracin de los distintos residuos aminoacidicos se ha efectuado tomando como referencia el orden establecido por Sutcliffe para TEM-1 (sss), por lo que las posiciones reales de las enzimas de tipo SHV son la indicadas con dos unidades ms (TABLA 3). SHV-2 presenta una nica substitucin en la posicin 236 (glicina por serma) (31), si bien en algunos trabajos se han encontrado otras modificaciones en las posiciones 31 (glutamina por leucina) (iso) y 17 (triptfano por leucina) (463), esta ltima en el pptido lder, que no afectan a la actividad enzimtica. SHV-3 (406), SHV-4 (446) y SHV-5 (62) se diferencian de sta slo en las posiciones 203 y 237 (TABLA 3). Huletsky y cok. (239) comprobaron que era necesario el cambio simultneo de las posiciones 236 y 237 (SHV-4 y SHV-5) para incrementar la hidrlisis de la ceftazidima.

25

Iwroduccin

Muy diferentes son las circunstancias que afectan a las BIPEA que derivan de TEM-1 y confieren resistencia a los inhibidores de 8-lactamasas. Por el momento se ha demostrado en cepas de origen clnico que los cambios en las posiciones 241, arginina por serma o cisteina (49,584), y 67, metionina por isoleucina (66), son importantes para la accin de los inhibidores de il-lactamasas. La substitucin, por mutagnesis dirigida, de la arginina 241 por lisina, aminocido anlogo, no afecta las caractersticas cinticas de la TEM-1 (48,332,333.334). Por el contrario, cambios realizados con la misma tcnica de la metionina 67, por vaina, leucina o isoleucina, interfieren en la accin de los inhibidores de 8-lactamnasas (41.424). Esta ltima posicin es anterior a] centro activo del enzima (serma 68) por lo que se ha postulado que sta sea la causa de la prdida de afinidad de los inhibidores de 8-lactamasas. El cido clavulnico pierde ms su actividad inhibidora que el sulbactam o el tazobactam; por otra parte la actividad del enzima sobre otros substratos B-lactmicos, incluyendo cefalosporinas de 3 generacin, podra mantenerse o, incluso disminuir (66,141). Asimismo, estudios in vitro realizados con 13-lactamasas relacionadas con las 8-lactamasas de tipo 514V confirman estos hallazgos (71). Mahilat y Courvalin en 1990 (322) anticiparon que la modificacin de la secuencia protica no sera una exclusiva de las oxiimino-B-lactamasas sino que con toda seguridad emergeran variantes en otras enzimas plasmidicas, como las oxacilinasas (grupo 2d de Bush) y carbenicilinasas (grupo 2c), que ampliaran el espectro bidrolitico. En este sentido, la OXA-1 1 que pertenece a la clase molecular D es consecuencia de dos substituciones a partir de la PSE-2 (OXA-lO), serma por asparagina en la posicin 143 y asprtico por glicina en el residuo 157 (z). Con ello, se modifican las caractersticas cinticas del enzima y elevan los valores de CMI, en panicular el de ceftazidima. Por otra parte, y aunque no se trate de cepas clnicas sino de variantes de laboratorio obtenidos por mutagnesis, Bejaqui y Levesque (47) modificaron la secuencia de la carbenicilinasa bIac.,~4. La doble substitucin, serma por arginina en la posicin 234 y serma por glicina en la posicin 238 altera las caractersticas cinticas y eleva la resistencia a la ceftazidima. Esta posibilidad tendra un impacto clnico importante por tratarse CARB-4 de un enzima comnmente encontrada en P. aeruginoso (363,607). Por otra parte, Payne (438) obtuvo in vitro mutantes de la carbenicilinasa PSE-4 (CARB-1) que incrementan el valor de la CMI de la ceftazidima. Finalmente, las cefanxicinasas surgen a partir de la integracin de genes de tipo ampC en plsmidos y aunque las secuencias estudiadas, MIR-1 (435), CMY-2 (43) y MOX-1 (236), se relacionan con ampC de E. cloacae, C. freundil y P. aeruginosa, la homologa no es total. Una de estas cefamicinasas, FOX-1, secuenciada en su totalidad por Gonzlez-Leiza (90) demuestra tan

26

Introduccin

slo una homologa de su secuencia nucleotidica del 43% con ampC de Serraa y 49% con el de 7. aerug!nosa. 3.2. Configuracin estructural de la protena. Las enzimas TEM-1 y 514V-! poseen entre si un 68% de similitud en su secuencia aminoacidica (34.558), presentando un centro activo de serma en las posiciones 68 y 66, respectivamente. Al igual que la 5-lactamasa PCI de 5. aureus y la del Badillus ltchen~form!s pertenecen a la clase A de la clasificacin de Asnbler (s) con una zona altamente conservada en los aminocidos que se sitan, en su estructura terciaria, en las inmediaciones del centro activo (228,267.557). Las modernas tcnicas de cristalizacin y el anlisis de la estructura tridimensional (281,551) han permitido establecer hiptesis y visualizar las interacciones que se desarrollan en el centro activo entre los diferentes residuos de la protena y el substrato y las consecuencias de las mutaciones o substituciones aminoacidicas. Tomando como referencia las 8-lactamasas PCi de 5. aureus (zzs) y TEM-I de E. col! (557) las posiciones 102, 162, 235, 236 y 237 se sitan espacialmente en las proximidades del centro activo. El aumento del espectro hidroltico est determinado por la substitucin de estos residuos. Sin embargo, al ser generalmente un cambio por aminocidos de mayor volumen o diferente carga, con frecuencia se produce un descenso en la eficiencia hidrolitica (ss). El modelo mejor conocido de las IIIPEA es el de las enzimas derivadas de TEM en las que se ha realizado un anlisis puntual de las diferentes substituciones. Asimismo, estudios recientes en substituciones realizadas sobre la il-lactamasa 01410-1(281), variante de SHV-l (529), y los trabajos de Lee (290) y Huletsky (239) en BIPEA de tipo SHV confirman los trabajos realizados con las SIPEA de tipo TEM. Un cambio en el residuo 236 (serma por glicina) permite la interaccin de la protena con el grupo oxima de las cefalosporinas y monobactmicos (239,288,453,551). Asimismo, se ha demostrado que la presencia de la usina en la posicin 102 de las BIPEA de tipo TEM en la posicin 237 en ambas familias, TEM y 514V, facilita la formacin de complejos con los grupos negativos de la cadena lateral de la ceftazidima (239,446). La interaccin electrosttica (enlace covalente) entre el grupo oxima de la ceftazidinia o el aztreonam puede ser establecida con cualquiera de los substituyentes de usina de las posiciones 102 6 237, gracias a la rotacin del grupo carboxilo de la cadena lateral de estos dos antibiticos. Por otra parte los puentes de hidrgeno entre el grupo oxima, nitrgeno u oxigeno, y el grupo amino del extremo de la lisina son tambin posibles, particularmente con la usina de la 27

Introduccin

posicin 102. Este enlace no covalente aumenta la cintica enzimtica, producindose con mayor facilidad en aquellos antibiticos que, como la cefotaxima, carecen de grupo carboxilo en su cadena lateral (551). Otras posiciones como la 162 (arginina) est altamente conservada entre las 8-lactamasas de clase A (267). Su substitucin por serma determina de una parte el alejamiento del residuo del centro activo (ss), pero por otra un mayor nmero de grupos hidroxilos libres que aumentan las posibilidades de unin a los substratos (iii). Por ello, su participacin en el ataque al antibitico 8lactmico no est del todo determinado. El anlisis tridimensional del resto de las BIPEA (clases B, C y D) es un camino a desarrollar. Sin duda el avance en las tcnicas de modelizacin y estudio de la realidad virtual harn posible la estructuracin de modelos aproximativos que prevean, incluso, las posibilidades y consecuencias de nuevas mutaciones y su interaccin con los antibiticos B-lactmicos. 3.3. Localizacin de los genes. El mismo ao en que Sbah y Stille describieran en Alemania
pneunioniae
(523)

las primeras cepas de K.

y E. coil con resistencia a cefotaxima y sensibilidad a cefoxitina, Knothe y cok. (280) documentaron la transferencia de este patrn a otras cepas de Ernerohacreriaceae, evidenciando que se trataba de un mecanismo de naturaleza plasmidica. Con la excepcin de TEM-12, enzima que tambin se ha localizado en el cromosoma bacteriano (599), todas las BIPEA son codificadas por plAsmidos, generalmente, de elevado tamao (40-300 Kb) (zss) y que determinan resistencia a mltiples antibiticos. Estos plsmidos pertenecen a unos pocos grupos de incompatibilidad M,C,FI y MU (6,255,437,449), pudindose encontrar una misma 8-lactamasa en diferentes replicones (63a96,252,255.473). Esta posibilidad y el estudio de una cepa de K. pneumoniae y otra de E. col! de un mismo paciente (532), ambas con idntica BIPEA
-

CAZ-7 (TEM-16) permiti constatar la hiptesis de que estos genes estuviesen integrados en transposones. En este caso, la cepa de 1<. pneumoniae tena un plsmido de 85 Kb del grupo de
-,

incompatibilidad Inc? M con genes de resistencia para la amicacina y gentamicina, mientras que la cepa de E. col! tena un plsmido con un tamao superior a 150 Kb del grupo Inc6 C que conferia resistencia a la amicacina pero no a gentamicina y tena integrado el gen bIOTEMI. Hibridaciones con diferentes sondas mostraron que el gen responsable de la sntesis de CAZ-7, los genes bIaTEMI, aacM y una secuencia de insercin se localizaban en un fragmento de 20 Kb comn

28

Introduccin

en ambos plsmidos (532). La transponibilidad fue confirmada al lograrse la transferencia recproca de los diferentes genes de resistencia entre los plsmidos de 85 y 150 Kb. Anteriormente, solo se haba documentado la presencia del gen blaflM.12 en un transposn de 4,8 Kb, presumiblemente idntico al Tn3 (Tn.4) (255). Con posterioridad Heritage y cok. (227) demostraron que este mismo gen poda tambin encontrarse en un transposn de 7 Kb (Tn841) relacionado con el Tnl que generalmente posee el gen blanM.2. Por su secuencia nucleotidica el gen blaTEM.12 parece haber evolucionado directamente a partir de blal-EM.1, que como se sabe, est generalmente asociado al Tn3 (55). Por otra parte, Jacoby y Sutton (255) en un amplio estudio con numerosas BIPEA (TEM3,4,5,6,7,8,9,12,26, MGH-1, SHV-2,3 y 4), algunas de ellas en diferentes replicones, no consiguieron demostrar la transponibilidad de las mismas. No obstante las secuencias vecinas de los genes responsables de las BIPEA TEM-3,4,6,7,8,9, y 12 contenan el gen tnpR que forma parte del transposn Tn3. Quedaba as constatado que al menos un gen de la maquinaria de transposicin estaba presente, desconocindose la ubicacin o funcionalidad del resto de los genes integrantes de este transposn. Mabilat y cok.
(325)

han confirmado, mediante estudios de hibridacin con sondas

especificas de los genes rnpA y tnpR (integrantes de transposones de tipo Tn3), nipA y mp! (integrantes de transposones del tipo Tn.21), aacA4 y de la secuencia de insercin IS 15, que algunas de las BIPEA de tipo TEM se asocian con transposones de tipo Tn3, si bien en algunos casos su estructura es incompleta. La deleccin en estas secuencias ha sido previamente documentada (20,145,226), perdindose con ello la capacidad de transposicin. Asimismo, Mabilat y toEs. (325) demostraron que el gen blalEM3, del plsmido pCFFO4, est localizado en una copia incompleta del Tnl interrumpido por secuencias relacionadas con transposones de la clase II (Tn3). Esta copia del Tnl est a su vez insertada en el gen de la transposasa de un transposn relacionado con el Tn2l que contiene adems un integrn que expresa el gen aacA4. Estos hallazgos, el que no siempre las enzimas TEM-1 TEM-2 sean transponibles (183) y, por otra parte, que an se discuta silos genes que codifican SHV-1 estn mediados o no por transposones, redundan en el bajo porcentaje de BIPEA caracterizadas en transposones. Indirectamente se podra deducir que la eficiencia del mecanismo de transposicin en la diseminacin de los genes de las BIPEA es relativamente baja. Como se ha dicho la mayor parte de las BIPEA estn asociadas a plsmidos pertenecientes a un nmero limitado de grupos de incompatibilidad (16, 255,437,449). Son estos plsmidos de carcter transferible (,plsmidos transferihles) los que facilitan 29

Introduccin

la diseminacin de los genes responsables de la codificacin de las BIPEA. En este sentido se ha responsabilizado a un mismo plsmido, identificado en diversas especies de Enzerobacieriaceae, de una o varias epidemias (67,4o1,48). Asimismo, son varias las ocasiones en las que se ha encontrado una misma BIPEA en distintas especies aisladas de un mismo paciente (16,532), indicando la posibilidad de transferencia in vivo y, con la excepcin de unos pocos casos (67,2s9,4o1,45), es relativamente fcil obtener transconjugantes in vitro (451). Una excepcin del tipo de plsmidos que vehiculizan las RIPEA lo constituye el pSLH52 que contiene el gen que codifica la enzima TEM-22 (a). Este plsmido posee un taniaflo de tan solo 15 kb, no transfiere por conjugacin y carece de otros genes de resistencia. A juicio de los autores este hecho condicion la nula dispersin de esta enzima en el hospital donde se encontr. El paso de un gen productor de una B-lactamasa cromosmica a un plsmido no es un hecho frecuente, aunque existen diversos ejemplos como el del gen blsHv o el de la 8-lactamasa CEP-2 (292). Las cefamicinasas, a diferencia de las oxiimino-B-lactamasas que se han generado por mutacin de otras enzimas ya existentes, provienen de la movilizacin e integracin de genes cromosmicos en plsmidos. Por el momento se desconoce el mecanismo por el cual se ha producido este proceso aunque es posible que se haya desarrollado a travs de la transposicin, sin excluir que adems haya tenido lugar alguna mutacin adicional. La mejor demostracin es la filactamasas MIRA, supuestamente generada por la adquisicin del gen ampC de E. cloacae por plsmidos del grupo N, unos conjugativos (Tra4) y otros no (Tra9 (435). El tamao de los plsmidos que albergan estas cefamicinasas es variable y oscilan entre las 180 kb de MOX-l y las de LAT-l (236,577). Todas las cefaniicinasas, excepto LAT-1 (577), se encuentran codificadas en plsmidos transferibles. La cefamicinasa LAT-1 se moviliza merced a la accin de otro plsmido
8 kb

de mayor tamao presente en la cepa salvaje y que circustancialmente codifica una BIPEA con un pl similar a SHV-5. Otros ejemplos de la integracin de genes productores de 8-lactamasas cromosmicas en plsmidos son las BIPEA relacionadas con las de K. arytoca: MEN-1 y KM (60,613), y 7. vulgaris: y FPM-1 (355,596). Los plsmidos en que se localizan son de variado tamao y no siempre fue posible obtener transconjugantes con idntico fenotipo de resistencia. El plsmido con la filactamasas KM no es conjugativo, transfirindose nicamente la resistencia por electroporacin (613).
FEC-l

La nica carbapenemasa de naturaleza plasmidica descrita en P. aeruginosa (595) se alberga en un plsmido de 31 MDa del grupo de incompatibilidad P-9 que no transfiere por conjugacin a cepas de E. col! pero si a 1. aeruginosa. Esta ausencia de transferencia a E. col! es compartida con 30

Introduccin

la OXA-il que est vehiculizada en un plsmido de 100 MDa y fue identificada en una cepa deP. aeruginosa
(211).

3.4. Genes de resistencia asociados. Los plsmidos que albergan los genes responsables de la codificacin de las BIPEA son generalmente de gran tamao, pudiendo coexistir con genes de resistencia a otros antimicrobianos (255,259,449,451, 532,341) y en ocasiones a metales pesados (255). El patrn de resistencia incluye: aminoglicsidos, tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y cloranfenicol. En numerosas ocasiones se puede encontrar ms de un marcador de resistencia junto a la BIPEA, lo que limita las opciones teraputicas en el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos con estas enzimas. El mecanismo de resistencia ms comnmente asociado a las BIPEA es la produccin de enzimas modificantes de aminoglicsidos, contransfiriendo con aquellas en la mayora de las ocasiones (66,451). Mediante estudios de hibridacin o anlisis enzimtico (perfil de substrato) se han caracterizado diversas enzimas modificantes de aminoglicsidos asociadas a las BIPEA: AAC(6)IV y AAC(3)I junto a TEM-3, TEM-16 (CAZ-7) y SHV-3 (6,406,449,532), con TEM-3 y SHV-2 (166,449), con TEM-4 y SHV-2 (66,437), AAC(3)V, AAC(6)I y
AAD(3)(9) AAC(3)II

APH(3)1 con SHV-2 (66) y AAC(3)V, AAC(6)I, ANT(2j, ANT(3) y APH(3)IV con una BIPEA de pI 5,4 identificada en una cepa de 1. mirabilis (489). Por este motivo, los fenotipos de resistencia a aminoglicsidos pueden ser diferentes pudiendo incluir resistencia a amicacina y/o gentamicina. La terapia combinada de cefalosporinas de

generacin y aminoglicsidos es uno de los factores ms importantes ligado a la diseminacin de estas B-lactamasas (539). En Francia se ha
3a

relacionado el hallazgo de BIPEA en asociacin con la enzima AAC(6)IV, que determina resistencia a amicacina, tobramicina, netilmicina y neomicina, con el consumo de amicacina ms cefotaxima o amicacina ms ceftazidima
(19,127,259,449).

Generalmente las cepas con RIPEA, particularmente oxiimino-I3-lactamasas, se aislan en enfermos ingresados en unidades de cuidados intensivos y servicios quirrgicos (27,451,538) por lo que se eleva la probabilidad de que presenten, simultneamente, otros mecanismos de resistencia no relacionados con los antibiticos Il-lactmicos. La codificacin de estos puede realizarse en el mismo plsmido, en otros diferentes, o directamente en el cromosoma bacteriano. La resistencia a quinolonas, tambin ha sido documentada en estas cepas en un porcentaje variable (9,128,285) que en ocasiones supera el 70% de los aislamientos
(28).

31

Introduccin

Otras BIPEA tambin se han asociado con la resistencia a otros antibiticos no 8-lactmicos: las cepas con las cefamicinasas CMY-1 y BIL-1 cotransfirieron la resistencia a tetraciclina y cloranfenicol (40,61 ), MIR-1 lo hizo para las tetraciclinas y los metales pesados (435) y MOX-1 nicamente para las tetraciclinas (236). En el caso particular de la CMY-l se constat, asimismo, la resistencia al sulfametoxazol y se caracteriz la enzima AAC(6)I tanto en la cepa salvaje como en los transconjugantes (40). Esta acetiltransferasa confiere resistencia a amicacina y tobramicina pero no a gentarnicina (82). Por otra parte, la carbapenemasa descrita en 7. aeruginosa cotransfiri la resistencia al imipenem junto con la de gentamicina y sulfamidas (595), siendo ms amplio el perfil de resistencia asociado a la nica oxacilinasa de amplio espectro descrita (OXA-1 1) que incluye cloranfenicol, sulfamidas, amicacina, tobramicina, gentamicina y metales pesados (211). Adems, esta ltima 8-lactamasa se caracteriz en una cepa de 7. aeruginosa resistente a la ciprofloxacina.

4.- EXPRESION DE LAS 0-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. 4.1.- Aspectos genticos. La expresin de las BLPEA se realiza de forma constitutiva, no habindose demostrado fenmenos de induccin o de hiperproduccin por desrepresin gentica. La hiperproduccin enzimtica descrita para TEM-1 (251) y SHV-1 (447) est, generalmente determinada por la presencia de numerosas copias de los plsmidos que las codifican, elevndose la cantidad de enzima. Bush surgiri en 1989 (89) la posibilidad de que las BIPEA estuviesen localizadas en plsmidos multicopia, sin embargo esta afirmacin queda cuestionada por el gran tamao de los plsmidos que las contienen (255). Por otra parte, la amplificacin de un gen productor de BIPEA solo ha sido evidenciada para SHV-3 (407). El perfil de restriccin plasmidico y la hibridacin con una sonda especfica para SHV-3 demostr la repeticin del gen blasHv3 en los transconjugantes obtenidos por seleccin con cefotaxima, en comparacin con los obtenidos al seleccionar con kanamicina. Asimismo, se constat un incremento de la CMI de cefotaxima (50 pg/ml frente a 0,5 pg/ml). Con independencia de estas dos cuestiones y a pesar de que alguna de las BIPEA descritas provengan de la incorporacin de genes cromosmicos responsables de la codificacin de enzimas inducibles (oxiiminocefalosporinasas relacionadas con 7. vulgaris y cefamicinasas relacionadas con las 8-lactamasas cromosmicas de clase 1) no se ha demostrado en ellas el carcter de
inducibilidad.

32

Introduccin

Un aspecto importante en la expresin de las 8-lactamasas es el relacionado con los promotores. Sougakofi y toEs. (549) demostraron, estudiando la secuencia de los promotores de RIPEA derivadas de TEM, que el promotor de bEOTEM4 y b)OTEM5 es similar al que presenta el transposn Tnl, responsable de la sntesis de la enzima TEM-2. En este caso existe un cambio en el nucletido 32 que determina, con respecto al Tn3 (que sintetiza blanMl) una duplicacin y solapamiento de su secuencia, hacindolo ms eficiente. Cha> y Clowes (35) demostraron que con ello se incrementa de seis a diez veces la produccin de la 8-lactamasa y elevan los valores de las
CMI para las cefalosporinas de 3a generacin. Similar situacin, demostrada por Mabilat y toEs.
(323),

acontece con la 8-lactamasa RHH-1 (TEM-9).

Con respecto a las 8-lactamasas derivadas de SHV-1 Podbielski y cois. (465) estudiaron una enzima con caractersticas bioqumicas y cinticas compatibles con SHV-2, que conferia un nivel superior de resistencia a cefotaxima al observado anteriormente; > 128 gg/rnl frente a 8-32 gg/ml (251). La secuencia nucleotidica de esta, a la que denominaron SMV-2a, evidenci un solo cambio en el residuo nmero 10 que no afectaba a las caractersticas del enzima. Un estudio posterior de sus promotores mostr diferencias entre ambas (464). La obtencin de transformantes que combinaban el promotor de SHV-2a y el gen estructural blasHv.2 elev la CMI de cefotaxima desde 8 ng/ml (en el transformante con el promotor de SHV-2 y blasHv2) a 64 gg/ml. Esta demostracin establece la posibilidad de recombinaciones entre 8-lactamasas y promotores especficos de otras. En este sentido, la nica oxacilinasa de espectro ampliado descrita, OXA-11 que se diferencia de su predecesora PSE-2 (OXA-lO) en tan solo dos aminocidos (211), presenta un promotor con mayor homologa con el de Pseudomonas pulida que con el de la PSE-2 encontrada en E. col!. Por ltimo, Goussard y cok.
(97),

mediante la amplificacin y secuenciacin del gen

estructural blaTEME y su promotor, hallaron una regin relacionada con la secuencia de insercin 151 del promotor (13) del gen NaTEM.1 incluida en el promotor de TEM-6 a la que denominaron ISI-like. La presencia de esta secuencia de insercin contribua a elevar la resistencia mediada por TEM-6 y otras 8-lactamasas derivadas de TEM. El aumento del nivel de la resistencia por la participacin de secuencias de insercin ha sido tambin evidenciado en las carbapenemasas transferibles encontrandas en B. fragilis en Francia ya que la resistencia al imipenem solo se manifiesta si estn presentes dichas secuencias (466). 4.2.- Aspectos bioqumicos. Con independencia de los cambios que se producen en el pI, las mutaciones en la secuencia molecular de las il-lactamasas de tipo TEM y 5MW modifican la estructura terciaria de la protena,
33

Introduccin

alterando el centro activo y las uniones con el antibitico B-Iactmico. Estas modificaciones ocasionan cambios en la afinidad del enzima por el substrato (1%,) y la velocidad o tasa de hidrlisis (vr) (348,551). A diferencia de las enzimas plasmdicas clsicas, las BIPEA hidrolizan las cefalosporinas de Y generacin y los antibiticos monobactmicos con unas tasas relativas de hidrlisis elevadas slo comparables a las de algunas 8-lactamasas cromosmicas de K. oxytoca (9o,93,ss,265). Por el contrario, los valores de afinidad son ms bajos en comparacin con TEM-1,2 y SHV-1. Bush (89) las ha calificado como descendientes perezosos de sus predecesoras ya que presentan una menor actividad enzimtica y, en general, una perdida de afinidad por las amino-, carboxi- y acilureido-penicilinas (251). Corno contrapartida, las oxiimino-B-lactamasas poseen una mayor afinidad por los inhibidores de 8-lactamasas (89). perfil de inhibicin revela unos valores
El

de ~ para el cido clavulnico, sulbactam y tazobactam inferiores a los obtenidos con TEM-1/2 y SHV-1, siendo el cido clavulnico el inhibidor ms efectivo (94,288).
Las diferencias ms acusadas con TEM-1,2 y SHV-l se establecen a nivel de las cefalospori-

nas oxiimino substituidas cefuroxima, cefotaxima y ceftazidima que presentan una tasa de hidrlisis mayor (94,288). En funcin de este valor y de la eficiencia hidrolitica (V~~/1y) las J3IPEA se han diferenciado como cefotaximasas y ceftazidimasas (438). Las primeras hidrolizan preferentemente cefotaxima e incluyen, entre otras TEM-3,4, SHV-2,3,4 y 5. Por el contrario, las
-

cefiazidimasas, fundamentalmente TEM-6,9 y 10, poseen una tasa relativa de hidrlisis y eficiencia bidroltica ms alta para ceftazidima (V,~~=55~~0. Vmn/Km=6,kSS) que para cefotaxima (v~ =16-29, V,~/K,~=1,8.2O). En algunas ocasiones, como es el caso de TEM-12, estas modificaciones son muy bajas con respecto a los valores obtenidos para TEM-1/2 y (v,,..~ para cefotaxima o ceftazidima <0,1), producindose incrementos de tan solo 5 10 veces en la tasa de hidrlisis
SHV-1

Un aspecto relevante de las oxiimino-B-lactamasas es la no inactivacin de cefamicinas o carbapenems (94,288), hecho que las individualiza de las cefamicinasas y carbapenemasas. La nica carbapenemasa transferible, descrita por Watanabe (sss) en 7. aeruginosa, presenta una mayor afinidad por las cefalosporinas que por las penicilinas. No obstante, los estudios cinticos demostraron la hidrlisis de penicilinas, de todas las cefalosporinas, incluyendo las oxilinininocefalosporinas y las metoxi-substituidas, y del imipenem. El aztreonani fue el nico filactmico estudiado resistente a la accin hidroltica del enzima. La actividad hidrolitica no fue inhibida por el cido clavulnico pero si por EDTA, CuSO4 y HgCI2. En este ltimo caso, la 2~, demostrndose que se trataba de una metaloenzima. inhibicin es reversible con la adicin de Zn

34

Introduccin

Las cefamicinasas, M~-1, BIL-1, MOX-l y LAT-1 se caracterizan por conferir resistencia a los metoxi-B-lactmicos y conferir un perfil de resistencia similar a las cefalosporinas de clase 1 (441). Los valores de 150 y I(~ demuestran que BIL-l posee una alta afinidad por la cefuroxima, cefotaxima y ceftazidima, rasgo tpico de las enzimas de clase 1 (us). Por el contrario, MIR-1, an mostrando una alta homologa con AmpC de E. cloacae (435), tiene una baja afinidad por estas cefalosporinas (u). En el estudio de MIR-l, utilizando un mtodo microbiolgico, se demostr la inactivacin enzimtica de la cefoxitina (435). Por el contrario, en la caracterizacin bioqumica de BIL-1, al igual que con las cefalosporinasas de clase 1, la baja tasa de hidrlisis impidi detectar espectrofotomtricamente esta hidrlisis (us). El comportamiento de los inhibidores, 150 para el cido clavulnico, sulbactam y tazobactain, en ambas enzimas es muy similar, diferencindolas claramente de las oxiimino-B-lactamasas. LAT-l posee idnticas caractersticas que BIL-1, pero a diferencia de sta se ha constatado, aunque de forma muy lenta, la hidrlisis de cefoxitina (577). El perfil de substrato de MOX-1 es similar al de AmpC de 7. acruginosa, demostrndose en el estudio cintico una alta afinidad por el moxalactam con una eficiencia hidrolitica elevada (236). Por otra parte, la nica oxacilinasa de espectro ampliado descrita, OXA-l 1, hidroliza penicilinas y nuevas cefalosporinas pero no cefoxitina y carbapenems (21 Esta BIPEA presenta una usa de hidrlisis ms elevadas para las penicilina que para las cefalosporinas y, al igual que su predecesora PSE-2 (OXA-lO), hidroliza rpidamente la oxacilina. Aunque la hidrlisis de las
).

cefalosporinas es baja, la afinidad es alta (baja K,r) por lo que la eficiencia hidrolitica es elevada,

particularmente para la ceftazidima. Los inhibidores de B-lactamasas poseen cierta actividad residual que se incrementa con la incubacin prolongada de estos substratos con el enzima. 4.3.- Fenotipos de resistencia.
~l descubrimiento de las BIPEA (oxilmino-Il-lactamasas) fue posible gracias al anlisis de un

fenotipo de resistencia inusual dentro de las Enrerobacieriaceae: resistencia a las cefalosporinas de 32 generacin y la sensibilidad a cefoxitina (280,523). La introduccin de los monobactmicos y los carbapenems mostr que estas enzimas conferan tambin resistencia al aztreonam pero no al imipenem (80,279,5W. En la actualidad pueden diferenciarse otros 4 fenotipos asociados a la codificacin de I3IPEA: el conferido por las cefamicinasas, el de las nicas carbapenemasa y oxacilinasa de espectro ampliado descritas, y por ltimo, el de aquellas enzimas resistentes a la accin de los inhibidores de 8-lactaniasas pero sensibles a oxiiminocefalosporinas (TABLA 4).

35

Introduccin

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36

Introduccin

Las 8-lactamasas derivadas por mutacin de TEM-1,2 y SHV-l confieren resistencia a amino-, carboxi- y acilureidopenicilinas con un nivel similar al que se genera con sus predecesoras. Asimismo, se caracterizan por la resistencia que determinan a las cefalosporinas de 1a generacin, 2, excepto la cefoxitina, y 3, excepto el moxalactam (251,25$). Los inhibidores de 8-lactarnasas sinergizan con las penicilinas y cefalosporinas, disminuyendo el valor de la CMI a concentraciones consideradas como sensibles (398,399). Por otra parte, la sensibilidad a metoxi-penicilinas (temocilina)
y a carbapenems (imipenem y meropenem) permanece inalterada (251) (TABLA 4).

Este fenotipo general de las oxiimino-l3-lactamasas puede sufrir algunas modificaciones que dependen fundamentalmente de: 1) diferente nivel de expresin producido por una misma enzima en una especie determinada, 2) diferente nivel de expresin en las distintas especies de Enterobaceriaceae, 3) coexistencia con Il-lactamasas cromosmicas que enmascaran este patrn de resistencia y 4) coexistencia con otros mecanismos de resistencia a 8-lactmicos, fundamentalmente relacionados con la permeabilidad, que alteren la uniformidad del fenotipo de resistencia. Es posible realizar una diferenciacin fenotipica entre las BIPEA de tipo TEM y las derivadas de SHV-1 utilizando un amplio rango de concentraciones con las aminopenicilinas, ya que, en general, las derivadas de TEM presentan una CMI inferior a la ampicilina que las derivadas de SHV (1.000-4.000 gg/ml frente a 500-16.000 gg/ml) (251). Similar apreciacin, aunque con diferente nivel de CMI, es valida para las cefalosporinas de 1 y 2 generacin y cefalosporinas orales cefixima, ceftibuten y cefdinir ~g/m]frente a 1-256 gg/mi) (37,38,251,278). Con respecto a las cefalosporinas de 3 generacin pueden reflejarse distintos niveles de resistencia con
(0,25-32

una misma enzima (167,252,291,406) que en algunas ocasiones ofrecen valores de CMI inferiores a 1-2 pg/ml (TABLA 2), o halos de inhibicin con discos con carga estandar (30 pg) de 23-30 mm, valores que entran dentro de la categora de lo sensible establecido por algunos organismos internacionales (398,399). En general, los valores de CMI para la cefotaxima en las cepas que codifican enzimas TEM derivadas oscilan entre 0,06 y 8 vg/ml, excepto TEM-3 y TEM-4 que confieren un nivel ms alto (32 gg/nil) (TABLA 2). Para la ceftazidima y el aztreonam son ms elevados, observndose un amplio rango, 0,2-256 pg/m] (TABLAS 2 y 4). Por otra parte, de las cinco enzimas derivadas de SHV-I identificadas, todas, excepto SHV-6, ofrecen un fenotipo homogneo, obtenindose valores superiores a 16 gg/mJ para cefotaxima, ceftazidima y aztreonam (TABLA 2). Las discrepancias entre los valores de CMI de la cefotaxima y los de la ceftazidima y el aztreonam en las diferentes enzimas podran ser tiles en la diferenciacin fenotipica de estas 8-lactaniasas
37
(252).

Introduccin

Las BIPEA con resistencia a inhibidores de il-lactamasas derivadas de TEM-1 se caracterizan por la ausencia de sinergia entre el cido clavulnico, sulbactam o tazobactam con las penicilinas (48,66,s69,584). En este sentido las CMI de la asociacin amoxicilina/cido clavulnico (32/16-64/32 pg/mJ) son ms elevadas que las encontradas para TEM-1 (4/2-8/4 gg/ml) y slo comparables a la que se generan con la hiperproduccin de sta enzima (16/8-64/32 ig/ml) (254,339). Por el contrario, los valores de CMI de la ticarcilina (8-1024 gg/ml) y piperacilina (1-512 gg/m]) son inferiores a los encontrados para TEM-1 (>1024 y 256-> 1024 pg/ml, respectivamente). Asimismo, las CMI de la cefazolina (2 pg/rnl) son inferiores a las que se generan con la hiperproduccin de TEM-1 (>16 pg/ml) (432). Estas ltimas apreciaciones son menos patentes con la cefotaxima y la cefrazidima que a lo sumo reducen una dilucin el valor de la CMI para las IPEA resistentes a los inhibidores de 8-lactamasas (66,584). Con el grupo de las oxiimnocefalosporinasas no existen datos de sensibilidad completos para todas las enzimas descritas. Tanto las relacionadas con las 8-lactamasas cromosmicas de 7. vulgaris como las que tienen cierta homologa con las 8-lactamasas de K. orytoca presentan resistencia a penicilinas, cefalosporinas de 1 y 2 generacin, excepto cefoxitina. Estas enzimas, son inhibidas por el cido clavulnico y no confieren resistencia a los carbapenems (60,355,596,613). La induccin de la cefuroximasa clsica de 7. vulgaris eleva fundamentalmente las CMI de cefotaxima con una menor afectacin de la ceftazidima y el aztreonani (307,502). Este patrn se reproduce con las enzimas y FPM-1, Il-lactamasas relacionadas con las cromosmicas deP.
FEC-1

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(355,596).

Por el contrario, la hiperproduccin de la 8-lactamasa Kl, enzima cromosmica

(478,502),

de K. oxyroca, afecta en mayor grado al aztreonam

BIPEA

caracterstica que se identifica en las relacionadas con las 8-lactamasas de K. oxytoca - MEN-1 y KH - (60,613). La descripcin de Enrerobacreriaceae con un fenotipo transferible que se caracterizaba por

la resistencia simultnea a cefalosporinas de 3 generacin y cefoxitina con sensibilidad a os carbapenems hizo sospechar que haba surgido un nuevo tipo de IIIPEA (40). Denominadas cefamicinasas por la resistencia que confieren a las cefamicinas, su nombre correcto deberla ser metoxi-betalactamasas ya que, con la excepcin de CMY-2 y FOX-1 (4s,n), la resistencia es cruzada con los oxacefems (moxalactam) y las 6-metoxi-penicilinas (temocilina) (4o,4s,236,43s,445,577). El comportamiento de los inhibidores de 8-lactamasas frente a estas enzimas no es uniforme y slo se observa una reduccin discreta de la CMI de cefoxitina al asociar cido clavulnico, sulbactam o tazobactam en las cepas productoras de las enzimas CMY-1 y CMY-2 (40,45). Asimismo, el compuesto BRL-42715B, potente inhibidor de B-lactamasas tanto plasmidicas clsicas como cromosmicas de clase!, ha demostrado actividad inhibidora en aquellas cefamicinasas ensayadas, CMY-1,2 y FOX-1 (46,190). 38

Introduccin

El fenotipo de resistencia que confieren las cefamicinas es muy Cercano al que determinan las B-lactaniasas cromosmicas de clase la (Enrerobacrer y Citrobacter) y Id (7. aerugtnosa) de las que derivan, mimetizando a estas en su estado desreprimido (307,44 1,502). La cefpiroma y la cefepima son las oxiiminocefalosporinas con mayor actividad intrnseca, reproducindose el fenmeno que se observa con las 8-lactamasas cromosmicas de clase 1 en su estado desreprimido. Como dato diferenciador, con las cefamicinasas se alcanza un nivel ms elevado de resistencia a la cefoxitina y las amino-, carboxi- y acilureido-penicilinas. Por el momento no existen datos clnicos sobre la incorporacin del gen ampC de E. coil en plsmidos, si bien tal posibilidad entradentro de lo probable. Iacoby y Carreras (251) estudiaron la expresin de este gen integrado en un plsmido, evidenciando un fenotipo muy similar al conferido por la hiperproduccin de la 8-lactamasa cromosmica de E. coil: resistencia a la ampicilina, amoxicilina/clavulnico, cefalosporinas de 1 y 2 generacin, incluyendo las cefamicinas. La ceftazidima fue la cefalosporina de 32 generacin ms afectada y en menor grado cefotaxima y ceftriaxona, siendo la cefpiroma y la cefepima las que menos elevaron su CMI. Un escaln ms en el grado de resistencia a los antibiticos 8-lactmicos fue el hallazgo en Japn de la carbapenemasa transferible de 7. aeruginosa (595). Su perfil hidrolitico determina resistencia a todos los antibiticos B-lactmicos e inhibidores de 8-lactamasa. Unicamente el aztTeonanl escapa a la accin hidrolitica del enzima, obtenindoseunos valores de CMI categorizados como sensibles (25 gg/ml en la cepa origina] y 3,13 gg/ml en los transconjugantes). A diferencia de esta, la oxacilinasa de amplio espectro - OXA-1 1 -, identificada tambin en P. aerugnosa, es sensible al imipenem y el meropenem (211). El alto grado de afinidad de la OXA-Il por la ceftazidima confiere una elevada disminucin de la sensibilidad a este antibitico (512 gg/ml) en comparacin con la cefotaxima (64 gg/m]) (TABLA 4). 4.4.- Influencia de la permeabilidad. La deteccin fenotipica de microorganismos con BIPEA se ha visto, en ocasiones, favorecida por la presencia de estas enzimas en cepas con alteraciones en la membrana externa (205,433,599). Con ello se incrementan los valores intermedios de CMII de algunas cefalosporinas que, con relativa asiduidad, se manifiestan en estas cepas (259,451). Asimismo, se minimiza el efecto de su relativa baja actividad enzimtica y la prdida de afinidad por algunos de los substratos (s9). Los defectos de permeabilidad en la cepas con BIPEA ha sido documentado en alguna ocasin (89), particularmente en K. pneumoniae (18,237,433,582,599). Pangn y cols.(433) demostraron 39

Introduccin

que la disminucin cuantitativa de dos porinas fundamentales (40 y 41 kfla) en una cepa de K. pneumoniae con una IIIPEA, TEM-3, elevaba los valores de CMI de la ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, aztreonam (de 2-8 a 16-32 ftg/ml), cefoxitina (de 4 a 32 ng/ml) y la actividad de los inhibidores de 8-lactamasas. Este trabajo posee una doble importancia; la documentacin de: alteraciones en la membrana externa en una cepa productora de I3IPEA y la constatacin de la. seleccin iii vivo de estos mutantes ya que esta cepa de K. pnewnoniae se obtuvo tras el tratamiento con cefoxitina y gentamicina de un paciente con una neumona por K. pneumoniac productora de TEM-3. Asimismo, se ha determinado que la ausencia de estas dos porinas o el cambio de sus propiedades fisicoqumicas afecta tambin a la expresin de la enzima SHV-5, confirmndose en este caso la disminucin de la efectividad de los inhibidores de il-lactamasas
(205,582).

Por otra parte, se han documentado alteraciones ms acusadas de la permeabilidad en una cepa de E. col! con una BIPEA dep1 5,25 - TEM-12 (599). Esta cepa presentaba una ausencia total
-

de OmpF y reduccin del nmero de porinas de 39 (OnipC) y 37 kDa. La actividad de ceftazidima

disminuy drsticamente, elevndose la CMI desde 0,2 a 37 pg/m]. Tambin se redujo el efecto de los inhibidores de 8-lactamnasa. Estudios in vitro con introduccin de diferentes plsmidos que codifican BIPEA en cepas isognicas de E. col! con alteraciones en las porinas OmpF y OmpC demostraron estos hallazgos y confirmaron que no slo afectaba a la expresin de la mayora de las BIPEA derivadas de TEM-1, 2 y SHV-1, sino tambin a otras 8-lactamasas como MIR-1 (73). Por otra parte, se
(73,99,251)

observ que un solo cambio en una porina determinada no condiciona modificaciones uniformes para

todos los antibiticos B-lactmicos. Asimismo, se constat que los cambios de comportamiento estn en relacin con la BIPEA estudiada y que la ceftazidima era uno de los 5-lactmicos ms afectados, mientras que la cefproma y la cefepima conservaban mayor actividad intrnseca (73,99,251). La adquisicin de un mecanismo de resistencia secundario debido a alteraciones en la permeabilidad en cepas productoras de BIPEA parece un hecho probado (433). Recientemente en un trabajo multicntrico realizado en Francia (538) se ha observado un incremento notable de la resistencia a la cefoxitina en Enterobacteriaceae, particularmente en E. col! y K. pneumoniae, por
lo que el proceso inverso, adquisicin de BIPEA en cepas con modificaciones en sus porinas, es un

hecho probable.

40

Introduccin

5.- IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE LAS 13-LACTAMASAS PLASMTiDXCAS DE ESPECTRO AMPLIADO. La deteccin de las cepas productoras de BIPEA est, en ocasiones, dificultada por el bajo nivel de resistencia que confieren estas enzimas, determinando una categorizacin errnea de los datos de sensibilidad cuando se aplican criterios de organismos internacionales comunmente aceptados (398,399,400). Por otra parte, la baja actividad enzimtica, el tipo de microorganismo que las alberga y la posibilidad de que ste produzca otra u otras B-lactamasas puede comprometer an ms su identificacin y posterior caracterizacin. En una primera aproximacin el patrn o fenotipo de resistencia a antibiticos B-lactmicos
ser quien establezca la posible presencia de IIIPEA (TABLA 4). Este fenotipo deber incluir los

datos de sensibilidad a las cefalosporinas de Y generacin, monobactmicos y los carbapenems y podr determinarse bien utilizando los dimetros de los halos de inhibicin, en la tcnica de difusin por disco (398), o bien los valores de la (tcnica de dilucin en agar y microdilucin) (399). En algunas ocasiones, la produccin enzimtica o expresin de la 6-lactamasa es baja y el nivel de resistencia que se alcanza no es elevado de tal forma que los valores de CMI o halos de inhibicin
CMI

se encuentran en la categora de o sensible establecido por diferentes organismos internacionales (398,399,400). Esta circustancia puede mininiizarse estudiando simultneamente la sensibilidad a las distintas cefalosporinas de 3 generacin y a] aztreonam (259,453) o elevando el inculo bacteriano (482). No obstante, es necesario que los sistemas utilizados para el estudio de la sensibilidad, y en concreto los que determinan la CMI, tengan un amplio rango de concentraciones de tal forma que puedan detectar pequefias elevaciones en los valores de la CMI (168). En este sentido algunos sistemas automticos comerciales utilizan paneles con unas concentraciones que escapan a esta
consideracin, habindose constatado, dependiendo de las concentraciones empleadas, fa]los en la

identificacin de las cepas con BIPEA

(J68j72,428).

El estudio con inhibidores de 8-lactamasas es til para la deteccin de stas enzimas, en panicular las derivadas de TEM-l ,2 y SHV-1. La sinergia entre las cefalosporinas de 3 generacin
y monobactmicos con el cido clavulnico, sulbactani o tazobactam facilita su identificacin

presuntiva. Jarlier y cols.

(259)

describieron en

1988 una

tcnica sencilla, denominada de doble

difusin con discos, basada en esta propiedad. Este mtodo consiste en la realizacin de un antibiograma convencional situando un disco de anioxicilina/cido clavulnico (20/10 gg) a una
distancia de 30 mm de discos con carga estandard (30 gg) de cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona y aztreonam. La ampliacin del halo de inhibicin de estos ltimos en las proximidades del disco de an,oxicilina/cido clavulnico indica la presencia de una BIPEA. Este mtodo tiene algunas

41

introduccin

limitaciones ya que enzimas de codificacin cromosmicas como son la cefuroximas de 7. vulgaris y la enzima Kl de 1<. oxyroca, la hiperproduccin de B-lactamasas cromosmicas de Klebs!ella spp. y de la plsmdica SHV-l producen sinergia entre alguno de los discos de las cefalosporinas o el aztreonam y el cido clavulnico. Asimismo, no todas las BIPEA descritas son inhibidas por el cido clavulnico (252) y en las cepas de Enterobacreriaceae con 8-lactamasas cromosmicas de clase la, Enrerobacrer, Cirrobacrer, Morganella y Serrana, la presencia de las BIPEA puede quedar enmascarada por la desrepresin enzimtica de aquellas (observaciones personales).
Al igual que lo acontecido con el anlisis del fenotipo de resistencia, la utilizacin de las cefalosporinas de 3 generacin, el aztreonam y los carbapenems en la determinacin del perfil de substrato y parmetros cinticos (V,~, K~ y eficiencia hidrolitica) facilitan la identificacin de

las

BIPEA.

Los extractos bacterianos necesarios para su realizacin se obtienen generalmente por

sonicacin (96) y es condicin imprescindible la presencia de una nica enzima. La determinacin de los parmetros cinticos puede estar limitada por la lenta reaccin de alguna de estas J3IPEA con el nitrocefin (lis), pudiendo substituirse por la cefaloridina o la bencilpenicilina. Junto a estos valores, es recomendable establecer el perfil de inhibicin frente a inhibidores suicidas como el
cido clavulnico, sulbactam y tazobactam y compuestos quelantes como el EDTA (96). Asimismo,

la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin y la aplicacin de los algoritmos propuestos por Papanicolaou y Medeiros (434) permiten diferenciar las BIPEA de las Il-lactamasas cromosmicas de clase 1 y las plasmdicas de amplio espectro. Existen algunas tcnicas microbiolgicas que adems de detectar la presencia de Il-lactamasa pueden utilizarse de forma semicuantitativa para conocer el perfil de substrato siempre que el extracto contenga una sola enzima, por lo que han sido propuestas y aplicadas para el ensayo de las La primera de ellas, fue descrita por Masuda en 1976 (353) y utilizada por Papanicolaou y cola. para el estudio de la cefamicinasa MIR-1 (435). Con esta tcnica se observa la destruccin
BIPEA.

del antibitico 8-lactmico por medio de discos cargados con diferentes diluciones del extracto bacteriano que contiene el enzima y su influencia en la sensibilidad de un microorganismo testigo, generalmente Micrococcus lureus. McGhe (361) modific esta tcnica, empleando un cultivo en fase logartmica en vez del extracto enzimtico, aunque no se ha aplicado al estudio de las IIPEA.

El mtodo descrito por van de Klundert y cois. (sso) tiene un fundamento similar a las dos anteriores, inactivacin de un substrato y observacin con un microorganismo testigo. Ha sido utilizado con exito para las B-lactamasas de amplio espectro y podra ser de utilidad en el ensayo de las BIPEA. Este mtodo incorpora un extracto enzimtico en el agar y utiliza Bacillus subrilis como

42

Introduccin

testigo de la inactivacin enzimtica. Sobre el agar se depositan discos de antibitico, cuantificando la inactivacin por la disminucin de los halos de inhibicin. Recientemente, Mackenzie y Ferris (329) han desarrollado un sistema de cribado para detectar cepas de K. pneumon!ae productoras de BIPEA. Esta tcnica se realiza utilizando diluciones seriadas de antibitico (ceftazidima) en agar Mueller-Hinton con un substrato de metilumbeliferil-BD-glucurnido (0,07 mg/mi). El crecimiento de una cepa de E. col! sobre estas placas produce la hidrlisis del substrato provocando fluorescencia cuando se ilumina con luz ultravioleta. Por el contrario el desarrollo de una cepa de K. pneumonie no genera fluorescencia al no bidrolizarse el substrato. La inoculacin simultnea de las placas en superficie con una cepa de E. col! y en boton con diferentes cepas de K. pneunzon!ae determina que por debajo de la CMI de la cepa de E. col! no se inhiba la induccin de la fluorescencia. Sin embargo, cuando una cepa de K. pneumon!ae produce una BIPEA facilita el satelitismo de la cepa de E. col! a su alrededor. Esta, hidrolizar el substrato y producir un anillo de fluorescencia entorno al botn de depsito. Thomson y cois.
(572)

comunican en 1984 la utilidad del mtodo de sensibilidad en tres

dimensiones para el estudio de la inactivacin enzimtica de los antibiticos il-lactmicos. Con posterioridad Thomson y Sanders (573) modificaron y aplicaron esta tcnica a la deteccin y ensayo de las BIPEA (oxiimino-B-lactaniasas y cefamicinasas). Bsicamente, el mtodo es una modificacin de la difusin por disco (398) y utiliza un inculo bacteriano (109~lOO UFC/ml) que se deposita en

una hendidura rea]izada en el agar a 3 mm de donde se depositan los discos de antibitico. La superficie del agar se inocula previamente con un inculo estandar del mismo microorganismo (mtodo directo) o con un microrganismo testigo, E. col! ATCC
25922

(mtodo indirecto). Con este

sistema se consigue una informacin simultnea de la sensibilidad antibitica y del perfil de

substrato, facilitando la identificacin de 8-lactamasas y en concreto de las de espectro ampliado. Desde que Matthew y cols. (358) introdujeran en 1975 la tcnica del isoelectroenfoque en el ensayo de las B-lactamasas han sido descritas y diferenciadas un gran nmero de enzimas (90.91). La coincidencia dep1 de varias enzimas ha limitado su uso para individualizar las BIPEA. En unin con otros parmetros o datos de sensibilidad es til para la caracterizacin de estas enzimas. Algunas modificaciones sencillas de esta tcnica renuevan su utilidad: la visualizacin de las il-lactamasas aplicando una solucin de nitrocefin con un inhibidor de 8-lactamasas, cefoxitina o una cefalosporina

de 3 generacin (88.435,510) pueden facilitar la identificacin de estas enzimas. Otra modificacin establecida por Bauerfeind y cois. (41) consiste en, una vez realizado el enfoque, depositar sobre el gel de isoelectroenfoque una capa fina de agar Mueller-Hinton con cefotaxima (1 pg/niJ). Tras dos horas de incubacin a 35 0C se inocula la superficie del agar con un cultivo de E. col! ATCC 43

Introduccin 25922 (CMI de cefotaxima 0,06-0,25 ~gIm])e incuba nuevamente a 35 0C durante 18 Ii. Si el enzima hidroliza la cefotaxima se producir crecimiento exclusivamente sobre la banda que contiene: la BIPEA. Esta tcnica permite adems identificar qu enzima es responsable de la hidrlisis en un extracto que posea ms de una 8-lactamasa (574). Una modificacin del isoelectroenfoque es la realizacin de las denominadas curvas de titulacin (ss), que se fundamentan en la obtencin de curvas sigmoidales diferenciadas al desarrollar la electroforesis perpendicularmente al gradiente de pH. Su utilizacin puede ser resolutiva en la separacin de enzimas con igual pl, circustancia posible tanto entre las BIPEA como entre stas y las de amplio espectro (252,495). Asimismo, se ha empleado la electrodillisis a partir de los geles de isoelectroenfoque para separar BIPEA de otras enzimas con pl cercanos (444). La separacin rpida de proteinas por cromatografla liquida (FPLC) (o) es otra tcnica de diferenciacin utilizada en el estudio de las BIPEA, que permiti la identificacin y separacin de la BIPEA IMP-! de pI 7,9 de otras dos enzimas presentes en la misma cepa de Al pneumon!ae. La aplicacin de la tcnologa gentica y en concreto la utilizacin de las sondas de ADN y el oligotipado ha supuesto un avance importante en la identificacin y caracterizacin de las BIPEA. Mabilat y Courvalin (322) utilizaron la hibridacin en colonia con oligonucletidos de tan solo 17 nucletidos con 265 aislamientos de Enrerobacrer!aceae que presentaban sinergia entre los inhibidores de IIIPEA y las cefalosporinas de V generacin. Con este estudio lograron indentificar 7 nuevas BIPEA (TEM-13,14,15,16,17,I8, y 19) e invidualizar estas y otras I3IPEA en cepas que presentaban ms de una enzima. Por otra parte, las tcnicas de biologa molecular han permitido establecer relaciones filogenticas entre las BIPEA y sus ancestros, particularmente en las resultantes de la integracin de 3-lactamasas cromosmicas en plsmidos (cefamicinasas y BIPEA relacionadas con enzimas cromosmicas de 7. vulgaris y K. oxyroca). Asimismo, el uso de esta tecnologa ha facilitado la caracterizacin de las diferentes clases de IIIPEA amplios (242,324).
(21 i)

y la realizacin de estudios epidemiolgicos

44

Introduccin

6.- EPIDEMIOLOGA DE LAS 8-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. Las primeras cepas de K. pneurnon!ae y E. col! con BIPEA (oxiimino-B-Iactamasas) se describieron en Alemania en 1983 por Shah y StiIle (523). Ese mismo alo y tambin en Alemania, Knothe y cok. (280) documentan la transferencia de la resistencia plasmidica a cefotaxima en K. pneumon!ae y S. marcescens. En 1985, Kliebe y cok. (279) caracterizan en una cepa de Klebsiella ozaenae del mismo origen que las anteriores, una nueva il-lactamasas a la que denominaron SHV-2 por su relacion con la enzima SHV-1. Breve tiempo despus y de manera casi simultnea, se describen en Francia dos brotes epidmicos causados por Enrerobacreriaceae, fundamentalmente K. pnewnoniae, con elevado nivel de resistencia a cefalosporinas de 3 generacin. En estas cepas se caracteriz una nueva 8-lactamasas plasmdica a la que se denomin inicialmente CTh-1 y con posterioridad TEM-3 por derivar por mutacin de TEM-2
(80,536).

Estudios retrospectivos han demostrado la existencia de estas enzimas en cepas clnicas con anterioridad a 1983. Payne y cols. (3,44-4) caracterizaron en una cepa de K. oxytoca aislada en febrero de 1982 una IIIPEA de pI 5,3 a la que denominaron TEM-E2. Asimismo, Casellas y Goldberg (Jos) estudiaron una cepa de Al pnewnoniae, liofilizada en 1982, y demostraron en ella la presencia de una BIPEA con un fenotipo similar a SHV-2. En Espafa, las primeras cepas con BIPEA se encontraron en 1988 en nuestro Hospital (28), aislndose de forma casi simultnea en otros hospitales de la Comunidad Autnoma de Madrid (167) y en la provincia de Barcelona (495,496). El estudio retrospectivo de los aislamientos de Enterobacter!aceae de nuestro Hospital desde el alo 1977 demostr la existencia de un nmero limitado de cepas de E. col! y K. pneumon!ae con este fenotipo en el alo 1982 (Ma), confirmndose la afirmacin realizada por Jacoby y Medeiros (252): se encuentran cuando se buscan. La resistencia transferible a la cefoxitina y por lo tanto la descripcin de las cefamicinasas fue documentada por vez primera por Bauerfeind y cols. (40) en 1989 en una cepa de K. pneumoniae aislada en Corea del Sur. Sin embargo, Knothe y cok. (280) en una de las primeras comunicaciones de I3IPEA observaron la resistencia transferible a cefoxitina en una cepa de 5. marcescens aunque no presentaron datos en relacin con el plsmido, la naturaleza del enzima o el perfil de sensibilidad. Con posterioridad Papanicolaou y cok. (435) comunicaron una epidemia intrahospitalaria acaecida entre septiembre de 1988 y junio de 1989 por K. pneumon!ae con una BIPEA (MIR-1) que hidroliza cefoxitina. El anlisis retrospectivo de los aislamientos de este hospital

45

Introduccin

y su estudio posterior confirm la presencia de una enzima similar en un aislamiento de K.. pneumoniae del alo 1981 (Medeiros, comunicacin personal). Otras BIPEA, carbapenemasas y oxacilinasas de amplio espectro, se describieron, respectvamente, en 1988 y 1991 (2i,s95). Por otra parte, la resistencia a inhibidores de il-lactamasas debida a 5-lactamasas de tipo TEM fue detectada por vez primera en Francia en 1991 (48) y cori posterioridad en Escocia (569). En Espafla la primera cepa con estas caractersticas se alsl en enero de 1992 en un paciente con una infeccin urinaria tratado con amoxicilina/cido clavulnico (66). 6.1. Distribucin y prevalencia. Las oxiimno-ft-lactamasas se han encontrado en los 5 continentes. Su prevalencia en los distintos paises es muy variable con diferencias importantes incluso de un hospital a otro dentro de una misma rea. Muchas de las RIPEA identificadas apenas elevan la CMI de las cefalosporinas de Y generacin por lo que en el estudio rutinario en el laboratorio pueden pasar desapercibidas (259,45 1). Por este motivo, la incidencia real de enterobacterias con J3IPEA es desconocida y pueden estar infravaloradas. Asimismo, existen pocos estudios multicntricos tendentes a aclarar esta incgnita. K. pneumontae es la enterobacteria en donde se han caracterizado ms BIPEA, sin que hasta el momento exista una explicacin convincente para tal circustancia (270). Con frecuencia, su hallazgo esta unido a epidemias nosocomiales (252,508). En estudios recientes realizados en Francia
(538),

Inglaterra (304) y Portugal

(69)

la incidencia de cepas de K. pneumon!ae con BIPEA se situaba

entre el 14 y el 16 %. Adems, se han aislado estas enzimas en otros gneros o especies: E. col!, K. orytoca, K. ozaenae, Salmonella spp., 5. marcescens, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundil, L. malonatica, M. morgan!!, 7. stuart!! (252,451,508) y ms recientemente en 7. mirabilis (63,sl,ss,4s9,596). El bajo nmero de BIPEA encontradas en esta ltima especie parece estar limitado por su baja frecuencia de conjugacin en comparacin con otros microorganismos (336). Francia es el pas que con mayor atencin ha estudiado la incidencia de las BIPEA. En un trabajo multicntrico de 16 hospitales, se observ que durante 1985 la frecuencia de K. pneumon!ae productoras de estas enzimas era de un 0,7%, 8,4% en 1987 y 11,0% en 1988 (568). Un estudio posterior en 12 hospitales, revel que este porcentaje se haba incrementado; 14,3% en 1989 y 14,1% en 1990 (sn). Mientras que en determinados centros de este estudio no se aislaron cepas con BIPEA, en otros la incidencia fue del 47,6%, demostrndose las diferencias existentes de un centro hospitalario a otro dentro de un mismo pas. Un trabajo ms reciente realizado en 26 hospitales

46

Introduccin

estim su incidencia en 1991 en un 9,6%, siendo TEM-3, TEM-21 y SHV-4 las enzimas caracterizadas (86). En el resto de Europa se han identificado cepas de Enterobacteriaceae productoras de oxiimino-B-lactamasas en el Reino Unido (15,149,264,326,438,439,444,526,552), Alemania (42,44,279, 280,486,523), Blgica (4384.42,590), Portugal (69,550), Suecia (257), Suiza (sos), Grecia (252,253,582) e Italia (431). En Espaa son pocos los estudios realizados, si bien se han caracterizado tanto 13lactamasas derivadas de TEM como de tipo SHV (3,1o6,16s,67,M,49sA9). Asimismo, las BlPEA se han identificado en: Australia (385), Singapur (385), China (233), India (394,uo), Canada (592), Estados Unidos (s,2s2,401,47.sos), Argentina (05,252,489), Chile (205,253), Israel (174), Turquia (202), Tnez (53,431), Egipto (508,526), Sudafrica (14) y Senegal (483). Es de resaltar que, en este ltimo pas, en un solo Centro hospitalario un 74,4% de los aislamientos de Enterobacter!aceae eran portadores de BIPEA. La mayor variedad de IIIPEA se ha encontrado en Francia (TABLA 2). Fuera de este pas, SHV-2 es el enzima ms identificado (sos), habindose caracterizado en al menos 13 paises. SHV-5 se ha encontrado en 8 paises, TEM-6 en 4 y TEM-10 en 3 (3,252,508). La distribucin de todas estas enzimas no es homognea ya que mientras en Europa se han encontrado BIPEA de tipo TEM y SHV, en Norteamrica, con la excepcin de SHV-2,4 y 5, predominan las derivadas de TEM y en Sudamrica, casi exclusivamente, las de tipo SHV (252,508). Aunque es dificil establecer una relacin puntual entre el tratamiento antibitico especfico y la aparicin de estas enzimas, el estudio de los diferentes brotes y epidemias ha asociado el aislamiento de cepas con BIPEA con el consumo de cefalosporinas de Y generacin y/o aminoglicsidos (so). Existen ejemplos claros; la utilizacin emprica de ceftazidima en monoterapa en pacientes febriles neutropnicos determin la seleccin y diseminacin epidmica de una cepa de K. pneumoniae resistente a la ceftazidima en la que se caracteriz una nueva enzima (TEM-26) (40!). La sustitucin posterior de este antibitico en los tratamientos limit su diseminacin. Similar experiencia, restriccin del uso de cefalosporinas de Y generacin y desaparicin de los respectivos brotes epidmicos, se produjo con las I3IPEA TEM-10 y TEM-12 (YQU-2) (374,481,578). Otros ejemplos son, sin embargo, contradictorios, ya que se demostr una mayor asociacin de aparicin de estas cepas en enfermos que haban recibido cotrimoxazol o quinolonas que en los que hablan recibido cefalosporinas de 3 generacin en comparacin con enfermos de grupos controles que haban recibido similar tratamiento (26). Por otra parte, el fracaso en el control de una epidemia por tratamiento con cefalosporinas de 3 generacin determin la aparicin de nuevas variantes de BIPEA en el misma unidad (532) e incluso en el mismo paciente (129), coexistiendo con las enzimas previamente caracterizadas.

47

Introduccin

Con independencia de la utilizacin de antibiticos, los pacientes en los que se han aislado estas cepas estan generalmente ingresados en unidades de cuidados intensivos, con estancias medias relativamente largas, sometidos a ventilacin mecnica, con catteres arteriales o sondas urinarias y en ocasiones pTevianlente colonizados a nivel intestinal por microorganismos productores de estas enzimas (bo,127.126). Por otra pax-te, existen tambin aislamientos de cepas productoras de BIPEA en pacientes ingresados en instituciones benficas o clnicas de acogida y en pacientes seguidos en rgimen ambulatorio (67,473). Por el momento, existen pocos datos epidemiolgicos con el resto de las BIPEA cefaxnicinasas, carbapenemasas y oxacilinasas - que permitan establecer la incidencia de estas enzimas: se han aislado en casos muy concretos y slo en determinados paises (252,508). Merece una mencin especial la cefamicinasa MIR-1, caracterizada en una epidemia que afect a 11 pacientes y ms recientemente las 8-lactamasas plasmdicas relacionadas con enzimas de tipo TEM que muestran resistencia a los inhibidores de 6-lactamasas, cuya prevalencia se desconoce y que por los escasos datos referentes a ellas (49,66.584,569) podran ser relativamente frecuentes en algunos pases como Francia (79,535).
(435),

control en la prescripcin de las cefalosporinas de 3 generacin (401,481,578), el uso de antibiticos 8-lactmicos no hidrolizados por las BIPEA (24,433) o B-lactmicos en asociacin con inhibidores de 8-lactamasas (60), el empleo de quinolonas (Casellas, comunicacin personal), la decontaminacin intestinal selectiva (s), y el aislamiento de los pacientes (326) han sido algunas de las estrategias ensayadas para el control de las distintas epidemias. La combinacin de estas medidas, pero sobre todo el cambio en la poltica de antibiticos y un buen seguimiento microbiolgico determinan una mayor probabilidad de xito en el control de la diseminacin de las BIPEA (24,127,257).
El

6.2.- Repercusin clnica.

Los 8-lactmicos de 3 generacin, introducidos en los inicios de la dcada de los 80 suscitaron

una gran expectacin y una falsa seguridad ante lo que podra ser la solucin del problema generado por la amplia diseminacin de las Il-lactamasas clsicas. Sin embargo, ante el asombro de clnicos y microbiolgos, surgieron las primeras publicaciones que hacan referencia a la capacidad hidroltica de las BIPEA y al fracaso terapetico subsiguiente a su utilizacin en diversos tipos de infecciones (80,280,523 536). A la alarma suscitada por lo que poda ser un hecho de marcada trascendencia terapetica, se abri un perodo en el que el cmulo de datos y el tiempo transcurrido permiti relativizar su repercusin clnica y analizar el problema con una perspectiva algo diferente
<438).

48

Introduccin

La significacin clnica de las BIPEA puede ser~muy variable y depende fundamentamente de la epidemiologa y patogenicidad del microorgansimo, del plsmido que la alberga y su trasferibilidad, de la resistencia asociada a la produccin del enzima, del estado clnico del propio paciente y del tipo de infeccin. Aunque existen brotes y epidemias bien documentadas por microorganismos productores de EIPEA, la mayora de estas enzimas se han aislado de forma espordica (252,sos). Por ello, si se considera el total de aislamientos de un hospital su incidencia global es generalmente baja. Independientemente de ello, su importancia clfnica radica fundamentaimente en la gran limitacin teraputica que condiciona su espectro hidrolitico (252), sobre todo en aquellas infecciones en las que los antibiticos hidrolizados por estas enzimas se consideran frmacos de primera eleccin. Teniendo en cuenta todas las BIPEA identificadas se puede establecer cuatro situaciones diferentes con implicaciones clnicas distintas: a) BIPEA de distribucin universal, b) asociadas a aislamientos epidmicos, e) en brotes limitados y d) aislamientos espordicos. Las distintas enzimas encuadradas en cualquierade los grupos establecidos pueden en un futuro verse desplazadas a otros. En este sentido, algunas de las BIPEA, como SHV-5 y TEM-10, fueron primeramente detectadas en casos puntuales (205,472) y en la actualidad se han descrito brotes o epidemias ms importantes incluso en reas muy alejadas del lugar inicial de identificacin (44,374,473). primer grupo, RIPEA de distribucin universal, posee a nuestro juicio una nica representante, SHV-2, de singulares caractersticas desde un punto de vista epidemiolgico (453). Es
El

una enzima con difusin universal identificada en al menos 14 paises (165,508). Su hallazgo es ms comn en el gnero Klebs!eIla y en menor medida en E. col! (453), en general, en brotes epidmicos localizados o en pacientes concretos de forma espordica, tanto ingresados como procedentes de la comunidad (65). Asimismo, se han detectado epidemias amplias por diferentes especies: E. cot, K. pneumonae, K. oxytoca, 5. marcescens, Salmonella wien y Salmonella ryphimur!um
(165,214,486).

Muy distintas son las circustancias de TEM-3, TEM-10, SHV-5 y SHV-4, asociadas a aislamientos epidmicos, que configuran un grupo con marcada significacin clnica. TEM-3 y SHV-4 son enzimas encontradas casi exclusivamente en Francia (19,85,124,259), identificndose en la mayora de las especies de Enrerobacteriaceae. Ambas BIPEA han dado lugar a brotes epidmicos amplios de infeccin nosocomial en ms de un hospital, con ms de 100 aislamientos y un nmero elevado de pacientes involucrados. En general, son enfermos ingresados en unidades de cuidados intensivos y en menor proporcin en otras reas de hospitalizacin sometidos a un tratamiento previo, generalmente prolongado, con nuevos >3-lactmicos y aminoglicsidos. La presencia de estas IILPEA se ha asociado a] fracaso teraputico y a un 10-20% de mortalidad. En ocasiones estas

49

introduccin enzimas han coexistido en el tiempo con otras de espectro ampliado, (TEM-24) (27,128), SHV-2 y SHV-3 (SS). Por otra parte,
TEM-10

CAZ-1

(TEM-5),

CAZ-6

es una BIPEA identificada en 1988 en una cepa de K. pnewnoniae

aislada en un paciente tratado con ceftazidima e ingresado en un hospital de Chicago (472). En la actualidad esta enzima se ha asociado a epidemias nosocomiales amplias en dos hospitales del mismo estado (zu), con similares caractersticas a las descritas para TEM-3 y SHV-4. Recientemente se ha identificado tambin en los estados de Nueva York (374,578) y Pensilvania (244) y en Canada (sos). Aunque el origen plasmdico parece no ser homogneo (473), TEM-10 se ha convertido en la IIIPEA ms frecuentemente aislada en EEUU. Asimismo, SHV-5, BIPEA descrita inicialmente en Chile en 1987 (205), ha sido identificada en al menos otros 7 paises. Recientemente se han descrito epidemias importantes que afectaron a 22 pacientes en Alemania (~) y a ms de 200 en el Massachusetts General Hospital de Boston
(249).

Un tercer grupo de BLPEA con repercusin clnica intermedia o moderada est constituido por aquellas enzimas que han dado lugar a brotes epidmicos limitados. Las Il-lactamasas TEMy 26, SHV-3 y MIR-1, constituyen los representantes caractersticos de este grupo cuya trascendencia clnica ha sido por el momento discreta y limitada exclusivamente a sus mbitos de aislamiento (252,40! sos). Alguna de ellas se han obtenido en ms de un centro hospitalario o pas, suelen afectar a un nmero limitado de pacientes ingresados generalmente en la
4,5,6,8,11,12,16,24

misma unidad de cuidados intensivos u otras secciones, en hospitales grandes o medios, afectos de patologa infecciosa variada y estado clnico diverso. Por lo general ms del 50% han recibido cefalosporinas de Y generacin y un aminoglicsido. Estas DIPEA se han caracterizado en microorganismos de los gneros Enterobacter, Cftrobacter y Serratia, adems de E. col! y Klebsiella, pero siempre en un nmero que no suele exceder de 20 aislamientos en cada episodio. Un ltimo epgrafe lo constituyen todas aquellas enzimas caracterizadas habitualmente en una sola cepa y en un solo lugar (aislamientos espordicos) cuya repercusin clnica, por el momento, es extraordinariamente reducida. Este grupo seria el ms numeroso e incluira las 8lactamasas TEM-7,9,13, 14,15,17,l8,19,20,21,22,23, TEM-EI,E2(CAZ-3) y E4, CAZ-8y CAZ-hi, MGH-I, MRH-1, CTX-2, CTX-MI y M2, MJ-1 y 2, DJP-1, SHV-6, FPM-1, KM y MEN-1, asi como las cefamicinasas CMY-1 y 2, BR-1, MOX-1, LAT-1 y FOX-! y la nica carbapenemasa descrita en P. acruginosa (TABLA 2). Sin duda, en la medida que se realizen estudios epidemiolgicos ms exhaustivos y el inters de microbiolgos y clnicos por estas enzimas sea mayor, las 8-lactamasas incluidas en este ltimo apanado podrn cambiar de grupo al conocerse su verdadera incidencia y repercusin clnica,

50

II.- OBJETIVOS

Objetivos

planteamiento de este trabajo y su desarrollo se ha dirigido a la consecucin de los siguientes objetivos:

El

1.-

Determinar la incidencia y evolucin de la resistencia a antibiticos B-lactznicos en Enterobaaeriaceae en el Hospital Ramn y Caja! durante el sexenio 1987-1992, analizando para cada gnero o especie los fenotipos de sensibilidad-resistencia a estos antimicrobianos con especial atencin al fenotipo determinado por las 8-lactaniasas plasmidicas de espectro ampliado (BIPEA). Analizar la expresin fenotipica conferida por diferentes prototipos de RIPEA en Eseherichia col K12 BM2l; establecer grupos fenotipicos de resistencia a antibiticos Il-lactmicos y estudiar la influencia de mutaciones que afectan a la permeabilidad (onipF9 en la expresin fenotpica de las BIPEA.

2.-

3.-

Analizar la capacidad de deteccin fenotipica e identificacin presuntiva de BIPEA en Enterobacreriaceae por diferentes sistemas de determinacin de la sensibilidad invitro. Determinar la incidencia de BIPEA en Enterobacteriaceae aisladas en nuestro Hospital durante el periodo 1981-1992, su distribucin en las diferentes especies bacterianas y los factores epidemiolgicos asociados.

4.-

5.-

Caracterizar las BIPEA identificadas, determinar el fenotipo de resistencia conferido por cada enzima o grupos de enzimas y estudiar los mecanismos de resistencia a otros antimicrobianos en Enrerobacreriaceae con BIPEA.

51

III.- MATERIAL Y METODOS

Material y mtodos

1.- MICROORGANISMOS. 1.1.- Aislamientos clnicos.

El estudio de sensibilidad a los antibiticos B-lactniicos se realiz prospectivamente en 24.058 aislamientos de Emerobacreriaceae procedentes, en su mayora, de pacientes ingresados en el Hospital Ramn y Caja! y, en menor nmero, de pacientes atendidos en el Servicio de Urgencias 0 4 del municipio de Madrid. Estos microorganiso Ambulatorios pertenecientes al Area sanitaria n mos se aislaron durante el perodo comprendido entre el 1 de marzo de 1987 y el 31 de diciembre de 1992. Su distribucin por especies bacterianas y procedencia clnica se recoge en la TABLA 5. TABLA 5.- Aislamientos de Enrerobaceriaceae y origen clnico.

Microorganismos

1<2 Tota]

Hemocultivos Tjrocultivos

Coprocultivos

I4quidos orgnicos

~~rsj

Exudados

1esrirat E. ecli Salsonella PP. .P. siratilis It. pneuwonhae 1. oxytcca P. vulgar-ls E. cloacas E. Berogenes C. freundja Y. sorganil 3. parcescens 14.234 959 2.634 1.674 693 171 1.380 254 520 479 1.060
15.6 2,0 7.0 6,2 0,6 8.2 4.1 4.0 4,4 5,7

71,6 1,6 54.5 55,4 24,8 46.6 19,3 10.1 52.0 32.5 24,1

0.1 80,9 7.8

1,9 0.2 1.3 2,0 4.7 2,3 2,5 0.4 2.6 3,6 6.9

6,7 1,6 36.2 28.7 48.7 41.3 50.2 77,5 25.6 52.6 52.8
25,3

2,3 0,1 6.0 6.9 15.6 9.2 19,8 7,9 9,0 6,9 10.5
5,0

TOTAL

24.058

6.8

57,4

3,4

2.1

a: porcentaje de aislamientos.

1.2.- Cepas con 8-lactamasas plasmdicas de espectro ampliado. 1.2.1.- Procedentes de muestras clnicas. Se aislaron un total de 80 cepas de Eruerobacreriaceae con un perfil de resistencia compatible con la presencia de BIPEA. Este perfil se caracteriza por la resistencia o menor sensibilidad a aminotiazol-cefalosporinas y monobactams y sensibilidad a los antibiticos il-lactmicos provistos de un grupo metoxi en C6 C7 y a carbapenems. Asimismo, la sinergia entre cefalosporinas de 3

52

Mo.teri.oJ y mtodos

generacin o monobactams y el cido clavulnico facilit su identificacin presuntiva. Las se caracterizaron por las tcnicas detalladas en el apanado 4.

BIPEA

La dentificadn bioqumica de estos microorganismos se realiz por el sistema semiautomtico PASCO (DIFCO, Detroit, MI) y el sistema API 20E (Bio Mrieux SA, MontalieuVercieu, Francia). La identificacin serolgica de las cepas de Salmonelta se realiz con antisueros de antgeno somtico y flagelar (Bacto Salmonella O Antisera; Bacto Salmonella H Antisera; Vi Antiserum, DIFCO, Detroit, MI) siguiendo los diferentes trabajos de White (6o4,os) y Kauffman (2n,273,274,27s), recogidos posteriormente por Edwards y Ewing (152,159). 1.21.- Procedentes de portadores fecales. Con el patrn de resistencia referido en el epgrafe anterior se estudiaron un total de 1 cepas de Enterobacreriaceae procedentes de 1.239 muestras de heces, obtenidas de 544 pacientes atendidos en rgimen ambulatorio en 3 Areas sanitarias del municipio de Madrid (Area 6: Ambulatorio de Arguelles; Area 5: Ambulatorio de Bravo Murillo; Area 4: pacientes ambulatorios del Hospital Ramn y Caja!) y 305 pacientes ingresados en el Hospital Ramn y Caja! durante un periodo de 9 meses (abril-diciembre de 1991). Estas cepas fueron seleccionadas en dos placas de agar de MacConkey que contenan cefotaxima
1.3.(1

gg/ml) y ceftazidima (1 gg/ml), respectivamente.

Cepas de referenda.

Para el control de calidad de los estudios de sensibilidad se utilizaron las cepas recomendadas por el National Comniittee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS)(396,397,398,399): E. cot ATCC 25922, E. cot ATCC 35218, E. faecalis ATCC 29212, 5. aureus ATCC 29213 y P. aerugnosa ATCC 27853. Las cepas con prototipos de B-lactamasas utilizadas en los estudios de sensibilidad y caracterizacin de las BIPEA se recogen en la TABLA 6. En los estudios de transferencia de la resistencia mediada porlas BIPEA y de cotransferencia de resistencia a antibiticos no B-lactmicos, se utilizaron las siguientes cepas receptoras de plsmidos conjugativos: E. cot K12 BM2I resistente al cido nalidixico (F gyrA X~) (27), E. coil
K-12 153-2

resistente a la rifampicina (metF63 poB22) (ion) y E. col K12 HBIOI resistente a la

estreptomicina (F hsdS2O recAl3 ara-l4proA2 lacYl galK2 rpsL2oxyl-5 mil-] supE44 >0) (72). En algunos casos se introdujo por transformacin ADN plasmidico en cepas competentes de E. cot K-12 TGI [A (lac-pro) supE ih hsdDs F(rraD3proAfl ~ tacZ MIS)] (370).

53

Material y mtodos

En el estudio de la influencia de las alteraciones de la membrana externa en la expresin de las SIPEA se utilizaron dos cepas isognicas de E. col! (una de ellas ompF) cedidas gentilmente por F. Moreno (Unidad de Gentica Molecular, Hospital Ramn y Caja!, Madrid): E. col) MC4100 [F araDl39 (loe JPOZYA-argF)U169 rpsL /ilA reA fla] (04) y E. col) MH2I [MC4lOO (ompF~acZ)hybl-21]
(212).

TABLA 6.- Cepas con prototipos de 8-lactamasas plasmidicas clsicas y de espectro ampliado.

Microorganismo E. E. It. E. E. E. E. E. E. E. E. cali cali pneuaoniae ccli cali cali cali ccli cali ccli ccli

Plsmido O nombre de la cepa RSK l725E(RPI) CF104 3532CpUD16> pCP6O4 88083101 CIa(pCIflOO) 3M2990 353<pCFF34> cla<pBRS22c3) RYClOOO(pECTEM17)

Luma

pI

Referencia 222 222 534 437 540 42 111 324 130 111 68 68 68 66 34 279 406 446 205 17

TEM1 TEM2 TENa TEM4 TEM5 TEM6 TEI47 TENE CAZ2 TEN12 TEM17

(CTX1) <CAZ1> <TEM201)

(TENlOl)

5.4 5.6 6.3 5,9 5.55 5,87 5.41 5,9 5.9 5,25 5,9
5,9 5,4 5,4 7,6 7,6 6,98 7,75 8,2 7.6

E. cali E. ccli E. cali E. A. E. E. E. E. cali cali cali cadi cali ccli

RYCIOOO(pBCTENLM) TENLM RYC1000<pEGTEMHa1> TENMal RYCI000<pIRT3> IRT3 353<R1O1O) 3C2926(pBPSO1) .3532(piJDlE> 3532(pUfl2l} J532(pAFP2) CIA(pSLH47> SHV1 SMV2 SRV3 SHV4 SMV5 SHV6

(CAZ5> (CAZ4)

E. cali E. cali E. cali E. claacae

1727EfRGN238> 1894E(RSlb HL101<pNOfl400) RYClI43Q/89

OXA1 OXA3 ROE1 filcromoadmica

7,4 7.1 8,1 8,8

359 359 366 100

2.- ANTIMICROBIANOS.
Los antibiticos e inhibidores de il-lactamasas fueron suministrados en forma de sustancia valorada por los diferentes laboratorios fabricantes: ampicilina, amoxicilina, cloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, temocilina, cefminox, ceftizoxima, cido clavulnico y BEL 42715B (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); cefazolina, cefalotina, cefaclor, moxalactam, tobramicina y apramicina (Lilly Indiana de Espafla); cefoxitina, imipenem y norfioxacina (Merck Sharp & Dohme); 54

Material y mtodos

cefuroxima, ceftazidima y nitrocefin (Glaxo); cefixima (Merck Igoda); cefotaxima, cefpiroma y ofloxacina (Hoechst Ibrica); azlocilina, mezlocilina y ciprofloxacina (Qumica Farmacutica Bayer); piperacilina, tazobactam y biapenem (Lederle-Cyanamid Ibrica); sulbactam (Pfizer); ceftriaxona y carumonam (Roche); aztreonam, kanamicina y amicacina (Bristol Myers-Squibb); cefotetan y meropenem (Zeneca); cefdinir (Parke-Davis); ceftibuten, gentarnicina, netilmicina, sisomicina y 5episisomicina (Schering-Essex Espaa); cido nalidxico y cloranfenicol (Sigma Chemical Co.); estreptomicina y fosfomicina (CEPA); espectinomicina (Upjohn); dibecacina y bleomicina (Almiral); neomicina (Liade); esparfioxacina (Rhne-Poulenc Rorer); temafloxacina (Abbott Laboratories) y rifampicina (Merrel Dow). Los discos de antibiticos fueron suministrados por Oxoid (Basingstoke, UK), Diagnostic Pasteur (Marnes-la-Coquette, Francia) y Mast Laboratories Ltd. (Merseyside, UK). Los discos de ce1~iroma y carumonam fueron preparados en nuestro laboratorio, con una carga de 30 gg.

3.- PRUEBAS DE SENSIBILIDAD. 3.1.- Mtodo de difusin con disco.

Con posterioridad a la deteccin presuntiva por microdilucin de las cepas con

y recogida con algunas modificaciones por el
NCCLS

se estableci un perfil de sensibilidad utilizando la tcnica de difusin con disco descrita por Bauer y cois. (35)
BIPEA

(396,398).

3.2.- Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI). 3.2.1.- Mtodo de dilucin en agar. Esta tcnica se realiz siguiendo las indicaciones de Ericsson y Sherrs (156) con las modificaciones y recomendaciones introducidas posteriormente por el NCCLS (397,399). Se utiliz un replicador de Steers (sss) y agar Mueller-Hinton (Oxoid, Basingstoke, UK) como medio de cultivo al que se incorporaron los antibiticos en diluciones en base 2. El inculo bacteriano empleado fue de io~ UFC/depsito. Adems, con el fin de conocer la influencia del incremento del inculo en los valores de CMI obtenidos en las cepas productoras de BIPEA, se utiliz un inculo de io~ y i07 UFC/depsito. La lectura de la CMI (menor concentracin de antibitico que impide el desarrollo de crecimiento visible en la superficie del agar) se realiz tras 18 h de incubacin a 35 0C.

55

Material y mtodos

Se utilizaron los valores de la CMI (pglml), para establecer los grupos fenotpicos de las distintas IIIPEA, la influencia de las mutaciones ompr en la expresin de las BIPEA y la resistencia a antibiticos no il-lactlmicos. 3.2.2.- Mtodo de nicrodilucin. El estudio de la sensibilidad a antibiticos B-lactmicos y su evolucin en el perodo anteriormente reseado se realiz utilizando los datos generados por el sistema semiautomtico PASCO (Difco, Detroit, MI), que emplea paneles con diferentes substratos para la identificacin bioqumica de los microorganismos y con concentraciones de antimicrobianos en base 2 para la determinacin de la CMI (Ref. paneles 66E y SE). A diferencia de otros equipos, en el sistema PASCO la lectura de la CMI se establece visualmente por el usuario y no de forma automtica, lo cual permite detectar anomalas en el crecimiento bacteriano, contaminaciones y efectos paradjicos. Los paneles, con anterioridad a su utilizacin, se almacenaron congelados a -20 0C. El inculo bacteriano de 5x1& UFC/mi fue similar al recomendado por el NCCLS para la determinacin de la CMI por el mtodo estandar de microdilucin (399), realizndose la lectura de los paneles tras 18 h de incubacin a 35 0C. 3.2.3.- Mtodo del Epsilon-Test. Con objeto de establecer criterios fenotpicos de diferenciacin entre las distintas BIPEA se compararon las tcnicas de dilucin en agar, microdilucin y difusin con disco con el sistema Epsilon-Test (E-Test) recientemente desarrollado (AB Biodisk, Solna, Suecia) (12,70,77). Este mtodo utiliza placas de agar convencionales y una tira de papel de 5 x 50 mm cargada con un antibitico en concentraciones decrecientes desde 256 a 0,016 gg/mi, que permite una graduacin ms amplia en el rango de concentraciones (29 diluciones) frente al sistema tradicional de dilucin en agar (15 diluciones en base 2). El inculo bacteriano se prepar a partir de 3-4 colonias inoculadas en un tubo con solucin salina (0,9%) ajustando la turbidez a] tubo 0,5 de la escala de McFarland. La inoculacin de las placas (Mueller-Hinton) se realiz con una torunda estril siguiendo la tcnica preconizada por el NCCLS para el mtodo de difusin por disco (398), depositando posteriormente la tira con el antibitico sobre la superficie del agar. Las placas se incubaron durante 18 h a 35 0C, considerando como valor de la CMI ~g/m]) el punto de interseccin entre el crecimiento bacteriano sobre la superficie del agar y la tira del E-Test (FIGURAS 13 y 19).

56

MaterioJ y mtodos

3.3.- Estudio con inhibidores de 8-lactamasas. 3.3.1.- Prueba de doble difusin con discos. En la identificacin inicial de las cepas con BIPEA se incluy la tcnica de doble difusin con discos descrita por Jarlier y cois. (259). Se realiz un antibiograma convencional empleando discos con carga estndar (30 gg) de cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima y aztreonam dispuestos a una distancia de 25-30 mm de discos con anioxicilina/cido clavulnico (20/10 pg). La aparicin de un halo ampliado en alguna de las cefalosporinas de 33 generacin fue indicativo de la posible presencia de una BIPEA. 3.3.2.- Sinergia con inhibidores de il-lactamasas. Se determin la CMI de amoxicilina, piperacilina, cefotaxima, cef~,iroma, ceftazidima, aztreonam y cefoxitina en presencia deS pg/ml de cido clavulnico, sulbactam, tazobactam y BEL 427 15B. 2.3.4.- Puntos crticos de resistencia. Los puntos crfticos de resistencia (PCR), utilizados para la definicin de los fenotipos de sensibilidad-resistencia a antibiticos 8-lactmicos (TABLA 7), se eligieron en funcin de los puntos crticos de resistencia microbiolgica (PCRM) establecidos segn la distribucin del nmero de cepas por cada concentracin de antibitico (Mo). El PCRM se defini como la concentracin de antibitico ms alta capaz de detectar la poblacin microbiolgica ms sensible (371). En el sistema de diluciones dobles para el clculo de la CMI, el PCRM viene dado por la concentracin de antibitico que cubre el primer pico en la distribucin del nmero de cepas, y estara representado por la concentracin crtica ms cercana al punto de inflexin de la curva a partir del primer pico en esta distribucin (Mo). A efectos prcticos el PCRM se corrigi considerando el valor del punto crtico farmacocintico (PCF) (133,182,262) de acuerdo con los siguientes criterios:
-

si el PCRM es inferior al PCF se tom aqul como PCR. si el PCRM es superior al PCF se tom este ltimo como PCR.

57

Material y mtodos

TABLA 7.- Puntos crticos de resistencia en Enierobacieriaceae.

Puntos Microorganismo MP TIC 32 32 32 32 32 MC 16/8 16/8 16/8 16/8 16/8 Xfl 8 8 16 16 16 Cflt 8 8 16 16 16 rox 8 8 16 16 16 cix 1 1 1 1 1 CAZ 1 1 1 1 1 crticos de resistencia < 2 49/51>

E. coli SalsonelIa spp. A mirabilis

It. pnnmoniae It. oxytoca

16 16 16 16 16

P. vulgar-it E. E. C. U. S. CJOtCOC aeragenes freur,dii marganil marcescen:

16 16 16 16 16 16

32 32 32 32 32 32

16/8 16/8 16/8 16/8 16/E 16/8

16 16 16 16 16 16

16 16 16 16 16 16

16 16 16 16 16 16

1 2 2 2 2 4

1 2 2 2 2 2

AH?: ampicilina; AHC: amoxicilina/clavultnico; TIC: ticarcilina; KFZ: cefazolina; Cxx: cefuroxima; FOX: cefoxitina;
Cix: cefotaxisa; CAZ: ceftazidima.

4.- CARACTERIZACION DE LAS il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO.

La caracterizacin de las RIPEA en las 80 cepas clnicas con un perfil de resistencia compatible con la presencia de estas enzimas se bas en la determinacin del punto isoelctrico (pl), en la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin y en la hibridacin con sondas de ADN especficas de las familias TEM y SHV. 4.1.- Obtencin del extracto crudo enzimtico. Los extractos crudos enzimticos fueron preparados por sonicacin
(583).

Para ello, se subcultiv

1 ml de un cultivo de 18 h en 40 ml de caldo Luria-Bertani (LB) (335), incubndose en agitacin durante 4 h a 35 0C. Tras este periodo, en el que el cultivo est en fase de crecimiento exponencial, se centrifug a 6.000 rpm durante 10 minutos a 4 0C. Eliminado el sobrenadante, se lav y resuspendi el depsito con tampn fosfato 15 mM pH 7,2. Tras un nuevo proceso de centrifugacin, se resuspendi en 3 ml del mismo tampn y se procedi a su sonicacin en hielo (Sonicator W-30, Heat Systems. Ultrasonics Inc., Farmingdale NY), utilizando 3-4 ciclos de 30 segundos. El sonicado se clarific por centrifugacin a 12.000 rpm a 4 0C, confirmando la actividad

58

Material y mtodos

-lactamasa aadiendo 5 ~tlde ste a 5 pi de nitroceffn 100 !M (Oxoid, Basingstoke, UK). El cambio de color del nitrocefin del amarillo al rojo evidenci la presencia de 8-lactamasa. 4.2.- Determinacin del punto isoelctrico. Se depositaron los extractos crudos sonicados (2 gil) en geles comerciales de poliacrilamida con anfrlitos de rangos de pH de 3 a 9, de 5 a 8 y de 4,5 a 6 (PhastGel 3-9, PhastGel 5-8 y PhastGel 4,54, Pharmacia, Uppsala, Suecia). EL isoelectroenfoque de las muestras se realiz segn la tcnica descrita por Huovinen (241) utilizando el aparato denominado Phastsystem (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en las condiciones establecidas por el fabricante. Paralelamente al enfoque de los extractos problema se realiz el de las cepas con las 5-lactamasas prototipos de pl conocido, determinndose el de aqullas por comparacin. La visualizacin de las bandas de las B-lactamasas en los geles se realiz aadiendo ~ pi de una solucidn de nitrocefln 100 pM. 4.3.- Determinacin de la actividad enzimtica especfica. 4.3.1.- Determinacin del contenido de protenas. Se realiz por espectrofotometra en los extractos crudos sonicados utilizando un sistema comercial (BCA, Protein Assay Reagement, Pierce, Rockford, XL) basado en la tcnica descrita por Lowry y cok. (318). Este sistema emplea el cido bicinconinico como cromgeno que reacciona con el Cu+ resultante de la reaccin alcalina de las protenas con el Cu24. La lectura de la absorbancia del complejo final [Cu4-2(cidobicinconinico)] se realiza a 562 nm. El contenido proteico se cuantific por medio de una curva patrn de albmina srica. 4.3.2.- Actividad 8-lactamasa. La tcnica empleada se bas en la descrita por OCallagham (422) que emplea nitrocefin como substrato (soo). Se utiliz un espectrofotmetro Gilford 250 (Gilford Instruments Laboratories Inc., Oberlin, OH) con lectura de la absorbancia a 482 mu. Se aadieron 10-100 pl de los extractos enzimticos, previamente diluidos en tampn fosfato 15 mM pH 7, a 1 ml de una solucin de nitroceffn 10 gM a 25 0C, determinndose el incremento de la absorbancia en el tiempo correspondiente a la hidrlisis del nitrocefn. A partir de este valor y utilizando el coeficiente de extincin molar del nitrocefin se calcul la actividad de 8-lactamasa expresada en micromoles de substrato hidrolizado por minuto y volumen aadido @mol/ml) a 25 0C y pH 7. Referido este valor

59

MoierioJy mtodos

a los mg de protena del extracto se obtuvo la actividad enzimtica especfica (mU/mm/mg). Los valores finales son el resultado de la media de al menos dos determinaciones. 4.4.. Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn. Esta tcnica, desarrollada por Papanicolaou y Medeiros (434), se emple para la caracterizacin de las distinta IPEA. EJ ensayo se fundament en el cambio de la densidad ptica determinado por la hidrlisis del nitrocefin por la accin de las il-lactamasas en presencia de diversos substratos (competidores e inhibidores). Se emplearon placas de microtitulacin de fondo plano (EIA/RIA 3590, Costar Cambridge, MA) en las que se dispensaron 50 pI de una solucin de nitrocefln (100 pM) y del substrato en tampn fosfato 0,1 M pH 7 a las concentraciones indicadas en la TABLA 8. En los pocillos control se sustituy el substrato por tampn fosfato 0,1 M pH 7. Posteriormente, se diluyeron los valor de absorbancia a 480 un de 0,2 a se real izaron por duplicado aadiendo 50 (nitrocefin + competidor/inhibidor) y a extractos en tampn fosfato 0,1 M pH 7 hasta obtener un los 2 minutos de iniciarse el ensayo. Las determinaciones pl de los extractos diluidos a los pocillos con los substratos los pocillos control (nitrocefin), midindose el cambio de

densidad ptica a 480 nm a los 2, 5, 10, 20, 30 y 40 minutos en un espectrofotmetro de enzimoinmunoensayo (Flow Titertek Multiskan Plus Mk II, Flow laboratories, Ayrshire, NB).

TABLA 8.- Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin.

Concentracin final Substrato mg/ml Nitrocefln Cloxacilina Ciavultnico Sulbactan Tazobactas Cefuroxima Ceftibuten 0.025 0.23 0.0005 0.005 0.001 0.5 2.0 50 520 2 20 3 1180 3200 Cefoxitina Cefotetan Cefotaxima Ceftazidima A2treonau Imipenem Substrato

Concentracidn final
mg/ml 2.5 0.5 2.5 1.25 0.5 0.31 uN 5500 870 5000 2000 1150

60

Material y mtodos

Se calcul el porcentaje de inhibicin (% ICN) aplicando la siguiente frmula:

porcentaje mximo de inhibicin se observ generalmente a los 2 5 minutos de iniciado el ensayo. Cuando el porcentaje mximo de inhibicin excedi del 25%, se calcul el grado de
El

disminucin del porcentaje de inhibicin o pendiente aplicando la siguiente frmula:

mximo % inhibicin Pendiente=

% inhibicin lo

10 minutos

En la caracterizacin de las enzimas estudiadas se utiliz el porcentajede inhibicin mximo, la representacin grfica del porcentaje de inhibicin en funcin del tiempo y el valor de la pendiente, en comparacin con los respectivos valores de las 8-lactarnasas de pl conocido. 4.5.- Hibridacin en colonia con sondas de ADN. 4.5.1.- Preparacin y lisis de las colonias. Sobre la superficie de agar LB con un crecimiento de 4-6 lx a 37 0C de colonias perfectamente aisladas se deposit una membrana de nitrocelulosa (Boebringer Mannheim Gmbh, Alemania). Tras un minuto de contacto, en el que se adsorbieron las colonias, se retir la membrana y se depost con las colonias hacia arriba en una solucin desnaturalizante (NaC 1,5 M; NaOH 0,5 M) durante 7 minutos. Tras este periodo se neutraliz, durante 3 minutos, en una solucin de NaC 1,5 M; Tris Cl 0,5 M pH 7,2; Na 2EDTA 0,001 M, repitiendo nuevamente este proceso. Posteriormente se lavaron las membranas dos veces con una solucin 2xSSC (solucin 2OxSSC: NaC 3M; citrato sdico 0,3 M) y una vez eliminada la humedad se fij el ADN en una cmara de luz u.v. siguiendo las instrucciones del fabricante ((SS Gene LinkerTM, Bio-Rad Laboratories, Richmond CA). 4.5.2.- Preparacin y marcado de las sondas. Se utiliz el fragmento SspI/PstI de 560 pb del plsmido PBR322 (131) como sonda especfica de tipo
TEM

y el fragmento interno de 450 pb, obtenido tras digestin del plsmido pHUC3Y con PstI/NorI (sonda intragnica de SHV-3), como sonda especfica de la familia SHV (406). El marcado de estos
61

Material y mtodos

dos fragmentos se realiz por el mtodo de incisin ambulante (nick transation) con un equipo comercial (BRL, LifeThecnologies Inc., Gaitherburg MD), utilizando (a-32P)dCTPcomo nucletido radiactivo (Amersham International plc, Amersham, UK). 4.5.3.- Hibridacin y autorradiografa. Con anterioridad a la hibridacin, se depositaron las membranas preparadas en el apanado 4.5.1. en un horno de hibridacin (Techne Hybridizer HB-1, Techne Ltd., Canibridge, UK) con 40 ml de solucin de prehibridacin [6xSSC;5x solucin de Denhardt; lauril sulfato sdico 0,5% (SOS); SO pl esperma de salmn 10 mg/ml (solucin de Denhardt: SOS 2%; Ficoll-400 2%; polivinflpirrolidona 2%)] durante 1 h a 65 0C en los trminos indicados por el fabricante. La hibridacin con las sondas marcadas se realiz, en el horno antes citado, durante 12 h a 650 C con 40 ml de la solucin utilizada para la prehibridacin (en este caso sin esperma de salmn). Tras este periodo y eliminada la solucin anterior con la sonda marcada se lavaron las membranas con una solucin de 2xSSC; SOS 0,05% durante 1 lx a 65 0C y despus con O,lxSSC; SOS 0,5% durante 1 h a 65 0C. Una vez secas, se introdujeron las membranas en pantallas amplificadoras durante 6-48 h a -40 0C para realizar posteriormente una autorradiografia.

5.- ESTUDIOS GENETICOS. 5.1.- Extraccin del ADN plasmdico. 5.1.1.- Lisis clara.
previa purificacin, para medir el tamao molecular de los plsmidos. Partiendo de un cultivo en 40 ml de LB se centrifug y lav con TE (Tris CItO mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8). El depsito se resuspendi en 1,25 ml de una solucin que contena sacarosa 20%, EDTA 40 mM pH 8 y Tris Cl 50 mM pH Sala que se aadi
(07),

Se utiliz el ADN plasmidico obtenido por este mtodo

0,25 ml de lisozima 1%, incubndose 30 minutos a 25 0C. Posteriormente se aadi 0,5 ml de EDTA 0,25 M pH 8 dejndolo actuar 10 minutos a O 0C. A continuacin se agregaron 2 ml de una solucin que contena Tritn 0,1%, EDTA 62,5 mM y Tris Cl 50 mM pH 8, mantenindose 10 minutos en hielo y centrifugndose a 15.000 rpm 60 minutos a 4 0C. Se recogi el sobrenadante y se mantuvo a 65 0C durante 15 minutos, enfrindose en hielo y centrifugndose a 5.000 rpm 15 minutos a 4 0C. Recogido el sobrenadante, se aadi 1/3 del volumen de ste de PEO (40%

62

Material y mtodos polietilenglicol en NaC 2 M) y se mantuvo al menos 12 h a 4 0C. Tras este periodo se centrifug a 9.000 rpm durante 15 minutos y se recogi el depsito en 100-150 gil de TE o agua destilada, desionizada y estril. 5.11.- Lisis alcalina. Para la visualizacin de los plsmidos en las cepas con se utiliz esta tcnica descrita por Birnbom y Doly
BIPEA

y en sus respectivos transconjugantes,

(335).

(64)

y modificada por Horowicz

El depsito del centrifugado de 1 ml de cultivo de 18 h se lav con TE y resuspendi en 100 pl de una solucin que contena glucosa 50 mM, EDTA 10 mM y Tris Cl 25 mM pH 8,0, mantenindose a 25 0C durante 5 minutos. Se aadieron 200 gil de NaOH 0,2 N y 1% SDS, mezclndose suavemente durante 5 minutos. Tras este periodo se mezcl durante 5 minutos con 150 gil de una solucin de acetato potsico 3 M y actico glacial 11,5% en agua, centrifugndose a 4 0C durante 5 minutos. El sobrenadante (400 gil) se transfiri a un nuevo tubo y se eliminaron las protenas con fenol/cloroformo. Recogido el sobrenadante, tras una nueva centrifugacin, se aadi de su volumen (40 gil) de acetato sdico 3 M pH 5,2 y posteriormente 800 gil de etanol. Se mantuvo 1 h a -20 0C y se centrifug 15-30 minutos a 4 0C eliminando el sobrenadante. El AUN presente en el depsito se lav con etanol 75% (0,5 mi) y centrifug 2 minutos, descartando nuevamente el sobrenadante. Secado a vacio se resuspendi en TE pH 8,0 con ARNasa (Boehringer
1/10

Mannheim Gmbh, Alemania).

5.1.3.- Purificacin del AUN plasmdico.

La purificacin del AUN plasmidico, obtenido mediante lisis clara (07), se realiz de acuerdo con el mtodo descrito por Guerry (20;) que utiliza una separacin por centrifugacin con un gradiente de densidad de cloruro de cesio. plasmidico, previamente obtenido, fue llevado a 9 ml de tampn TE y se aadieron 9 gr de CICs y 10 mg de bromuro de etidio. Una vez homogeneizado se introdujo en un tubo de
El AUN

ultracentrifuga (Beckman, Palo Alto CA) y sellndose adecuadamente se centrifug a 38.000 rpm 4S b a 20 0C (Centricon T-1075, Kontron lnstruments, Zurich, Suiza). El AUN plasmidico, visualizado con luz u.v., se extrajo por aspiracin con una jeringa hipodrmica. El bromuro de etidio que acompaaba al AUN plasmidico se elimin con CICs a saturacin en isopropanol. Posteriormente se dializ en TE pH 8,0 a 4 0C durante 48 lx (Dialysis Tubing Medicel, International Ltd., London, UK).

63

Material y mtodos

as obtenido se concentr por precipitacin con acetato sdico pH 5,2 a una concentracin final 0,3 M y un volumen igual de isopropanol. Se mantuvo a -20 0C durante 2 h, centrifugndose posteriormente a 4 0C. El depsito, con el AUN plasmdico, se lav con etanol 70%, centrifug nuevamente y sec a vaco. Finalmente se resuspendi en agua destilada,
El AUN

desionizada y estril. 5.1.4.- Electroforesis en geles de agarosa.

La electrofresis del AUN se realiz en geles de agarosa 0,6-0,8% (Bio-Rad Laboratories,

Richmond CA) en tampn TBE (10,8% Tris; 5,7% cido brico; 0,93% EDTA) (335). El AUN se visualiz, previo tratamiento con bromuro de etidio, por transiluminacin del gel con luz u.v. 5.1.5.- Medida del tamao molecular de los plsmidos. Para determinar el tamao del plsmido(s) que codificaba(n) la BIPEA implicada en la nica epidemia acaecida en nuestro hospital, el AUN plasmidico purificado de las cepas de S. arizonQe (36536/89) y E. coil (5H/89) se digiri con EcoRX siguiendo las instrucciones del fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Por comparacin del patrn de restriccin obtenido con el de los fragmentos de tamao conocido resultantes del tratamiento del AUN del fago X con Hindl se determin el tamao aproximado de los plsmidos (335) que codificaban la 8-lactamasa.

5.2.- Transferencia de la resistencia.

La transferencia del AUN plasmdico se realiz por conjugacin (376), recurriendo a la transformacin cuando no fue posible obtenertransconjugantes (137). La obtencin de transformantes por electroporacin fue empleada en el estudio de las mutaciones gyrA responsables de la resistencia a quinolonas en las cepas productoras de IIIPEA.

5.2.1. Conjugacin y frecuencia de conjugacin. La conjugacin se realiz en medio slido (agar Columbia con sangre de carnero 5%) utilizando
como soporte membranas estriles de fosfocelulosa dispuestas en piezas de 1 cm2 sobre la superficie del agar. Las cepas donantes, con plsmidos que codifican las BIPEA, y las cepas receptoras de E. coli (BM2I, HB1OI y J53) se cultivaron en LB hasta alcanzar la fase exponencial. Se aadieron 25 gil del cultivo de la cepa receptora sobre la superficie de la membrana, mantenindose a temperatura ambiente hasta su desecacin. Posteriormente se aadieron, sobre el depsito anterior, 25 gil de la
64

Material y mtodos cepa donante, incubndose, una vez seco, 18 h a 37 0C. Transcurrido este tiempo, la membrana con el crecimiento bacteriano se transfiri a un tubo con 9 ml de LB y se agit hasta obtener una suspensin del crecimiento bacteriano. Se subcultivaron alcuotas de sta en medios selectivos con cido nalidixico, estreptomicina o rifampicina (100 gg/ml) y ampicilina (50 gig/ml), cefotaxima o ceftazidima (en concentraciones entre 0,5 y 4 gig/ml segn la CMI del donante). Como controles se emplearon la cepa donante y la receptora. La frecuencia de conjugacin se expres como el nmero de clulas receptoras que adquirieron el plsmido con la BIPEA en 1 h a 37 0C respecto al nmero de clulas donantes (376). Para ello, la cepa donante se cultiv en LB hasta alcanzar la fase exponencial (Uf UFC/ml) y la cepa receptora hasta alcanzar la fase estacionaria (10~~l01o UFC/ml). Se mezclaron 5 ml de cada cultivo y se mantuvieron 1 lx a 37 0C con agitacin suave. Inmediatamente se sometieron a agitacin fuerte durante 1 minuto y se enfri a O 0C. La cuantificacin del nmero de clulas donantes se realiz plaqueando sobre medios selectivos con cefotaxima o ceftazidima (0,5-4 gg/ml) y se calcul el nmero de clulas receptoras que adquirieron el plsmido de resistencia seleccionando sobre los medios indicados en el prrafo anterior.
5.2.3.-

Transformacin.
(137)

El mtodo seguido fue descrito por Dagert y Ehrlich obtenidas por la accin del CaCI

que utiliza clulas competentes de E. cot

2. En la preparacin de las clulas competentes se parti de un cultivo de 18 h de E. cot EBIOI o E. cot TUl. Subcultivado en 40 ml de LB (1:100) se hizo crecer hasta obtener una densidad ptica de 0,3-0,4 a una longitud de onda de 600 nm. Se centrifug 0C y resuspendi el depsito en 20 ml de CaCL 5 minutos a 5.000 g 4 2 50 mM estril. Esta suspensin se mantuvo en hielo durante 30 minutos, centrifugando nuevamente en iguales condiciones. El nuevo depsito se resuspendi en 1,5 ml de CaCI2 50 mM estril y se dej a 4 oc 24 lx para su utilizacin en la transformacin. En la transformacin se aadieron 2-10 gil de AUN plasmidico a lOO gil de clulas competentes, mantenindose en hielo durante 30 minutos. Se incub posteriormente esta mezcla a 0C durante 2 minutos e inmediatamente se enfri en hielo. A continuacin se aadieron 2 ml de 42 LB, incubndose durante 2 h a 37 0C con agitacin. Transcurrido este tiempo, los transformantes se seleccionaron en agar LB con estreptomicina (100 gg/ml) ms ampicilina (50 xg/ml), cefotaxima cefiazidima (0,5-4 gig/ml). Como control de la trasformacin se emple el plsmido pBR322 con la enzima TEM-l y un control sin AUN.

65

Material y mtodos

5.2.3.- Transformacin por electroporacin. Se utiliz este mtodo con el fin de introducir el plsmido pBGB1O1 que contiene el gen salvaje ~rA y el gen ap/zA 1 que determina resistencia a la kanamicina (67) en las cepas de Enterobacteriaceae con BIPEA que eran resistentes a quinolonas.

La electroporacin constituye un mtodo de transformacin, descrito inicialmente para E.

cali (48) y posteriormente para otras bacterias (170), que aumenta la eficacia de los mtodos tradicionales. En la preparacin de clulas competentes se parti de 50 ml de LB inoculado (1:100) con un cultivo de 18 h. Se incub a 37 oc con agitacin fuerte hasta obtener una densidad ptica de 0,5-0,8 a una longitud de onda de 600 un. El cultivo se mantuvo posteriormente en hielo durante 30 minutos y se centrifug a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 0C. Eliminado el sobrenadante se resuspendi el depsito en 10 ml de agua destilada, desionizada y estril. Tras una segunda centrifugacin se resuspendi en 2,5 ml de agua destilada, desionizada y estril y en una tercera en 1 ml de glicerol 10%. Despus de una ltima centrifugacin se resuspendi el depsito en 100-150 gil de glicerol 10% hasta alcanzar una concentracin final de clulas de 1-3 x 1010 UFC/ml. Las clulas competentes se congelaron en hielo seco y mantuvieron hasta su uso a -70 0C. La electroporacin se realiz en cmaras diseadas para este fin (Gene pulser cuvetes BIORail 0,1 cm, Bio-Rad Laboratories, Richmond CA) utilizando una fuentede corriente (Bio-Rad Gene Pulser, Bio-Rad Pulse Controller). Se mezaron 40 gil de clulas competentes descongeladas con 1-2 gil de AUN plasmidico (pBGB1O1), dejando en hielo durante 1 minuto. Una vez aadida esta mezcla en la cmara de electroporacin se someti a un pulso de 12,5 Kv/cm durante 4-5 msec. Inmediatamente se aadi 1 ml de LB y transfiri a tubos de 17 x 100 mm de polipropileno, incubndose en agitacin durante 1 lx a 37 0C. La seleccin de las clulas con el plsmido pBGBIOl se realiz en agar LB con kanamicina (30 gig/ml), cloranfenicol (60 gig/ml) y ampicilina (50 gig/ml). 5.3.- Extraccin del AUN cromosmico. El AUN total de las cepas de S. arizonae implicadas en la epidemia por BIPEA se extrajo por la tcnica de Pitcher y cois. (459) modificada por Alonso y cok. (4). Para ello, se suspendi en tubos de Eppendorf 1 asa de cada cepa en 100 gil de TE y trat durante 15 minutos con 500 gil de GES (tiocianato de guanidina 5,5 M, EUTA 0,1 M, sarcosil 0,02 M) para su lisis. Posteriormente se aadi 250 gil de acetato amnico 7,5 M y mantuvo en hielo durante 15 minutos, eliminando las protenas con fenol-cloroformo 1:1 tal como describe Sambrook y cois. (499). La fase acuosa se mezcl con 500 gil de isoamil alcohol-cloroformo 24:1, centrifligndose a 12.000 g durante 15
66

Material y mtodos
minutos. El AUN, presente en la fase acuosa, se precipit con etanol y dej a -20 0C durante 2 h. Tras este periodo, se recogi con un asa de plstico y lav con acetato amnico 1,5 M - alcohol

y posteriormente con alcohol absoluto. El AUN se resuspendi en 200 gil de agua dejando 2-3 h, aadindose posteriormente proteinasa K (500 gig/gil) (Sigma, St. Louis Ltd. MO). Despus de 1 Ii de incubacin a 37 0C se someti nuevamente a desproteinizacin con isoaniil alcohol70%

resultante se trat con EcoRI siguiendo las instrucciones del fabricante (Pharmacia, Uppsala, Suecia), comparando los perfiles de restriccin obtenidos.
cloroformo.
El AUN

6.- RESISTENCIA A ANTIIBIOTICOS NO il-LACTAMICOS EN Enterobaderiaceae CON il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO.
Tanto en las cepas de origen clnico como aquellas que se aislaron de portadores fecales con IIIPEA se procedi al anlisis de las resistencias a antibiticos no 8-lactmicos: aminoglicsidos,

tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y fosfomicina. El estudio se realiz en las cepas salvajes y en

sus respectivos trafisconjugantes, determinndose la cotransferencia de las resistencias con la BIPEA. La resistencia a aminoglicsidos se evalu con mayor detalle, caracterizndose las enzimas modificantes de aminoglicsidos. Asimismo, se estudi en las cepas salvajes la posible implicacin

de mutaciones en gyrA que confieren resistencia a quinolonas.

6.1.- Resistencia a aminoglicsidos: enzimas modificantes.

Se estudi el perfil de sensibilidad a aminoglicsidos por medio de las tcnicas de dilucin en agar (399) y difusin con disco (395). La caracterizacin de las enzimas modificantes de aminoglicsidos en las cepas con BIPEA y en sus respectivos transconjugantes se realiz en los extractos crudos

obtenidos por sonicacin mediante la tcnica de Ozanne y cols.

(40).

(430)

recogida por Davies y ols.

Esta tcnica se fundamenta en la transferencia de marcadores radiactivos desde un cofactor adecuado, - acetato, adenilato o fosfato -, al aminoglicsido. Las reacciones que tienen lugar son:
-

acetilacin:

Aminoglicsido + 14C-AcCoA nucleotidilacin: Aminoglicsido + 4C-ATP fosforilizacin:

Aminoglicsido +
32P-ATP

14C-Ac-aminoglicsido + CoA

4C-AMP-aminoglicsido 32P-aminoglicdsido

+ PPi

+ ADP

67

Mate>t#, mtodos Esta tcnica se denorffma tambin mtodo de adsorcin al papel de fosfocelulosa, ya que el compuesto resultante de la actuacin del enzima, aminoglicsido modificado y marcado radiactivamente, se une de forma covalezne a un soporte de fosfocelulosa, pudiendo medir en l la radiactividad que estar en relacin con la presencia del enzima (209). Para diferenciar los distintos enzimas modificantes de aminoglicsidos se utilizaron los criterios recogidos por Miller y cols. (375) en 1980, Eryan (82), PtlIips y Shannon Simuzi y cols. (528) un afio despus y Baquero y mIs. (29) en 1989. 6.1.1.- Actividad acetiltransferasa. Se emple como cofactor acetilcoenzima A marcado radiactivamente (FI.4C]-AcCoA 6 mCi/mmol, Amersham International plc, Amershani, UK). La solucin radiactiva de trabajo se ajust a IgiM/ml con AcCoA no marcado (Boeheringer Mannheim Gmbh, Alemania) siendo la concentracin final de AcCoA en la reaccin de 0,825mM. La reaccin de acetilacin del grupo amino del aininoglicsido se desarrollo en placas de microtitulacin en presencia de Tris-malato a
4giCi/giM,

(457)

en 1984,

una concentracin final 0,1 M pH 5,7;

mM y D~ (ditiotreitol) 2,5 mM (25 gil). La 0C concentracin final del aminoglicsido fue de 0,416 mg/ml (10 gil). Esta mezcla se incub a 37 durante 30 minutos en presencia de 25 gil del extracto crudo sonicado de las cepas estudiadas, siendo el volumen final de la reaccin de 60 gil. Se transfiri una alcuota de 25 gil de la mezcla resultante
2 10

MgCI

sobre un papel de fosfocelulosa de 1 cm2 (Whatman PSi, Balston Ltd, UK). Tras unos segundos a temperatura ambiente se sumergi 1-2 minutos en agua destilada a 80 C. Una vez lavados los papelillos de fosfocelulosa varias veces con agua destilada para eliminar el compuesto radiactivo que no hubiese reaccionado, se procedi al secado de los mismos en estufa a 60 0C. La lectura se efectu en presencia de lquido de centelleo en un contador de radiactividad (Spectrometre a scintillation liquide SL 30, Intertechnique, Plaisir, Francia). Para cada extracto crudo sonicado de las cepas originales y sus transconjugantes se emple agua destilada como control en lugar de la solucin de antibitico. 6.1.2.- Actividad nucleotidiltransferasa. Para estudiar la nucleotidilacin del grupo hidroxilo de los aminoglicsidos se emple trifosfato de adenosina marcado [l-14C]-ATP 500 mCi/mniol (Amersham International plc, Amershan, UK). Se ajust la solucin radiactiva de trabajo a 4 giCi/gimol,2giM/ml con ATP no marcado (Sigma, St. Louis Ltd. MO) siendo la concentracin final de ATP en la reaccin de 0,33 mM. La reaccin de 68

Material y mtodos

nucleotidilacin del aminoglicsido y su lectura se desarroll en los mismos trminos expresados en el apanado anterior en presencia de Tris Cl a una concentracin final de 0,1 M pH 7,8; MgCI2 7,5 mM, UIT 2,5 mM y 0,416 mg/ml de antibitico. 6.1.3.- Actividad fosfotransferasa. Como cofactor en la reaccin de fosforilacin de grupos hidroxilos se emple ATP marcado 32P]-adenosina trifosfato 3000 Ci/mmol, Amersham International plc, Amershan, radiactivamente ([aUK). Se ajust la solucin radiactiva de trabajo hasta obtener 110 cpm/pmol con ATP no marcado (Sigma, St. Louis Ltd. MO) siendo la concentracin final de ATP en la reaccin de 0,825 mM. La mezcla de reaccin est compuesta por tampn cacodilato a una concentracin final de 0,1 M pH 7; MgCI 2 7,5 mM, UIT 2,5 mM y una concentracin final de antibitico de 0,104 mg/mI. El proceso es idntico a los anteriores, realizndose en este caso la lectura sin necesidad de aadir lquido de centelleo. 6.2.- Resistencia a quinolonas: mutaciones en gyrA. En el estudio de la resistencia a quinolonas se determin la sensibilidad al cido nalidxico, norfioxacina, ciprofloxacina, temafloxacina, ofloxacina y esparfioxacina por la tcnicas de dilucin en agar (399) y difusin por disco (396). Asimismo, se identific la posible implicacin de alteraciones en la subunidad gyrA en las cepas con resistencia al cido nalidixico. Para ello, se siguieron las observaciones de Hane y Wood (217) que encontraron que los alelos sensibles al cido nalidixico de gyrA eran dominantes sobre los correspondientes alelos resistentes. Con posterioridad Nakamura y cois. (392) introdujeron un plsmido con un gen gyrA salvaje en una cepa con mutacin gyrA que conferia resistencia al cido nalidixico, demostrando que revena a un fenotipo sensible. En nuestra experiencia, se utiliz el plsmido pEGRiOl
(67)

(cedido gentilmente por J.

Blzquez, Hospital Ramn y Cajal, Madrid) con el gen vrA salvaje de E. coil K12 donado en el
vector pACYC184 (132) junto con el gen ap/iAl, que confiere resistencia a la kanamicina. La

introduccin del plsmido pBGB1OI en las correspondientes clulas competentes de las estirpes
resistentes se realiz por electroporacin. La preparacin de las clulas competentes se llev a cabo

segn se expresa en el apanado 5.2.3.. La disminucin del valor de las CMI de las diferentes quinolonas demostr la presencia de mutaciones vrA.

69

Material y mtodos

6.3.- Resistencia a tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y fosfomicina. La incidencia de resistencia a tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprim y fosfomicina en las cepas productoras de BIPEA y en sus respectivos transconjugantes se realiz estudiando el perfil de sensibilidad por las tcnicas de dilucin en agar (399) y difusin por disco (398).

7.- ANALISIS EPIDEMIOLOGICO. 7.1.- Datos microbiolgicos.

Se analiz el nmero de microorganismo con BIPEA, as como el gnero, especie y origen clnico de los mismos. Este anlisis discierne tanto los aislamientos nicos de un solo microorganismo en una sola muestra y en una sola fecha como los aislamientos mltiples de slo un microorganismo en muestras distintas y fechas diferentes.

7.2.- Pacientes y factores asociados.

Se revisaron los datos clnicos (historia clnica) de los pacientes con Enrerobacteriaceae con BIPEA, agrupndose segn su origen en pacientes de servicios quirrgicos o unidades de cuidados intensivos, de servicios del rea mdica y pacientes atendidos en el Servicio de Urgencia o por las consultas externas del Hospital (origen extrabospitalario). De acuerdo con los datos recogidos en la historia clnica se determin si existan criterios de infeccin o se trataba de una colonizacin bacteriana (74). Asimismo, se analiz la duracin de la estancia hospitalaria, el tratamiento antibitico previo al aislamiento, duracin del mismo, as como el tratamiento posterior al aislamiento de las cepas con BIPEA y la evolucin clnica.

8.- METODOS ESTADSTICOS.

El estudio estadstico de la evolucin de la sensibilidad a los antibiticos 8-lactmicos se realiz con el programa de estadstica SIGMA (versin R-SIGMA, Horus Hardware, 1990), considerando diferencias significativas a aquellos valores de p inferiores a 0,05 (prueba de la x%. La correlacin entre los valores de actividad enzimtica y CMI para cefotaxima y ceftazidima y el clculo de la correspondiente recta de regresin se realiz con el programa de estadstica PRESTA (versin 2.2,
FIS, 1991).

70

RESULTADOS

Resultados

1.-

INCIDENCIA Y EVOLUCION DE LA SENSIBILIDAD-RESISTENCIA ANTIBIOTICOS il-LACTAMICOS EN Enterobacteri.aceae (1987-1992).

La incidencia de aislamientos resistentes durante el perIodo 1987-1992 de 11 especies de Ernerobacerioceae frente a 8 antibiticos B-lactniicos, de acuerdo con los puntos crticos de resistencia establecidos queda reflejada en la TABLA 9. La evolucin de la sensibilidad, por especie, durante este sexenio se recoge en las TABLAS l0~20, resaltndose en las FIGURAS 1-3 algunos de los aspectos ms sobresalientes.

TABLA 9.- Incidencia de aislamientos resistentes (%) a antibiticos 8-lactrnicos en Enrerobacreriaceae en el Hospital Ramn y Cajal (1987-1992).

~hcroorgansmo

NS

AH? > 16a

56,2 19,6 36,9 98.0 98,2 97,2 89,2 92,8 81,8 98,3 98,6

TIC 232
55,6 18,9 24,9 97,7 97,5 45.4 24,9 56,0 35.4 16.8 37,1

AHC 216/8

KFZ 28 216
. . 12.4
10,1 37.8

CXN
216 2,2 2,0 2,1 5.4 10.7 90,0 37.5 53,5 27,7 87,4

FOX

CTX

CAZ

28 4.2 0.6 . . . .

216 . . 0,9 2,7 1,5

21 1.6 2.6 0.3 3,4 2.2

22 . . . . . .
21,9 35,9 26.1 18,4

=4 . . . . . .
. . . .

21 1.6 3,1 1,0 4.3 2,2

22

E. enIl Sal.<nelld spp. P. ,nrabilis X. pneuwoniae A. oxytoc 1. vulgaris E. cloaeae E. erogenes C. f<rjndii It. . rganhi 5. &srceSCeflS

14.234 959 2.634 1.674 693 240 1.380 254 520 595 1.060

24,6 13,6 8.2 7,3 10,3 13,5 14,6 93.4 90.7 83,1 95,9 98,7 . . . . . 3,9 .
. .

95.4 96.1 90,4 90,0 98,4 99.7

3.3 14,1 94,7

. . . .

3.4
. . . . .
r~

19,5 43,3 21,2 17,7 10,8

. . .

94.1 90.2 22.5

kH?: awpiciiina; CX~: cefuroxima;

~: untos

CrIticO8

98,6 . 85.2 . . 22.5 TIC: ticmrcilina; KFZ: cd CkZ: ceftazidima. MC: amoxicilina/el&vuinico:otaxima; FOX: cefoxitina; CTX: cef 1)~ de resistencia (vg/~

71

Resultados

1.1.- Eseherichia cot.

El

56,2% de los 14.234 aislamientos de E. col! estudiados en nuestro hospital desde 1987 hasta 1992

fueron resistentes a la ampicilina, el 55,6% lo fueron a la ticarcilina y el 13,6% a la cefazolina. Por el contrario, menos del 2% fueron resistentes a la cefotaxima y la ceftazidima (TABLA 9). Durante estos aos, se observ una disminucin progresiva del nmero de aislamientos resistentes ala ampicilina (=16 gig/ml): 60,2% en 1987 y 54,3% en 1992 (p<O,OOl). En paralelo, es de resellar el aumento de aislamientos inhibidos por una concentracin de ampicilina de 2 gig/ml (pc0,001). Este hecho tambin se constat al analizar la distribucin en las diferentes concentraciones de la asociacin amoxicilina/cido clavulnico: en 8/4 gig/ml aument significativamente el nmero de aislamientos (p<O,00l) desde el 25,7% en 1987 al 34,5% en 1992 y disminuyeron aquellos con una CMI superior a 16/8 g/ml, 7,3% en 1988 y 4,1% en 1992 (p<O,OI). El descenso del nmero de microorganismos resistentes fue ms significativo (p<0,0O1) cuando se consideraron CMI superiores o iguales a 16/8 gig/ml, 31,5% en 1987 frente a un 18,0% en 1992. Con respecto a la ticarcilina tambin se observ una disminucin del nmero de aislamientos resistentes (=32 gig/mfl: 59,9% en 1987 y 54,2% en 1992 (p<0,00l) (FIGURA 1). Los valores obtenidos para la cefazolina (=8gg/ml) indicaron, asimismo, una reduccin de la resistencia: 17,8% en 1987 frente a un 9,8% en 1992 (p<0,00l). Nuevamente, en concentraciones intermedias. 1 y 2 gig/ml, se elev el porcentaje de aislamientos inhibidos, 36.2% y 23,9% en 1987 y 45,6% y 29,1% en 1992. Frente a la cefuroxima, aument tambin el nmero de microorganismos inhibidos por una concentracin crtica intermedia (2 .tg/ml), 44.5% en 1987 y 64,1% en 1992 (pcO,O0l). Para valores de CMI ms altos (=16gig/mi) no existieron modificaciones. El aumento del nmero de aislamientos inhibidos por 2 gig/m] de cefoxitina fue paralelo al que se produjo con 2 gig/ml de cefuroxima. La media de aislamientos resistentes a la cefoxitina (=8gg/mi) fue del 4,2%, mximo del 5,9% en 1990 y mnimo del 3,6% en 1992. La incidencia de resistencia a la cefotaxima y ceftazidima fue, en general, baja y no se modific sustancia]rnente durante el periodo de estudio. Para cefotaxima el porcentaje de aislamientos inhibidos por una concentracin superior a 2 gig/ml fue inferior al 1% en todos los aos, no incrementndose de forma significativa al considerar una concentracin de 0,5 y 1 gig/mi, 2,0% y 1,6%, respectivamente (TABLA 21). El porcentaje de aislamientos con CMI superior o igual a 1 gig/ml de ceftazidima fue del 2,2% con un valor mximo del 2,6% durante 1989 y 1990.

72

Resultados

FIGURA 1.- Evolucin de la resistencia a B-lactniicos en Escher!chia col! y Salmonella spp. a) Escherichia cot
% .i.I.mhoW. r.M.t.o1.
00
% ~

b) Salmonella
% aiaIsmI.et. m.i.t.,t.. -

8p0.

.&mMcIIin. (16 ugfml)

TIcsnIIh,. (32 111/mi)

E~o.ffihb OPEA (3 nZO*J

40~

40-

AmpIdIn. <6 ugInui) 20-

C.tcIIna <4 ughnt)

20-

flo.rtIIIna (32 Mg~fiuI)

(6 sg/mI)
1187 9986 1969 lIGO 1991 1992 Ao 198? lasa 1989 logo itti 1992 Ao <>1 ug/mI)

Ampicilina

ricarcliria

~ Gefamlina

Ceftazidima

1.2.-Salmonellaspp.. La tasa de resistencia a la ampicilina (19,6%) fue sensiblemente inferior a la observada en E. col! (56,2%). Adems en Salnzonella spp. la resistencia a la ampicilina aument a lo largo del periodo de estudio desde el 11,1% en 1987 al 25% en 1992 (pc 0,001) con un mnimo del 8,2% en 1990 y un mximo del 27,9% en 1989. Una epidemia por Salmonella ar!zonae productora de BIPEA ocurrida en 1989 elev la tasa de resistencia a la ampicilina y el resto de los antibiticos Blactmicos: ticarcilina, 27,9%, frenteauna media en el sexenio del 18,8%; cefazolina, 9,6%, media 3,9%; cefuroxima, 3,1%, media 2,0%; y en panicular la ceazidima, 12,2%, media 3,1% (FIGURA 1). Por otra parte, las modificaciones que se observaron en E. col! al considerar concentraciones intermedias de antibitico slo se manifestaron en Salmonella para la cefoxitina (2 gig/nl]) (p.(0,001). 1.3.- Proteus mubiis. La tasa de resistencia a la ampicilina en esta especie (36,9%) ocup un lugar intermedio entre la observada en E. col! y en Salmonella spp. (TABLA 9). Se evidenci una estabilidad de los valores de sensibilidad para la ampicilina y anioxicilina/clavulnico a lo largo del sexenio, si bien, se observ una disminucin significativa (p.C0,001) de la resistencia a la cefazolina de ms del 10%. Es de destacar, que en el ao 1987 se obtuvieron las cifras mximas de resistencia a la cefazolina (19,1%), cefuroxima (4,3%), cefoxitina (1,8%) y ceftazidima (1,2%). 73

Resultados

1.4.- Klebsiella pneumonbe y lUebsiella oxytoca. En ambas especies, la resistencia a la ampicilina y la ticarcilina fue cercana al 100%, siendo los aislamientos de K oxyroca significativamente ms resistentes (=16 g/ml) a la cefazolina (37,8%) y la cefuroxima (10,7%) que los de K. pnewnoniae (10,1 y 5,4%, respectivamente) (FIGURA 2). Con independencia de este hecho se redujo el nmero de microorganismos con resistencia a la cefazolina: 16,7% en 1987 y 11,9% en 1992 (p<O,OS) para K. pneumoniae y 55,9% en 1987 y 36,8% en 1992 (p.c 0,01) para K. oxyroca. Asimismo, en 1<. oxy:oca disminuy el nmero de aislamientos resistentes a la amoxicilina/clavulnico: 19,2 % en 1988 y 9,3% en 1992 (p<0,0l). En este gnero y al igual que en E. col! se produjo una elevacin del nmero de aislamientos inhibidos por concentraciones criticas intermedias. En K. pnewnontae, si consideramos 1 pg/ml de cefazolina, 2 gg/mi de cefuroxima y 2 pg/ml de cefoxitina se observ un aumento significativo (pCO,05) del 13,3%, 11,2% y 5,4%, respectivamente. Asimismo, en K. oryboca a una concentracin crtica de 2 hg/ml de cefazolina, cefuroxima y cefoxitina el aumento fue del 11,1%, 11,2% y 5,4%, respectivamente. Es de resaltar que, an sin significacin estadstica, el nmero de aislamientos con menor sensibilidad a la cefotaxima (>2 gg/ml) y ceftazidima (=1pg/mJ) en 1<. pneumoniae fue mayor en 1992 que en 1987. Por el contrario, la sensibilidad a la cefotaxima y ceftazidima en 1<. oxytoca se mantuvo con pocas variaciones a lo largo del perodo de estudio. FIGURA 2.- Evolucin de la resistencia a B-lactmicos en Klebsella. a) KIebsielIa pneun,oniae
00 60
-

b) KIebsieIIa oxytoca

40

--

40

c.n=a.
20

bu pg1I>

1657 1985 559 1990 591 592

A*,njS.v. <.19/8 nt0

20<.19 .VS
(1

Amwcv.Q1418 uglmil
Cfwoxbfla <16 ug/mI)

C.fwfl,.

C.ttarIdM,a

flMtO o
1987 1988 1989 1990

cftnWIm. <1 ug/mI) 1991 1992 Ao

Ao

Amox./c(av.

Cefazolina

Cefuroxima

Cal tazidima

74

Resultados

1.5.- Proteus vulgaris. El bajo nmero de aislamientos por ao con respecto a otras especies de Enterobacteriaceae impidi apreciaciones muy precisas en la evolucin de la sensibilidad y la constatacin de patrones de resistencia uniformes a lo largo del perodo estudiado. No obstante, es de resaltar el alto nmero de aislamientos con resistencia a la cefuroxima (>90%) y el mayor porcentaje de cepas resistentes a la cefotaxima con respecto a la ceftazidima, siendo estas ms numerosas en 1988 y en 1990. Asimismo, en estos mismo aos se alcanz el mayor porcentaje de cepas con resistencia a la asociacin de amoxicilina/cido clavulnico: 20,0% en 1988 y 18,9% en 1990. 1.6.- Enterobacter clin cae y Enterabaeter aerogenes. La resistencia a la ampicilina, amoxicilina/clavulnico y cefazolina en E. cloacae no sufri modificaciones importantes con valores medios del 89,2% (rango 87,6-92,1%), 93,4% (91,3-94,8%) y 96,1% (94,3-97,6%), respectivamente. Frentealaticarclina, media 24,9%, y cefuroxima, media 37,5%, se obtuvieron cifras mximas de resistencia en el ao 1991, 33,7% y 46,1%, respectivamente. Asimismo, en 1991 la resistencia a la cefotaxima (>2 gg/ml, 30,5%) y ceftazidima (=2gg/ml, 29,1%) alcanzaron los valores ms altos. Por el contrario, las cifras mnimas de resistencia estuvieron marcadas por el inicio y el final del perodo (FIGURA 3). En E. aerogenes los valores medios de resistencia fueron mayores que los obtenidos en E. cloacae: ticarcilina, 56,0%; cefotaxima, 35,9% y ceftazidima, 43,3% (TABLA 9 y FIGURA 3). El mayor nmero de aislamientos resistentes a estos tres antibiticos se obtuvo en 1987, detectndose tambin ste mismo ao el mximo porcentaje de resistencia a la cefuroxima (69,2%) (FIGURA 3). 1.7.- Citrobacterfreundii. Ms del 20% de los aislamientos de C. freundil fueron resistentes a la cefotaxima y ceftazidima (TABLA 9), obtenindose las cifras mximas en el ao 1990 (FIGURA 3). En 1992 se observ una tasa de resistencia inferior a la de 1987 (pC0,001): 28,6% frente a un 52,3% para la ticarcilina; 20,8% frente a un 30,1% para la cefotaxima (>2 gg/mI) y 26,6% frente a un 42,8% para la ceftazidima (= 1 gglnd). La cefuroxima sigui una trayectoria similar con un mximo de resistencia en 1990 (34,5%) y un mnimo en 1992 (24,2%).

75

Resultados

FIGURA 3.- Evolucin de la resistencia a 8-lactmicos en Enrerobacrer cloacae, Enrerobacrer aerogenes, Cftrobacrerfreundii, Morganella morganh y Serrara marcescens.

a) Ehterobacter o/sacie
loo 80 60 40

b) Enterobacter aerogenes
loo 80 1 .L.bml.to. mM.tfl.
_____

1 aakminlo. me.t..t..
-_______

CfoxIth,. (16 uulml>

- --~

C.foxIIba (le 119/mi>

_

--

60 Cfljmxhs <II ug/mI>

-

TIcwtILIn. --t>8t~/mf>

C.turoxknt (16 ua/mI>

-- - -

40 20 o
-

c.fou,lm. (2 ug/ml)

TInnlib.. C.fotnlm. <>2 ugImI) o

1987 1988 1889 1990 991 1992

(>42 uo/mI) Ao 1987 1968 1989 1990 1991 992 Ao

c) Citrobacter freundll
1 .i.Inl.oto. rnatotn 100 80 60 TIctjtflln. (32 uo/mI) 40 20 o
-

d) Morganella morganil
1 uisL.mlrlos rnjtq~t 100

C.foxltlo. (18 uIml>

60 80 40 20 029g/nul>
-

CflHVXlm. <16 Mg/m)

>,~/s<.foxltln.

(>16 sg/mI>

1987 1968 1989 1990 1991 1992

Ao

<32

e) Serrat/a maroescena
100 80 0 40 20 laIsiaml.nto. m.J.l.ct..
_____

C.fuw,hn <16 jo/mI>

C.fwclth. <.16 .g/ml) Tkutflbi. (82 sg/ml)

--- -

-~

Cefoxitina Ticarcilina Cefuroxima

-~

--------

Cefot.xln.a (>2 igiml) o 1987 1988 1989 1990 1891 1992 Ao

Cefotaxima

76

Resultados

1.8.- Morganella morganil. La prctica totalidad de los aislamientos de M. morganh! fueron resistentes a la ampicilina, amoxicilina/clavulnico y cefazolina, con una resistencia media para la cefotaxima y ceftazidima (=2gg/ml) del 18,4% y 17,7%, respectivamente. El ao 1990, al igual que en C. freundil, marca un punto de inflexin en cuanto a la resistencia a 8-lactmicos. Tras una disminucin del nmero de aislamientos con valores de CMI superiores a 2 gg/ml de cefotaxima y mayores o iguales a 1 gg/ml de ceftazidima en los aos 1988 y 1989 respecto a 1987, se alcanzaron cifras mximas en 1990, 25,3% (cefotaxima) y 32,9% (ceftazidima). En 1991 se produjo una disminucin de la resistencia a ambos antibiticos, tendencia confirmada en 1992. Es de resaltar que en este ltimo ao las cifras obtenidas, 12,4% para cefotaxima y 15,9% para ceftazidima, marcaron el mnimo del sexenio (FIGURA 3). Este mismo hecho se observ con la ticarcilina, obtenindose las cifras mximas de sensibilidad en 1992, 90,2% (p<O,OI). 1.9.- Serratia marcescens. La resistencia media a la ampicilina, amoxicilina/clavulnico, cefazolina y cefuroxima fue superior al 95%, observndose ms de un 20% de aislamientos con resistencia a la cefotaxima. El ao 1992 marc el mnimo de resistencia, con diferencias significativas (pCO,OOl) en relacin a los valores obtenidos en 1987: ticarcilna, 22,6% en 1992 frente a un 42,8% en 1987 y cefoxitina, 71,6% frente a un 95,7%. Estas diferencias fueron menores al analizar la resistencia a la cefotaxima y ceftazidima.

77

Resultados

TABLA 10.- Escherichia cali: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

E. col Ao 1987 1989 1929 1990 1991 1992 n~ 2.096 2.598 2.618 2.021 2.379 2.522 s 9,5 4,6 5,9 4,9 9,2 4,6 6,4 6,4 AIWICILINA 2 21,6 25,6 28,6 29,3 30,4 31,0 27,8 34,2 4 7,5 11,2 8,6 10,6 5,3 8,7 8,7 42,9 CMI (pg/ml> 8 1,2 1,6 0,5 0,3 0,5 1,1 0,9 43,8 16 0,8 0,4 0,3 0,2 0,2 0,3 0,3 44,1 >16 59,4 56,6 56,1 54,7 54,4 54,3 55,9 100

TOTAL 14.2341 ~e acumulado

E. ccli AJ4OXXCILINA/cLAVULANICO cMI (pg/ml) Ao nR s4/2 8/4 16/8 >16/8 1987 1988 1.246 42,8 25,7 24,2 7,3 1989 1.481 45,0 23,1 24,0 7,9 1990 2.021 49,5 27,0 18,3 5,2 1991 2.379 48,4 27,3 20,4 3,9 1992 2.522 47,5 34,5 13,9 4,2. TOTAL] 9.649~ 47,1 28,3 19,3 5,3 % acumulado 47,1 75,4 94,7 100

E. ccli Ao nR 1987 2.096 1988 2.598 1989 2.618 1990 2.021 1991 2.379 1992 2.522 T0TAL~14.234~ % acumulada

TICARCILINA s8 16 39,2 0,9 42,6 1,5 43,4 0,7 45,1 0,5 45,3 0,5 45,4 0,4 43,6 0,8 43,6 44,4

CMI <pg/ml> 32 64 1,3 0,6 0,7 0,7 0,2 0,1 0,2 0,4 0,2 0,2 0,2 0,3 0,4 0,3 44,8 45,1

>64 58,0 54,5 55,6 53,8 53,8 53,7 54,9 100

E. 0011 Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n 2.096 2.598 2.618 2.021 2.379 2.522 2 50,5 8,2 2,3 4,5 2,6 2,4 3,4 3,8 3,8

CEFAZOLINA 1 2 36,2 44,3 42,3 41,3 40,9 45,6 42,0 23,9 24,8 27,5 26,4 29,9 29,1 26,9

CMI 4 13,9 14,2 13,5 14,8 14,2 12,1 13,7

<pg/ml) 8 7,1 6,8 6,2 7,4 6,1 4,7 6,4 92,5

16 4,1 3,7 2,4 2,6 2,4 1,8 2,9 95,7

>16 6,6 3,9 3,6 4,9 4,1 3,3 4,3 100

TOTAL14.2341 % acumulado

45,8

72,7

86,4

78

Resultados

TABLA

10.- Escherichi,a cdi (continuacin).

E. Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 coil n~ 2.096 2.598 2.618 2.021 2.379 2.522 s 32,8 16,5 26,1 19,5 14,2 12,9 20,1 20,1 CEFUROIIMA 2 44,5 51,9 56,7 54,6 60,4 64,1 55,7 75,8 4 15,9 24,6 13,6 19,2 19,7 17,6 18,5 94,3 CMI (pg/ml) 8 3,4 4,4 2,2 4,6 3,3 3,7 3,5 97,8 16 1,3 1,2 0,7 1,4 1,0 0,6 1,0 98,8 >16 2,1 1,4 0,7 0,7 1,4 1,1 1,2 100

TOTAL]14.234] % acumulado

E. Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992

coli n 2.096 2.598 2.618 2.021 2.379 2.522 2 51 21,2 11,7 18,5 8,9 5,6 5,9 11,9

CEFOXITINA 2 4 60,4 65,1 68,5 67,1 73,2 75,2 68,5 80,4 13,6 18,5 10,6 18,1 16,8 15,3 15,4

CMI

(pg/ml> 8 16 2,5 3,0 1,9 4,3 2,6 2,0 2,7 98,5 1,0 1,1 0,1 0,9 0,5 0,9 0,7 99,2

>16 1,3 0,6 0,4 0,7 1,3 0,7 0,8 100

TOTAL]14.234] % acumulado

11,9

95,8

E. coil Ao n~ 1987 1.645 1988 2.598 1989 2.556 1990 2.021 1991 2.379 1992 2.522 TOTAL]13.72)i] % acumulado
E. cali Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n~ 675 2.598 2.618 2.021 2.379 2.522

CEFOTAXINA CMI (~ag/ml> 52 4 8 16 32 >32 99,2 0,6 0,2 99,5 0,2 0,1 0,03 0,07 99,6 0,2 0,03 0,1 0,03 0,03 99,7 0,2 0,1 99,6 0,3 0,08 0,04 99,8 0,1 0,08 0,04 99,6 0,2 0,1 0,04 0,02 0,04 99,6 99,8 99,9 99,9 99,9 100
CEFTAZIDLMA 50,5 98,7 97,8 97,3 97,4 97,5 98,5 1 1,0 1,0 1,9 1,4 1,3 0,7 CMI <ig/mhl 4 0,3 0,9 0,6 0,9 1,0 0,7 16 0,3 0,1 0,2 0,2 0,1 >16 0,03 0,1 0,04 0,04

TOTALI12.8131 % acumulado

97,8 1,2 91,8 99,0

0,8 99,8

0,1 0,04 99,9 LOO

79

Resultados

TABLA 11.- Solmonella spp.: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

Salmonella spp. AXPICILINA CMI Qag/mI> Ao n2 s 2 4 8 16 >16 1987 208 76,9 10,1 1,9 0,5 10,6 1988 182 74,2 7,2 0,5 18,1 1989 197 70,1 2,0 27,9 1990 98 80,6 11,2 8,2 1991 147 71,4 2,0 0,7 0,7 25,2 1992 127 58,9 16,1 25,0 TOTAL] 959 72,2 7,5 0,6 0,1 0,1 19,5 % acumulado 72,2 79,7 80,3 80,4 80,5 100

Salmonel.Za spp. AJ4OXICILINA/cLAVULAR. CMI(~Jg/m1) 54/2 8/4 16/8 >16/8 Ao n2 1987 1988 1989 139 77,9 9,3 2,0 10,8 1990 98 92,8 5,1 2,1 1991 147 82,2 8,9 8,2 0,7 1992 127 81,6 10,5 7,1 0,8
TOTALF 511 % acumulado
83,2 8,6 5,1 3,1

83,2

91,8

93,9

100

Salmonella spp. TICARCILINA Ao n2 58 16 1987 208 90,4 0,5 1988 182 79,7 2,8
1989 1990 1991 1992 TOTAL] 197 98 147 127 959 72,1 91,8 74,8 75,0 1,1

0241 (pg/ml) 32 64
0,5

>64 9,1 17,5

27,4 7,1 25,2 25,0

80,4
80,4

0,7
81,1

61,1

0,1
81,2

18,8
100

% acumulado

Salmonella spp. Ao n2 sO,5 1987 208 1,4 1988 182 9,9 1989 197 10,4 1990 98 3,1 1991 147 0,7 1992 127 1,6
TOTAL 959 4,9 4,9 % acumulado

CIFAZOLINA 1 2 66,9 26,9 67,1 18,7 41,9 33,6 87,7 7,1 67,3 24,5 66,2 20,2
63,9 23,5 92,3 68,8

CMI (~g/m1) 4 8 16 2,9 2,2 0,5 4,5 0,5 0,5 2,1 6,1 0,7 4,8 4,0 0,8
3,8 96,1 0,8 96,9 0,2 97,1

>16 1,9 1,6 8,6 0,7 2,4

2,9 100

80

Resultados

TABLA 11.- Salmonella spp. (continuacin).

Salmonella spp. CEFUROXINA CMI <pg/ml) Ao n~ Sl 2 4 8 16 >16 1987 208 33,2 55,8 8,2 2,8 1988 182 1,1 31,9 57,7 8,2 1,1 1989 197 9,1 29,9 43,2 14,7 3,1 1990 98 7,1 58,2 32,6 2,1 1991 147 3,4 42,9 42,9 8,8 2,0 1992 127 42,8 40,3 15,3 1,6 TOTAL] 959 J 3,3 37,6 47,2 9,9 2,0 1 acumulado 3,3 40,9 88,1 98,0 100

.Salmonella spp. CEFOXITINA CMI (pg/ml> Ao n2 =1 2 4 8 16 1987 208 43,3 51,5 4,8 0,4 1988 182 54,9 39,2 5,4 0,5 1989 197 44,3 49,7 5,5 0,5 1990 98 20,4 77,4 1,1 1,1 1991 147 13,6 80,9 4,1 1,4 1992 127 12,1 83,1 4,8
TOTAL[ 959 34,6 34,6 60,2 94,8 4,6 99,4 0,6 100 % acumulado

>16

Salmonella spp. CEFOTAXIMA CMI (pg/ml> Ao n~ s2 4 8 16 32 1987 208 100,0 1988 182 100,0 1989 197 90,4 6,6 3,0 1990 98 100,0 1991 147 99,3 0,7 1992 127 100,0
TOTAL 959 97,9 97,9 1,4 99,3 0,7 100 % acumulado

>32

.Salmonella spp. Ao n2 50,5 1987 61 98,4 1988 182 99,4 1989 197 87,8 1990 98 100,0 1991 147 97,9 1992 127 100,0
TOTAL] 812 96,4 96,4 1 acumulado

CtFTAZIDIXA 1 1,6 0,6 1,4

0,5 96,9

CMI (pg/ml) 4
96,9

16

>16 12,2 0,7

3,1 100

96,9

81

Resultados TABLA 12.- Proteus mirabilis: % de aislamientos sensibles por concentracin antibitico.
P. mirabilis Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 393 498 457 384 447 455 51 57,1 54,6 58,4 58,3 60,2 51,9 56,7 AMPICILINA 2 4,6 8,4 3,5 4,7 2,0 9,2 5,5 62,2 4 1,8 0,8 0,5 0,4 0,5 0,6 62,8 CMI <pg/ml) 8 0,7 0,4 0,7 0,2 0,3 63,1 16 0,2 1,2 0,4 1,3 1,1 0,5 0,8 63,9 >16 35,6 34,6 37,0 35,2 36,3 37,7 36,1 100

TOTALf 2.6341 56,7 % acumulado

P. mirabilis Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 194 457 384 447 455

AI4OXICILINA/CLAVULASICO CMI(pg/m) s4/2 82,4 85,7 87,8 85,4 85,3 85,6 85,6 8/4 8,4 7,2 4,2 7,2 8,7 7,1 92,7 16/8 4,6 4,9 4,4 3,6 3,7 4,2 96,9 >16/8 4,6 2,2 3,6 3,8 2,3 3,1 100

TOTAL]1.937 % acumulado

P. mirabilis Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n~ 393 498 457 384 447 455

TICARCILINA =8 66,2 70,1 67,1 70,0 69,6 68,3 16 5,6 5,6 7,4 6,8 5,8 8,0

CMI (pg/m) 32 4,3 4,2 6,5 4,9 4,7 5,3 64 4,6 4,4 6,1 5,5 4,5 4,6 >64 19,3 15,7 12,9 12,8 15,4 13,8

TOTAL 2.634J % acumulado

68,6 68,6

6,5 75,1

5,0 80,1

4,9 15,0 85,0 100

.p. mirabilis Ao n~ 1987 393 1988 498 1989 457 1990 384 1991 447 1992 455
TOTAL] 2.6341 % acumulado

CEFAZOLINA =0,5 1 2 0,2 1,3 33,3 0,8 43,5 0,9 52,0 0,2 1,8 51,6 1,6 52,1 0,5 1,8 50,8
0,2 0,2 1,3 1,5 47,3

CMI <pg/rnJ.) 4 8 16 >16 40,5 5,6 4,3 14,8 35,5 7,4 3,8 9,0 27,1 9,2 3,5 7,3 25,9 7,5 3,3. 9,9 29,3 5,6 2,5 8,9 30,6 7,8 1,1 7,4
31,5 80,3 7,3 87,6 3,0 90,6 9,4 100

48,8

82

Resultados

TABLA 12.- Proteus mirabilis (continuacin).

P. mirabilis Ao 22~ 1987 393 1988 498 1989 457 1990 384 1991 447 1992 455 TOTAL[ 2.634 % acumulado CEFUROXINA CMI <pg/nil) =1 2 4 8 16 85,8 8,4 1,5 0,8 83,4 12,4 1,8 0,4 90,4 7,6 0,9 0,2 85,4 12,5 0,5 0,5 82,8 11,9 2,0 0,2 0,7 88,2 8,1 1,4 0,7 86,0 10,2 1,4 0,3 0,3 86,0 96,2 7,6 97,9 98,2 >16 3,5 2,0 0,9 1,1 2,4 1,6 1,8 100

P. mirabilis Ao n2 1987 393 1988 498 1989 457 1990 384 1991 447 1992 455
TOTAL[ 2.6341 % acumulado

=1 2,0 0,4 2,6 1,6 0,2 1,2

1,3

CEFOXITINA cMI (/Jg/ml) 2 4 8 16 72,6 21,1 2,5 0,5 74,7 21,7 2,8 0,4 78,1 17,1 1,3 0,9 76,1 19,0 2,8 0,5 74,4 22,0 2,4 0,6 66,0 29,6 2,5 0,5
73,6 74,9 21,8 96,7 2,4 99,1 0,6 99,7

>16 1,3 0,4 0,2

0,3 100

1,3

P. mirabilis Ao n2 1987 355 1988 498 1989 457 1990 384 1991 447 1992 455
TOTAL 2.596] % acumulado

=2 99,8 99,8 99,6 97,7 99,8 99,8

99,8

CEFOTAXIMA 4 0,2 0,2 0,4 0,3 0,2 0,2

0,2 100

CMI (pq/rnl> 16 32

>32

99,8

P. mirabilis Ao n~ 1987 81 1988 498 1989 457 1990 384 1991 447 1992 455

CEFTAZIDIMA =0,5 1 98,8 1,2 99,2 0,4 99,0 0,8 99,0 0,5 99,0 0,4 99,2 0,6

CMI (pg/ml) 4 0,4 0,2 0,5 0,6 0,2

16

>16

TOTAL]2.322 % acumulado

99,0 0,6 99,0 99,6

0,4 100

83

Resultados

TABLA 13.- Klebsiellapneumoniae: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

1<. pneumoniae AMPICILINA CMI (pg/m) 2 =1 2 4 8 16 Ao n 1987 228 1,7 0,4 0,9 2,2 1988 1989 1990 1991 1992 258 292 269 325 302 0,4 1,3 0,6 0,6 0,6 2,3 0,3 0,9 1,5 0,3 1,2 1,5 0,3 0,9 1,1 0,8 2,0 9,0 1,4 1,5 4,0 3,8 >16 94,8 86,8 97,0 97,0 94,5 95,1

TOTAL] 1.674j % acumulado

3,6 94,4 5,6 100

E. pneumoniae Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL] n2 113 275 269 325 302 1.284[

ANOXICILINA/CLAVULANICO CMI(bg/mJ.) =4/2 77,8 70,8 76,2 81,5 77,5 78,2 77,6 8/4 9,5 13,4 10,0 9,2 14,0 11,5 89,1 16/8 7,9 10,3 8,2 3,4 5,3 6,1 95,8 >16/8 4,8 5,5 5,6 5,9 3,2 4,2 100

% acumulado

E. pneumoniae Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 228 258 292 269 325 302

TICARCILINA =8 4,4 4,7 2,1 0,4 0,6 1,9 1,9 16 1,6 0,4 0,3 0,3 0,4 2,3

CMI 32 3,1 7,0 1,0 2,9 4,0 1,8 3,2 5,5

(pg/rnl> 64 4,8 7,3 5,1 3,7 7,4 5,6 5,7 11,2 >64 87,7 79,4 91,8 92,6 87,7 92,3 88,8 100

TOTAL] 1.674[ % acumulada

E. pneumoniae CEFAZOLINA CMI (pg/ml) Ao n2 =0,5 1 2 4 8 16 >16 1987 228 3,1 47,4 15,8 10,9 6,1 5,7 11,0 1988 258 1,5 65,1 13,2 8,5 4,7 1,2 5,8 1989 292 2,1 57,6 17,1 12,3 4,8 1,0 5,1 1990 269 3,3 52,9 18,2 8,9 6,3 3,3 7,1 1991 325 2,1 57,9 24,0 5,0 1,5 1,2 8,3 1992 302 1,4 60,7 15,6 6,6 3,8 1,7 10,2 TOTALf 1.674] 2,2 57,2 17,6 8,5 4,4 2,2 7,9 % acumulado 2,2 59,4 77,0 85,5 89,9 92,1 100

84

Resultados

TABLA 13.- Klebsiella pneumoniae (continuacin).

1<. pneumoniae Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTALj n2 228 258 292 269 325 302 1.674] =1 38,6 42,7 46,6 42,4 44,0 36,1 41,8 41,8 CEFUROXINA 2 36,9 34,9 41,1 40,5 39,7 48,1 40,4 82,2 4 13,6 11,6 6,5 8,6 5,6 7,4 8,3 90,5 CMI (pg/ml> 8 6,1 4,2 2,7 3,0 3,7 3,5 4,1 94,6 16 1,3 3,5 0,7 1,1 1,8 0,3 1,4 96,0 >16 3,5 3,1 2,4 4,4 5,2 4,6 4,0 100

% acumulado

E. pneumon.iae Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTALj n2 228 258 292 269 325 302 1.674] =1 17,4 14,7 12,0 18,6 11,7 19,5 15,5

CEFOXITINA 2 59,3 56,7 67,5 58,5 64,6 64,7 62,3 77,8 4 15,8 19,0 15,4 14,5 14,8 12,3 15,5

CMI (pg/ml) 8 4,0 5,0 3,1 4,4 5,6 2,3 4,0 97,2 16 .3,1 1,5 1,3 1,5 1,5 0,6 1,4 98,6 >16 0,4 3,1 0,7 2,6 1,8 0,6 1,3 100

% acumulado

15,5

93,2

E. pneumoniae Ao n~ 1987 1988 1989 1990 1991 1992 178 197 292 269 325 302

=2 97,8 98,0 99,0 96,4 96,7 96,5

CEFOTAXIMA 4 8 1,1 1,0 0,3 1,2 0,9 1,1 1,0 0,7 0,6 0,3

CMI <pg/ml) 16 32 0,3 0,1 98,7 0,3 0,6 0,6 0,3 99,0

>32 0,3 1,1 1,2 2,6 1,0 100

TOTAL] 1.563] % acumulado

97,3 0,7 0,6 97,3 98,0 98,6

E. pneumoniae Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 86 258 292 269 325 302 =0,5 97,4 96,2 96,0 95,3 95,1 95,7

CEFTAZIDIMA 1 1,2 2,7 2,7 1,1 2,5 1,0

CMI 4 1,4 1,1 0,7 1,5 0,6 1,0

</Jg/ml> 16 0,3 1,8 1,5 2,0 >16 0,3 0,3 0,3 0,3

TOTAL] 1.5321 95,7 2,0 % acumulado 95,7 97,7

1,0 98,7

1,1 0,2 99,8 100

85

Resultados

TABLA 14.- Klebsiella oxytoca: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

R. oxytoca Ao n2 1987 84 1988 85 1989 109 1990 102 1991 161 1992 152 TOTAL] 693 % acumulado AJWICILINA CMI </19/mi) =1 2 4 8 16 >16 1,2 3,6 95,2 100,0 2,7 3,6 93,7 1,9 98,1 1,2 1,2 6,8 90,8 0,7 0,7 4,9 93,7 0,3 0,2 0,2 1,1 3,6 94,6 0,3 0,5 0,7 8,8 12,4 100

1<. oxytoca Ao n2 1987 1988 33 1989 109 1990 102 1991 161 1992 152 TOTAL] 557 % acumulado

M4OXICILINA/CLAVULAI4XCO CMI(pg/ml> =4/2 8/4 16/8 >16/8 69,2 65,2 82,3 82,0 84,1 78,6 78,6 11,6 16,5 5,9 5,0 5,6 7,9 86,5 3,9 10,1 8,9 5,0 4,7 6,5 93,0 15,3 8,2 2,9 8,0 5,6 7,0 100

oxytoca 2 Ao n 1987 84 1988 85 1989 1990 1991 1992 109 102 161 152

1<.

TICARCILINA =8 16 3,5 1,2 1,2 0,7 1,0 2,4 2,3 1,8 0,9 0,6 1,4 1,5

CMI 32 8,3 5,9 5,6 3,9 3,7 2,8 4,6

(pg/ml> 64 20,2 10,6 13,7 9,8 15,0 9,0 12,9

>64 65,6 80,0 78,9 85,4 79,5 86,1 80,0

TOTAL1 693 % acumulado

1<. oxytoca Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 84 85 109 102 161 152

1,0

2,5

7,1
CMI <pg/ml) 4 9,5 15,4 27,5 16,6 24,2 21,5 20,5 8 14,4 20,0 21,1 15,7 11,8 12,5 15,3

20,0

100

CEFAZOLINA =0,5 1 11,9 0,9 0,6 0,3 7,0 9,2 8,8 11,2 9,8 9,8 2 8,3 7,0 13,7 16,6 24,2 19,4 16,3

16 19,0 10,6 10,1 14,7 4,4 9,0 10,4

>16 36,9 40,0 17,5 27,6 23,6 27,8 27,4

TOTAL 693 % acumulado

0,3

10,1
86

26,4

46,9

62,2

72,6

100

Resultados

TABLA 14.- Kjebsiella oxytoca (continuacin).

X. oxytoca 2 Ao n 1987 84 1988 1989 1990 1991 1992 ToTal 85 109 102 161 152 693 ] =1 32,1 24,8 39,4 32,4 42,2 31,2 34,5 34,5 CEFIJROXINA 2 4 33,3 36,5 42,2 44,4 34,2 37,5 37,8 72,2 19,1 16,4 9,2 12,5 11,8 13,9 13,4 85,7 CMI <~g/m1) 8 16 2,4 4,7 1,8 0,9 2,5 7,6 3,6 89,3 0,9 0,9 0,6 1,4 0,7 90,0 >16 13,1 17,6 6,5 8,9 8,7 8,4 10,0 100

% acumulado

K. oxytoca Ao n2 1987 84 1988 85 1989 109 1990 102 1991 161 1992 152
TOTal % acumulado

=1 31,0 22,3 29,3 20,7 28,6 24,5

CEFOXITINA CMI (pg/ml) 2 4 8 16 55,9 8,3 1,2 3,6 64,7 4,7 5,9 2,4 62,4 7,3 1,0 58,8 15,7 2,9 1,9 57,8 11,2 1,2 1,2 58,6 9,8 5,9 0,6
59,6 85,7 9,8 95,5 3,0 98,5 1,4 99,9

>16 0,6
0,1 100

693 ] 26,1 26,1

1<. oxytoca Ao nQ 1987 84 1988 85 1989 109 1990 102 1991 161 1992 152
TOTAL 693 % acumulado

=2 98,8 96,5 100,0 98,2 99,4 98,7

CEFOTAXIMA 4 1,2 3,5 1,8 0,6 1,3

CMI <pg/ml) 16 22

>32

98,7 1,3 98,7 100

1<. oxytoca Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ n2 84 85 109 102 161 152 693 =0,5 96,5 95,3 97,3 99,1 98,8 98,7 97,8

CEFTAZIDIMA 1 3,5 3,5 2,7 0,9 1,2 1,3 2,1 99,9

CMI (/1g/ml> 4 1,2 0,1 100 16 >16

1 acumulado

97,8

87

Resultados

TABLA 15.- Proteus vulgaris: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

P. vulgaris Ao n~ 1987 29 1988 57 1989 40 1990 34 1991 42 1992 38
TOTAL[ 240 % acumulado

=1 5,2 2,5 2,9

2,0

AMPICILINA CMI <pg/mi) 2 4 8 16 6,9 2,9 2,9

0,4 2,4 0,4 2,8 2,8 0,8 3,6

>16 93,1 94,8 97,5 91,3 100,0 100,0

96,4 100

2,0

P. vulgaris Ao n~ 1987 1988 17 1989 40 1990 34 1991 42 1992 38 TOTAL[ 171 % acumulado

IOXICILINA/CLAVIJLANICO CMI(pg/ml> =4/2 8/4 16/8 >16/8 58,8 23,6 11,7 52,5 27,5 12,5 53,1 38,2 2,9 28,7 52,4 14,2 37,2 51,4 5,7 42,1 41,5 8,8 42,1 83,6 92,4 5,9 7,5 5,8 4,7 6,7 5,8 100

1. vulgaris Ao 1987 1998 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ n2 29 57 40 34 42 38 240

TICARCILINA =8 31,0 38,5 37,5 41,2 38,1 48,6 39,6 39,6 16 17,2 15,8 30,0 11,8 7,2 2,9 15,0 54,6

CMI (pg/m1) 32 17,2 10,5 17,5 8,8 21,4 8,6 13,3 67,9 64 13,8 15,8 10,0 23,5 11,9 11,4 14,2 82,1 >64 20,8 19,4 5,0 14,7 21,4 28,5 17,9 100

% acumulado

P. vulgaris 2 Ao n 1987 29 1988 1989 1990 1991 1992 57 40 34 42 38

=0,5

CEFAZOLINA 1 2

CMI 4 3,4 2,5 2,9 2,9

1,2

(/1g/ml) 8 3,4 2,9 2,9

1,2

16 3,4 2,9 8,6

2,1

>16 89,8 94,8 97,5 88,4 100,0 85,6

93,3

5,2 2,9
1,7

TOTALf 240 % acumulado

1,7

2,9

4,1

6,3

100

88

Resultados

TABLA 15.- Proteus vulgaris (continuacin).

P. vulgaris Ao n~ 1987 29 1988 57 1989 40 1990 34 1991 42 1992 38
TOTAL] 240 % acumulado

=1 6,9 7,0 2,5 11,7 17,0

7,1

CEFUROXIMA 2 2,9 2,4 2,9

1,2 8,3

CMI (pg/ml> 8 16 10,3 5,2 2,9 2,9

1,7 8,3 10,0 1,7 11,7

>16 82,8 87,8 97,5 85,4 97,6 74,3

88,3 100

7,1

P. vulgaris Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL] n2 29 57 40 34 42 38 240 =1 1,7 0,4

CEFOXITINA 2 41,4 33,3 40,0 35,3 21,4 34,3 33,8 34,2 0,4 4 41,4 49,1 57,5 50,0 61,9 54,3 52,9

CMI

(pg/ni.> 16 3,4 3,5 2,5 2,4 2,5 99,2 >16 3,4 1,9 0,8 100

8 10,4 10,5 14,7 14,3 11,4 9,6 96,7

% acumulado

87,1

P. vulgaris Ao n2 1987 29 1988 49 1989 40 1990 34 1991 42 1992 38 TOTAL] 232 1 % acumulado

CEFOTAXIMA CMI <pg/ml> =2 4 8 16 32 96,6 75,7 8,1 6,1 2,0 2,0 95,0 2,5 79,4 8,9 2,9 2,9 88,1 4,8 97,1 2,9 87,9 4,3 1,7 0,9 0,9 87,9 92,2 93,9 94,8 95,7

>32 3,4 6,1 2,5 5,9 7,1 4,3 100

P. vulgaris CEFTAZIDIMA CMI (/19/mi> Ao n2 =0,5 1 4 1987 29 96,6 3,4 1988 21 90,6 4,7 1989 40 95,0 2,5 1990 34 97,1 2,9 1991 42 100,0 1992 38 100,0 TOTALI 204 [ 97,1 1,5 0,5 % acumulada 97,1 98,6 99,1

16 >16 4,7 2,5 0,9 100

89

Resultados

TABLA 16.- Enterobacter doacae: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

E. cloacae Ao n2 1987 209 1988 191 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTAL]1.380 3 acumulado =1 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4 0,4 0,4 AIGICILINA CMI <pg/ml> 2 4 8 16 >16 1,4 2,4 5,3 9,5 80,9 0,5 2,7 4,2 5,2 86,9 2,2 3,0 6,7 0,8 86,9 2,5 2,6 4,1 8,8 81,5 2,1 5,3 3,9 7,4 81,3 2,2 4,9 4,9 7,2 80,4 1,9 3,7 4,8 6,5 82,7 2,3 6,0 10,8 17,3 100

E. cloacae Ao n~ 1987 1988 47 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTALJ1.027 % acumulado

AMOXICILINA/cLAVULANICO CMI (pg/ml> =4/2 8/4 16/E >16/8 4,2 2,2 4,6 3,2 5,6 4,0 4,0 2,1 3,0 4,1 3,2 0,8 2,6 6,6 10,7 6,7 6,3 6,4 4,5 6,1 12,7 83,0 88,1 85,0 87,2 89,1 87,3 100

E. cloacae Ao n2 1987 209 1988 191 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTAL1.380 ] 3 acumulado

TICARCILINA =8 16 69,4 3,9 73,8 4,2 75,8 2,2 69,9 5,7 64,6 1,7 76,6 3,7 71,6 3,5 71,6 75,1

CMI (pg/mi) 32 64 1,4 1,4 2,1 1,1 2,2 2,2 2,6 2,5 0,7 2,3 2,3 1,8 1,7 76,9 78,6

>64 23,9 18,8 17,6 21,8 30,5 15,1 21,4 100

E. Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992

cloacae n2 209 191 227 193 282 278 30,5

CEFAZOLINA 1 0,5 1,8 0,5 0,3 0,8 0,6 0,6 2 0,9 0,5 0,9 2,1 1,1 1,5 1,2 1,8

CMI </1g/mJ.) 4 0,5 1,1 1,8 1,5 0,7 1,9 1,2 3,0 8 1,4 1,1 0,4 1,5 0,3 1,5 0,9 3,9 16 1,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,1 1,5 5,4 >16 94,8 96,2 93,8 92,9 95,9 93,2 94,6 100

TOTAL1.380 3 acumulado

90

Resultados

TABLA 16.- Emerobacter rJoacae (continuacin).

E. cloacae Ao n~ 1987 209 1988 191 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTAL]1.380 % acumulado CEFUROXIMA CMI (pg/ml> =1 2 4 8 16 3,4 8,1 34,9 20,5 4,3 1,6 12,0 28,8 22,0 8,4 3,5 10,1 34,4 19,4 7,5 1,0 9,3 22,8 24,8 10,4 2,8 12,1 24,1 14,9 9,2 2,7 10,9 29,4 22,3 8,3 2,6 10,5 29,0 20,4 8,0 2,6 13,1 42,1 62,5 70,5 >16 28,8 27,2 25,1 31,7 36,9 26,4 29,5 100

E. cloacae Ao n2 1987 209 1988 191 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTAL]1.380 r % acumulado

CEFOXITINA CMI (pg/ml) =1 2 4 8 16 >16 0,9 1,9 1,9 1,4 3,4 90,5 1,1 1,1 2,6 95,2 0,8 0,4 4,4 1,3 4,9 88,2 1,5 3,1 1,0 6,7 87,7 0,7 1,7 2,1 1,4 94,1 0,4 1,5 3,0 1,1 2,3 91,7 0,4 1,1 2,4 1,4 3,3 91,4 0,4 5,5 7,9 9,3 12,6 100

E. cloaca. Ao n~ 1987 193 1988 172. 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278 TOTAL]1.344 % acumulado

CEFOTAXIMA CMI (/1g/ml> =2 4 8 16 32 >32 82,9 1,5 2,1 2,1 1,0 10,4 82,4 2,3 1,8 1,8 1,8 9,9 83,8 3,0 0,8 0,8 2,7 8,9 75,6 3,6 1,0 2,6 3,7 13,5 69,5 1,4 1,1 2,8 1,1 24,1 82,2 2,6 2,3 1,5 1,1 10,3 78,5 2,4 1,5 1,9 1,9 13,8 78,5 80,9 82,4 84,3 86,2 100

E. cloaca. Ao n2 1987 75 1988 191 1989 227 1990 193 1991 282 1992 278

<0,6 82,7 75,9 81,0 73,1 68,8 81,4

CEFTAZIDIMA 1 10,7 6,3 3,5 5,2 2,1 2,8

CMI (pg/ml> 4 16 1,3 4,2 2,1 3,1 1,3 2,6 3,1 2,5 2,1 1,1 2,6

>16 5,3 11,5 11,1 16,0 24,5 12,1

TOTALI1,246 % acumulado

76,2 4,3 76,2 80,5 91

2,5 83,0

2,1 14,9 85,1 100

Resultados

TABLA 17.- Entero hacter aerogenes: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.
E. aerogenes 2 Ao n 1987 39 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ 35 47 40 39 54 254 =1 2,5 0,4 0,4 MWICILINA 2 5,7 2,1 2,5 1,9 2,0 2,4 4 2,8 2,1 5,0 5,1 2,4 4,8 CMI <pg/ml> 8 16 11,4 2,5 1,9 2,4 7,2 10,2 14,2 2,5 2,5 6,0 5,5 12,7 >16 89,8 65,9 95,8 87,5 89,9 90,2 87.3 100

% acumulado

E. acrogenes Ao n2 1987 1988 24 1989 47 1990 40 1991 39 1992 54

TOTAL] 204 % acumulado

AJ4OXICILINA/CLAVULANICO CMI<gq/ml) =4/2 8/4 16/8 >16/8 8,3 4,2 7,5 5,1 9,8
6,9 6,9

4,2 4,2 2,5 1,9

2,4 9,3

2,5 12,8 11,8

6,9 15,2

87,5 91,6 90,0 79,6 76,5

84,8 100

E. Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992

sero genes 39 35 47 40 39 54 254 ]

TICARCILINA 58 30,8 60,0 42,6 45,0 38,5 37,3 40,9 40,9 16 2,8 2,1 7,5 2,5 3,9 3,1 44,0

CMI (pg/mi) 32 5,2 2,8 2,5 5,9 2,8 46,8 64 17,9 5,7 4,2 10,0 7,7 3,9 7,9 54,7 >64 46,1 28,7 51,1 35,0 51,3 49,0 45,3 100

TOTAL

% acumulado

E. aerogenes CEFAZOLINA Ao flg =0,5 1 2 1987 39 1988 35 8,6 6,7 1989 47 2,1 2,1 1990 40 5,0 1991 39 1992 54 2,1 7,8 TOTAL] 254 % acumulado 2,8 5,6
2,8 2,8

CMI (/1g/ml) 4 8 11,4 4,3 2,5 2,5 3,9

2,0 2,0

16 5,1 2,8 2,5 1,9

2,0

>16 94,9 71,4 91,5 92,5 95,0 84,3

88,4

7,6

9,6

11,6

100

92

Resultados

TABLA

17.-

Enterobacter aerogenes (continuacin).

E. acro genes Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ ~ 39 35 47 40 39 54 254 =1 5,2 5,7 4,2 12,5 2,5 5,9 5,9 5,9 CEFUROXIMA 2 17,9 34,3 21,2 15,0 30,8 13,7 21,7 27,6 4 5,2 22,8 17,1 20,0 2,5 13,7 13,8 41,4 CMI (pg/ml) 8 2,5 2,8 6,4 7,5 2,5 7,8 5,2. 46,5 16 5,7 6,4 7,7 5,9 4,3 50,8 >16 69,2 28,7 44,7 45,0 54,0 53,0 49,2 100

1 acumulado

E. aerogenes Ao n2 1987 39 1988 35 1989 47 1990 40 1991 39 1992 54

TOTAL[ 254 1 acumulado

=1

CEFOXITflEA CMI (pg/rnJ.> 2 4 8 16 2,5 2,5 5,7 2,8 2,8 4,3 2,1 2,5 2,5 5,0 2,5 2,5 6,0 1,9 1,9
3,1 1,6 1,2 2,0

>16 95,0 88,7 93,6 95,0 90,0 90,2

92,1

3,1

4,7

5,9

7,9

100

E. aero genes Ao n2 1987 39 1988 35 1989 47 1990 40 1991 39 1992 54

TOTAL 254 1 acumulado

=2 43,7 68,6 51,2 55,0 46,1 49,1

52,0

CEFOTAXIMA CMI (pg/ml) 4 8 16 32 2,5 12,8 15,4 17,9 8,6 2,8 8,6 2,1 8,5 10,6 25,5 2,5 7,5 15,0 12,5 2,5 10,3 5,1 18,0 1,9 11,8 13,7 13,7
3,1 55,1 9,1 64,2 11,8 76,0 15,0 91,0

>32 7,7 11,4 2,1 7,5 18,0 9,8

9,0 100

52,0

E. Ao 1987 1998 1999 1990 1991 1992

acro genes n9 9 35 47 40 39 54 224

CEFTAZIDIMA =0,5 1 44,5 11,1 57,1 20,0 53,2 52,5 48,8 41,2 50,0 2,1 2,5 2,5 7,4 6,7 56,7

CMI 4 11,1 7,5 2,5 7,4 3,6

(pg/ml> 16 11,1 8,5 7,5 10,3 9,2 8,0 >16 22,2 22,9 36,2 30,0 35,9 31,4 31,7 100

TOTAL]

1 acumulado

50,0

60,3

68,3

93

Resultados

TABLA 18. Citrobacerfreundii: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

C. freundii Ao n2 1987 63 1988 98 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80 TOTAL[ 520 % acumulado AMPICILINA CMI <pg/ml> =1 2 4 8 16 >16 1,6 4,8 7,9 8,5 10,6 66,6 1,0 3,1 4,1 13,3 12,2 66,3 1,2 2,5 3,7 6,2 21,0 65,4 1,1 3,2 5,4 8,6 12,9 68,8 1,9 6,7 8,6 12,4 70,4 3,9 6,5 7,8 13,0 68,8 1,3 2,5 5,6 8,8 13,7 68,1 1,3 3,8 9,4 18,2 31,9 100

C. freundil Ao n~ 1987 1988 42 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80 TOTAL 401 ] % acumulado

AMOXICILINA/CLAVULANICO CMI(gg/ml) =4/2 8/4 16/8 >16/8 2,1 2,4 10,7 5,7 5,2 5,7 5,7 8,4 16,0 16,1 7,6 7,8 11,2 16,9 35,4 21,0 21,6 25,7 27,3 25,2 54,1 60,6 51,6 61,0 59,7 57,9 42,1 100

C. freundil Ao n2 1987 63 1988 98 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80 TOTAL 520 ] ~eacumulado e. freundil Ao n2 1987 63 1988 98 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80
TOTAL] 520 % acumulado

TICARCILINA =8 16 42,9 4,8 56,1 2,1 75,4 1,2 59,2 4,3 61,9 3,8 68,8 2,6 61,5 3,1 61,5 64,6 CEFAZOLINA 1 2 3,2 3,2 1,0 1,0 1,2 4,3 2,8 3,9
1,4 1,9

CMI (pg/mi) 32 64 >64 1,6 6,3 44,4 1,0 2,1 38,7 1,2 22,2 1,1 4,3 31,1 1,9 2,8 29,6 28,6 1,2 2,5 31,7 65,8 68,3 100 CMI (pg/ml> 4 8 16 4,8 6,2 3,1 3,1 3,7 3,7 2,4 4,3 3,2 3,2 3,8 0,9 0,9 3,9 2,6
3,8 2,9 1,7

~0,5

>16 88,8 85,6 89,0 85,0 91,6 89,6

88,3

1,4

3,3

7,1

10,0

11,7

100

94

Resultados

TABLA 18.- Citrohacterfreundll (continuacin).

C. freundii CEFUROXIHA CMI (/19/m> Ao n2 =1 2 4 8 16 >16 1987 63 20,6 28,6 17,4 4,8 1,6 27,0 1988 98 7,1 34,8 27,5 6,1 3,1 21,4 1989 81 8,7 53,2 16,0 2,4 1,2 18,5 1990 93 11,8 29,0 20,4 4,3 4,3 30,2 1991 105 6,7 35,2 20,0 5,7 3,8 28,6 1992 80 6,8 44,1 19,6 5,3 24,2 TOTAL[ 520 9,6 37,3 20,6 4,8 2,5 25,2 % acumulado 9,6 46,9 65,7 72,3 74,8 100

ch freundil Ao n~ 1987 63 1988 98 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80

TOTAL] 520 % acumulado

=1 1,6 1,0 3,9

1,0

CEFOXITINA CMI (/19/mi) 2 4 8 16 3,2 4,8 1,6 4,1 6,1 1,0 2,1 3,7 1,2 6,2 7,5 4,3 2,1 0,9 4,7 1,9 3,8 1,3 2,6 5,2 5,2
3,5 4,5 3,8 8,3 1,5 9,8 3,5 13,3

>16 88,8 86,7 88,8 86,1 88,7 81,8

86,7 100

1,0

C. freundii Ao n2 1987 63 1988 78 1989 81 1990 93 1991 105 1992 80 TOTAL 500 ] % acumulado

CEFOTAXIMA CMI (/19/mi) =2 4 8 16 32 >32 69,9 7,9 4,8 6,3 7,9 3,2 74,4 11,5 1,3 1,3 3,8 7,7 86,6 1,2 1,2 2,4 2,4 6,2 68,8 4,3 4,3 2,1 9,7 10,8 76,3 0,9 1,9 2,8 2,8 15,3 79,2 1,3 2,6 6,5 10,4 75,8 4,2 2,2 2,8 5,4 9,6 75,8 80,0 82,2 85,0 90,4 100

C. freundil Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL] n2 21 98 81 93 105 80 478 =0,5 66,8

CEFTAZIDIMA 1 9,5 77,8

CMI 4 4,7 3,1 5,4 4,7 3,9 4,0

(/19/mi> 16 4,7 1,1 2,4 1,1 1,9 1,5 >16 14,3 14,3 10,0 21,5 19,1 18,2 16,7 100 83,3

71,4 10,1 81,4 6,2 60,2 11,8 71,4 74,0 70,7 2,9 3,9 7,1

% acumulado

70,7

81,8

95

Resultados

TABLA 19.- Morganella morganii: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico.

JI. morganhl Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL] n~ 96 100 95 79 109 116 595 J =1 1,1 0,2 0,2 AMPICILINA 2 0,9 0,2 0,4 4 1,1 1,3 0,3 0,7 CMI (/1g/ffil> 8 2,1 2,0 1,3 0,9 2,0 1,7 16 1,0 1,8 0,5 2,2 >16 95,7 97,0 100,0 97,4 99,1 97,3 97,8 100

% acumulada

JI. morganhl Ao n~ 1987 1988 1989 1990 1991 1992 22 95 79 109 116

AMOXICILINA/cLAVTJLANICO CMI(/1g/ml> =4/2 8/4 16/8 >16/8 8,8 1,9 0,9 2,4 2,4 3,1 1,3 0,9 1,8 1,7 4,1 4,5 1,1 1,8 0,9 5,0 95,5 95,8 89,9 97,2 95,5 95,0 100

TOTAL] 421 3 acumulado

JI. morganil Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 96 100 95 79 109 116

TICARCILINA =8 66,6 60,0 86,3 65,8 78,9 80,5 73,5 16 8,3 12,0 5,3 11,4 11,9 9,7 9,7

CMI 32 2,1 8,0 1,1 5,1 4,6 2,7 3,9

(pg/ml) 64 7,3 1,0 2,1 5,1 0,9 2,5 >64 15,6 19,0 5,2 12,6 4,6 6,2 10,4

TOTALI 595 % acumulado

JI. morganhl Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ n2 96 100 95 79 109 116 595

73,5

83,2

87,1
CMI (/1g/mi> 4 3,1 1,0 1,3 0,9
1,0

89,6

100

CEFAZOLINA =0,5

2 1,1 1,3
0,3

8 0,9 0,9
0,3

16 3,0 1,1 1,3 0,9

1,0

>16 95,8 96,0 98,9 96,1 98,2 98,2

97,4

% acumulado

0,3

1,3

1,6

2,6

100

96

Resultados

TABLA 19.- Morganella morganil (continuacin).

JI. morganhi Ao 1987 1988 1989 1990 1992. 1992 TOflL n~ 96 100 95 79 109 116 595 =1 5,2 4,0 2,1 2,5 1,8 1,8 3,0 3,0 CEFUROXINA 2 4,2 2,0 1,0 1,2 2,7 2,2 5,2 4 3,1 3,0 2,1 1,2 1,8 2,0 7,2 CMI (pg/ml> 8 4,2 4,0 9,5 7,6 4,5 4,4 5,4 12,6 16 12,5 7,0 22,1 16,6 15,6 10,6 13,3 25,9 >16 70,8 80,0 63,2 70,9 76,3 80,5 74,1 100

% acumulado

JI. morganhl Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTALJ n~ 96 100 95 79 109 116 595 =1 3,1 1,1 0,7

CEFOXITINA 2 10,4 9,0 1,1 3,8 3,7 3,5 5,2 5,9 0,7 4 10,4 5,0 11,5 3,8 10,1 5,3 7,6

CMI

(/19/mi> 8 16 26,1 15,0 6,3 33,0 12,5 9,7 16,6 94,1 >16 7,3 9,0 2,1 2,5 3,7 2,7 5,9 100

42,7 62,0 77,9 56,9 66,3 78,8 64,0 77,5

% acumulado

13,5

JI. morganhl 2 Ao n 1987 90 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL[ 90 95 79 109 116 579

=2 85,6 80,0 87,3 74,7 85,5 87,6 83,9

CEFOTAXIMA 4 8 3,4 5,5 8,4 5,1 2,7 8,8 5,7 89,6 5,5 8,8 2,1 3,8 6,4 1,8 4,7

CMI

(pg/ml> 16 32 1,1 2,2 1,1 10,1 2,7 1,8 2,9 97,2 1,1 2,5 2,7 1,1 98,3

>32 3,3 3,3 1,1 3,8 1,7 100

% acumulado

83,9

94,3

JI. morganhl Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n2 26 100 95 79 109 116 =0,5 69,2 70,9 82,1 67,1 74,3 84,1 76,0

CEPTAZIDIMA 1 7,7 8,9 6,3 7,6 5,5 3,5 6,3

CMI 4 7,7 8,9 2,1 5,1 3,7 3,5 4,7

(pg/ml) 16 11,6 8,9 8,4 7,6 12,8 5,4 8,8 >16 3,8 2,4 1,1 12,6 3,7 3,5 4,2

TOTAL 525 % acumulado

76,0

82,3

87,0

95,8

100

97

Resultados

TABLA

20.-

Serrada marcescens: % de aislamientos sensibles por concentracin de antibitico. S. marcescens AJ4PICILINA CMI (pg/m1) Ao n9 =1 2 4 8 16 1987 301 1,0 1988 296 0,6 0,3 2,4 1989 121 4,1 1990 137 1,4 3,6 5,8 1991 115 0,9 6,3 1992 90 1,1 3,4 3,4
TOTAL LOGO % acumulado
0,2 0,4 0,8 3,1

>16 99,0 96,7 95,9 89,2 92,8 92,1

95,5

0,2

0,6

1,4

4,5

100

S.rnarcescens Ao nI 1987 1988 113 1989 121 1990 137 1991 115 1992 90
TOTAL 576 % acumulado

AI4OXICILINA/CLAVULANICO cMI <sg/ml> =4/2 8/4 16/E S16/8 1,1

0,2 0,2

0,8 2,2 1,7 2,3

1,2 1,4

1,7 3,3 10,2 4,3 5,7

5,1 6,6

98,3 95,9 87,6 94,0 90,9

93,5 100

3. Ao 1987 1988 1989 1990 1991

marcescens nI 301 296 121 137 115

TICARCXLINA =8 52,2 54,0 47,9 57,0 49,5 68,2 54,2 54,2 16 5,0 3,7 4,2 2,9 6,1 9,1 4,7 58,9

CMI 32 3,0 E,? 3,3 2,2 2,6 6,8 4,0

(pg/ml> 64 1,6 4,1 1,6 0,7 1,7 4,5 2,5 >64 38,2 32,5 43,0 37,2 40,1 11,3 34,6 65,4 100

1992 90 TOTAL 1.060 % acumulado

62,9

S. niarcescens Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 n 301 296 121 137 115 90 =0,5

CEFAZOLINA 1 2 0,3 0,3

CMI 4

(pg/ml) 8 0,3 16 >16 99,4 99,7 100,0 100,0

100,0 1,1 98,9

TOTAL] ~.oso] % acumulado

0,2 0,2

0,2 0,1 99,6 0,3 0,3 100

98

Resultados

TABLA

20.-

Serratia marcescens (continuacin).

S. r,arcescens CEFIfltOXfl4A CMI (pg/ml> =1 2 4 8 16 Ao n2 1987 301 1,0 0,3 1,3 1988 296 0,3 0,7 1,0 1,7 1989 121 0,8 2,5 1990 137 0,7 0,7 5,8 1991 115 0,9 0,9 1992 90 1,1 2,3 2,3
TOTAL]1.060 % acumulado
0,5 0,4 0,5 2,0

>16 97,4 96,3 96,7 92,8 98,2 94,3

98,6

0,6

1,1

1,8

2,8

100

5. marcescens Ao n2 51 1987 301 1988 296 1989 121 1990 137 1991 115 1992 90 TOTAL[1.060 % acumulado
5. Ao 1987 1988 1989 1990 1991 1992 TOTAL narcescens n2 273 260 121 137 115 90 996 =2 85,8 72,8 74,4 80,3 66,1 80,6
77,5

CEFOXITINA CMI (/1g/mi) 2 4 8 16 >16 0,7 3,6 32,9 62,8 1,0 13,2 27,0 58,8 1,6 18,2 33,9 46,3 1,7 21,2 25,5 51,6 0,9 12,2 24,3 62,6 1,1 1,1 26,2 34,1 37,5 0,1 1,0 13,1 29,6 56,2 0,1 1,1 14,2 43,8 100
CEFOTAXIMA 4 5,1 11,5 14,9 5,1 7,0 10,2
8,6

CMI (pg/mi) 8 3,3 8,8 3,3 5,1 6,1 3,4

5,3

16 2,5 1,9 3,3 2,9 6,1 2,3

2,9

32 1,1 2,3 1,6 3,7 1,7 2,3

2,1

>32 2,2 2,7 2,5 2,9 13,0 1,1

3,6

% acumulado

77,5

86,2

92,4

94,3

96,4

100

3. marcescens CEFTAZIDIMA CMI (/19/mi> Ao n9 =0,5 1 4 16 1987 205 76,2 9,5 13,3 1,0 1988 296 76,7 12,5 9,1 1,0 1989 123 84,3 6,6 9,1 1990 137 88,3 6,6 5,1 1991 115 73,9 8,7 13,0 4,4 1992 90 84,1 6,8 2,3 3,4
TOTAL] 866 80,0 9,2 89,2 8,8 98,0 1,4 99,4 % acumulado 80,0

>16 0,7 3,4

0,6 100

99

Resultados

TABLA 21.- Porcentaje de aislamientos sensibles por concentracin de cetotaxima.

CPU <iag/8 Mi croargan amo E. ccli Salsonella spp. .7. mirabiIis A. pnPLmoniae 1. oxytoea =0,1
90,4 92.1 98,5 92,1 93,7

1)
0,2 1,4 1.0 0,7 1.3

0.2
7.6 4.9 1.1 4.0 2.8

0,5
0.4 0.4 0.1 0.4 1.3

1
0,6 0.1 0,1 0,3 0,6

2
0,6 0,4 0.1 0,4 0.3

8
0,1 0,7 0,6

16
0.04 0.1

32
0,02 0,3

>32
0,04 1,0

P. vu198r1s E. ccaese E. aercgenes e. treundil N. worganii 5. marcescens

83,4 40,0 52,1 48,7 71,7 10,7

2.1 20,9 16,3 10.2 4,6 12.9

0.4 13.6 9,3 32.3 3,4 21.1

0,7 3,6 2,7 2,7 1,9 18,7

1,3 0.4 1.4 3,9 2,3 8,1

4,3 2.4 3,1 4,2 5.7 8,6

2,7 2.5 9,1 2.2 4,? 5,3

0,9 1,9 11,8 2.8 2,9 2,9

0.9 1,9 1,5 3,4 1,1 2,1

4.3 13.8 9,0 9,6 1.7 3,6

TABLA 22.- Porcentaje de aislamientos sensibles por concentracin de ceftazidima.

CPU <pg/tI) ~iicroor~&nismo4 50,1 0.2 23.6 54,2 3.6 24,2 6.4 5.1 35,9 21.6 7,4 24.7 46.8 0.5 3.4 20,1 2,8 14,9 9.3 1.2 23,4 9.8 6.8 20.2 12.4 1 0,5 0,5 0,6 2,0 2.1 1.5 4,3 6,1 6,3 7,1 9.2 2 0,3 0.3 0,4 0.5 1.4 2.4 2.6 2,3 6.1 4 0,4 0.1 0.6 0.1 0.5 1,1 1.2 2.1 0.7 2,7 8 0.2 0.3 0.4 2.6 2.3 0.4 0,6 16 0.16 0.8 0,9 1,7 5.4 6,5 1,1 0.8 >16 0,04 2,6 0.2 14,9 31,1 4,2 16,7 0,6

E. ccli Salaonella spp. p. zrnbilis

Y. pneumoniae A. oxytoea

71.4 22,6 92,6 56,6 82,1 90,3 16,9 18,6 61,8 26.8 20,8

P. vulgaris E. cloacap E. aerogenes fi. .organhi C. treundi S. gareescens

100

Resultados

2.-

ANLISIS DE LOS FENOTIPOS DE SENSIBILIDAD RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS 8-LACTAMICOS EN En.terohacteriaceae (1987-1992).

-

Los fenotipos de sensibilidad-resistencia a antibiticos B-lactmicos (TABLAS 23-31) se establecieron a partir de la distribucin de aislamientos inhibidos por cada concentracin de antibitico (TABLAS 10-20) y utilizando como criterio de resistencia los puntos crticos reseados en la TABLA 7. Para la cefotaxima y la ceftazidima se aniplid el rango de concentraciones, por el mtodo de dilucin en agar, para un nmero representativo del total de las cepas estudiadas (TABLAS 21 y 22). Estos ltimos microorganismos procedan en su mayora de bemocultivos y orinas y, en menor medida, de exudados quirrgicos y respiratorios (344,345,347,346,350). El nmero de aislamientos incluye: 653 E. col, 208 Salmonella spp., 108 P. mirabls, 166 K. pneumoniae, 54 K. oxyroca, 38 P. vulgaris, 90 M. morganh, 127 E. cloacae, 32 E. aerogenes, 86 U freundil y 140 5. nzarcescens. 2.1.- Escherichia cdi, Salmonella spp. y Proteus mirabiis. Con respecto a E. coil, y siguiendo la clsica diferenciacin de los fenotipos en funcin de la sensibilidad a la ampicilina y las carboxipenicilinas descrita por Medeiros y cok. (367) y aplicada con posterioridad por Loza y Martnez-Beltrn (319), se establecieron tres grandes grupos. El primero de ellos (fenotipo 1), sensible a la anipicilina y la ticarcilina, represent ms del 40% de los aislamientos: el segundo, y ms numeroso (55,6%), estuvo definido por la resistencia a ambos antibiticos (fenotipos II-V); y por ltimo, el minoritario (0,6%) se caracteriz por presentar resistencia disociada a la ampicilina y la ticarcilina (fenotipos VI y VII) (TABLA 23). Dentro del segundo grupo se diferenciaron, en funcin del resto de los antibiticos, varios fenotipos. El ms comn, fenotipo II (31,4%), mostr sensibilidad a la amoxicilina/clavulnico y a todas las cefalosporinas ensayadas. La resistencia a la arnoxicilina/clavulnico y/o cefalosporinas caracteriz a los fenotipos III (22,7%), V (1,2%) y IV (0,2%), en el que estn incluidas todas las cepas de E. cot con BIPEA. Este mismo esquema fue til para Salmonella y P. mirabilis, an con una incidencia diferente a la encontrada en E. cot. En Salmonella se observ un fenotipo mayoritario (1) sensible a todos los antibiticos 8-lactmicos que engloba el 80,4% de los aislamientos, mientras que el 18,9% (fenotipos II-y) mostr resistencia simultnea a la ampicilina y la ticarcilina y, de forma testimonial, un 0,7% (fenotipos VI y VII, 7 cepas) fueron resistentes a la anipicilina y sensibles a la ticarcilina (TABLA 24). Por el contrario, en 1. mirabilis, an cuando el fenotipo 1 fue el ms prevalente (63,1%), los aislamientos resistentes a la ampicilina y sensibles a la ticarcilinafueron ms 101

Resultados

numerosos (fenotipos VI y VII, 12,0%) (TABLA 25). Debemos destacar el nmero anormalmente elevado de aislamientos de Salmonella adscritos al fenotipo IV (2,6%) debido a la existencia de 25 cepas de 5. arizonae con una BIPEA. Este fenotipo no se observ en P. mirabilis. TABLA 23.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Escherchia coil.
-

Fenotipo 1 II III IV V

AM? 5 R R R R

TIC s R R R R

AMO s S S SIR R

KFZ
S S SR R E

0)04 5

FOX
5

CTX 5 S S S SIR

CAZ 5 43,8

S SIR R E
SIR E

R R R R
SIR R

R R R R
R R

31,5 22,7 0,2 1,2 0,4 0,2

VI VII

R R

5 5

R E

SIR R

S SIR

AMP: ampleilina: AMC: amxicIinA/~IavuInico; TIC: ticartilina; KFZ: cefazolina; CXM: cefuroxima; FOX: cefoxitin.; CTX: cefotnirna; CAZ: cefiazidima.

TABLA 24.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Salmonella ~I4

-

Fenotipo 1

AM? 5

TIC 5

AMO 5

KFZ

CXM
5

FOX
5

CTX
5

CAZ
5

%
80,4

II III IV y VI VII

R R R R E E

R R R R 5 5

S S S/R E E E

S SIR R E 5/? R

5 5/E E R SIR E

S S S SIR SIR E

S S S SiR 5 5/E

R R R R E E

11,3 4,7 2,6 0,3 0,5 0,2

AMI: ampkilina; ASIC: ,nioxieIina/clavuUnico; TIC: ticarcilina; KFZ: cefazolina; CXM: cefliroxinia; FOX: cefoxifina; CTX: cefotaxima; CAZ: cefiazidinu.

TABLA 25.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Proreus mirabilis.

-

Fenotipo 1 II III IV y VI VII

AM? 5 E E E E E E

TIC 5 E E E E 5 5

AMO 5 S SIR SIR R 5 E

KFZ 5 E E E E E E

0>04 5 5 5/E R R E E

FOX 3 E E E E R R

CTX 5 S S S SIR S SIR

CAZ 5 E E E E E E 63,1 13,3 11,2 0,4 12,4 0,6

AMI: anipicilina; AMO: amoxicilinafclavuUnico;TIC: ticarcilina, KFZ cefazolma, 03CM: cefliroxima; FOX: cefoxitina; 073<: cefotaxima; CAZ: cefiazidima.

102

Resultados

2.2.- Klebsidlla pneumonio.e y Kebsiella orytoca. La mayora de los aislamientos de A. pnewnoniae (97,7%) y A. oxyroca fueron resistentes a la ampicilina y la ticarcilina (fenotipos II a] VI) (TABLA 26). La diferenciacin de stos estuvo marcada, en primer lugar, por la sensibilidad a la cefazolina y amoxidiina/clavulnico (mayor en A. pnewnoniae que en A. oxyroca) (fenotipo II) y en segundo lugar, por la resistencia a la cefuroxima, cefotaxima y ceftazidima (fenotipos 111-VI). El porcentaje de aislamientos resistentes ala cefoxitina fue relativamente bajo (menos del 3%), distribuyndose entre los fenotipos VI y VII. Por otra parte, las IIIPEA, cuya presencia slo se demostr en A. pneumontae, conformaron el fenotipo V (1,6%). TABLA 26.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Klebsiella.
-

Fenotipo 1 II III IV V VI Vn

AM? 5 E E E E E E

TIC E E E E E 5

AMC 5 S SIR E 5/E E S/E

KFZ 5 E E E E E E

CXM 5 5 5/E E E E E

rox 5 E E E E E 5/E

CTX 5 5 5/E 5 E S/E s/E

CAZ ~ E E E E E S/E

E. pneum.

K.oxytcca

2,c9 87,9 4,9 0,8 1,6 2,5 0,3

1,8 60,4 35,6 0,2 -1,3 0,7

AMP: anipicilina; ASIC: amoxicilina/clavulnico; TIC: ticarcilina; KFZ: cefazolina; CX?~4: cefiuroxizna; FOX: cefoxitina; CTX: cefotaxima; CAZ: cefiazidima; a: % de ineidencia.

2.3.- Proteus vulgaris. La incidencia de aislamientos sensibles a todos los antibiticos 13-lactmicos fue inferior al 3% (fenotipo 1). Si exceptuamos un mnimo porcentaje, 0,6% (fenotipo II), la resistencia simultnea a la ampicilina y la ticarcilina en esta especie estuvo acompaada de resistencia a la cefazolina y la cefuroxima (fenotipos I11-V, ~,8%). En este ltimo grupo, el fenotipo ms numeroso (fenotipo III, 31,2%) se caracteriz por su sensibilidad a la anioxicilina/clavulnico, cefoxitina, cefotaxima y ceftazidima. La resistencia a estos antibiticos determin la diferenciacin de los fenotipos IV y y. Entre los fenotipos con resistencia a la ampicilina y sensibilidad a la ticarcilina destac el nmero VI, que con un 49,7% fue el ms numeroso (TABLA 27).

103

Resultados

TABLA 27.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Proteus vulgaris.

-

Fenotipo

AM? 5 E E E E E E

TIC 5 E E E E 5 5

AMC 5 E E E/E E 5 E

KFZ 5 E E E E 5/E E

CXM 5 E E E E 5/E E

FOX 5 E E E E S S/E

CTX 5 E E E E 5 5/E

CAZ 5 E E E E 5 5/E 2,8 0,6 31,2 10,7 2,9 49,7 2,1

1 II III IV V
VI VII

AM?: .mpicilina; ASIC: amoxicilins/clvulnico;TIC: tkarcilina; KFZ: cefazolina; CXM: ceft,roxima; FOX: cefoxitina; CIX: cefotaxima; CAZ: ceft.zidima.

2.4.- Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacterfreundii, Morganella morganii y Serrada marcescens. La participacin de mecanismos genticos de resistencia comunes en este grupo (5o2,503) permite el anlisis conjunt.o de los fenotipos de sensibilidad-resistencia. En todos los casos se observ un nmero variable de aislamientos sensibles a la ampicilina y ticarcilina (fenotipo 1), mximo en C. freundil (18,2%) y mnimo en 5. marcescens (1,4%). En este fenotipo la sensibilidad no fue siempre extensible a todos los B-lactmicos, detectndose aislamientos resistentes a la cefazolina (M. iorganhi) o con un perfil de resistencia ms amplio que inclua cefazolina, amoxicilina/clavulnico y cefoxitina (E. cloacae, E. aerogenes, C. freundil y 5. marcescens) (TABLAS 29-3 1). Con la excepcin de E. aerogenes, el fenotipo ms frecuente fue el VI, que est definido por la resistencia a la ampicilina, amoxicilina/clavulnico y cefazolina, y sensibilidad a la cefotaxima y ceftazidima. La resistencia a cefoxitina, comn en E. cloacae y C. freundil, vara en Al. morganil y 5. marcescens. Por otra parte, la resistencia a la cefotaxima y ceftazidima determin la diferenciacin de los fenotipos IV, V y VII. Los dos primeros mostraron resistencia simultnea a la anipicilina y ticarcilina y el ltimo resistencia disociada. Globalmente, estos tres fenotipos (IV, V y VII), fueron ms frecuentes en E. aerogenes (43,3%) que en C. freundil (26,1 %), 5. marcescens (22.5%), E. cloacae (21,9%) y Al. morganil (18,4%). La sensibilidad a la cefotaxima y la ceftazidima con resistencia a la ticarcilina (fenotipos (II y III) fue mxima en 5. marcescens (26,9%) y mnima en Al. morganil (7,9%). Las cifras observadas en el resto de las especies incluidas en este grupo fueron: E. aerogenes, 18,1 %; C. freundil, 16,6%; y E. cloacae, 12,6%.

104

Resultadas

TABLA 28.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Enterobacter.

-

Fenotipo 1 II III IV V VI VII

AM? ~ E E E E P P

TIC ~ E E E E 5 5 1

AHC ls/E S/E E E E E E

KFZ 5/E 5/E E E E E E

0304 5 5 5/E E E 5/E E

FOX 5/E E E E E E E

CTX 5 S S S/E E E E

CAZ 5 5 5 5/E E E E

E.cloacae E.aerogenes
7,2 2,4 10,2 2,4 9,9 54,7 9,6 2,1 16,0 6,1 31,8 31,4 5.4

AMI: ampicilina; ASIC: amoxicilina/clsvuMnico; TIC: ricarcilina; KFZ: cefazolina; CXM: cefinoxima; FOX: eefoxitina; CIX: cefotnima; CAZ: cefiazidima; a: 1 de incidencia.

TABLA 29.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Cttrobacterfreundii.

-

Fenotipo

AM?

TIC

AMO

KFZ

0>04

FOX

CTX

CAZ

1 II III IV V VI VII

5 E E E E E E

5 E E E E $ 5

5/E 5/E E E E E E

5/E 5/E E E E E E

5 S SIR E E SIR E

5/E E E E E E E

5 E E E E E E

5 E E E E E E

18,2 2,4 14,2 4,9 13,9 39,1 7,3

AMI: ampicilina; A1~4C: amoxicilinu/clavulnico; TIC: ticarcilina; KFZ: cefazolina; CXM: cefuroxima; FOX: cefoxitina; CIX: cefotaxima; CAZ: cefiuzidima.

TABLA 30.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Morganella morganu.

-

Fenotipo 1 II III IV y

AM? 5 E E E E

TIC 5 E E E E

AMO 5

KFZ 5/E E E E E

CX)! 5 5 5/E E E

FOX 5 S S S/E E

CTX 5 E E E E

CAZ 5 S S S/E E 1,7 2,4 5,5 7,3 1,6

SIR E E E
E E

VI VII

E E

5 5

E E

5/E E

5/E E

E E

E E

72,0 9,5

AMI: ampicilina; AMC: amoxiciliaa/ctavwllnico;TIC: ticarcilina; KFZ: cefazolina; CXM: cefuroxinia; FOX: cefoxitina; CIX: cefotaxima; CAZ: ceftazidima.

105

Resultados

TABLA 31.- Fenotipos de sensibilidad resistencia en Serrana marcescens.

-

Fenotipo

AM?

TIC

AJ4C

KFZ

CXI! E

FOX 5

CTX 5

CAZ 5 1,4

1 II III IV V VI VII

5 E E E E E E

5 E E E E 5 ~

SIR 5/E E E E

5/E E E E E E E

E E E E E E

5 5/E 5/E E 5/E E

E E E E E E

E E E E E E

7,0 19,9 11,7 4,2 50 9 6,6

AM?: ampicilina; AMC: amoxicilin./clavulnico;TIC: ticarcilina; KFZ: cefazlina; CXM: cefi.roxima; Fox: cefoxilina; CIX: cefotaxima; CAZ: ceflazidima.

3.- DEFINICION DE FENOTIPOS CONFERIDOS POR PROTOTIPOS DE 8LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO.

de sensibilidad, y teniendo como objetivo la obtencin de resultados homogneos en la expresin de las BIPEA que no fuesen interferidos por las caractersticas del hospedador, se procedi con las cepas con los prototipos de las 8-lactaniasas de amplio espectro y espectro ampliado a la obtencin de transcorijugantes utilizando la cepa E. col! K12 BM2I (27> como receptor de los
Previo al estudio

plsmidos que las codifican. Posteriormente se analiz el perfil de sensibilidad de cada transconjugante a 30 antibiticos B-lactmicos por el mtodo de dilucin en agar, con un amplio rango de concentraciones, diluciones en base 2 desde 1.024 128 gg/ml hasta 0,01 pg/mi, y se compar con el obtenido por las tcnicas de microdilucin (sistema semiautomtico PASCO) de difusin con disco y el sistema comercial Epsilon-Test (E-Test) (12,70,77). Los grupos fenotipicos con los prototipos de las BIPEA se establecieron con los valores de CMI (dilucin en agar) de la ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima, subdividindose cada uno de ellos en dos segn su origen gentico: TEM SHV (TABLAS 32 y 33). La actividad de otros antimicrobianos permiti definir caractersticas particulares dentro de cada subgrupo. Los valores de CMI para la anipicilina, anioxicilina, carbenicilina y ticarcilina fueron, con la excepcin de TEM-4, TEM-5 y TEM-12, superiores a 1.024 pg/nil. Por el contrario, la piperacilina nunca alcanz este valor, siendo el rango obtenido con las enzimas derivadas de TEM
(64-256 xg/mi) inferior al observado con las derivadas de SHV (256-5 12 gg/m]). Con la asociacin

piperacilina/tazobactam se obtuvo un rango de 4/0,5 a 8/1 gg/m] para las BIPEA de tipo TEM y de 16/1 a 64/8 gg/rnl para las de tipo 511V. Estas diferencias fueron menos acusadas con las asociaciones de amoxicilina/cido clavulnico o ticarcilina/cido clavulnico.

106

Restitados

En general, se observ una mayor elevacin de los valores de CMI de las cefalosporinas de 1~ y 2~ generacin, incluyendo las cefalosporinas orales cefixima y cefdinir, con las 8-lactamasas de tipo TElA que con las de tipo 514V. Por el contrario, los valores obtenidos para los metox-Illactmicos (ternocilina y cefamicinas) y los carbapenenis fueron muy similares. Slo la codificacin de TEM-12 determin un valor de CMI para el imipenem de 1 gg/ml, considerablemente mayor que con el resto de la 3IPEA (0,06-0,2 gglml).
TABLA 32.-

Grupos fenotpicos de sensibilidad (agIm]) de Eseherichia col! K12 BM2l con diferentes 5-lactamasas de amplio espectro y BIPEA de tipo TEM.
8lactamasa, plaemldicas de amplio tapectro Alactamaaas
1 GRUPO la GRUPO II&

plaumidicas
1

de

espectro

ampliado

GRUPO ZITa

flhtbtico

TEH1 TEN2 pI 5.4 pI 5.6

Aapicilina kaoxicilina liperacilina Carbenicilina licarcilin. Ai~ox./c1av. Ticar./clav. ?iper./tazO. Cefalotina Cefazolina Cefatandol Ceturoxisa Cefaclor Cefixma Cefdinir Cefotaxima Ceftizoxiaa Ceftr~axona Cefpiroua Ceftazidiaa Aztreonam Carusonte Temocilina Cefoxitina Cefmlr>ox Cefotetan Hoxalactaa laipenez Neropenea Ziapenea >1024 >1024 256 >2024 >1024 8/4 32/2 4/0,5 32 4 1 4 8 0.2 0,2 0,03 0,03 0,03 0,06 0.1 0,01 0.01 4 4 2 0,06 0,06 0,06 0,01 0.01 >1024 >1024 512 >1024 >2024 8/4 16/2 16/2 >128 8 2 8 16 0.5 0,5 0,06 0,06 0.06 0.2 0.5 0.1 0,06 8 4 2 0,2 0.2 0.2 0.03 0.03

TEI43 TEH4 pI 6.3 pl 5,9

>1024 >1024 256 >1024 >1024 8/4 32/2 8/1 128 64 16 32 123 4 8 8 4 4 1 16 16 0.5 8 4 2 0.5 0,5 512 512 64 >1024 >1024 8/4 16/2 4/0,5 >128 64 8 32 >126 32 8 8 4 8 1 8 4 2 6 4 2 0.5 1

TEH6 pI 5.9
>1024 >1024 64 >1024 >1024 8/4 32/2 8/1 32 16 8 4 16 2 0,5 0.5 0,2 4 1 64 32 4 8 4 1 0.5 1 0.1 0.03 0.03

TEH5 7KM? IDia pI 5,55 pI 5,41 pI 5,9

512 512 64 >1024 >1024 8/4 16/2 8/1 128 64 16 16 128 32 8 1 1 2 1 32 4 2 4 4 2 0.2 1 0,2 0.03 0.03 >1024 >1024 256 >1024 1024 16/8 8/2 8/1 16 8 4 8 16 1 0.5 0.5 0,2 2 2 16 2 0.1 >1024 >1024 256 >1024 >1024 8/4 16/2 4/0,5 64 16 6 8 2 1 1 2 2 1 64 8 1

TEM12 pI 5,25 1024 1024 128 >1024 >1024 8/4 16/2 4/0,5 64 32 8 16

1 1 1
0,5 1 2 4 32 0,5 0.2 16 4 2 1 1 0 0.03 0.03

a 1 0,5 0.5
0.1 0,01 0.03

8 4 1 1 1
0.1 0.01 0.03

0,1 0.1 0.01 0,01 0,03 10.01

107

Resultados

TABLA 33.-

Grupos fenotpicos de sensibilidad (pg/m]) de Encherichia col! 1(12 BM2I con

diferentes B-lactainasas de amplio espectro y
8lactamasa. plasmldacas de amplio espectro

BlPEA de tipo SHV.

de espectro ampliado GRUPO UIt 8HV6 pI 7,6

Alactamasas plas.tdicas GRUPO Ib SHV2 pI 7.6 SMV3 pl 6A8

GRUPO lib SIIV4 pI 7,8 SKV5 pl 8.2

Antibitico SHV1 pl 7,6 Amplellina Asoxcilina Piperacilina carbenicilina Ticarcllina Amox./ciav. Tcar./ciav. Piper./tazo. Cefalotina Cefazolina Cefnandol Cefuroxima Celador Gel ixita Celdinir Cefotaxima Ceftizoxma Celtriaxona Celpiroma Celtazidima Aztreonam Carumonas

>1024 >1024 512 >1024 >1024

16/8 32/2 64/8 32 8 2 4 16 0.5 0,5 0.06 0.06 0.06 0.1 0.2 0.06 0.01 0 0 0 0.1 0,1

>1024 >1024 512 >1024 >1024

16/8 32/2 64/8 128 32 16 64 64 8 8 32 16 32 16 16 16 2 16 2 4 0.2 0.5

>1024 >1024 Sil >1024 >1024

16/8 64/2 64/8 >128 128 32 64 >128 8 16 32 16 32 16 16 16 1 16 4 2 1 1

>1024 >1024 512 >1024 >1024

16/8 64/2 64/8 >128 >128 32 128 128 64 32 16 32 32 8 64 64 16 32 4 2 1 0,5

>1024 >1024 256 >1024 >1024

8/4 16/2 16/1 >128 128 64 16 >128 64 16 2 22 16 2 64 64 8 16 2 2 0.5 0,5

>1024 >1024 256 >1024 >1024

8/4 64/2

128 32 16

0,5 1 0,5 0.1 32 2

Temocilina Gel oxitina Cefsinox Cefotetan Moxalactas luipenes )4eropenes Biapenee

16 2 1

0.06 0,01 0.03

0,1 0.03 0.03

0.06 0.01 0.03

0.06 0,01 0.03

0,06 0,03 0,03

0.06 0,01 0.01

3.1. Diferenciacin de grupos fenotpicos. Los grupos fenotpicos establecidos fueron: ~rnnaJ. Comprende aquellas L3IPEA que determinan valores similares de CMI para la ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima (igual CMI una dilucin), distinguindose 2 subgrupos la y Ib.
Grupo CAZ ATt! CTX Grupo Ib: SHV-2 y SHV3. la: TEM3 y TEM4.

108

Resultados

La diferenciacin entre TEM-3 y TEM-4 requiere la utilizacin de la cefixima, el aztreonam o el carumonarn, ya que el resto de las cefalosporinas de 38 generacin, ceftizoxima, ceftriaxona y cefpiroma poseen similares valores de CMI. TEM-3 y TEM-4 presentan valores de CMI de 4 a 16 veces ms bajos para las cefalosporinas de Y generacin que los que confieren las enzimas SHV3 y SHV-4. Fenotpicamente, SHV-3 y SHV-4 son indistinguibles, mostrando tan solo SHV-3 valores mayores de CMI para la cefazolina (TABLAS 32 y 33). Gmno II. Recoge aquellas BIPEA que determinan valores similares de CMI para la ceftazidima y el aztreonam, siendo ambos superiores a los de la cefotaxima (2 ms diluciones), distinguindose, de nuevo, dos subgrupos la y lib.
Grupo la: CAZ ATt! > CIX Grupo lIb: SHV-4 y SHV-S. TEM6.

TEM-6 condiciona una menor afectacin de los valores de CMI para cefotaxima (0,5 gg/ml) en comparacin con los obtenidos con SHV-4 y SHV-5 (8-16 gg/ml). Asimismo, las CMI para el resto de las cefalosporinas de 33 generacin, ceftizoxima, ceftriaxona y cefpiroma, son inferiores para TEM-6. Por otra parte, dentro del grupo lib, SHV-5 determina una CMI menor para la cefpiroma (2 gglmi) en comparacin con SHV-4 (8 ggmJ) (TABLAS 32 y 33). Gruno III. Comprende aquellas BIPEA que determinan valores de CMI para la ceftazidima superiores a los del aztreonam y stos superiores o similares a los de la cefotaxima, diferencindose dos subgrupos.
Grupo CAZ > ATM > CTX Grupo UIt: SHV6. lila: TEM5,7,8 y 12.

En general, los valores observados con TEM-5 para las cefalosporinas de P y 2~ generacin fueron superiores a los observados con TEM-7, TEM-8 y TEM-12. Por el contrario, para las cefalosporinas de 33 generacin y el aztreenam fueron muy similares. La individualizacin fenotpica de las enzimas incluidas dentro de este grupo requiere la definicin de caractersticas particulares. TEM-7 confiere unos valores de CMI para la ceftizoxima inferiores a los que se obtienen con el resto de las enzimas de este grupo. TEM-12 condiciona un bajo valor de CMI para el aztreonam y superior para la cefpiroma en comparacin con el resto de las BIPEA de tipo TEM, mientras que con SHV-6 los valores de CMI para la cefpiroma son similares a los que se obtienen con la presencia de TEM-l y SHV-1 (TABLAS 32 y 33). 109

Resultados

3.2.- Estudio comparativo de las tcnicas de difusin por disco, dilucin y Epslon-Test. Los resultados para las distintas 8-lactamasas prototipos TEM y SHV, obtenidos con la tcnica de dilucin en agar y los sistemas comerciales de microdilucin (PASCO) y E-Test para la cefazolina, cefoxitina, ceftazidima, aztreonam, cefotaxima e imipenem, as como los halos de inhibicin (mm) para los mismos antibiticos, quedan comparativamente recogidos en las FIGURAS 4 y 5. FIGURA 4.- Anlisis comparativo de los perfiles de sensibilidad a B-lactmicos en Enchercha col! 1(12 BM2l conferidos por BIPEA de tipo TEM.

a) Dilucin en agar.
II <mJg/mI)
126 32

b) Epsilon-Tesr.
128 32
7KM1 4 flM3

71*1 1KMa 7K*.e

7KM 7KMa 7KM.e

8
2
0,5 0,1 003

4 7KM-a
~

* 71M4 -O TTM4~- 7KM-e O 7KMY -A- 7KM-B 4

2
0,5 0,1 0.03

0
X

0 7KMY
~ 4

flM-n

KF

FOX

CAZ

CM

Cfl

tMP

ICF

#OX

CAZ

CM

CTX

IMP

c) Difusin por disco.

lisio. de inhibicin (l-tnml) -6
12 -18

d) Microdilucin (sistema PASCO).

128 32
7KM-~
7KM-4
7KM-S -4 7KM3
~

e
2
0,5 0,1 0,03

7KM-

~
~

7KM-a 7KMa
71M5

-E
~

-0X 0-A-

7KM-a
07KMY

7M4
7KM-Y 7KM4

-24
-30 -38
ICF FOX

.4. 7KM-a
~* 7KM-u

7KM-U

CAZ

CM

Cfl

IMP

kF

FOX

CAZ

CM

CTX

IMP

GRUPOI

GRUPOII

--

--

GRUPO III

110

Resultados

FIGURA 5.-

Anlisis comparativo de los perfiles de sensibilidad a 8-lactrnicos en Eschericha col! 1(12 BM2l conferidos por J3IPEA de tipo SHV.

a) Dilucin en agar.
128

b) tpsIon-TesV.
CMI (ug/mI)
128

32
8

32
MV-i

8
4- MV-2

4 MV-2

2
0,5 0,1

-41- MVS

2
0,5 0,1 0,03

*-

MV-a

-0

MV-e
NY-E

-0 MV-4
-4<- MV-E

.41- V-4
-#-

-O- MV

3,03
KF FOX

CAZ

CM

Cm

IMP

KF

FOX

CAZ

CM

CTX

IMP

c) Difusin por disco.

Mio. de Inhibicin -mml) -5
-

d) Microdilucin (sistema PASCO).

128

32
4

MV., MVI I~v-a

NV4 SMV.4

SMV, MV2

-18
-24
-30 -38
ICF FOX CAZ ATM CTX IMP

a-O
~-

2
0,5 04 0,03

-4 MVI
-O 4<.~.

MVC

MV-E
MV.4

-O- 8MV..

ICF

FOX

CAZ

ATM

CTX

MP

GRUPO 1

GRUPO II

GRUPO III

Al igual que con la dilucin en agar, los valores de CMI obtenidos con el E-Test para la ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima, permiti establecer grupos fenotpicos con las distintas I3IPEA, no asi la difusin por disco y la microdilucin (sistema ASCO) en los que se produjo una superposicin de los distintos perfiles (FIGURAS 4 y 5). El mtodo del E-Test para la cefotaxima, ceftazidim y aztreonam diferenci claramente TEM-l/TEM-2 y 514V-! de las BIPEA (datos de TEM-2 no mostrados en las figuras). En este sentido, el E-Test y la dilucin en agar para cefotaxima en TEM-l/TEM-2 mostraron CMI muy bajas, 0,023-0,047 pgml y 0,03-0,06 gg/mi, respectivamente, claramente diferentes a las obtenidas con TEM-6, TEM-7, TEM-8 y TEM-12 (0,38-0,75 gg/mJ y 0,5-1 ~g/mJ)y TEM-3, TEM-4 y TEM-5 (4-24 pg/mi y 1-8 pg/mi). Por el 111

Resultados

contrario, el disco de cefotaxima no discrimin TEM-1/TEM-2 de TEM-6, TEM-7, TEM-8 y TEM12 (halos de inhibicin de 30-32 mm), aunque s lo hizo para TEM-3, TEMA y TEM-5 (18-20 mm). Con respecto a las 8-lactaniasas de tipo SHV, el disco de cefotaxima diferenci SHV-1 (32 mm) de SHV-2, SHV-3, SHV-4 y SHV-5 (21-23 mm), pero no de SHV-6 (30 mm). Su poder de discriminacin fue inferior al E-Test y la dilucin en agar, ya que estas ltimas s diferenciaron SHV-6 de SHV-1. Los valores de CMI para cefotaxima fueron 0,06 pg/m] por el E-Test y 0,064 gg/m] por dilucin en agar para 5HV-1 y 0,5 ~g/m1por ambos mtodos para SHV-6. En general, los valores obtenidos para la ceftazidima y el aztreonam con el E-Test y la dilucin en agar fueron ms discriminatorios que con el empleo de la difusin por disco. La ceazidima diferenci claramente TEM-1/TEM-2 de TEMA con el E-Test (0,047 y 12 gg/mI, Tespectivamente) y la dilucin en agar (0,1-0,5 y 8 gg/rni) y con menos nitidez con la difusin por disco. Asimismo, el E-Test para ceftazidima facilit la discriminacin entre TEM-6 (48 ~gml)y TEM-8 (128 ~tg/ml)y entreSHV-4 (64 gg/ml) y SHV-5 (128 vg/ml) en comparacin con la dilucin en agar (64 ~tg/rnipara las cuatro il-lactamasas) y entre SHV-2 (24 gg/mI) y SHV-3, (16 gg/ml) tambin en comparacin con la dilucin en agar (16 ~g/m] para ambas enzimas). Slo utilizando el sistema de referencia, dilucin en agar, o el E-Test se observaron pequeos aumentos de la CMI de imipenem para TEM-12 (1-0,75 pg/mi) en comparacin con los valores obtenidos para TEM1/TEM-2 (0,03-0,06 gg/mi) y el resto de las BIPEA (0,06-0,2 gg/mi). El sistema semiautomtico comercial (PASCO) fue menos discriminatorio que la tcnica de difusin por disco debido al bajo nmero de concentraciones utilizadas, de 2 a 32 gg/mI para cefotaxima y de 0,12 a 16 ~g/ml para la ceftazidima y el aztreonam. 3.3. Influencia de mutaciones en las protenas de membrana externa (omplfl. En general, los valores de CMI de la cepa de E. col! MC4lOO con una mutacin ompF, con respecto a los de su cepa isognica, E. col! MH621 (OmpF~) (FIGURA 6), fueron superiores en 2-4 diluciones tanto con las BIPEA como las enzimas TEM-1, TEM-2 SHV-1. La presencia de una mutacin ompP mcretnent en al menos dos diluciones los valores de CMI de la ampicilina, ticarcilina (512-> 1.024 gg/mJ a > 1.024 ~zgIml) y piperacilina (64-512 gg/nil a 128-> 124 hg/ml) conferidos por las BIPEA. Con la excepcin de TEM-6 y SHV-5, la mutacin ompF multiplic por dos el valor de la CMI de la asociacin amoxicilina/cido clavulnico (de 8/416/8 ~ug/rnJ a 16/8-32/16 gg/ml). Esta elevacin fue superior para ticarcilina/clavulnico con todas las BIPEA de tipo TEM (de 8/2 ~g/m1 a 16/2->32/2 gg/ml) y con SHVA y SHV-5 (8/2 a >32/2 112

Resultados

hg/ml). Para la piperacilina/tazobactam se obtuvieron valores de CMI inferiores con las BIPEA de tipo TEM (8/1-16/2 gg/ml) que con las de tipo SHV (16/2-64/8 ig/mi). FIGURA 6.Protenas de membrana externa. A) control de pesos moleculares; B) Escheri cha col MH2l, ompF~; C) Escher!chia col! MC4IOO, ompF.

60

a ~-

e.
~

OBpO

3629

Ompa

24fl
20

La mutacin ompW no modific los valores de CMI de TEM-6 y SHV-2 para la cefazolna (8 y 64 gg/ml) y cefuroxima (8 y 32 gg/ml) con respecto a su isognica ompF~. Con el resto de las BIPEA, la mutacin ompP elev de 2 a 8 veces los valores de las CMI de estos dos antibiticos, siendo TEMA y SHV-4 las ms afectadas. Con independencia de la BIPEA, la mutacin ompF elev de 2 a 4 veces las CMI de cefoxitina, cefminox, temocilina y moxalactam. Es de resaltar que en ausencia de la forma OmpF la elevacin de la CMI del cefotetan fue ms manifiesta en las filactamasas de tipo TEM (factor 4 a 8) que en las de tipo 514V (factor 2). Por otra parte, los valores de CMI de la cefotaxima, ceftazidima, cefpiroma, aztreonam (FIGURA 7) y carumonam fueron los ms afectados por la prdida de la porina OmpF, disminuyendo de 2 a 10 veces su actividad. Entre estas cefalosporinas, la cefpiroma fue la menos afectada (2-16 ng/ml en comparacin con 2-128 gg/ml para la cefotaxima y 16-128 para la ceftazidima). Por el contrario, el imipenem y meropenem perdieron poca actividad en ausencia de OmpE con unos valores de CMI inferiores a 1 gg/ml. 113

Resultados

FIGURA 7.-

Influencia de OmpF en el perfil de sensibilidad a antibiticos fi-lactmicos conferidos por BIPEA en Escherichia coil (MH21, on~pF~; MC4100, ompF9.
CMI (i.ig/mI)

120100

Cefotaxima SC) eo
40 20

Ceftazidima

Cefpiroma

Aztreonam

hu

lii

I .
LII

III,

lA. LIII

1 LIII

liii

<*a.LP~ II

MIlis.
1 II

34567 34567

34567 34567

34567 34567

34567

34567

Enzimas TE M-derivadas
E. coli OmpE~ CMI Uig/mI) 120 09

E cok OmpE-

Cefota ma Ceftazidma

Cefpiroma

Azt reonam

8)
60
4)

20

2345

2345

11
~

!~4s

II

1~1

2345

2345

2345

~ III

2345

2345

Enzimas SHV-dervadas
E. coIi OmpF~ E ccli OmpE-

114

Resultados

4.-

ESTUDIO Y CARACTERIZACION DE LAS B-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO (BIPEA) EN Enterobacteriaeeae (1987 1992).
-

En el estudio prospectivo de sensibilidad de las 24.058 Enterohacreriaceae aisladas en nuestro laboratorio desde marzo de 1987 a diciembre de 1992, se seleccionaron todas aquellas cepas con un fenotipo de resistencia compatible con la presencia de una IIIPEA (oxiimino-f3-lactamasas). Este perfil inclua resistencia o menor sensibilidad a la cefotaxima o ceftazidima, sensibilidad a la cefoxitina y sinergia entre penicilinas e inhibidores de 8-lactamasas. Un estudio de sensibilidad ms amplio por dilucin en agar; la observacin en los antibiogramas de un halo de inhibicin ampliado para las cefalosporinas de 33 generacin o monobactams frente a discos con inhibidores de 8-lactaniasa (prueba de doble difusin en disco) (259); la transferencia de la resistencia y la determinacin del pl confirmaron la existencia de un total de 80 cepas con BIPEA: 25 E. col!, 27 A. pneurnoniae, 25 S. ar!zonae, 1 E. cloacae, 1 Enrerobacrer gergoviae y 1 S. marcescens. 4.1.- Identificacin nidal. Todas las cepas con BIPEA mostraron (sistema semiautomtico PASCO), resistencia simultnea a la ampicilina (>16 gg/mI) y la ticarcilina (>64 ng/mi). El 57,5% de los aislamientos tuvieron un valor de CMI para amoxicilina/clavulnico de 16/8 ng/mI, mientras que en el 27,5% fue superior a esta concentracin y slo el 15,0% inferior o igual a 8/4 gg/m]. Con respecto a cefazolina y cefuroxima, slo el 1,3% y el 22,5%, respectivamente, mostraron valores de CMI inferiores o iguales a 8 gg/ml, con un valor modal, para ambas cefalosporinas, mayor de 16 gglml. En general, los valores de CMI para cefoxitina oscilaron entre 2 y 4 g/ml, obtenindose una CMI superior o igual a 16 gg/m] para un aislamiento de E. col!, dos de A. pneumon!ae y dos Enterohacrer. La distribucin de los valores de CMI para cefotaxima y ceftazidima (sistema PASCO) y los respectivos halos de inhibicin con discos de 30 gg queda reflejada en la FIGURA 8. En la deteccin inicial de las BIPEA fue preciso considerar simultneamente los Valores de CMI de cefotaxima y ceftazidima, sistema PASCO, ya que hasta un 55% de las cepas fueron catalogados como sensibles de acuerdo con los criterios establecidos por el NCCLS (397,399,4oo). Esta cifra se redujo a un 22,5% utilizando 4 gg/m] como concentracin crtica de sensibilidad, valor ms cercano a los puntos crticos recomendados por la Socit Frangaise de Microbiologie (544) y su homloga britnica (British Society for Antimicrobial Chemotherapy) (75). Los datos obtenidos con la difusin por disco mostraron, aplicando los criterios del NCCLS (396,398,400), un 48,7% de cepas sensibles para la cefotaxima y un 35% para ceftazidima (FIGURA 8).

115

Resultados

No obstante, con independencia del valor de CMI o halo de inhibicin para cefotaxima y ceftazidima todos los aislamientos mostraron un halo de inhibicin ampliado en la prueba de doble difusin con disco (FIGURA 9), siendo necesario en un 28,8% de las cepas reducir la distancia entre los discos desde 30 mm, tal como recomiendan Jarlier y cols. (259), a 20-25 mm para evidenciar este efecto. FIGURA 8.Anlisis comparativo de la capacidad de identificacin presuntiva de Emerobacreriaceae con BIPEA.

a) CEFOTAXIMA: Sist. semiautomtico

35

b> CEFTAZIDIMA: Sist. semiautomtico

30 25 20
15 10 5

o
2
4

6 16 CMI (ug/ml>

32

32

0.5

VIO

CMI (ug/mI>

c)
20

CEFOTAXIMA: difusin por disco

d) CEPTAZIDIMA: difusin por disco

20

15

10

o
3030262624222018161412106 6

>3030282624222018161412108

halo de inhibicin (mml

halo de inhibicin (mm)

116

Resultados

FIGURA 9.-

Prueba de doble difusin con discos.

Klebsiella pneumoniae productora de SHV-2.

(AM?: ampicilina; CAZ: eefiazidinm; AUG: an,oxicilina/cido clavulnico; CTX: cefotximna; ATM: aztrecnamn)

4.2.- Caracterizacin por soelectroenfoque. La determinacin del pI en los extractos crudos sonicados permiti establecer tres grupos iniciales distribuidos en torno a tres pI distintos (FIGURAS 10-12): Grupo 1.-pI 7,6 + 7,1
+ 5,4 + 5,4 + 8,8 + 8,2

4 E. col!, 2 K. pnewnonzae. 1 E. col!. 5 E. cofl, 24 K. pneumonzae. 1 E. gergoviae. 1 K. pneumon!ae. 2 E. col!, 25 S. arizonae. 7 E. col!. 1 S. marcescens. 1 E. cloacae. 6. col!.

Grupo 2.- pI 5,9 + 5,4 + 8,0

+

8,8

Grupo 3.- pI 5,4

11~7

Resultados

El 48,1% de las cepas mostraron una sola banda en el isoelectroenfoque, el 48,7% dos y slo el 2,5% tres bandas. En los transconjugantes de aquellas cepas con una segunda tercera banda que enfocaba en la zona alcalina (7,1-8,8) no se observaron stas. Solamente se pudo separar por conjugacin la banda secundaria de la zona cida (5,4) en un 29,7% (11/37) de los casos (3 E. col! y una K. pneumon!ae del grupo 1 y 7 E. col! del grupo 2). Es de resaltar que en el grupo 2, a diferencia del grupo 1, no se encontr ninguna cepa de K. pnewnonae, mientras que todas las cepas del grupo 3 fueron E. col!. FIGURA 10.- Grupo 1.- Isoelectroenfoque de extractos enzimticos de Enrerobacteriaceae con BIPEA de pI 7,6.

12345678

12345678

PI
8,8

8,2
7,6 7,1
4

6,3 5,4

-A-

-E-

A)

Lneas, 1: K. pneu~noniae 66877/90 (pI, 7,6+5,4); 2: E. coli R6K (TEM-1, pI 5,4); 3: K. pneunloniae CFIO4 <TEM-3, pI 6,3); 4: E. col JC2926(pBPO-1)(5HV-2, pI 7,6); 5: E. cloacae RYC11439/89 (pl 8,8); 6: E.
gergoviae 63027/91 (pI, 8,8+7,6+54), 7: E. coli J53-2(pAFF2)(SHV-5, pI 8,2); 8: E. coIi 65907/90 (pI

7,6 +7,1). B)
Lneas, 1: K. pneumoniae CFIO4 (TEM-3, pI 6,3); 2: E. ccli E6K (TEM-I, pI 5,4); 3: K. pneumoniae

65951/92

(pl, 7,6+5,4);

4: K. pneumoniae 56513/90 (pI, 8,2+7,6);

pneumoniae 5162/89 (pl, 7,6)7: E.

5: E. gergoviae 63027/91 (pI, 8,8+7,6+5,4); 6: K. coIi J53-2(RIOIO)(SHV-1, pI 7,6); 8: E. ccli CIA(pSLH47)(SIzIV-6, pl 7,6).

118

Resultados

FIGURA it- Grupo 2.- Isoeleetroenfoque de extractos enzimticos de Enrerobacteriaceae con RIPEA de pI 5,9.
12345678
e

3.
a

PI

6,3
5,9 5,4

Lneas, 1: E. ccli J53(,pCFF34) (pI 5,9); 2:

5.

marcescens 51140/90 (pI 8,0+5,9); 3: 1<. pneumoniae CF1O4

<TEM-3, pI 6,3); 4: E. doacae 39373/89 (pI 8,8+5,9); 5; E. ccli MX <TEM-1, pl 5,4); 6: E. ccli 511189 (pI, 5,9+5,4), 7: 5. arizonae 36536/89 (pI 5,9); 8: E. ccli 88083101 (TEM-6, pl 5,9).

FIGURA 12.- Grupo 3.- Isoelectroenfoque de extractos enzimticos de Enterobacteriaceae con BIPEA de pI 5,4.
123
r

45678
-r-r ~r

PI
6,3

5,9
5,41

s
.44<

5,4
5,25

g5~<

~~~

-v

Lneas, 1: E. ccli Cla(pCIFIOO) (TEM-7, pI 5,41); 2: E. cot 151521/90 (pI 5,4); 3: K. pneunzcniae CFIO4 (TEM-

3, pI 6,3); 4: E. ccli 88083101 (pI 5,9); 5: E. ccli CIa(pBR322-C3)(TEM-12, pI 5,25); 6: E. ccli MX (TEM-I pI 5,4), 7: E. ccli 47676/90 (pI 5,4); 8: E. ccli Tc-47676/90 (pI 5,4).

119

Resultados

4.3.- Grupo 1.- BIPEA de pI 7,6: Fenotipos SHN-2 y SHV-6. El nmero de aislamientos con una banda de pI 7,6 en el isoelectroenfoque fue de 38, y comprendi 27 cepas de K. pneumon!ae, 10 de E. col! y una de E. gergoviae que procedan de 28 pacientes. El patrn de resistencia permiti diferenciar dos subgrupos: a) el primero y ms numeroso, 35 cepas, asociado a un perfil tpico de SHV-2, se caracteriz por tener unos valores de CMI muy similares para la cefotaxima, la ceftazidima y el aztreonam; b) el segundo, compatible con el perfil descrito para la enzima SHV-6 (17), mostr unos valores de CMI para la ceftazidima superiores a los del aztreonam y ambos claramente ms elevados que los de la cefotaxima. El estudio bioqumico y gentico de las 8-lactarnasas implicadas, en comparacin con los prototipos de las BIPEA, confirm la adscripcin de estos dos fenotipos a enzimas del tipo SHV-2 y SHV-6. 4.3.1.- Perfil de sensibilidad y sinergia. El perfil de sensibilidad a antibiticos B-lactmicos y otros antimicrobianos de los aislamientos con BIPEA de pI 7,6 queda recogido en las TABLAS 34 y 35. La ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima, utilizados para establecer los grupos fenotipicos, mostraron en los aislamientos con perfil SHV-2 unos valores de CMI que oscilaron entre 0,5 y 64 gg/ml. Asimismo, el rango para la cefpiroma y ceftizoxima fue tambin amplio, 0,1-32 gg/m], y algo menor para la ceftriaxona, 232 gg/ml. Estos valores fueron corroborados con el E-Test para la ceftazidima, 2-24 gg/ml, el aztreonaxn, 0,38-12 pg/m] y la cefotaxima, 148 ng/ml (FIGURA 13). La presencia de una segunda banda dep1 5,4, presumblemente TEM-l, en 5 cepas de E. col! y 24 de K. pneumon!ae dep 8,2 en 1 cepa de 1<. pneumon!ae no increment los valores de CMI para las cefalosporinas de 32 generacin. Por el contrario, la 8-lactamasa dep1 5,4 elev los valores de CMI para la piperacilina desde 512 gg/nil hasta 1024-> 1024 ggln-il. Asimismo, la 8-lactamasa cromosmica de pI 8,8 en la cepa de E. gergov!ae increment la CMI de la cefotaxima hasta 64 pg/ml respecto del E. col! transconjugante que mostraba una CMI de 8 gg/mi. El segundo perfil de sensibilidad asociado con un pI de 7,6 y caracterizado posteriormente como SHV-6, se encontr en 1 cepa de K. pneumonae y 2 de E. col!. Estos aislamientos mostraron un patrn similar al de SHV-2 en cuanto a los valores de CMI para la ceftazidima, 4-32 gg/ml, siendo inferiores los de la cefpiroma, 0,5-2 gg/mi, aztreonam, 1-4 gglml, cefotaxima, 0,2-0,5 pg/m], ceftizoxima, 0,06-0,1 gg/nd, y ceftria.xona 0,1-0,5 pglml. La presencia de una banda asociada de pI 7,1, coincidente con OXA-3 (91), en una cepa de E. col!, no modific los valores de CMI con respecto a su transconjugante y al de los otros aislamientos que carecan de ella.

120

Resultados

TABLA 34.- Grupo 1, fenotipo SHV-2: Perfil de sensibilidad ~g/ml) y actividad enzimtica.

Perfil pI 7,6 pI

SNV2 pI t6+8.2 pI 7,6.5,4+8,8

7,6 5.4

Antibitico E. cali (3)

Aupicilina Piperacilina Carbenicilina Ticarcilina Azlocilin Meziocilina >1024 512 >1024 >1024 1024 5121024

Y. rneumoniae (1)
>1024 512 >2024 >1024 >1024 >1024

E. cpu (5)
>1024 1024>1024 >1024 >1024 1024 1024

Y. pneubonhae (241
>1024 1024>1024 >1024 >1024 >1024 256>1024

Y. pneumoniae (1)
>2024 512 >1024 >1024 >1024 512 8/4 16/2 32/2 512 256 32 1 1 1 1 16 0 0.5 1 1 1 1

E. gergoviae (1> >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024

32/16 32/4 >32/2 512 512 64 64 26 32 32 8 16 4

Amox./clav. Piper/tazo. Ticar./clav.

Cefalotiria cefazolina Cefuroxima Cefotaxima Ceftzoxiaa Ceftriaxoria Cefpiroma Ceftazidima Aztreonae Carumonae Temocilina Ce! oxitina Ce! Metan Moxalactea

16/8 16/2 >32/2

256512 256 64 816 8 16 8 32 8 2 8 24 1 0.10,2

32/16 >32/4 >32/2

512 512 64 32 8 16 4 64 16 2 4 8 2 1

32/16 8/116/2 >32/2

3264 16 16 48 416 8 4 1632 1632 12 816 24 0,51 12

4/232/16 8/1>32/4 16/2>32/2

256512 32512 864 164 0.532 232 0.116 0,532 0,516 0.14 216 28 0.22 0.21

16 4 4

luipenea Meropenn
Gentamicina Tobraulcina Amicacina

0,1 =0.01
1 0.51 0.51

0.5 0.06
32 8 1

0.1 0,060,03
>128 64 1

0,10.5 0,030.06
0.5128 0.564 0.516

0.1 0,03
0.5 0.5 0.5

0,2 0.06 0,5 0,5 0.5 0 0.03

1

A. nalidlxico Ciprofloxacina
Poafomicina Actividad enziuttica&

12 SO,01
2

1 0.03
2

1 0,03
0.10.2

12 &0.010.06
0.532

= =0,01
32

0.090,02

0.48

0,870,06

0,890.27

1,31

2,B(l.oqt

a. mU/sin/mg de proteXna; b : actividad enzimtica del tranaconjugante pI 7,6+5,4.

121

Resultados

TABLA 35.- Grupo 1, fenotipo SHV-6: Perfil de sensibilidad (gg/m]) y actividad enzimtica.

Perfil BNV6 pI 7.6 pI 7.6.7.1

. coil (1>

Antibitico E. ccli (1)

Ampicilina Piperacilina Carbenicilina TicarciIina Aziocilin Meziociflna Amox./clav. Piper/tazo. Ticar./cav. Cefalotna Cefazolina Cefuroxita Cefotaxima Ceftizoxima Ceftriaxona Cefpiroma ceftazidima Aztreonau carumonaa Temocilina Cefoxitina Cefotetan Moxalactaa
Tmipenem Neropenes

it pT2euwonhae (1>
>1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 32/16 >32/4 >32/2 256 126 8 0.2 0,06 0.5 2 32 4 0.1 8 2 2 0.5 0.06 =0,01

>1024 512 >1024 >1024 >1024 512 16/8 >32/4 >32/2 256 64 8 0.2 0,06 0.1 1 8 2 0,06 4 2 1 0.5 0.1 =0,01

>1024 512 >1024 1024 1024 1024 16/8 16/2 32/2 512 256 8 0,5 0,1 0,5 0,5 4 0 0.2 0 0 0 0,5 0.2 10,01 1 1 4 0,01 0.5

Gentaaicina Tobramicina Amicacina

A. nalidixico ciprofloxacina Post omicina Actividad

0.5 1 1
2 10.01 1

0.5 0,5 2
2 10.01 >128

1,21
a: mU/mm/mg de protena

1,57

1.40

122

Resultados

FIGURA 13.- Grupo 1, Fenotipo SHV-2. El Epsilon-Test en la determinacin de la CMI para una cepa de Klebs!ella pnewnon!ae con una BIPEA de pI 7,6.

<.4..

&

fi

III

III

Ir.

khnn

IiLi2uw3tt*hM#JIIiIffi
A ~ ______

-A;,

7<?

j%;
~,-

~..

,Lw nhI~~.
-,

4~

.4

IP: imipenem; PP pipemcihna CE cofalotina AM ampidiina; FX: cofoxitina; AT: aztrconam; TZ: ceftazidima; CT: oefotaxhna.

7 UFC/depsito, en el estudio de sensibilidad La modificacin del inculo de i& a y i0 de cepas seleccionadas por sus diferentes niveles de CMI, mostr una mayor influencia en aqullas con un perfil de tipo SHV-2 que en las de perfil SHV-6 (TABLAS 36 y 37). Un inculo de i07 UFC/depsito en los aislamientos con BIPEA de tipo SHV-2 elev de 4 a 8 veces el valor de la CMI para la cefotaxirna, siendo menor el incremento observado para la ceftazidima y el aztreonam (factor 2-4). Para la cefpiroma el aumento fue variable: de 4 a 8 veces en aquellas con una nica banda de 7,6 una de 7,6 y otra 5,4, y slo 2 veces en las que presentaron una banda secundaria de pI 8,2 (K. pneumoniae) u otra de 8,8 (E. gergoviae). En los aislamientos del segundo grupo, SHV-6, el aumento fue m. discreto: 2 veces para la cefotaxima y ceftiroma y ninguno para la ceftazidima y el aztreonam. En ambos grupos, SHV-2 y 814V-fr no se detect aumento significativo de los valores de CMI para la cefoxitina. Por el contrario, el incremento del inculo disminuy, discretamente y en algunas cepas, la actividad del imipenem. El estudio de sensibilidad con los inhibidores de B-lactamasas contribuy a la identificacin de las BIPEA. La actividad de amoxicilina y piperacilina se increment con la asociacin de 5 gglml de cido clavulnico, sulhactam, tazobactam BRL 42715B (TABLAS 38 y 39). Todos los aislamientos con BIPEA de tipo SHV-2, a excepcin de la cepa de E. gergovae, mostraron unos 123

Resultados

TABLA 36.- Grupo 1, fenotipo SHV-2: Efecto del incremento del inculo en la CMI (pg/ml).
Perfil pI Antibitico 7.6 pI SEV2 pI 7.6,8.2 pI 7.6,5.448,0

7.6 5.4

E. ccli A.pnetrnoniae E. ccli K.pneumoniae K.pneaaonie 36471/88 61407/91 40739/90 66877/90 50912/89
Ce tota xima o~~ 10~ Cef picota 10~ 10~ 10~ Ceftazidima 10~ 0~ 10~ >4 treonas 10~ 7 o Cet oxit ma 10~ 8 8 8 0.1 0,1 0.5 8 8 8 0.2 0,5 0,5 4 4 4 0,1 0,1 0,1 2 2 2 0,1 0,1 0,1 4 4 8 0,1 0,1 0.5
1 16 128 2 8 32 8 32 64 2 8 16

K.pn.umcaiae 56513/90
3 3 32 1 2 4 4 32 128 1 2 8 4 4 8 0,1 0,1 0.1

E.gergoviae 63021/91
32 64 256 32 32 64 2 4 16 2 16 32 8 16 32 0.2 0,2 0,5

32 32 128 2 4 16 32 64 64 16 16 32

1 1 16 4 4 32 32 32 64 32 64 256

0.5 1 4 0.1 0.1 0,5 1 1 4 0,5 0,5 2

32 64 >128 8 16 64 16 16 64 8 16 32

Imipenet 1O~ 10~ 10~

: unidades formadoras

de colonia por depsito.

valores de CMI para las asociaciones del cido clavulnico y amoxicilina (8-32 pg/mi) y cido clavulnico y piperacilina (1-32 ggmJ) sensiblemente inferiores a los obtenidos con el BRL 427 15B (8-64 y 2-32 ~g/m]), tazobactam (8-64 y 2-32 ~g/m]) y sulbactam (16-128 y 16-128 ~gIniI). Para la cepa de E. gergovae la capacidad inhibitoria del BRL 427 15B fue mayor que la del resto de los inhibidores. En los aislamientos con una BIPEA de tipo SHV-6, el cido clavulnico y el BRL 42715B fueron los inhibidores ms activos, siendo menor las diferencias entre el sulbactam y el tazobactam. En los aislamientos con BIPEA de tipo SHV-2, el cido clavulnico disminuy de 5 a 9 diluciones la CMI de la cefotaxima y la ce~iroma; el tazobactam y el BRL 42715B de 4 a 9 y de 124

Resultados

TABLA 37.- Grupo 1, fenotipo SHV-6: Efecto del incremento del inculo en la CMI (jg/ml).

Perfil pI 7,6

BHV6 pI 7,6*7,1 E. cali 65907/90

>ntibidtico
E. ecli 30753/89
CeEotaxima o~ 10~ 10~ cefpiroma 10~ 10~ 7 o ceftatidma 10~ 10~ Aztreonam o5 o~

E. pneLffo.Iae 5162/89

0.1 0,2 0.5 1 1 2 2 8 8 0.2 2 2

2 2 2

0.2 0,2 0,5 0.2 2 4 8 32 32 0,2 4 4

4 4 4

0,5 0.5 1 0.2 0.5 1 2 4 8 1 1 2

4 4 4

Cefoxitina 10~ 10~ 10~

Imipenes io~ 10~ lo,

0.1 0,1 0.5

0,06 0,06 0.5

0.1 0,2

unidades formadoras de colonia por dep8ito

3 a 6 diluciones el sulbactam. Asociados a la ceftazidima o al aztreonam las diferencias fueron menores: de 3 a 8 diluciones de disminucin con el cido clavulnico y de 3 a 7 con el sulbactam, tazobactaxn o BRL 42715B. En los aislamientos con BIPEA de tipo SHV-6, los valores de CMI ms bajos se obtuvieron con la asociacin del cido clavulnico con la cefotaxima y el BEl. 42715B con la cefotaxima (=0,01-0,03 ~gIml). No obstante, la mayor disminucin se produjo al asociar el cido clavulnico y la ceftazidima (5-7 diluciones) o el BRL 42715B y el aztreenam (4-6 diluciones). En ambos grupos, SHV-2 y SHV-6, la asociacin del inhibidor no modific los valores de CMI de la cefoxitina.

125

Resultados

TABLA 38.- Grupo 1, fenotipo SHV-2: Perfil de sensibilidad (gg/mJ) en asociacin con inhibidores de -lactamasas (+ 5 g/ml).

P.rf 11 Antibitico Inhibidor pI 7,6 pI

8BV2 pI 7.68.2 pI 7,6*8.0*5,4

7,6 5,4

E. ccli <3)
Amoxcilina 4 CLV SUL TAL SRL Piperacilina CLV 4 SUL TAL S~L cefotaxima CLV SUL TAL BR!. Cefpiroma * CLV SUL TAL * BRL Ceftazidima CLV SU!. * TAL ML Aztreonaa + CLV SU!. TAL SRL cefoxitina CLV SU!. 4 TAL SRL >1024 8 16128 1632 1664 512 12 832 24 28 816 0.03 0.20,5 0,030,06 0.030.1 8 0,01 0.51 0,060.1 0.1 32 0.1 0.54 0.21 0.21 8 0.1 0,21 0.10,2 0.51 24 24 24 4 24

X.pneuacniae (1)
>1024 16 32 16 16 512 8 64 32 16 32 0.2 1 0,5 0,5 4 0.06 0,2 0.1 0,1 64 2 6 4 4 32 2 1 1 2 8 8 8 4 4

E. ccli (5)
>1024 8 16 8 8 1024fl024 16 32 32 16 48 0,010,03 0.060,1 0,06 0.03 4 0.03 0.1 0,1 0,060.1 1632 24 816 4 28 16 12 4 4 24 24 4 4 2 2

X.pnsuaoniae <24)
>1024 1632 32128 1664 3264 1024>1024 832 16128 1632 832 164 10,012 0,068 10,014 0.034 0.116 0.034 0.10.5 0,06-1 0.061 0.532 10.012 0,064 0,062 0,034 0.516 10.010,5 0,14 0,062 0.032 28 48 28 28 24 SRL:

K.pneuaonioe <1)
>1024 16 32 8 32 512 32 64 16 16 8 10,01 0,1 0.06 0.01 2 10,01 0,2 0.1 0,03 16 0.2 1 0.5 0.5 2 10,01 0,2 0.1 0.03 4 4 4 4 4 SL- 427155.

E. Qergoviae <1)
>1024 512 256 512 64 >1024 64 32 64 16 64 2 8 4 4 32 1 2 2 2 8 0.5 1 1 1 16 2 4 2 2 16 32 16 8 16

CLV: cido clavulnico;

SU!.: mulb&Ctam; TAL: tazobactae;

126

Resultados

TABLA 39.- Grupo 1, fenotipo SHV-6: Perfil de sensibilidad (ug/ml) en asociacin con inhibidores de B-lactamasas (+ 5 pg/rnl).

Perf 1 Antibitico inhibidor pI 7.6

SEV6 pI 7.6*7,1 E. coil <1) >1024 16 128 64 4 512 8 32 16 8 0.5 0.01 0.06 0.03 0.01 0,5 0.06 0.2 0.1 0.06 0 0,2 1 1 0.2 0 0.06 0.1 0.06 0.06 4 2 4 4 4

E. coIl (1>
Amoxicilina CLV SUL 4 TAL BR!. Piperacilina CLV SUL * TAl. BRL cebotaxma + CLV SU!. TAL ELCefpiroma CLV SUL TAL ELCeft.zidima CLV SU!. TAL * BR!.
Aztreonam CLV SU!. TAL ELCefoxitina * SU!. *311!. TAL ERL

1. pneuaoniae (1>
>1024 16 512 512 32 >1024 4 512 512 16 0.2 0,01 0.06 0.03 0,01 0 0,06 0,5 0.5 0.1 32 0.2 8 8 8 0 0.1 0.5 0.2 0.06

>1024 16 512 128 32 512 8 32 32 16 0.2 0,03 0,06 0,03 0,03 0.1 0,03 0,06 0,06 0,06 0 0.2 2 1 0.5
0 0.1 0,2 0.2 0.06

2 2 2 2 2

CLV: cido clavulnico; ERL: BR]. 42715B.

SU].: sulbactam; TAL: tazobactas;

127

Resultados

4.3.2.- Actividad enzimtica especfica. La actividad enzimtica especfica de los extractos sonicados queda recogida, junto con los datos de CMI, en las TABLAS 34 y 35. Los extractos con una nica enzima de tipo SHV-2 mostraron una actividad especfica sensiblemente inferior (0,07-0,48 mU/mm/mg protena) a la obtenida con las del grupo SHV-6 (1,2 1-1,57 mU/mm/mg). Asimismo, fue inferior a la observada con los extractos que presentaron una banda secundaria de pI 5,4, 8,2 u 8,8 (0,35-12,8 mU/mm/mg) y a la de las cepas utilizadas como controles E. col! 153(R1010) con una 8-lactaniasa SHV-1 (37,09 mU/mm/mg) (34) y E. cloacae RYC1 1439/89-SDM con una B-lactamasa cromosmica estblemente
-

desreprimida (854,92 mU/mm/mg)

(468)

-.

Es de resaltar, la buena correlacin (r=0,745) entre los valores de CMI para la ceftazidima en las 24 cepas de K. pneumon!ae que mostraron una banda de 7,6 y otra de 5,4 y la actividad enzimtica de sus extractos (FIGURA 14), objetivndose una mayor CMI a medida que aumenta la actividad enzimtica. La correlacin para la cefotaxima fue menor (r=0,638). Este mismo hecho fue corroborado en 15 transconjugantes (pI 7,6 + 5,4) de estos aislamientos (datos no mostrados), si bien los coeficientes de correlacin (0,552 para la ceftazidima y 0,427 para la cefotaxima) fueron infer!ores. FIGURA 14.- Grupo 1, fenotipo SHV-2: correlacin entre la actividad enzimtica y los valores de CMI de cefotaxima y ceftazidima en 24 cepas de K. pneunion!ae (SHV-2 + TEM-l).

8>

Cefotaxima.

b) Celtazidima.
rrU/m4n/rng ~roeina

mU/m4r/mg 00161ra
.4 1.2

0.6 0.8

0070653

0.
0.2 0 4 $ 12 1$ 20 2 28 32 38 40 44 44

02 06 60 64
0,41
CEPTAZIDIMA (ug/mI)

C.Al CEFOTAZIMA (u~~m[)

128

Resultados

4.3.3.- Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitroceffn. La FIGURA 15 recoge el perfil de inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin de los extractos enzimticos de 2 aislamientos clnicos, E. col! 36504/88 (pI 7,6) y K. pneumon!ae 61407/91 (pI 7,6) representativos de aqullos con un fenotipo de sensibilidad SHV-2 y del extracto enzimtico de E col! 3C2926 <~pBP60-1) con la 5-lactaniasa prototipo SHV-2 (279). El perfil de inhibicin de los extractos enzimticos de estas cepas fue superponible al obtenido con el extracto de la cepa de referencia con la enzima SHV-2. El sulbactam, tazobactam, cloxacilina, cefotaxima e imipenem determinaron una inhibicin mxima superior al 80% (81-98%), siendo menor para el cido clavulnico, aztreonam (72-83%), cefuroxima, cefoxitina (50-69%), ceftazidima, ceftibuten y cefotetan (8-16%) (datos de cloxacilina y cefotetan no representados). En todos ellos, las pendientes de las representaciones grficas (FIGURA 15) fueron muy similares (diferencia inferior o igual a 0,2). La FIGURA 16 representa el perfil de inhibicin de los extractos de las cepas de E. col! J53(RlOlO) y E. col! CIA(pSLH47) con las enzimas SHV-1 (34) y SHV-6 (17), respectivamente, y del aislamiento clnico de K. pneumoniae 5162/89 con un fenotipo de sensibilidad de tipo SHV-6. El extracto enzimtico de esta ltima cepa mostr un perfil similar al de SHV-1, SHV-2 y SHV-6 para ceftibuten y cefotetan. Asimismo, comparti valores de inhibicin mxima y pendiente para la cefiazidima, aztreonani, cefoxitina e imipenem con SHV-1 y SHV-6 y cefuroxima con SHV-2. Con respecto al imipenem mostr un porcentaje de inhibicin mximo similar al de SHV-2, pero con una pendiente muy diferente, 2,2 para la cepa de K. pnewnon!ae 5162/89 y 1,0 para el extracto con la enzima SHV-2. El porcentaje de inhibicin mximo para la cefotaxima fue mayor en el extracto de la cepa 5162/89 (24,6%) y de la 3-lactamasa SHV-6 (23,1%) que con la enzima SHV-1 (17,6%) y claramente menor que en el de SHV-2 (92,0%). Por otra parte, en el extracto de la cepa de K. pneurnon!ae 5 162/89 los inhibidores de B-lactamasa determinaron unos perfiles superponibles a los obtenidos con SHV-6. siendo ligeramente inferiores a los de SHV-1. 42.4.- Transferencia de la resistencia y frecuencia de conjugacin. Con la excepcin de la cepa de 1<. pnewnon!ae 5162/89 que mostr un perfil de tipo SHV-6, la
resistencia a cefotaxima y ceftazidima fue siempre transferida por conjugacin. En dicho aislamiento

tampoco se consiguieron transformantes con resistencia a las cefalosporinas de 32 generacin. En el resto de las cepas, los transconjugantes se obtuvieron con un frecuencia de conjugacin entre y 2x107 (moda ot, no objetivndose diferencias significativas entre las distintas especies de Enerobacrer!aceae. 129

Resultados

FIGURA 15.- Grupo 1, fenotipo SHV-2: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn en comparacin con la BIPEA prototipo SHV-2.

SHV-2 (pI 7,6>

% Inhibicin

SHV-2 (pl 7,6)

% inhlbclr loo

100 o 80o
4. ciavuinico

80v.< 4<

aztreonsm

so.
4020-

-4-

ulbaotam tambsotmm
oetotaxbna

oef*~roxima
cefoxitina

-4-

-~~

o
.4<.
-y

ceftibuten
imipenem

ceflazid ma
D

y
10

4<

4<

o
0

20 30 40 Tiempo: minutos

50

10

20

so

40

50

Tiempo: minutos

36504/88 (pI 7,6)

loo so 60 40 20
-

36504/88 (pl 7,6)

% inhibicin loo
4<, 4<-

&~YzI

..x.
-4<. 4<.
-

so
a. cIav~lnioo
~+~

-4<

aztrsonam

sulbaotam tazobactam osfotaxima oeftazidlma

so 40 20
-

cefuroxima
a- ce fox itina o ceftibuten
.4<.

~~--

imipenem

~ ~

10

20 30 40 Tiempo: minutos

60

10

20

30

40

50

Tiempo: minutos

61407/91 (pI 7,6>

1 inhIbicin

61407/91 (pI 7,6)

1 Inhibicin 100 80

loo
so
60 o 40 20
4< 4< 4
~

4<. 4<. 4< * 4<

-4-

a.

oiavuliiioo 60 o 20 o
-

aztmonam
Cefuroxima

sulbactam tambactam
cefotaxkna

cefoxitio.
o ceftibuten Imipenem
~0

~
-4<-

osftazidima

o 20 30 40 50

10

20

30

40

50

10

Tiempo: minutos

Tiempo: minutos

130

Resultados FIGURA 16.- Grupo 1, fenotipo 5EV-E: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin en comparacin con la Il-lactamasas prototipos SHV-l y 5EV-E.

SHV-1 (pI 7,6>

1 inhibioln

SHV-1 (pI 7,6)

% Inhibicin 100 50 60 40 20 o

a. OleytjinIoo sulbaotam
cal otaxk>a ostaildIma

4< 4<

4-

Y
4<.

aztreonam cefuroxima a- cefoxitine

4-

~
.4<~

~
~

oeftibuten inlpen.m

10

20

90

40

50

Tlenpo: minutos

10

20

30

40

50

Tiempo: minutos

SHV-6 (pI 7,6>

1 inhibicin

8i-4V-6 (pl 7,6>

1 inhibicIn
loo so

loonoa. ciavulnico
00 40
euibactam a- taxobactan O cefotaxima ccl tazid Iba

aztreonam
~

cefuroxima
O

4<

40 20

~-*

4<
4<.

mo

4<

Cetoxitina oeftlbuten 4<~ imipenem

o
0
10 20 30 40

o
0 10 20 30 40 50

so
Tiempo: minutos

Tiempo: minutos

5182/89 (pI 7,6)

1 InhIbicin loo

6162/89 (pl 7,6)

1 inhibicin loo 80
-

so
Be 40 20 ~0
O 4
-~~

a. citvuitiioo suibactsm tazobaotam cefotaxima

4< so .4< 4< 4< 4<

-4-

aztreonarn ccl uroxima celtibuten

imipenem a- ccl ox tina
O
..4<. O

~
O

40 20-

DO

O t

10

20

30

40

50

10

20

30

40

50

Tiempo: minuten

Tiempo: minutos

131

Resultados

FIGURA 18.- Hibridacin en colonia con sondas especficas de las familias SHV (a) y TEM (b).

a)
A B

tu-,,

Ir

b)
A B

lA, E. ccli J53(pUD18ft5HV3);

2A, E. cot 1C2926(pBP6O-!) (5HV-2);

3A, E. ccli

36471/88 (514V-2);

4A,

K.

pneumonae 61407/91 (SIIV-2); SA, E. ccli 40739/90 (SHV-2+TEM-1);

A,

1<. pnewnonioe 66877/90 (5HV-2+TEM-!).

111,

E. ccli K12 BM2I (sin 13-laetamasa de tipo TEM 4 814V); 211, K. pndumonae 50912/89 (5HV-2+TEM-!);

311, K.

pneuntoniae 65951/92 (SHV-2+TEM-I); 411, E. ccli E. ccli 30753/89 (SHV-6).

C1A(p5Llzl47) (5HV-6); 511, 5<. pneumoniae 5162/89

(5HV-6); 6B,

It, 5<. pneumoniae CF104 (TEM-3);

4C,

E. cot J53-2(pUD!6) (TEM-4);

2C, 5. arizonce 36536/89 (TEM.6/8), 3C, E. cot 514/89 (TEM.6/8+TEM-1), SC E. cot 69350/89 (TEM.4), GC, E. cot 15521/90 (TEM-pI 5,4).

133

Resultados

4.4.- Grupo 2.- DIPEA de pI 5,9: Fenotipos TEM-6/8 y TEM-4. El nmero de cepas que mostraron una banda de pI 5,9 fue de 36 e inclua 1 cepa de E. cloacae, 1 de S. marcescens, 9 de E. col) y 25 de S. arizonae, 24 de las cuales estuvo asociada a la nica epidemia por BIPEA acaecida en nuestro hospital. Atendiendo al patrn de sensibilidad se diferenciaron dos subgrupos: a) el primero y ms numeroso, 28 cepas, mostr un perfil de resistencia de tipo TEM-6 caracterizado por valores de CMI para la ceftazidima muy cercanos a los del aztreonam y claramente superiores a los de la cefotaxima. La enzima responsable de este fenotipo mostr similitud bioqumica con la BIPEA TEM-8, por ello nos referiremos a este subgrupo como perfil TEM-6/8; h) el segundo subgrupo, compatible con el perfil de resistencia descrito para TEM-4 (252,437), mostr unos valores de CMI para la ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima muy similares entre s. El estudio gentico confirm la adscripcin de estos dos subgrupos a enzimas de tipo TEM. 4.4.1.- Perfil de sensibilidad y sinergia. Los valores de CMI para la cefotaxima permitieron diferenciar fenotipicamente los dos subgrupos de I3IPEA de pI 5,9 (TABLA 40), siendo ms elevados en las de perfil TEMA (8-64 gg/mi) que en las de perfil TEM-6/8 (0,5-8 gg/ml). En los transconjugantes (datos no mostrados) se obtuvieron rangos menores, 8-16 gg/ml para las de perfil TEMA y 0,5-2 pg/ml para el resto. Es de resaltar que los aislamientos con perfil TEMA (incluyendo en el anlisis el transconjugante de la cepa de S. marcescens) mostraron unos valores para la ceftazidima y la cefotaxirna muy similares entre si, 4-8 ggm], mientras que en las de perfil TEM-6/8 la CMI de la cefotaxima (0,5-8 gg/ml) fue de 4 a 8 diluciones menor que la de la ceftazidima (16-1024 gg/ml), corroborndose estos resultados con la tcnica del E-Test (FIGURA 19). Con las penicilinas, asociaciones de stas con inhibidores de B-lactamasas, cefalosporinas de 1 y 2a generacin, metoxi-B-lactmicos y carbapenems no se objetivaron diferencias entre las cepas de perfil TEMA y las de perfil TEM-6/8. La modificacin del inculo en cepas seleccionadas por sus diferentes niveles de CMI, mostr una mayor influencia en los valores de CMI de la cefotaxima y la cefpiroma (3A diluciones) que en la ceftazidima (1-3 diluciones) (TABLA 41). Las CMI del aztreonam se vieron menos afectadas en las cepas con BIPEA de tipo TEMA que en las de perfil TEM-6/8. Los valores de cefoxitina no se modificaron en ninguno de los dos subgrupos y slo en la cepa de S. ar!zonae la CMI del imipenem alcanz un valor de 1 ~g/mI con un inculo de 07 UFC/depsito.

134

Resultados

TABLA 40.- Grupo 2, fenotipos TEM-6/8 y TEMA: Perfil de sensibilidad ~g/mi) y actividad enzimtica.

Perfil pI Antibitico S.erizona, (25) Aupicilina carbeniciina Ticarcilina Aziocilin Piperacilina ~4i.lOCiliflt Ayn ,x./cav. Ticar./clav. Piper./tazo. Cefalotina Cefazolina cefuroxima Ce!otaxima Ceftizoxima Ce!triaxona Ce!~iroma Ce!tazidima Aztreonam CaruEona~ Temociina Cefoxitina C~fotetan MoxaThetas Isipenem MriOpCfl$t Gentamicina Tobraticina Amicacina Arialidixico ciprofloxacina Foafomicina Actividad Y?>kt~C$a >1024 024 >1024 >1024 5121024 1024>1024 8/416/8 32/2>32/2 16/232/4 128256 32228 816 28 12 24 816 5121024 64256 416 1664 24 0.2 0,20,5 0.10,5 =0.0I0,06 128>128 3264 0.52 12 10.010,03 0,52 5.9

TBl6/8 pI 5,9.5,4 pI 5.9.8.8 E.cloacae (1> >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >32/16 >32/2 >32/4 512 512 32 1 1 1 4 128 128 4 8 128 32 0.1 0,2 0.06 128 16 1 2 0.03 2 pI 5,9 E. cali <1)

Perfil

TH44 pI 5,9*8,0 S.mtrcncens <1> >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >32/16 >32/2 >32/4 >512 512 128 64 64 64 2 4 2 0,1 32 8 8 2 0.2 0,06 32 2 >64 8 1

pI 5,9*5,4 E. cali (6> >1024 >1024 >1024 >1024 1024 1024>1024 8/416/8 >32/2 8/116/2 64128 32 3264 8 48 48 24 48 24 0.21 416 24 0.21 0.1 0.10.2 =0,010.03 >128 3264 48 1 ~o,o 0.51

E. cali (1> >1024 >1024 >1024 1024 256 256 4/2 4/2 4/0.5 256 64 32 1 1 8 2 16 16 2 8 2 0.2 0,5 0.2 0.03 128 32 1 1 =0.01 0,2

E. coil (1> >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 16/8 >32/2 16/2 64 16 4 0.5 0.5 0.5 1 64 16 2 16 2 0,2 0.2 0,1 =0,01 64 8 1 1 =0.01 0.5

>1024 >1024 >1024 1024 256 512 8/4 8/2 8/1 64 32 32 8 8 8 1 4 2 0,1 4 2 1 0,5 0.2 0.03 16 8 2 1 ~0.01 0.5

1080.57

1.59

2,16

2,ss<o.97>b

1.25

1,730.42 pl 5.9

3,59<0,87>b

a: mu/Din/mg de protena;

actividad

enzimtica del traneconjugante

135

Resultados

FIGURA 19.- Grupo 2, fenotipo TEM-6/8: Detalle del Epsiln-Test en la determinacin de la CMI de una cepa de Salmonella arzonae con una IIIPEA de pI 5,9.

~S&cN. S
AT~\~

C
U

u.

a e u It

11
u
e
B

e e
4 a

U 24 1B u

2 1.5

lo,

..

ti

u
a a S4
.001

AT:

aztrconam;

TZ: cefimzidlina; CT: cefotaxinia

El estudio con inhibidores de 5-lactamasas revel un efecto sinrgico cuando se asociaron con amoxicilina, piperacilina, cefalosporinas de Y generacin o aztreonam (FABLA 42). En los aislamientos con perfil TEM-6/8, 5 gg/ml de sulbactam determinaron una menor reduccin de los valores de CMI de amoxicilina y piperacilina que 5 gg/ml de cido clavulnico, HRL 42715B o tazobactam. Tomando como referencia los 25 aislamientos de 5. ar!zonae, la disminucin de la CMI de las cefalosporinas de 32 generacin y el aztreonam fue menor con sulbactam (3-6 diluciones) que con clavulnico, tazobactam o BRL 42715B (6-10 diluciones). En las cepas con perfil TEMA, a diferencia de las de perfil TEM-6/8, el BRL 427 15B fue el inhibidor menos activo, confirmndose este efecto con las cefalosporinas de 32 generacin y el aztreonam (FABLA 42). 4.4.2.- Actividad enzim~1tica
especfica.

En la TABLA 40 se muestran los valores medios de la actividad enzimtica de los extractos con BIPEA de pl 5,9. En las cepas de 5. ar!zonae el valor medio fue de 1,08 mU/mm/mg protena (rango 0,61-3,29). La presencia de una 8-lactamasa cromosmica en las cepas de E. cloacae y 5. marcescens elev el valor de la actividad enzimtica a 2,85 y 3,59 mU/mm/mg, respectivamente, siendo menores los valores obtenidos con sus transeonjugante, 0,97 y 0,87 mU/mm/mg. 136

Resultados

TABLA 41.- Grupo 2, fenotipos TEM.6/8 y TEMA: Efecto del incremento del inculo.

Perfil pl Antibitico S.arizonae 36536/89 Ce! otaxiua 3 ir 10~ Ce!piroma 3 2O~ 1~ Ce!tazidirna 2 2 64 4 8 32 256 512 1024 Jal reonam 16 64 >512 Ce! oxitina 3(3 128 256 >512 S.arizonae 1111/89 4 4 32 8 16 32 512 1024 >1024 5,9

T~6/8 pI 5,9*5,4 E. cali SH/89 0,2 0.5 4 1 1 32 32 64 >512 16 16 256 pI 5,9.8,8 E. cjoacap 39737/89 3 3 32 1 4 64 64 128 512 32 128 512 pI 5,9 E. ccli 10205/89 > > >128 1 1 16 2 4 4 1 2 4

Perfil

TEM4 pI 5.9.8.0 S.marcescens 51140/90 32 64 128 1 2 4 4 4 16 2 2 8

pI 5,9.5,4 E. ccli 69350/89 1 1 128 0,5 2 16 4 4 8 2 4 4

2 2 4 0,06 0,2 1

4 4 4 0.5 0,5 1

2 2 4

64 128 128

2 2 8

2 2 2

4 8 8

1. penn 3fl3 10~

0,06 0,1 0,2

0,2 0,2 2

0,1 0.2 0,5

0.1 0,1 0,5

0,2 0.2 0,5

6:

unidades foreadora

de colonia por depdsito.

4.4.3.- Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin. El perfil de inhibicin del extracto enzimtico del transformante de la cepa de S. arizonae 36536/89

(Tf-36536/89) con pI 5,9 se representa comparativamente en la FIGURA 20 con el de las cepas de

E. coli TEM-6 A15R~ HB1 14-5748 (42) y E. col! TEM-8 BM2929 (322,324). Los porcentajes mximos de inhibicin de estos extractos fueron similares entre s para el cido clavulnico, 82,1%2,9% (valor medio desviacin tpica); sulbactam, 89,2%2,0%; tazobactam, 92 5% +3 6%; cloxacilina, 90,4% 3,4%;aztreonarn, 37,4% 5,3%; e imipenem, 96,0% + 1 3% Por el contrario, TEM-6, TEM-8 y Tf-36536/89 se diferenciaron en los porcentajes de inhibicin de cefoxitina y ceftazidima, mximos para TEM-6 (87,4% y 46,9%, respectivamente) y mnimos para Tf-3653689 (30,2% y 1,6%). Por otra parte, los perfiles de cefotaxima y cefotetan fueron muy similares para TEM-6 y TEM-8 (83,8% y 85,2%), distancindose claramente del Tf-36536/89 (38,8%). Con este ltimo se obtuvo un perfil para cefuroxima superponible al de TEM-8. 137

Resultados

TABLA 42.- Grupo 2, fenotipos TEM-6/8 y TEMA: Perfil de sensibilidad (jglm]) en asociacin con inhibidores de B-lactamasas (+ Spg/rnl) Perfil TB46/8 pI 5.9 pI 5,9.5,4 pI 5.9.8.8 S.arizonae E. ccli E. ccli E.cloac.e (25> <1) <1) (1) >1024 >1024 >1024 >1024 1631 16 16 >512 64512 128 512 >512 3264 16 16 >512 1632 32 64 512
5121024 28 432 12 48 28 0,060.1 0,10,2 0.060,2 0,030,2 816 0,10,2 12 0,10.5 0,10.5 5121024 0.11 416 0,21 14 64256 0.52 1632 0,51 14 24 2 24 24 24 256 2 8 4 4 1 0.1 0,2 0,06 0.1 2 0,03 0,2 0,06 0,2 16 0,5 2 1 0,5 16 0,06 8 0,03 0.5 2 2 2 2 2 SU!.: subactam; >1024 4 128 8 64 0.5 0,03 0.1 0,06 0.03 1 0,1 0.5 0.1 0.1 64 1 8 1 2 16 1 8 0,2 2 2 2 2 2 2 >1024 4 128 2 2 1 2 0,5 2 1 4 0.2 1 0.1 0,06 128 2 32 0.5 0,06 128 E 4 1 1 128 >128 64 64 4

Antibidtico inhibidor Amoxicilina 4 CLV 4 SUL 4 TAL 4 BRL

Piperacilina CLV BU!. + TAL BR!. Cefotaxiua CLV 4 SU!. 4 TAL 4 BR]. Cefpiroua 4 CLV SU!. TAL BRE Ceftazidiaa 4 CLV SUL 4 TAL BR!. Aztreonaa 4 CLV SU!. + TAL 4 BR!. Cefoxitina C!.V 4 SU!. TAL BR].

peflhl TDI4 pI 5,9 pI 5,9*5,4 pI 5,9+8,0 E. cali E. ccli 8 .arcescens (1> (6) <1) >1024 >1024 >1024 8 816 >512 8 832 >512 1 fr-lb >512 32 3264 512
256 1 2 1 8 8 0.06 0.1 0.1 2 < <0,01 <0,01 <0.01 0,1 0 0.03 0,06 0,03 0,1 0 0.03 0,06 0,03 0,1 2 2 2 2 2 1024 28 816 48 32 8 0.03 0.03 ~0,010,03 2 24 <0.010.06 <0,010.06 <0.010,06 0,5 48 0,060.1 0,060,2 0.060.1 0.5 24 0.06 0,060,1 0,030,1 0.20.5 24 2 2 2 24 >1024 64 16 8 2 64 0,5 1 1 2 2 0,1 0,1 0,1 2 4 0,5 0,5 0,2 2 2 0,2 0,5 0,2 1 8 64 16 8 2

CLV: cido clavulnico;

TAL: tazobactaa; BR!.: BR]. 427153.

Los extractos enziniticos de las cepas de E. col! TEM-LM, TEM-I7 y TEMA (FIGURAS 21 y 22), con igual (5,4) pI y diferente fenotipo de resistencia, mostraron un perfil similar al del transformante Tf-3653689, excepto para el sulbactam, tazobactam, ceftazidima y aztreonam. El perfil de inhibicin de TEM-3 fue, salvo para cefotaxima y cefotetan, indiferenciable del de TEMA. Asimismo, el perfil de TEMA fue superponible al obtenido con los extractos del transformante de la cepa de E. col! 69350/89 y del tranconjugante de la deS. marcescens 51140/90. Estas cepas slo fueron similares a TEM-LM y TEM-17 en los perfiles del tazobactam, ceftazidima y cefuroxima. 138

Resultados

FIGURA 20.- Grupo 2, fenotipo TEM-6I8: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin en comparacin con las BIPEA prototipos TEM-6 y TEM-8.

TEM-6 (pI 5,9)

1 inhibicin loo
80
O

TEM-6 (pI 5,9)

1 inhibicin

loo
000 t

4<

4<

so

o
O

~-

a. olavvlnico suibaotsm cefotaxkna oettuzidima

atreonam

so
40 20 o

-e-

cefuroxima osfotetan
imipenern

40

-a- cclox tina

O
-~ -

O -4<.

4<

10

20

30

40

50

10

Tiempo: minutos

20 30 Tiempo: minutos

40

80

TEM-8 (pl 5,9>

1 inhibicin looso
O

TEM-8 (pI 5,9)

1 inhibicin loo
O

80
A.

Ciev~jiniCo

aztteonam

o 40

o
O

suibactam
O

so
40

Cefuroxirna
4-
O

cetotaxima

cefoxitina cefotitan lmlpenem

mo

4< 4<
4<

20
.4< 4< 4<

4<-

o 50

10

20

30

40

10

20

30

40

50

Tiempo: minutos

Tiempo: minutos

11-36536/89 (pI 5,9)

1 tnhibioin
II

11-36636/69 (pI 5,9)

1 inhibicin
100
80
4<

a. cianjinico suibsctfli taztbactam celotaxina celtazidlma

uztreonam

so.
40

o-

O O O ~~~0

~-*-

celuroxima a- c.loxithia
~-4-O

O
-4<~

cefotetan imlpenem

mo o

10

20

30

40

50

10

20

00

40

50

Tiempo: minutos

Tiempo: minutos

139

Resultados

FIGURA 21.- Grupo 2, fenotipo TEM-4: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn en comparacin con las BIPEA prototipos TEM-3 y TEMA. TEM-3 (pI 6,3>
t inhibicin 100 80
O

TEM-3 (pI 6,3>

% Inhibicin

~-

00
40

-9
D

a. ciavvinioo suibaotam tambeotem oelotaxbna celtazidima

..4<. .4<

4<
~ *.

aztreonam cefuroxima cefoxitina celotetan

imipenem

60 40 20

DO

o ~

4- --0

20 o 0 10

e o o

o
20 30 40 Tiempo: minutos 50 0
10 20 30 40 Tiempo: minutos 60

TEM-4 (pl 5,9)

% Inhibicin loo 80

TEM-4 (pI 5,9>

1 Inhibicin 100
Do

80

.4< ~4<.

~ 0

a. cievulnico eulbactem tazobaotam cetotaxiria celtazidima

y
o
-4-

fltreonam ocluroxima
colox itin a
-4-

Be O 40
O

o
O O O

o
~>

40
20 o

celotetan imipenem

sc.

10

20

30

40

80

10

Tiempo: minutos

20 30 40 Tiempo: minutos

80

11-69350/89 (pl 5,9>

1 inhibicin loo

11-69350/89 (pI 6.9)

1 inhibioln loo

~O .~a.
o

80

4*

O O O

00 40 o 20
4< .4

~-

4-~

~
.4<~

a. cisvtiinioo uibactfim tazobectam celotaxima oeltazidima

00 40 20 o

aztreonam Cefuroxima celoxitina celotetan mipenem

o
4<

o
.4

10

20

30

40

50

10

20

30

40

50

Tiempo: minutos

Tiempo: minuto.

140

Resultados

FIGURA 22.- Grupo 2, fenotipo TEM-4: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitroceffn en comparacin con las 8-lactamasas prototipos TEM-LM y TEM-17. TEM-LM (pI 5,9>
% Inhibicin 100 I00 so

+.-

TEM-LM (pl 5,9)

1 inhibioin

a. olavijinico eulbaotern tazobectam celotaxha celtazidima

aztmotiam osfuroxima cefotetan Impensm

so o 20
-t

~
.4<

~
4<

o
0 10

4<....

o
50 0 10 20 30 40 Tiempo: minutos
50

20

30

40

Tiempo: minutos

TEM-17 (pI 5,9>

1 inhibicin

TEM-17 (pI 5,9)

1 inhibicin loo Co

a. ciavgi*flioo suibectam tsobaotam

osfotaxima

&ztreonam
osfuroxima Oc fox itin e

4-~

so

O .4<~

O 4<

cefotetan
imipenem

ostandima

o0
0 10 20 30 40 50

10

20

30

40

60

Tiempo: minutos

Tiempo: minutos

Tc-51140/89 (pI 5,9>

1 InhIbicin 100

Tc-51140/89 (pI 5,9>

1 Inhibicin ioo 80

Co
a. olavulflico
00
00

4<

o
-~-

aztreonam osfuroxima cefoxitina

cefotetan
imipen.m

suibactani a- taabaotam
4--

60 40
-.

40 o 20 o o
-.4<.
-

~
O
.4<~

o
4<

cefotaxhila oeftaxidima

O
4<

20

o
0

o
50 0

10

20

30

40

10

Tiempo: minutos

20 30 40 Tiempo: minutoa

50

141

Resultados

4.4.4.- Transferencia de la r5istencia

y frecuencia

de

conjugacin.

En este grupo se obtuvieron transconjugantes resistentes a la cefotaxima y la ceftazidima en todos los aislamientos, evidencindose una frecuencia de conjugacin de rango 2x1054x1(Y8 (moda 10-y). 4.4.5.- Anlisis plasmdico e hibridacin en colonia. En todos los aislamientos con BIPEA de pI 5,9 se demostr la existencia de plsmidos conjugativos. En las cepas de 5. arizonae aisladas en la epidemiapor I3IPEA, se asoci la resistencia a ceftazidima con un plsmido, pRYC36S36, de tamaf o aproximado de 59 Kb (FIGURA 23). Asimismo, en los controles epidemiolgicos realizados en la Unidad de Cardiologia Peditrica, donde se produjo la epidemia, se aisl a partir de las heces de un paciente, una cepa de E. col! que presentaba dos
plsmidos con taniaflo aproximado de 63 (pRYC5H) y 2 Kb. El primero de ellos codificaba

simultneamente la BIPEA de pI 5,9 y otra B-lactamasa de pI 5,4 (TEM-1). La hibridacin con sondas especficas de tipo TEM, fragmento SspI/PsrI de 560 pb del
plsmido PBR322 (131), y 514V, fragmento PsrIINorI de 450 pb del plsmido pHUC37 (406),

confirm la adscripcin de estas enzimas a las 8-lactamasas de tipo TEM (FIGURA 18). FIGURA 23.- Grupo 2: Representacin de la digestin de los plsmidos pRYC353 y pRYC5H portadores de la BIPEA de pI 5,9 (FEM-68).
1 2 3 4 5 6 7 fi 9 10

=======

===

2~O. ItwJ.

Lfnoas:

y 8, X/Rinall1; 4, pRYC36S36

(S.

azonae

36536/89);

5, p36536/89 EcoR!; 6, pRYCSH (E. cot

5H/89); 7, pRYC 514/89 /EcoPJ.

142

Resultados

4.5.- Grupo 3.- BIPEA de pI 5,4. Este tercer grupo se observ en 6 cepas de E. col! aisladas de la orina de 3 pacientes no relacionados entre s. Obviamente, la diferenciacin entre la BIPEA de pI 5,4 y TEM-1 no fue posible por isoelectroenfoque, la sinergia con el cido clavulnico en la prueba de doble difusin por disco, ausente en TEM-1, y su panicular fenotipo de resistencia transferible nos permiti su individualizacin. 4.5.1.- Perfil de sensibilidad y sinergia. El fenotipo de resistencia de los 6 aislamientos y sus respectivos transconjugantes queda recogido, junto con el de la cepa de referencia de E. col! productora de TEM-l, en la TABLA 43. En las cepas con la BIPEA de pI 5,4 y en sus respectivos transconjugantes se observ, comparativamente con TEM-l una elevacin de 16 a 64 veces de los valores de CMI para la cefazolina, cefalotina y cefuroxima; de 4 a 64 veces para las cefalosporinas de Y generacin y de 64 a 128 para el aztreonam. Comparativamente con TEM-1 y otras IIIPEA, se observ un incremento de las CMI de la temocilina, cefoxitina, cefotetan y moxalactam (TABLAS 32-35,40 y 43). El incremento del inculo estudiado con la cepa de E. col! 1552 1/90, y su transeonjugante objetiv una menor afectacin de los valores de CMI de la cefotaxima que el obtenido con la cepa de referencia con la enzima TEM-l (TABLA 44). La elevacin de los valores de CMI de la ceftazidima para ambas enzimas, BIPEA de pI 5,4 y TEM-l, fue de 4 diluciones, no afectndose apenas los de la cefpiroma y el aztreonam. La adicin de 5 gg/ml de cido clavulnico, sulbactam, tazobactam o BRL 42715B a la amoxicilina o piperacilina determin un menor efecto en las cepas con IIIPEA de pI 5,4 respecto de TEM-1, siendo el sulbactam el inhibidor menos activo (TABLA 45). La asociacin del BRL 427 1SB con cualquiera de las cefalosporinas de Y generacin o el aztreonarn determin el rango de CMI con lmites ms bajos, 0,03-0,5 ~gImd,siendo el del cido clavulnico, 0,03-1 gg/m], tazobactam, 0,06-1 pg/ml, y sulbactam, 0,1-2 pglml. Coincidente con lo descrito con las cepas con BIPEA de pI 7,6 y 5,9, la adicin de 5 gg/ml del inhibidor no modific los valores de CMI de la cefoxitina.

143

Resultados

TABLA 43.- Grupo 3, OIPEA de pI 5,4: Perfil de sensibilidad (pg/rnl) y actividad enzimtica.

Perfil

TDEderivada pI 5,4

TDI1 pI 5.4 E. ccli <Rbi)

Antibitico

E. cali (6f
Ampicilina Piperacilina Carbenicilina Ticarcilina Azlocilir N..zlocilina Asex./clav. Piper./tazc. licar./clav. cefalotina Ce! azolina Cefuroxima Cefotaxisa Ceftizoxiaa Ceftriaxona Crfpiroua Ceftazidiaa Aztreonat Carusonas Tetocilina Cci oxitina Cefotetan Moxalactaw Imipenea Heropenes Biapenen Gentamicina Tobramicina Amicacina >1024 512 >1024 512>1024 512 256 32/16 8/1>32/4 8/2>32/2 256512 64256 1632 0,51 1 0.12 0.52 48 0 0,11 48 816 14 12 0,1 =0,010,06 0,030,06 0,51 24 24

tranzconjugantes (61 >1024 512 >1024 >1024

>2024 256 >1024 >2024

16/8 8/116/8

8/4 4/0.5 32/2 32 4 4 0,03 0,03 0.03 0,06 0.1 <0.01 <0,01 0 0 0,06 0,06 0.06 <0.01 <0.01

64128 1632
0,52 0,22 0.52 28 12 48 832 0,060,1 0,03

0.51 12 0,20.5 >64

A. nalidxico 1>64 Ciprofloxacina =0,014

Posfozicina
Actividad enzimticaa a: su/sin/mg

226
2.080.44 de protena. 1,940.59 0.46

144

Resultados

TABLA 44.- Grupo 3, BIPEA de pI 5,4: Efecto del incremento del inculo.
Perfil InIderivada pI 5,4 kntIbI tico E. cali 15521/90
Cefotaxima

pI 5.4

traneconjugante Tc15521/90 0,5 1

E. coil <SAR>

0.5 0.5
o~ Cefplroma 10~ los aol Ce! tatidima 10~ los

0,03 0,03 0.1

0.2 0.5

0.5 1

<0.01 0.03 0.06

4 4 16

4 8 16

0,03 0.06 0.1

Aztreoham 10~ 10~ 10~

2 2 2

1 1. 2

0,01 0,03 0,03

Cefoxitina 10~ 10~ 10 7 1.iptriet 10~ 10~ 10

8 8 16

2 4 4

4 4 4

0.03 0,1 0,1

0,03 0,03 0,06

0,06 0,06 0.1

a. unidades formadoras de colonias por depsito.

4.5.2.- Actividad

enzimtica especfica.

La actividad enzimtica especfica, recogida en la TABLA 43, fue similar en los extractos de las cepas clnicas y en el de sus respectivos rransconjugantes (2,080,44y 1,940.59mU/mm/mg protena), siendo superior a la detectada para TEM-l (0,46 mU/mm/mg). 4.5.3.- Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefn. En las FIGURAS 24 y 25 se recoge el perfil de inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin de los extractos enzimticos de E. cdi 15521/90 y E. coil <7676/90 en comparacin con los de las B-lactainasas TEM-l, IRT-3, TEM-7 y TEM-Hal, todas ellas de pI 5,4. Las cepas 15521/90 y 47676/90, representativas del resto de los aislamientos clnicos con BIPEA de pI 5,4, mostraron un perfil similar; no obstante el extracto enzimtico de la cepa de E. con 47676/90 determin un 145

Resultados

TABLA 45.- Grupo 3, BIPEA de pI 5,4: Perfil de sensibilidad (.uglml) en asociacin con inhibidores de 8-lactamasas (+ Sgg/ml).
Perfil knt ib tico * inhibidor Asoxicilina CLV * SU!. * TAl BR]. Piperacilina * CLV * SU!. TAL * BR!. Tul-derivada pI 5.4 E. ccli <6) >1024 3264 64128 64 3264 512 14 416 48 12 tranaconjugantes <6) >1024 1664 64128 3264 32 512 1~-8 416 416 28

pI 5.4 E. ccli <RAE

>1024 8 16 8 8 256 2 4 4 2 0.03 =0,01 0,03 10.01 10.01 10.01 0.01 10.01 10.01 10,01 0,06 0,03 0.06 0.06 0.06 0,03 10.01 0.03 0,03 =0,01 1 1 1 1 1 TAL: tazobaotam;

Cefotaxima CLV SU!. TAL BR!. Cefpiroua CLV SU!. * TAL + BR!. Ceftazidima * CLV * SU!. * TAL BR!. Aztreonam + CLV * SU]. TAL * BR!.
Cefoxitina * CLV SU!. * TAL * BR!.

0.51 0.2 0,20,5 0,2 0,10.2 0.52 0.1 0.1 0,06 0,060,1 48 0,11 0.12 0,22 0.10.5 2 0.10.5 12 0.12 0,10,2
816 816 816 16 816

0,52 0.10,2 0,10,5 0,10,2 0,1 0,52 0,060.1 0.10,2 0.1 0.060.2 28 0,061 0.52 0.11 0.060.5 12 0,030,2 0.51 0.060.5 0,030,1
832 832 832 832 8

CLV: cido clavulnico; SUL: sulbactas; BRL: BR!. 4THSB.

porcentaje de inhibicin mximo un 10% ms elevado para la cefotaxima, ceftazidima y cefoxitina que el obtenido con el de E. col! 15521/90. Con independencia de ello, las pendientes fueron similares, 1,9, 0,8 y 1,8, respectivamente. El perfil para el ceftibuten y el cefotetan, no representado en las figuras, fue tambin similar en ambos casos. Es de resaltar que en ambos aislamientos, el porcentaje mximo de inhibicin para el cido clavulnico se produjo a los 10 minutos de comenzado el ensayo y no a los 2 5 minutos como es 146

Resultados

habitual, siendo equiparable a lo observado con la B-lactamasa IRT-3 resistente a los inhibidores de 8-lactamasa. En este caso el porcentaje mximo fue del 10,6% frente al 48,9% y 54,3% de los extractos de las cepas de E. col! 1552 1/90 y E. col! 47676/90, y del 97,4% para la enzima TEM-1. TEM-7 mostr para el cido clavulnico, sulbactam, tazobactam y cloxacilina unos porcentajes de inhibicin ms altos que los obtenidos con la enzima TEM-l o los extractos de las cepas con BIPEA de pI 5,4. El porcentaje mximo de inhibicin para el aztreonam (16-22,5%) slo fue equiparable al obtenido con la enzima TEM-7 (12,5%), mientras que para la cefuroxima (16,3%-9,3%) el parecido fue mayor con el de TEM-1 (17,2%) y la TEM-Hal (9,3%). Con respecto a la cefoxitina, el perfil de inhibicin difiri del resto de las 8-lactamasas, ocupando un lugar intermedio entre TEM-I, IRT-3 y TEM-Hal, que mostraron valores menores (12,4-29,8%) y TEM-7 en los que el porcentaje mximo de inhibicin fue superior al 80%. Para cefotaxima y ceftazidima estos porcentajes mximos fueron mayores a los obtenidos con TEM-1, IRT-3 y TEM-Hal y slo comparables a los obtenidos con TEM-7, si bien las pendientes fueron mucho ms altas en esta iltima. Por ltimo, con el imipenem el perfil fue similar en todos los extractos enzimticos menos en la IRT-3, que fue sensiblemente menor. 4.5.4.- Transferencia de la
resistencia y frecuencia

de

conjugacin.

Las 6 cepas de E. col! con la ZIPEA de pI 5,4 tTansfnieTon la Tesistencia a las cefalospoTinas de Y generacin y al aztreonam, obtenindose transconjugantes con una frecuencia de conjugacin entre 3,1x106 y i0~ (moda iot. 4.5.5.- Anlisis plasmdico e hibridacin en colonia. En todas las cepas clnicas con BIPEA de pI 5,4 se detect la presencia de plsmidos conjugativos, siendo positiva la hibridacin en colonia con la sonda especfica de tipo TEM (fragmento SspI/Ps:I del PBR322) (31) y negativa con la sonda especfica de tipo SHV (fragmento PstI/NotI del pHUC37) (406) (FIGURA 18).

147

Resultados

FIGURA 24.- Grupo 3, BIPEA de pI 5,4: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin en comparacin con las il-lactamasas prototipos TEM-l e IRT-3. TEM-1 (pI 5,4)
% inhibicin

TEM-1 (pl 5,4)

% inhibicin

ioo
4<

sof.
O 0 O
-

o
a. Cisvuianico
4--.~4-~

-4<. .4*-4<-

euibaotam tazobsctam oloxacilina aztrsonam

60

-4--8-

as uroxima celoxitina cetotaxima oeltazidima

imipen.m

O ~

40
.4<..

o
0 10 20 30 40 50 0

OU

10

20

30

40

60

Tiempo: minutos

Tienipo~ minutos

IRT-3 (pl 6,4)

1 InhibicIn 100

IRT-3 (pI 5,4>

1 InhibIcin loo so

so

O O

a. clavuinico

cefuroxima

so.
40 20

~
O

suibactam a- tazot,aotam
4O 4<

so
40 20

4< -4<

-4-

cclox tina

-8O .4<.

oloxecilina atreonsm

cefotaxima celtazidime imipenem

u,

Ej

La

o
o
10 20 30 40 50
Tiempo: minutos

o
0 10 20 30 40
50

Tiempo minutos

15521/90 (pl 5,4) 1 inhibicIn

loo 80~ -

15521/90 (pl 5,4)

1 inhibicin loo

80
a. olevuinico

ceturoxima cefoxitina cefotaxima oeftazidima Imipenem

60

-c

euibactam cioxecilina aztreonam

so

4--~

a- tszcbactam

40
-

O
~

40
20

~
4<

20 o 0 10 20 30 40 Tiempo: minutos 50

o
0 10 20 30 40 50
Tiempo. minutos

148

Resultados

FIGURA 25.- Grupo 3, BIPEA de pI 5,4: Inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin en comparacin con las I1-lactamasas prototipos TEM-7 y TEM-Hal. TEM-7 (pI 5,4>
1. inhibicin ioo
o fi. Oi*vviiiico

TEM-7 (pI 6,4)

1 inhibicin

oo
60-1 ccl uroxima
--4

so
40 20
-

-4-

suibactein tazobeotm
@icxoiiifl*
az

so
40 20

-4-8-

celoxitina Cetotaxim
ccl tazidima

O
.4<-

o
~D 0 0 0 0 0

t reonam

Imipen.m

o
0 10 20 30 40 Tiempo: minutos 50 0 10 20 30 40 Tiempo~ minuto; 50

TEM-I-ial (pI 6,4>

1 inhibicin

TEM-Hal (pl 6,4)

1 inhibicin
loo

so
4-

a. ciavuinico cuibactan,

ccl uroxima

so
40 20
o

-4-

ccl ox hine cefotaxima octazidima

imipcnem

a- tazobactain

-4-

~
4<

OioxaciiiT,8 azreonan,

e
O -4<-

10

20 30 40 Tiempo: minutos

50

10

20 30 40 Tiempo~ minutos

50

47676/90 (pI 5,4>

1 inhibicin

47676/90 (pl 5,4)

1 inhibicin
loo
*4<

too
so
o o o

ao

a. clavuiflico
0~

ccluroxima
-4-4-

so
40

suitactan, -a- tazobsctem

-4-

cciox itinc

celotaxima ccitazid ma imipcnsm

O
.4<4<

mo
o
0
-.4< *

CiOxoiiifl aL1tuenavn

20

10

20 80 40 Tiempo: minutos

50

10

20 30 40 Tiempo: minutos

so

149

Resultados

5.- RESISTENCIA A ANTIBIOTICOS NO il-LACTAMICOS EN Enterobacteriaceae CON 8-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. La presencia de otros marcadores de resistencia a antibiticos no B-lactncos en las cepas con I3IPEA se recoge en la TABLA 46. Los aminoglicsidos (97,5%) y las sulfamidas (80,0%) mostraron la mayor usa de resistencia asociada, mientras que un nmero reducido presentaron resistencia asociada a las quinolonas (6,2%) y la fosfomicina (3,7%) (FIGURA 26). Todos los aislamientos, excepto una cepa de E. gergoviae, mostraron al menos otro marcador de resistencia asociado: el 7,5% presentaron un solo marcador; el 51,2% dos; el 31,2% tres; y el 8,7%, cuatro o ms. Considerando los 80 aislamientos de Enterobacreriaceae con BIPEA, excepto la cepa de K. pnewnonae 5162/89 con fenotipo SHV-6 en la que no fue posible obtener transconjugantes o transformantes, en el 94,9% de los casos (74/79) pudo transferirse al menos un marcador de resistencia con la BIPEA. TABLA 46.- Marcadores de resistencia no Il-lactmicos en Enterobacteriaceae con I3IPEA.
Perfil SIPEA
514V2

Ais1am~entos (nfl>
E. E. K. K. E. X. K. E. E. E. E. E. E. E. E. Y. E. ger9oviaP (1) ccli <3) pneL,mcniae (1) pneumcniae <a> ccli <1> pnsumoniae <3> pneu.cniae <1> pneuroniae <1> pneusoniae (1) ccli <1> ccli <3> preumonjee <4) pneurnoniae <6> pr~euzonhae > pneumoniae (2) pneumoniae U) pneumoniae (4)

MARCADORES DE RESISTENCIA St Sp Hm K~ Ak It Gt Se Nt Dk Te Su Tp
. St St st st st St St St Sp Sp Sp Sp Hm Hm Hm Km Km Km n a se rt m Sp . .. Su Su Su Su Su .. Su . . .. . . . . .. Te Te Te . . .. .. .. Mt Mt rt Mt #t Dk L* M ~ m .. Te .. Te Te Te Su Su .. Su.. .. SuTp . .

Ef

Ha

Ef

TbGmSsMtm fl it Ti> Km cm st .. .. rL Ti> Orn a a Orn a Si Es se E, sg

..

Ha

spNmLAkflassMtD*

SHV6

E. pneuaonhae (1> .5. ccli <1> E. ccli (1) 5. E. E. E. arizonee cloacae ccli <1> ccli (1) <25> (1)

StSp St Sp Hm Km

Te .. Te

.. .. Su.. Su ..

Ef Ef

TENe/E

ita SaNt .1k it Orn 5, Mt m nassnm St Sp Mm Km .. Tha5sNtm

.. St ., Ma E. Ak Ti> Cm 5* Mt t ThGuSsMtIMc

.. Te ,.
Te Te

Su.. Su su Su..
Su SuTp .. Ha

1fl4-4

E. ccli (7) 5. marcescens <1>

TE)4deriv. E. ccli (1> pI 5.4 E. ccli (2) E. ccli <3)

St Sp Hm Ka St Sp Hm Ka St Sp Hm Km

Te Te Te

Su Tp Su Tp Su Ip..

St: estreptomicina; Sp: espectinomicna; Hm: neomicina; Ka: kanamicina; Ak: amicacina; It: tobramicina; Gr gentamicina; Se: sisomicina; Ht: netilmicina; Dk: dibecacina; Te: tetraciclina; Su: sulfaetoxazol; Tp: trimetopria; Ef: fosfomicina; Ma: a. nalidixiro. Merite 7 cursiva: marcadores de resistencia cotranaferidos con la 1PtA.

150

Resultados

FIGURA 26.- Resistencia asociada y cotransferencia en Enierobacteriaceae con 3IPEA.

nt cepas
80 60 40 20

o
ESB AG

Marcadores de resistencia
~

SU

TE

TP

NA

VF

Rnt. asociada (%)

Reet. ootran.ferida

5.1. Enzimas modificantes de aminoglicsidos y co-transferencia de la resistencia.

Todas las cepas con BIPEA excepto dos mostraron resistencia a aminoglicsidos (97,5%), resumindose en la TABLA 47 las enzimas modificantes involucradas y los fenotipos a que dan lugar. El 66,6% de las cepas presentaron una nica enzima modificante de aminoglicsidos, el 24,3% dos enzimas y el 9% tres. Globalmente, el 74,3% de las cepas fueron resistentes a la gentamicina y la tobramicina y slo el 14,1 % a la amicacina. La incidencia de resistencia del resto de los aminoglicsidos fue la siguiente: dibecacina, netilmicina y sisomicina, 74,3%; estreptomicina, 33,3%; kanamicina, 32,0%; neomicina, 28,2% y espectinomicina, 25,6%. Las enzimas modificantes de aminoglicsidos, caracterizadas por la tcnica de Ozanne y cois. (430), as como sus respectivos perfiles de substrato se recogen en las TABLAS 47 y 48. La enzima AAC(3)V descrita por Gmez-Lus (189) AAC(3)V<~L.fue la ms prevalente, detectndose
-

en 46 cepas (58,9%): 15 cepas de K pneumoniae y 3 de E. coIl en asociacin con BIPEA de tipo SHV y 25 cepas de S. arzonae, 2 de E. coli y 1 de E. cloacoe con enzimas de tipo TEM. La enzima AAC(3)VGL confiri resistencia a gentamicina y tobramicina, obtenindose unos rangos de CMI que oscilaron entre 32 y 512 tg/mI y 8 y 64 ng/ml, respectivamente. Asimismo, la enzima AAC(3)V descrita por Coombe y George (13) - AAC(3)V00 -, identificada en un 14,1% de los aislamientos, 4 cepas de K. pnewnoniae con SHV-2 y TEM-1 y 7 de E. col con TEM-4, confiere resistencia a la gentamicina y tobramicina pero a diferencia de la anterior aade resistencia o menor sensibilidad a la amicacina (2-16 gg/ml) y mayor nivel de resistencia a la kanamicina (> 1024
gglml).

151

Resultados

TABLA 47.- Enzimas modificantes de aminoglicsidos en Enerobacterioceae con BIPEA.

Luma modificante de aminogliesidos Perfil pl Perfil 7.6 01PtA Aislamientos SNV2 .5. ccli (3) Perfil (nfl> de resistencia AAC
AA~..L3> VOL AEXLSJ.2J. AEJILL.I. AA~.tflVG!. AflIZilil. ~ AACC3)VGL M~J:flCG AAjj AEILLJJj.2. ANT(3t(9) AEJLIX2. APH(31

ANT

APM
AELXLI.

St Orn It Nt 3. t DIC St St Orn TI, Su Ntt DICt St Sp Km St Sp Hm Orn It Ht Sg KmT~<5> Lk Km Orn Ts Nt Sc LIC St Sp Hm Ak St Sp

Y. pngurnoniae <1> 7.6+5.4 .5. cali <1)

K. pneumonaae Cl> E. cali (4)

K. pneurnaniae (3) X. pneumoniae <3> Y. pneuaonioe <13>

Y. pneuaoniae (4) 7,6+8.2 7,6.8,8 Perfil 7,b Y. pnvumoniae <11 .5. gerqoviee SNV6 E. cali (1> (II

St Sp

AEh.IXILL2J.

AEli.U21.

Pr. pneumoni&C (1> 7,6+7,1 Perfil 5,9 .5. ccli (1> Km St Sp Hm

ANT(3fl9>

APH<3>I

TEN6/S 2. erizonee (25) E. cali (1> (1)

5.9*5,4

.5. cali

Os 75 Ss NO LIC Orn It, 5. Nt1 DIC1 0. Ib Su St Sp Km HmT NO DICT Orn Ib Se HO DIC

A AAC( a> ~uxOL AAnJJ.1 VOL AEU.LLLL AEIILE.L.

5.9+8,8

E. claacee

<1)

Perfil

1044 E. cali E. cali

(1) (6>

5.Q*S,4 5,9.8,0

8. rnarcescons (1)

Km Orn Ib Nt 5. DIC Hmt Akt Km Orn 15 3. DIC Nt1 Hmt Mc Gi Ib Se St NtT DICT

AA~.La1VCG A.3QUn~ AALU.U.U AliZL2mD.

Perfil 704-derivada 5.4 E. cali (6>

Km Hm St Sp

ANT(3)<9>

APM(3>I

por dilucin en agar. microdilucin y difumin por disco;

St: estreptomicina;

Sp: espectinomicina; Hm: neomicina; Nt: netilmicina; Km: kanarnicina~ Mc: amicacina; Ib: tobrarnicina; Orn: gentamicina; Su: Sisomicina; LIC: dibecacina; : intermedio; <3>: sensible; AAC<3>VGL: descrita por OdmezLus y cols.(1980>; AAC<S)VGC: descrita por Ceombe y George (1982). L r1n42: enzima modificante que cotranefiere con la LLPEA.

152

Resultados

TABLA 48.- Perfil de substrato de las enzimas modificantes de aminoglicsidos detectadas en las cepas de Emerobauer!aceae con BIPEA.

Enzimas modificante. de aminoglucdsidos a) Acetiltraneferasas AAC(3>Ttt AAC<3>VGL AAC(3)VCO b> Nucleotiditransf AWT(3>(9) ANT(2>
e) Fomfotransferasas A~H(3) APH(3>I

Perfil de substrato St Sp Hm Km Ak Ib Orn Si Nt Dk Otros

,/

* 1 +

* *

* + .

+ *

*/~ +

* +

Sepi5s

crasas * * + .4

+ *

St: estreptomicina; Sp: espectinomicina; Hm: neomicina; Km: kanamicina; Mc: amicacina; TI,: tobramicina; Gm: gentamicina; Se: sisomicina: Nt: netilmicina; Dk: dibecacina; 5epiSs: 5epi.isomicina; AAC(3>VO!.: descrita por OdmezLus y co~s. <1980). similar a AAC(3>II pero con menor actividad frente a Km; AAc(3>V : descrita Ceombe y George (1982)

La resistencia simultnea a la estreptomicina y espectinomicina (24,3%) fue debida a la nucleotidiltransferasa ANT(39(9), detectndose en 12 cepas de K. pneumoniae y 1 de E. coil del grupo SHV y 6 de E. col! con enzimas de tipo TEM. Asimismo, la resistencia a estreptomicina en ausencia de resistencia a espectinomicina (21,8%) fue debida a la fosfotransferasa APH(3). Otras enzimas identificadas fueron: APH(3)I, 21,8%; ANT(2), 14,1%; y AAC(3)III, 1,3%. Por otra parte, es de resaltar que en todos los casos excepto en 4 aislamientos (94,8%), que presentaron simultneamente ANT(3X9) y APH(3)I, se consigui transferir al menos uno de los enzimas modificantes de aminoglicsidos (TABLA 47). La enzima ms prevalente, AAC(3)VGL, transfiri junto con la BIPEA asociada en todas las ocasiones.

153

Resultados

5.2. Resistencia a quinolonas

por mutaciones en

gyrA.

En nuestra experiencia fue infrecuente la resistencia asociada a quinolonas ya que slo 5 (6,2%) de las 80 cepas de Enrerobacreriaceae con EIPEA mostraron resistencia al cido nalidixico y las fluorquinolonas (FIGURA 26 y TABLA 46). La implicacin de mutaciones gyrA, evidenciada por la disminucin de las CMI de las quinolonas al introducir el plsmido pBGB1Ol con el gen salvaje de la gyrA (67), slo fue posible en una cepa de K. pneumoniae con SHV-2 y una de S. marcescens con TEM-4. En el resto de los aislamientos, 3 cepas de E. col! con un BIPEA de pI 5,4, no se objetiv la disminucin de las CMI y por tanto la presencia de mutaciones en gyrA (TABLA 49). TABLA 49.- Perfil de sensibilidad a quinolonas en Ernerobacieriaceae con BIPEA resistentes al a. nalidixico y sus transformantes con el plsmido pBGB 101 con el gen salvaje urA.

BiPEA S}?V2 TEH4

Aislamiento Y. pneumoniae 61384/92

MAL 2.048 8 2,048 512 >4,096 >4,096 >4,096 >4,096 >4,096 >4.096

MOR 0 0,2 1 1 32 32 64 32 32 32

CMI (Mg/mil CIP TEN 0.1 0.03 0 0.2 4 4 4 4 4 4 0.5 0,06 1 1 It, 16 E 8 8 4

OF!, 0 0,1 0 0.5 E E E E E E

SPA 0,2 ~0,01 0 0.2 4 4 4 4 4 4

Tf61384/92
5. mercescens 51140/89

TL51140/89
TF.Mp 5,4

E. ccli E. ccli E. ccli

47676/90 Tf47676/90 45232/90 Tf45232/90 44545/90 Tf44545/90

KA!,: cido nalidxico; TIs~: temafloxacina;

MOR: norfioxacina; OF!,: ofloxacina;

CII: ciprofloxacina; SPA: emparfloxacina.

523. Resistencia a tetraciclinas, sulfamidas, trimetoprm y

fosfomicina.

La resistencia a las sulfamidas (sulfametoxazol) y el trimetoprim se encontr en 60 (80,0%) y 10 (12,5%) cepas, respectivamente (FIGURA 26 y TABLA 46), pudiendo transferirse en el 82,8% y el 60,0%, respectivamente. La resistencia a la tetraciclina ocup un lugar intermedio, 43,7%, y slo un 3,7% lo fue a la fosfomicina. En ninguna de las tres cepas con resistencia a la fosfomicina se consigui transferir sta con la BIPEA. Por el contrario, todos los aislamientos con resistencia a tetraciclinas, excepto uno, cotransfirieron sta con la BIPEA. 154

Resultados

6.- EPIDEMIOLOGA DE LAS il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. Entre los 24.058 aislamientos de Enterobacreriaceae estudiados prospectivamente entre marzo de 1987 y diciembre de 1992, identificamos 80 cepas (FIGURA 27) con un patrn de resistencia compatible con la codificacin de IIIPEA, totalizando una incidencia media del 0,33% con valores anuales del 0%, 0,06%, 0,8%, 0,5%, 0,2% y 0,2%, respectivamente. K. pneumoniae (27 cepas, 33,8%), E. col! (25 cepas, 31,2%) y S. arizonae (25 cepas, 31,2%) fueron las especies con mayor incidencia de BIPEA. El resto de los aislamientos inclua 2 cepas de Enterobacter (2,5%) y 1 de A. marcescens (1,3%). Considerando el total de aislamientos de cada gnero o especie la incidencia de cepas con BPEA fue: Salmonella, 2,6%; K. pneumoniae, 1,6%; E. col!, 0,2%; 5. marcescens, 0,09% y Enterobacrer, 0,03%. FIGURA 27.- Enrerobacreriaceae con BIPEA aisladas en el Hospital Ramn y Cajal (1987-1992).

Enfr,cb.cIe, spp. 8. mna,c.sceni

irIwn..

W s.

E. cali

1987

1988

1989

1990

1991

1992

Ao

Las 80 cepas con BIPEA se obtuvieron a partir de 76 muestras de acuerdo con la siguiente distribucin: 24 exudados respiratorios (31,6%), 17 orinas (22,4%), 11 muestras de heces (14,5%), 9 exudados de herida (11,8%), 8 hemocultivos (10,5%) y 7 catteres (9,2%) (TABLA 50), obtenindose en cuatro muestras simultneamente 2 cepas con BIPEA. Las 76 muestras procedan de 44 pacientes, 24 hombres y 20 mujeres, con un rango de edad entre 29 das y 78 aos. El 68,2% perteneca a la Unidad de Cardiologia Peditrica, por lo que la media de edad fue relativamente baja, 14,4 aos. La distribucin por reas de hospitalizacin se refleja en la FIGURA 50: el 75,0% proceda de servicios quirrgicos o unidades de cuidados intensivos y el 15,9% de servicios del rea mdica, siendo el 9,1% (4 pacientes) enfermos del mbito extrahospitalario (FIGURA 28). 155

Resultados

TABLA 50.- Distribucin de cepas de Enerobacrer!aceae con BIPEA en el Hospital Ramn y Cajal (1987-1992) por pacientes, muestras y servicios.

Perfil

AXPEA

E. ccli
8 s~ orinas(4> SAS (3> catteres<1>

Y. pneufonlae

S. arizonae

frterobecter
1 1 DAS (1)

S. marcescer,s

ZBY.2 <pT 7.6> nflcepas nfl pacientes Huestrascnfl

Servieios< >~

26 20 orinas(4> heridas(S) RAS (11> hemocultivos(s) catteres(S) Cardio~Ped.(4b> CardioP.d(15) Hefrologia<1) Urologan> UCX(2) .Pediatria(2)

Heu.ologla<1)

SHV6 (pl 7.6) n2 cepas nS pacientes P4uestras<n21 Servicios> >~

2 2 heridasc> orinas<1> CardicPed(1> Urgencias (1>

1 1 hemocultivos<1) Urgenciasl>

(pI 5,9> nP cepas n2 pacientes Nuestras(n2>

2 2d esputos(1> hecest>

25

Sernczcs( ~a Tfl<4 (pl 5.9) nP cepas nP pacientes Huestrascrip)

CardioPed<1> Pibr. Quisticacd)

t> BAS<9>,esputos(1~> heces<10> cattteres<l heridas <2> catteres ( hemocu]tivos<1) CardioPed(s) Cardio~Ped(1d> Pibr. Qulstica(1)

Servicios> >a

7 2 heridas(3) Orinas (1) hemocultivos (1> c mte t eres < 1) Pediatria<1> Urgenciam

1 1

orinas<1>

Urologim<1)

TEHderv.<pt 5,4> nP cepas o nflpacientes o Nuestras orinas(6) Se~vicios( >a Gastroenterolgta(1) Rehabilitacin<1) Pediatra(1)

t: pacientes por servicio; b: un paciente tambin con una cepa d~ Y. pneumoniae con SHV2; en un RAS se misi simuitneamente E. ccli y Y. pneumoniae; un paciente tambin con S. arizona.; ~ se samia simultneasente E. coil y 2. arizona.; se simia simultaneamente ir. cloaca. y 5. arizonhe; 9: ingresado anteriormente en Pediatra; amb: paciente ambulatorio.

156

Resultados

FIGURA 28.- Distribucin de pacientes con aislamientos de Enrerobacseriaceae con IIIPEA por reas de hospitalizacin.

rea Quirrgica-UCis

Servicios

QIIIIIII

PIbr. QuMica
Urgencias

W Otros
rea Mdica Pediatria

LII
~

Uds
Nefrologla/UrOlOgIa Cardioig.-Peditrica

Urgenciaa/Ambulante

10 16 20 25

30

36

Nmero de pacientes

Hasta junio de 1988 no se detectaron en nuestro hospital las primeras cepas productoras de BPEA en 2 enfermos del rea de cuidados intensivos de la Unidad de Cardiologa Peditrica. En 1989 fueron 13 los pacientes en los que se identificaron cepas de Enrerobacteriacae con BIPEA (9 implicados en una misma epidemia en la Unidad de Cardiologa Peditrica); en 1990 en 12 pacientes; en 1991 en 7; y por ltimo en 1992 en 10 enfermos. Considerando globalmente los 44 pacientes, el 61,3% present un solo aislamiento mientras que en el 39,7% restantes se obtuvieron ms de 1 aislamiento de la misma especie (29,5%) o de distinta especie (9,1%). Se consideraron aislamientos distintos aquellos que mostraban caractersticas bioqumicas diferentes (por ejemplo, de un paciente se aislaron dos cepas de E. col!, una fermentadora y otra no fermentadora de la lactosa), se obtenan en fechas diferentes o bien, aun aislndose en el mismo da, procedan de localizaciones distintas. En 4 de los 44 pacientes no pudo consultarse la historia clnica, por lo que el anlisis de los factores asociados al aislamiento de Enrerobacteriaceae con BIPEA se realiz en 40. La estancia hospitalaria media fue de 49,1 28,9 das (rango 13-124), cifra superior a la estancia media del total de los pacientes ingresados en nuestro hospital (12,9 das) en el perodo de estudio. La media de aparicin de un aislamiento con BIPEA desde el ingreso fue de 24,6 13,8 das (rango 10-64). Considerando el tratamiento previo con antimicrobianos como factor de riesgo asociado, todos los pacientes analizados excepto 1 haban recibido antibiticos antes de la deteccin de la cepa 157

Resultados

de BIPAE. En dicho paciente se aisl una cepa de E. gergoviae que posteriormente se valor como colonizacin y no como infeccin. De los pacientes tratados, 3 recibieron nicamente
productora profilaxis quirrgica con cefazolina o cefazolina ms gentamicina y uno cotrimoxazol en

monoterapia. De los restantes, 10 recibieron dos antibiticos, otros 10 tres antibiticos, 9 cuatro y 6 ms de cuatro antibiticos. La duracin media del tratamiento antibitico previo fue de 9 9 + 4 7 das (rango 3-32). Los 8-lactmicos fueron los antibiticos ms frecuentemente administrados, a 12 pacientes en monoterapia y a 22 en combinacin con aminoglicsidos. De todos ellos, la cefotaxima se paut en 17 pacientes y la ceftazidima y la cefazolina en 12, respectivamente. La combinacin de una cefalosporina de 32 generacin y un aminoglicsido fue empleada en 14 pacientes, no destacando ninguna asociacin en concreto: ceftazidima ms gentamicina tobramicina, 7 pacientes; cefotaxima ms gentamicina tobramicina, 6 pacientes; y cefotaxima ms amicacina, 1 paciente. Las penicilinas naturales o semisintticas se emplearon en 17 enfermos, en 4 de ellos en asociacin con inhibidores de 8-lactarnasa (amoxicilina/clavulnico), mientras que la ceftriaxona, aztreonam e imipenem en un enfermo cada uno. Entre los aminoglicsidos el ms empleado fue la gentamicina (14 pacientes), seguido de tobramicina (9) y amicacina (2). El nmero de pacientes tratados con otros antibiticos fue el siguiente: vancomicina, 10; eritromicina, 2; clindamicina, 2; y cotrimoxazol, 2. Por otra parte, pudimos constatar que el 82,5% de los pacientes reunan criterios de infeccin y el 10% de colonizacin, no pudiendo determinarse en el resto si el aislamiento correspondi a infeccin o colonizacin. Ninguno de los pacientes colonizados recibi tratamiento antibitico especfico. Por el contrario, 19 de los pacientes infectados (57,5%) fueron tratados con imipenem, 7 (21,2%) con imipenem ms un aminoglicsido (gentamicina o amicacina), 2 con fluorquinolonas, 1 con cefoxitina ms amicacina y en 4 se instaur un tratamiento inicial con cefalosporinas de 33 generacin (3 en asociacin con gentamicina), substituyndose con posterioridad
por imipenem.

De los pacientes tratados 5 fallecieron, no pudiendo atribuirse este hecho nicamente a la infeccin, puesto que cuatro eran enfermos con graves malformaciones cardio-respiratorias y el otro un enfermo terminal con cirrosis heptica. 6.1.- Grupo 1.- BIPEA dc pI 7,6: SHV-2 y SHV-6. El nmero de aislamientos con una banda de pI 7,6 inclua 27 cepas de K. pneumoniae, 10 de E. col! y 1 de E. gergoviae procedentes de 28 pacientes de los cuales el 82,1% estaban ingresados en servicios quirrgicos o en unidades de cuidados intensivos (TABLA 50).

158

Resultados

Los primeros aislamientos de Enterobacrer!aceae con fIIPEA de nuestro hospital <junio de 1988) constituyeron el primer hallazgo de estas enzimas en Espaa (za). En este pequeo brote que afect slo a 2 pacientes de la Unidad de Cardiologa Peditrica se identificaron 3 cepas de E. col! con un perfil tpico de SHV-2. En aos posteriores, en 16 pacientes de la misma Unidad, 4 en 1990, 4 en 1991 y 8 en 1992, se aislaron 20 cepas de Al pnewnoniae y 2 de E. col! con la misma enzima de pI 7,6 (SHV-2). Asimismo, en 2 pacientes de la Unidad de Cuidados Intensivos (septiembre, 1989 y junio, 1991), 1 del Servicio de Urologa (octubre, 1990) y 2 del Servicio de Pediatra (febrero y noviembre, 1992) se aislaron 6 cepas de K. pneumoniae con SHV-2, mostrando una de ellas una banda secundaria de pI 8,2 que no transfiri por conjugacin. Adems, en 1 paciente del Servicio de Nefrologia (julio, 1990) se identificaron 3 cepas de E. col! con SHV-2 y en 1 paciente del Servicio de Neumologia se aisl una cepa de E. gergoviae (noviembre, 1991) con esta misma enzima. Con respecto al tratamiento, es interesante resear que 18 de los 25 pacientes con aislamientos con la enzima SHV-2 recibieron previamente cefalosporinas de 3a generacin: 9
cefotaxima, 4 ceftazidima, 1 ceftriaxona y 4 ceftazidima y cefotaxima.

El segundo perfil de sensibilidad asociado con una B-lactamasa de pI de 7,6, SHV-6, se encontr en 2 cepas de E. col! y 1 de 1<. pneumoniae. Una de las cepas de E. col! (abril, 1989) y la de K. pnewnon!ae (enero, 1989) se aislaron en los hemocultivos de 2 pacientes tomados en el momento del ingreso y presentaron una nica enzima de pl 7,6 que pudo transferirse por conjugacin slo en el caso de E. col. La otra cepa de E. col! (noviembre, 1990), se obtuvo de la
orina de 1 enfermo de la Unidad de Cardiologia Peditrica, mostrando una banda de pI 7,6 y otra

dep 7,1 identificada como OXA-3. 6.2.- Grupo 2.- BIiPEA de pI 5,9: TEM-6/8 y TEM-4. El nmero de aislamientos con una banda de pI 5,9 inclua 9 cepas de E. col!, 25 de A. ar!zonae, 1 de E. cloacae y 1 de A. marcescens. Estas procedan de 13 pacientes, de los cuales el 76,9%
estaban ingresados en servicios quirrgicos o en unidades de cuidados intensivos (TABLA 50). Se identificaron dos tipos de enzimas, TEM-6/8 y TEM-4, estando la primera esencialmente relacionada
con

la Unidad de Cardiologia Peditrica, y la segunda con el Servicio de Pediatra.

El grupo de Enrerobacreriaceoe con perfil TEM-6/8 fue el ms numeroso debido, fundamentalmente, a que su aparicin estuvo unida a la nica epidemia por BIPEA acaecida en
nuestro Hospital que afect a la Unidad de Cardiologia Peditrica. Este episodio estuvo precedido

del aislamiento en 2 pacientes de esta Unidad, entre enero y mayo de 1989, de una cepa de A. arizonae sensible a la ampicilina. Con posterioridad, en junio del mismo ao, se aislaron en 8 159

Resultados

De los 9 pacientes implicados en esta epidemia, slamente 4 haban recibido cefalosporinas de 32 generacin (2 ceftazdima, 1 cefotaxima y 1 ambas cefalosporinas), mientras que al resto se les administr penicilinas o cefazolina. Asimismo, en esta Unidad se detect un importante aumento del consumo de ceftazidima en los 6 meses que precedieron a la aparicin de la epidemia (192 gramos) con respecto al consumo del mismo periodo del ao anterior (110 gramos). Es de destacar que, sin ningn nexo epidemiolgico evidente, se aisl en enero de 1991 a partir del esputo de un paciente ambulante seguido por la Unidad de Fibrosis Quistica, una cepa de A. arizonae y otra de E. col i que presentaron positividad en la prueba de doble difusin con disco y un patrn de resistencia similar al observado en las cepas de la epidemia antes citada (TABLA 40). Como nico factor predisponente, este paciente recibi nebulizaciones de aztreonarn (1 g/12 h) con anterioridad al aislamiento de la cepa resistente. El perfil de sensibilidad TEM-4 se identific inicialmente en 6 cepas de E. col! (abril de 1989) obtenidas de hemocultivos, herida y catter de un enfermo de la UVI de Pediatra que previamente haba recibido cefiazidima y cefotaxima. Con posterioridad, en la orina de un enfermo que 2 meses antes haba estado ingresado en Pediatra (enero 1990) se aisl 1 cepa de E. col! con una BIPEA de pI 5,9 que conferia un perfil de resistencia similar al observado en las cepas anteriores. Por ltimo, en un paciente del Servicio de Urologa (septiembre, 1990) se aisl 1 cepa de A. marcescens con dos bandas en el isoelectroenfoque: una de pl 8,0 y otra de 5,9, mostrando el transconjugante una sola de pl 5,9 y un perfil de resistencia similar al de las cepas aisladas en Pediatra. Este paciente haba recibido nicamente cotrimoxazol. 6.3.- Grupo 3.- BIPEA de pI 5,4. Este tercer grupo se identific en 6 cepas de E. col! aisladas durante 1990 en la orina de 3 pacientes no relacionados entre si (Pediatra, febrero de 1990; Rehabilitacin, agosto de 1990; Gastroenterologia, agosto 1990). Dos pacientes haban recibido previamente penicilinas semisintticas, uno en asociacin con un inhibidor de 8-lactamasas (amoxicilina/clavulnico), mientras que al otro, ingresado en Gastroenterologia, se le administr cefotaxima. 6.4. Portadores fecales de Enlerobacteriaceae productoras de BIPEA. Se estudiaron 1.239 muestras de heces de 849 pacientes (64,1% seguidos en rgimen ambulatorio), aislndose 7 cepas con un perfil de resistencia compatible con la codificacin de BIPEA: 5 cepas de E. col!, 1 de K. pneumon!ae y 1 de C. freundil (TABLA 51). Estas cepas procedan deS pacientes, 161

Resultados

uno ingresado y el resto atendidos por las consultas externas de nuestro hospital, constatndose que estos ltimos haban estado ingresados con anterioridad. En los cultivos procedentes de los pacientes de los Ambulatorios que participaron en este estudio no se obtuvieron cepas de Enrerobacrer!aceae con BIPEA. TABLA 51.- Enzerobacrer!aceae con BIPEA de portadores fecales: perfil de sensibilidad (ug/ml).

pI Antibidtico

8,0

pI 7.6*8,2 C. freundil (1> >1024 256 >1024 >1024

pI 5,9 E. ccli u> 512 128 1024 1024

pI 5.9.5,4 E. ccli ca> >1024 512128 >1024 >1024

E. ccli (1>
Atpicilina ?iperacilina C~rbeniei1ina Ticarcilina >1024 256 >1024 >1024

.pneumoniae <>
>1024 256 >1024 >1024

Amox./clav. :iear./clav. Piper/tazo.

Cefazolina cefuroxima Cfotaxima Ceftizoxima Ceftriaxona alpiroma CeItazidima Aztreonam etroxitina Noxalactas Iaipenem Mer-openem Geritamicina Tobramicina Auicacina Tetraciclina Sulfametoxazol Trisetoprim Ptsfosicina A. nalidlxico Ciprofloxacina a: sensibilidad ~: sensibilidad

16/8 32/2 16/2 256 64

64 4 16 2 2 4 0 0,2 0,1 0,03 0,5 1 2 5a 3 2 <16

8/4 32/2 32/4

512 64

lb/E<B/l>b 8/2 8/1

256 64 32<16) 32 32 4 8(8> 8(8) >32(4> 0,5 0.5 0,03 1 1 2 2 2 2 <16 0 0,06

4/2 8/2 16/2

32 8 32 16 32 8 4 4 0 0.2 0,1 <0,01 0.2 0,5 1 R R(S> RiS) <16 = =0,01

16/84/2 32/216/2 32/4 6432 328

6432 3216 5216 168 164 164 82 0,50.2 0,20,1 0,03 >128(0,51) 64(0.51> 4<24)

32 2 32 4 4
8 0 0.2 0,1 0.03 0,5 1 2

8 8 <16 0 0,03

R<R) R(R) <16 >128(24> 816<0,030,2>

0 0,03

por difusidri con disco; b: sensibilidad del transeonjugante; del transformante con el plsmido pBOMOI.

162

Resultados

La cepa de C. freundil mostr en el isoelectroenfoque dos bandas, una de pI 7,6 y otra de pI 8,0; la primera se observ en el transconjugauxte que present en el estudio de sensibilidad un perfil SHV-2. Esta cepa proceda de un paciente ambulante del Servicio de Pediatra que haba permanecido 25 das hospitalizado sin recibir tratamiento antibitico. Cuatro de los 5 aislamientos de E. col! mostraron una banda dep1 5,9 (TABLA 51). Estas cepas procedan de 3 enfermos, uno ingresado en el Servicio de Neumologia que haba recibido cotrimoxazol y eritromicina y 2 pacientes ambulantes del Servicio de Medicina Interna y la Unidad de Enfermedades Infecciosas que haban recibido cefotaxima durante su estancia en el hospital. El perfil de resistencia fue similar en todos los casos y se caracteriz por unos valores de CMI para cefotaxima ms elevados que los de ceftazidima, siendo stos similares a los de aztreonam (TABLA 51). Por ltimo, en otro paciente ambulante de Medicina Interna, tratado con cefotaxima, tobramicina, clindamicina y ciprofloxacina durante su estancia previa en el hospital, se obtuvo una cepa de E. col! y otra de Al pneumon!ae, ambas con una B-lactamasa de pI 8,0. El perfil de resistencia asociado mostr unos valores de CMI para cefotaxima de 16 a 32 veces ms elevados que los de ceftriaxona, cefpiroma y ceftazidima (TABLA 51). El estudio de resistencia a antibiticos no il-lactmicos mostr que 3 de las 4 cepas de E. col! con una 8-lactamasa de pI 5,9 eran resistentes a quinolonas, relacionndose con mutaciones gyrA. Adems, estos 3 aislamientos fueron resistentes a tetraciclinas, sulfametoxazol y trimetroprim, transfirindose estas resistencias junto con la BIPEA. Asimismo, se detect la presencia de enzimas modificantes de aminoglicsidos, APH(3) y AAC(3)VOL, cotransfiriendo slo la primera con la BIPEA.

163

y.

DISCUSION

Discusin

1.- EVOLUCION DE LA SENSIBILIDAD Y FENOTIPOS DE RESISTENCIA A ANIIBIOTICOS il-LACTAMICOS EN Enterobacteriaceae (1987

-

1992).

El estudio de la evolucin de la sensibilidad a los diferentes grupos de antibiticos, y en particular a los 8-lactmicos, no debe circunscribirse a la simple aportacin del nmero de bacterias resistentes y a su variacin en el tiempo. La resistencia a un antibitico dado est determinada por uno o varios mecanismos de resistencia que responden, en trminos generales, a uno o varios determinantes genticos. Por ello, la expresin de un gen que codifica un mecanismo de resistencia ocasiona una resistencia fenotpica de nivel variable que da lugar a un determinado fenotipo de resistencia
(83,144,250,293).

La caracterizacin del fenotipo de resistencia en un microorganismo dado para un grupo de antibiticos de una misma familia, permite realizar inferencias acerca del correspondiente mecanismo bioqumico de resistencia a partir del cual se pueden deducir comportamientos fenotipicos a veces no detectados en la primera caracterizacin. Este anlisis ha sido recientemente denominado por Courvalin (16) lectura interpretativa y facilita, una vez realizado, la adecuada calificacin clnica de los resultados obtenidos. Asimismo, al estudiar la sensibilidad a lo largo del tiempo, la lectura interpretativa permite conocer la evolucin de los distintos mecanismos de resistencia ms que el simple anlisis porcentual de las variaciones observadas (2H7.39,s=4,537). Por otra parte, la lectura interpretativa hace posible la discriminacin de fenotipos comunes de otros menos habituales o raros y de los fenotipos imposibles, de tal forma que la reiteracin de perfiles inesperados podra indicar la existencia de un nuevo mecanismo de resistencia ( 16). El anlisis de la resistencia a antibiticos 8-lactmicos en Enterobacter!aceae y su evolucin en el tiempo nos ha permitido conocer, a la luz de su lectura interpretativa, los diferentes fenotipos de resistencia, la modificacin de estos patrones en el tiempo y la constatacin de un fenotipo raro en nuestro hospital: Enerobacteriacae con BIPEA. 1.1.- Escherichie col, Soimonella spp. y Proteus miro,bilis. Esta triada constituye uno de los grupos de microorganismos ms frecuentemente aislados en el laboratorio de microbiologa clnica. En ellos, los mecanismos de resistencia a antibiticos filactmicos son similares (83,144,250,293), si bien diferencias en la participacin e incidencia justifican su discusin por separado.

164

Discusin

Escherichia coil.

E. col!, aun siendo ubicuo e integrante de la flora normal del hombre, puede producir gran variedad de infecciones, que incluyen tanto cuadros de menor entidad clnica como otros ms importantes: bacteriemia, meningitis neonatal y neumona nosocomial (153). No es por tanto de extraar que sea uno de los patgenos ms estudiados tanto en el campo de la patogenia como en el de la resistencia a los agentes antimicrobianos. En esta especie, el mecanismo de resistencia a antibiticos 6lactmicos ms significativo es la produccin de 8-lactamasas (362) y en un segundo trmino otros
que incluyen modificaciones en

la membrana externa (z,256,4o=,4o9,41o)y alteraciones en las PBP

(protenas fijadoras de penicilinas) (3s31,4o4,553,554,s97). La produccin de la 8-lactamasa cromosmica de E. col!, B-lactamasa de clase Ib, se realiza de forma constitutiva por el gen ampC (48,5o2,507,so). Su expresin en condiciones normales determina una baja cantidad de enzima (26>) y condiciona, en ausencia de 6-lactamasas plasmidicas, un fenotipo sensible a todos los antibiticos 6-lactmicos (351,503). En nuestra experiencia, y teniendo en cuenta todos los aislamientos de E. col! desde 1987 a 1992, se correspondera con una poblacin importante que supera el 40% (fenotipo 1). El aumento en la cantidad del enzima, bien por mutaciones que afectan al promotor o atenuador del gen ampC (58,261)
0

por un mayor nmero

de copias del propio gen anzpC (s,47,426), determinara un fenotipo similar al VI, de baja incidencia (<1%), constituido por cepas resistentes a la ampicilina y amoxicilina/clavulnico (351) y sensibles a la ticarcilina. Un mayor nivel enzimtico podra afectar a la cefoxitina y a la ceftazidima y en menor medida a la cefotaxima (349,565) (fenotipo VII, 0,2%) (TABLA 23). La incidencia de aislamientos sensibles a la ampicilina, 43,8% (CMI < 16 ggml), y por tanto con un bajo nivel de produccin de il-lactamasa cromosmica y ausencia de 13-lactamasas plasmidicas, es inferior a la encontrada por otros autores, que oscila entre el 54% y el 92%
(22,1 12,146,258,284,524,537,538,545,546). Por el contrario, el porcentaje de aislamientos que posee un

fenotipo compatible con la hiperproduccin de 6-lactamasa cromosmica de clase Ib, fenotipos VI y VII (<2%), est en concordancia con lo referido en otros estudios (h2.zss.3ot362A94,s24,s3s, 550,614) si bien en algunas series la incidencia se eleva hasta un 20% (351,362). El resto de los aislamientos de E. coil (fenotipos II-V, 55,6%) se caracterizan por ser resistentes simultneamente a la arnpicilina y la ticarcilina, denotando, con una alta probabilidad, la presencia de Il-lactamasas plasmidicas (112,254,362). Hasta el momento se han identificado en E. col! 14 13-lactamasas plasmidicas de amplio espectro: TEM-I, -2, SHV-1, OXA-l,-2,-3 (178,356,366, 492,603,607) -4, y -7 (13), PSE-l y -2, OHIO-] (366,607), TLE-l (365), HMS-l (356) y SAR-2 (393). 165

Discusin

La enzima TEM-l es la ms prevalente, destacando posteriormente OXA-l, -2, TEM-2 y SHV-I (17s,254,3o4,35636=,3a,49,492,6o3,6o7). Todas ellas confieren un perfil de sensibilidad muy similar, siendo difcil su individualizacin fenotipica (342). TEM-1 es inhibida eficazmente por el cido clavulnico (248,314) y no confiere, en estado de produccin normal, resistencia a la cefazolina, cefuroxima, cefoxitina, cefotaxima y ceftazidima (251,254). Los aislamientos de E. col! con esta enzima estaran incluidos dentro del fenotipo 11(31,5%). La hiperproduccin de TEM-1, debida generalmente a plsmidos multicopia (339.395), incrementa los valores de CMI para la amoxicilina/clavulnico, cefazolina e incluso la cefuroxima (fenotipo III)
(i 12,175,338,432,493,505,525,537,608).

Si utilizamos la resistencia a la cefazolina como

marcador y excluimos otros posibles mecanismos de resistencia que afecten la actividad de este antibitico, su incidencia seria del 11,8%, cifra superior a la estimada en nuestro hospital por Martnez-Beltrn (340) durante el periodo 1977-1986(2,7%). La incidencia en nuestra serie es muy similar a la descrita por Shannon y cols. (12,9%) (524) en un amplio estudio que incluye cepas de E. col! aisladas de hemocultivos desde 1969 a 1991. Parcializando los valores de este trabajo en distintos perodos, la hiperproduccin de TEM-1 (calculada en funcin de la resistencia a la amoxicilina/clavulnico en los aislamientos con resistencia simultnea a la arnpicilina y la carbenicilina) fue entre 1969 y 1977 del 8,1%, y de un 16,4% entre 1989 y 1991. En un trabajo multicntrico recientemente realizado en la Comunidad de Madrid
(),

la incidencia de aislamientos

de E. col! procedentes de bacteriurias extrahopitalarias con resistencia a la amoxicilina/clavulnico, 19%, es ligeramente inferior a la detectada en nuestro laboratorio (24,6%). Por otra parte, se ha constatado que la hiperproduccin de TEM-l y OXA-] eleva ligeramente los valores de CMI para la cefotaxima sin modificar los de ceftazidima (254,349), situndolos entre 0,2 y 2 gg/mI. La mayora de las cepas con este perfil estaran por debajo del PCR elegido y quedaran incluidas en los fenotipos II y III. Asimismo, y aunque documentado en K. pneumon!ae
(447),

la hiperproduccin de SHV-1 puede disminuir la actividad de la ceftazidima,

alcanzndose valores de 8 gg/mI, sin afectar la de cefotaxima. Hasta la fecha no ha sido documentado este fenmeno en E. col!. factores que elevan los valores de CMI para la amoxicilina/ clavulnico son los relacionados con modificaciones en las protenas de la membrana externa. La prdida de las porinas OmpF, OmpC o ambas incrementa los valores de CMI para las asociaciones de penicilinas e inhibidores de B-lactamasas y las cefalosporinas, quedando menos afectadas las penicilinas (218,232, 254,256,476). La combinacin de factores relacionados con la permeabilidad y la hiperproduccin de
Otros
-

TEM-1 determinara un mayor nivel de resistencia 166

(476)

reflejado en el fenotipo V.

Discusin

Un inculo de o~ UFC/depsito tambin eleva los valores de CMI para las asociaciones de penicilina e inhibidores de B-lactamasas y cefalosporinas de 12 y 2~ generacin (excepto cefoxitina) (340.475,505). Asimismo, la propia inestabilidad a medio plazo del cido clavulnico en los paneles del sistema semiautomtico utilizado en el estudio de sensibilidad (paneles PASCO con soluciones congeladas de antibiticos y conservados a -20 0C) podra explicar el mayor porcentaje de cepas resistentes a la amoxicilina/clavulnico (24,6%) en relacin a la encontrada para la cefazolina (13,6%) (TABLA 9). La hiperproduccin de TEM-1 determina una resistencia comn (493,505) y slo, muy recientemente, ha sido comunicado el hallazgo de cepas de E. col! resistentes a Ja amoxicilina/clavulnico y sensibles a la cefazolina (49,su). Esta ltima posibilidad, esta determinada por mutaciones en la secuencia de TEM-1 que confieren resistencia a la inhibicin por el cido clavulnico y a otros inhibidores de 8-lactamasa (enzimas TRI; TEM resistant to 8-lactamase inhibitors). Estas cepas tienen la particularidad de ser ms sensibles a la cefazolina que aquellas con la enzima TEM-1. Su presencia, adelantada por Bush en 1989 (89), fue confirmada en mutantes in vitro por Oliphant y Struhl (424), Manavathu y ,ls. (332,333,334) y Delaire y coL.
(141).

Los primeros aislamientos en cepas clnicas se

observaron en Francia en 1991 por Belaaouaj y coL. (48), caracterizndose dos 8-lactamasas distintas, TRI-l y TRI.2, ambas con un pI 5,2, en las que la arginina de la posicin 241 se substitua por cisteina y serma, respectivamente (49584). Este caso no parece ser una situacin aislada ya que han sido comunicadas en este mismo pas (79,535) otras cepas de E. col! con similar fenotipo de resistencia pero con una mayor variedad de enzimas en cuanto a sus pI, 5,2, 5,3, 5,4 y 5,5. Recientemente, se ha comprobado que la incidencia de este tipo de cepas procedentes de infecciones urinarias es elevada tanto en el medio hospitalario (14,7%) como extrabospitalario (25.1%) (2=5). Asimismo, en Escocia, Thomson y Aniyes (569) han aislado una cepa de E. col! con una 8-lactamasa de pI 5,25 (TRC-l) no inhibida por el cido clavulnico y otros inhibidores de B-lactamasas (570). En Espaa, la primera cepa de estas caractersticas se obtuvo en 1992 de un paciente con infeccin urinaria adquirida en la comunidad que haba sido tratado durante dos semanas con anioxicilina/cido clavulnico. La B-lactamasa implicada posea una doble mutacin: metionina de la posicin 67 por isoleucina (responsable de la resistencia) y metionina de la posicin 180 por treonna, siendo el pI (5,4) igual al de TEM-l (5,66). Recientemente se han detectado en nuestro hospital algunos aislamientos de E. col! con este fenotipo de resistencia que codificaban una Blactamasa de pl 5,4 (Martnez-Beltrn y Cantn datos no publicados).
Entre

los fenotipos plasmidicos en E. col!, (fenotipos II-y), la resistencia individual o

simultnea a la cefotaxima y ceftazidima y sensibilidad a la amoxicilina/clavulnico y cefoxitina 167

Discusin

(fenotipo IV) caracterizan la presencia de BIPEA (oxiiminocefalosporinasas) (252,341,453). En esta especie se ha descrito un gran nmero de enzimas tanto de la familia TEM como SHV (252,508). En nuestra experiencia, su incidencia a lo largo de los 6 aos de estudio (0,2%) fue inferior a la encontrada en K. pnewnon!ae (1,6%) (TABLAS 23 y 26) y est en concordancia con la referida en otros trabajos (452,453,538). La caracterizacin y aspectos epidemiolgicos de las RIPEA implicadas se discutirn con posterioridad. Por otra parte, la codificacin de l-lactaxnasas plasmidicas en cepas de E. col! con hiperproduccin de 8-lactamasa cromosmica no es un hecho frecuente (493,537). Este perfil, caracterizado por un patrn similar al conferido por la hiperproduccin de la B-lactamasa cromosmica pero que adems aade un alto nivel de resistencia a la ticarcilina (349,493), quedara incluido dentro del fenotipo V. En ste tambin se albergaran, como se expres anteriormente, las cepas que aaden alteraciones en la membrana externa (232,254.476) y aquellas con un mecanismo de resistencia que involucrara la produccin de cefamicinasas o 5-lactamasas plasmidicas de clase 1 (u>). El prototipo de estas enzimas en E. col! es la B-lactamasa BIL-] (4.45,61 ) de pI 8,8 que confiere resistencia a metoxi-J3-lactmicos, asociaciones entre penicilinas e inhibidores de 13lactamasas, oxiiminocefalosporinas y aztreonam (us). Otras cefaniicinasas, con p que oscila entre 6,8 y 8,9 CMY-l (40), CMY-2 (45), MIR-] (435), MOX-l (236), LAT-l (577) y FOX-l (192) encontradas en K. pneumoniae presentan, al transferirse a E. col!, un fenotipo similar superponible
~-,

al que se produce en mutantes establemente desreprimidos de E. cloacoe y C. freundil. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores referentes a los fenotipos de resistencia y su explicacin en trminos bioqumicos, podra afirmarse, al analizar los datos de la evolucin de la sensibilidad que existe una tendencia hacia una mayor incidencia de la resistencia. En nuestro hospital y con respecto a perodos anteriores, 1977-1986 (340), se elevara el ndmero de cepas con una mayor nivel de produccin de 8-lactamasa plasmdica (fenotipo III) y aparecera un fenotipo nuevo, BIPEA (fenotipo IV) que amplia el espectro hidrolitico afectando a las cefalosporinas de 32 generacin. Sin embargo, es importante destacar, que la resistencia media a la ampicilina se situ en E. col! durante el sexenio 1987-1992 en un 56,2%, inferior a la detectada durante el periodo 1977-1986, 59,7% (340), habiendo disminuido de forma significativa (p<O,00l) desde el alIo 1987 (60,2%) hasta 1992 (54,3%). Esta cifra final es, sin embargo, superior a la encontrada en otras series que oscilan entre el 29% y el 44% (474,524,538.ss,587,606). La reduccin de la resistencia a la ampicilina en E. col! podra sugerir una menor presencia de 8-lactamasas plasmidicas en esta especie. Martnez-Beltrn estirn en un trabajo previo realizado entre 1977 y 1986
(340)

que la incidencia de B-lactamasas plasmidicas clsicas de tipo TEM en E. 168

Discusin

cot en nuestro medio se situaba en torno al 57%. El mismo planteamiento, surgido del anlisis fenotipico indicara que estas no sobrepasan el 50% en el presente trabajo. Paralelamente a esta apreciacin, se ha observado un aumento del nmero de cepas inhibidas por concentraciones criticas bajas (2 gg/mi de ampicilina, cefuroxima y cefoxitina y 1 2 gg/m] de cefazolina) lo que podra indicar un cambio en el perfil de sensibilidad de E. col! con respecto a los antibiticos 8-lactmicos: disminucin del nmero de cepas con B-lactamasas plasmidicas (resistencia de alto nivel) y aumento de la resistencia de bajo nivel. La disminucin del 5,6% de las cepas resistentes a la ampicilina (TABLA 10) solo compensara en parte, al desplazarse supuestamente hacia concentraciones de sensibilidad, el aumento del 9,6% de las cepas con una CMI de 2 gg/ml, quedando un 4% de cepas que responderan con mayor probabilidad a mecanismos de resistencia de bajo nivel. A este respecto, se ha demostrado que la perdida de las porinas OmpP y/o OmpC en E. col! determina un ligero aumento de los valores de CMI para la ampicilina y cefazolina que es ms acusado para la cefoxitina y cefuroxima (99,28,232.254,256,56). En estos dos ltimos antibiticos, la elevacin del nmero de cepas inhibidas por 2 gg/mi supone el 14,8% y el 19,6%, respectivamente. No es fcil encontrar una explicacin clara para estos cambios de comportamiento, ya que siempre la introduccin y utilizacin de nuevos antibiticos 8-lactmicos conleva la aparicin de nuevos mecanismos de resistencia. Conviene recordar que en 1944, poco tiempo despus de introducirse la penicilina en clnica, Kirby (277) relacion la produccin de penicilinasa con la resistencia de A. aureus a la penicilina; en 1948 un 50% de las cepas eran resistentes por produccin de esta enzima (sE) y aos ms tarde esta cifra era cercana al 80% (46=).Una explicacin verosmil por demostrar para la prdida de la resistencia de alto nivel y aumento de la de bajo nivel, seria el efecto que podra haber ejercido la introduccin de las fluorquinolonas en la teraputica. Este grupo de antibiticos de amplia utilizacin en los ltimos aos, ejerce su accin sobre la ADN girasa (5=7,542,6w)y el sistema SOS de la clula (26,303,456,591). Bajo la accin de estos compuestos se ha demostrado un efecto curativo cuando se exponen clulas portadoras de plsmidos a concentraciones subinhibitorias de quinolonas (~ ,6oo,WQ, asi como, la disminucin de la frecuencia de conjugacin en su presencia (86,391) y un cieno cambio en la estructura del peptidoglicano de las bacterias gram.negativas (154,588). Por este motivo, la interaccin de estos compuestos con la flora habitual del hombre, y en concreto con E. col!, podra haber generado una disminucin del nmero de clulas portadoras de plsmidos de resistencia y un cambio sutil en la conformacin de las porinas de la membrana externa o en su entorno, que afectase a la permeacin de las quinolonas y de los antibiticos 8-lactmicos al interior de la clula (509.229,232,235), disminuyendo por una parte la incidencia de fl-lactamasas plasmidicas pero elevando la resistencia de bajo nivel. Con independencia de otras posible hiptesis, este hecho queda constatado debiendo observarse la evolucin del mismo en un periodo de tiempo ms amplio. 169

Discusin

Salmonella spp..

La primera referencia en la literatura de la sntesis de una 6-lactamasa codificada por elementos extracromosmicos en Enterobacter!aceae se realiz por Datta y Kontomchalou (39) en un trabajo publicado en 1965 en el que describen la codificacin de la enzima TEM-1 por una cepa de Sojmonella pararyph! (R7268). Este hecho podra ser considerado fortuito debido a la menor incidencia de resistencia a antimicrobianos en Salmonella con respecto a otras especies de Emerobacreriaceae (23), si bien en la actualidad se observa un claro incremento de esta (7,136,520). Los fenotipos de resistencia a antibiticos 8-lactmicos son similares a los encontrados en E. col!. No obstante, una menor incidencia de 8-lactamasas plasmidicas (78,356,362,363,366,s60), una mayor participacin de los mecanismos de resistencia debidos a problemas en el acceso de los 8-lactmicos al punto de actuacin (50,369,203) y finalmente que hasta el momento no haya sido posible esclarecer la presencia del gen ampC (57,514) en este gnero, establecen algunas diferencias que inciden en los porcentajes de los fenotipos encontrados (TABLA 24). La resistencia a la ampicilina, a diferencia de lo sucedido en E. col!, aument un 14,4% desde 1987 a 1992 (pC0,001) con una media del 19,6%. Esta cifra es elevada si se consideran los aislamientos de nuestro hospital obtenidos entre 1977 y 1986 (6,2%) (93.340), pero est en concordancia con la tasa de resistencia encontrada en paises del resto de Europa (36,594), Estados Unidos (36,327) y Asia (302), distancindose claramente del 1,5% encontrado en Nueva Zelanda (223) y el 85,4% comunicado en Irn (161). En nuestro pas esta cifra es variable, oscilando entre el 46% encontrado por Als y cois. (7) en un rea geogrfica cercana a nuestro hospital y el 5,5% por Rivera y coL. (487) en un hospital comarcal de la provincia de Zaragoza. Estas diferencias se producen en funcin de la epidemicidad de los diferentes serotipos que lleven asociados plsmidos de resistencia a la ampicilina (o3,64320,3s6,387,469,479,5o). La relativa baja incidencia de resistencia a la ampicilina determina que la mayor parte de los aislamientos pertenezcan al fenotipo 1(80,4%), sensible a todos los antibiticos Il-lactmicos. El mecanismo ms comn en las cepas con resistencia a la ampicilina obedecera a la produccin de TEM-1 (78) y se correspondera con los fenotipos II y III (15,4%). Asimismo, con este mismo
perfil se

han caracterizado otras enzimas plasmdicas, TEM-2, SHV-1, OXA-1 y OXA-2 y PSE-1 (3s6,362,363,366,so), por lo que no debe descartarse en nuestros aislamientos la presencia de otras fi-

lactamasas de amplio espectro distintas de TEM-1. Las tasas globales de sensibilidad y resistencia a la amoxicilina/clavulnico, cefazolina y cefuroxima indicaran que cerca del 5% de las cepas son hiperproductoras de TEM-l (fenotipo III). No obstante, es posible que este porcentaje indique tambin niveles normales de TEM-1 asociado a un mecanismo que implique la disminucin o 170

Discusin

prdida de las porinas, OmpF u OmpC (50,203,369). La mayor implicacin de factores de permeabilidad en Aalmonella determina una menor actividad intrnseca de la ceftazidima con respecto a E. col! (TABLA 22). Las variaciones que se observaron en E. col! a concentraciones bajas de antibiticos solo se manifiestan de forma estadisticamente significativa (p.cO,0Ol) en Aoimonella para 2 jzg/mI de cefoxitina, elevndose el mimero de cepas en ms del 30% desde 1987 a 1992. La resistencia a quinolonas en este gnero, expresada en trminos de resistencia al cido nalidixico (CMI = 16 pglrnl), surgi a partir de 1991 con una cifra del 0,6% en 1991 y 3,3% en 1992 (datos no mostrados en las tablas). Por otra parte, la codificacin de IIIPEA (oxiimino-13-lactaniasas) se corresponde con el fenotipo IV. Su descripcin en el gnero Salmonella es relativamente frecuente habindose caracterizado tanto B-lactamasas de tipo TEM (,98,322,451,490) como SHV (5,52,214,291,451). Su presencia es ms comn en A. yph!murium (39,sz,3n,sJ,589) pero tambin se han encontrado en Sainionella wten (24,2s,451), Aalmonella panama (98), Salmonella enrerica serotipo kedougou y Salinonella mbandaka (467). El porcentaje anormalmente elevado de IIIPEA (fenotipo IV) en nuestro hospital (2,6%) se debe, fundamentalmente, a una epidemia por A. arizonae con una
(6,3z2)

BIPEA de pI 5,9 y que afect en junio de 1989 a la Unidad de Cardiologa Peditrica (MS), determinando un aumento significativo de la resistencia a la ceftazidima y cefotaxima (TABLAS 11 y 24). La caracterizacin del enzima implicado se detallar posteriormente. Los dos ltimos fenotipos identificados en Aalmonella (fenotipos VI y VII), de muy baja incidencia (7 cepas), muestran resistencia a la anipicilina y sensibilidad a la ticarcilina. Estos fenotipos se corresponden, fundamentalmente, en E. col! con la sntesis elevada de la JI-lactamasa cromosmica de claseIb (58,254,351). La presencia de ampC en Salmonella es un hecho controvertido aunque Bergstrom y cols. (59) utilizando una sonda intragnica ampC de E. col! 1<12 detectaron una secuencia homloga en A. yphimurium, si bien con un menor grado de homologa que en cepas de E. col!. Estos mismos autores (57) empleando por separado una sonda para el opernfrd (fumarato reductasa) y otra para ampC, situados en la misma zona en E. cali 1<12 con secuencias comunes (99), demostraron que A. yphimurium LT2 tena determinantes con una gran homologa para el gen frd pero no para atnpC, por lo que la secuencia necesaria para producir el enzima podra no ser completa y por tanto inoperante. Por ello, los fenotipos VI y VII slo podran explicarse, en ausencia de ampC en Salmonella, por alteraciones en la membrana externa, ya que la produccin de niveles bajos de B-lactamasa plasmidica no afectara a las cefalosporinas.

171

Discusin

Proteus mirabiis.

En Enterobacter!aceae, P. m!rabilis ocupa un lugar preferente despus de E. col! en cuanto a nmero de aislamientos en el laboratorio clnico (276), siendo ms frecuente en muestras de origen urinario, aunque tambin se ha asociado a bacteriemia, infecciones postquirrgicas y de tejidos blandos (87). Los fenotipos de resistencia en P. m!rabil!s se ajustan, en general, a los descritos para E. col! y al igual que en Salmonella es til su diferenciacin en funcin de la actividad de la ampicilina y la ticarcilina (TABLA 25). Siguiendo este esquema destaca, en primer lugar, una poblacin mayoritaria, 63,1 %, sensible a todos los B-lactmicos (fenotipo 1), que carecera de mecanismos de resistencia a 8-lactmicos o bien presentara una 8-lactamasa cromosmica de baja expresin que no afecta la actividad de los antibiticos estudiados (491,360). Este porcentaje, prcticamente invariable a lo largo del sexenio, es sensiblemente inferior al encontrado por otros autores (258,328,474,537,538,606) y no difiere sustancialmente de los datos obtenidos en nuestro hospital entre 1977 y 1986 (187,340). Casi un 25% de las cepas de P. mirabilis se caracterizaron por poseer resistencia simultnea a la ampicilina y ticarcilina debida esencialmente a la sntesis de il-lactamasas plasmidicas (fenotipos II, III y IV). El fenotipo II (13,3%) respondera a la produccin de TEM-1, -2 y OXA-l (78,356,491,492,531), aunque tambin se han identificado en esta especie otras 13-lactamasas de amplio espectro, SHV-l, OXA-2, PSE-l (271,356,363,366) y otras menos frecuentes, PSE-4 (607), CEP-1 (69), N-3, N-29 (566) y HMS-1 (359). El fenotipo III (11,2%) se correspondera con el incremento de la sntesis de TEM-1, que condiciona, como en el caso de E. col!, la afectacin de la cefazolina y de la asociacin an,oxicilina/cido clavulnico (=54,339,387). La mayor actividad intrnseca de la cefuroxima en P. mirabilis, a diferencia de lo sucedido en Salmonella (606), determina un mayor nmero de cepas resistentes a la cefazolina y sensibles a la cefuroxima. Un pequeo porcentaje de los aislamientos con resistencia a la ampicilina y ticarcilina mostraron resistencia a la cefoxitina y cefalosporinas de 3a generacin (0,7%, fenotipo V),
constatndose en

>7,2

(5%)

ellas la ausencia de BIPEA. Estas enzimas de pI que oscilan entre 5,4 (157.158) y no han sido encontradas hasta fechas recientes en P. mirabifls (63,157,58,4s9,596). Su baja la baja frecuencia de conjugacin plasmfdica en esta

incidencia (57) podra estar en relacin con

especie (336). Por ello, el fenotipo y, con resistencia a la cefoxitina, debe responder con mayor probabilidad a una afectacin de la permeabilidad. A este respecto, se ha demostrado la obtencin de mutantes in vitro (l0~-10~) con estas caractersticas seleccionados con una concentracin de 172

Discusin

25 ~g/mide cefoxitina

(380).

Su estudio demostr la prdida de la nica porina fundamental (40

kfla) de esta especie (379,516). Un hecho constatado previamente en nuestro laboratorio (187,319) y comn, aunque en menor medida, en P. vulgaris (ss), es la existencia de un nmero relativamente importante de aistarnientos resistentes a la ampicilina y sensibles a la ticarcilina (11,4%, fenotipo VI) que no producen niveles apreciables de 8-lactamasa cromosmica y que, por el contrario, sintetizan JI-lactarnasas plasmidicas de tipo TEM-1 (is?). Los valores de CMI de la ticarcilina para estas cepas (moda 16 ggml) son superiores a los obtenidos en las cepas sensibles a la ampicilina e inferiores al PCR utilizado en la diferenciacin de los fenotipos (TABLA 7). Junto a este fenotipo, encontramos otro (fenotipo VII) con incidencia inferior al 1 % que aade resistencia a la cefazolina, cefuroxima, cefoxitina, ceftazidima y, en menor medida, a la cefotaxima. Este fenotipo es similar al condicionado por la hiperproduccin constitutiva de la B-lactamasa cromosmica en E. col! (58,254,351), y, verosmilmente, respondera a esta circustancia. En relacin a la evolucin de la sensibilidad, nicamente destaca el incremento de ms del 10% con respecto a la cefazolina (pC0,001). La obtencin en 1987 de las cifras mximas de resistencia para la cefazolina (19,1%), cefuroxima (4,3%), cefoxitina (1,8%) y ceftazidima (1,2%), sustentara la hiptesis de una mayor incidencia de cepas con mayor nivel de il-lactamasa cromosmica al inicio del periodo estudiado y, probablemente, de forma simultnea un nivel ms elevado de produccin deTEM-1.

1.2.- Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca.

El gnero Klebsiella, y en particular K. pneumon!ae, est relacionado tanto con infecciones nosocomiales como con aquellas adquiridas en la comunidad (382,s75,6o7,6o9). A pesar de presentar una resistencia natural a la ampicilina y la ticarcilina con valores de CMI generalmente desplazados por encima de las concentraciones farmacolgicamente alcanzables en el compartimento plasmtico, la diferenciacin de los fenotipos de resistencia en funcin de la actividad de estos dos antibiticos sigue siendo un planteamiento vlido (258,319,345,493,537). Una vez establecidos, asimilar estos fenotipos a un mecanismo bioqumico de resistencia es menos certero que en E. col!. Klebsiella es el gnero con mayor nmero de 3-lactamasas plasmidicas y cromosmicas identificadas (2s2,363,478,503,56o), que confieren fenotipos similares caracterizados por valores para la ampicilina y la ticarcilina superiores a sus PCR (342). En este gnero se ha identificado un grupo amplio de 3lactamasas cromosmicas (8-lactamasas de clase IV o constitutivas de Klebs!ella) con pI que oscilan entre 5,1 y 9,2 (M,22o.us,478,48s,so=,so); II 3-lactamasas plasmidicas de amplio espectro, 173

Discusin

TEM-1,2, SHV-l, HMS-l, OXA-l,3, PSE-2,3, 01-110-1, LXA-l y TLE-2 492,508,607,615); y ms de 40 BIPEA (8,236,341,40,438,47,5o4,63).

(78,252,356,363,477,478,

La ausencia de B-lactamasas plasmidicas y la sntesis de bajo nivel de 3-lactamasas cromosmicas determinan, tanto en 1<. pneumon!ae como en K. oxytoca, un bajo porcentaje de cepas sensibles (=2%)que conforman el fenotipo 1 (TABLA 26). En contraposicin, destaca una poblacin mayoritaria cercana al 98%, que se caracteriza por la resistencia simultnea a la ampicilina y ticarcilina (fenotipos II-y) en la que es posible identificar 8-lactamasas plasmidicas, 13lactamasas cromosmicas o ambas (3s6,42o,z,63). En este gnero, la utilizacin de los valores de sensibilidad a la asociacin amoxicilina/cido clavulnico como marcador de la codificacin de 13lactamasas plasmidicas no es posible, ya que las 3-lactamasas cromosmicas de K7ebsiella tambin son inhibidas eficazmente por los inhibidores de Il-lactamasas. Este hecho no es circunstancial ya
que la enzima LEN-I, prototipo de las 8-lactamasas cromosmicas de Klebsiella, muestra una alta

homologa con las plasmidicas de tipo TEM

(4)

y SHV (34,so,23s,372,406,420,529). Por ello, no es

de extraar que presenten un comportamiento similar y sean inhibidas por el cido clavulnico. Con un nivel normal de produccin enzimtica, los valores de CMI de la asociacin amoxicilina! clavulnico son inferiores al PCR (93,2s.4,342,363,so3), por lo que las cepas de Klebsiella con estas enzimas quedaran incluidas dentro del fenotipo II. Asimismo, se ha demostrado que el extremo Nterminal de la enzima MEN-], una nueva BIPAE descrita en E. col! (61,60), posee alta homologa con el de la 3-lactamasa cromosmica de K. oxytoca (5,32,480) y que la denominada B-lactamasa plasmidica KH descrita en A. oxytoca (=,63)est relacionada con la clsica B-lactamasa Kl de K. oxyroca (9o,93,ss,26s,337), siendo tambin inhibidas por el cido clavulnico. La diferenciacin fenotipica entrelas 3-lactamasas cromosmicas y plasmidicas de Klebsiella puede realizarse ampliando el rango de las concentraciones de aminopenicilinas y carboxipenicilinas (Mo): las cepas con 8-lactamasas cromosmicas, considerando un nivel de produccin normal, confieren un nivel de resistencia menor que el determinado por las 13-lactamasas plasmidicas. El fenotipo subyacente de un nivel elevado de 13-lactamasa cromosmica es indistinguible, con los antibiticos utilizados, del conferido por la sntesis de las il-lactamasas plasmidicas, y solo permitira, como referiremos posteriormente, la identificacin presuntiva de cepas con hiperproduccin de SHV-l. Referido exclusivamente a mecanismos enzimticos, la asociacin de amoxicilina/cido clavulnico slo se ve afectada en las cepas del gnero KlebsielIa por la hiperproduccin enzimtica con independencia de su codificacin plasmidica o cromosmica (448,478), y se correspondera con los fenotipos III y IV. La presencia de 3-lactamasas cromosmicas y su hiperproduccin es ms 174

Discusin

ftecuente en K. oxyroca que en 1<. pneumoniae, como recientemente ha demostrado Reig y cois.

La hiperproduccin cromosmica afecta a la asociacin amoxicilina/clavulnico, cefazolina, cefuroxima, oxiiminocefalosporinas (cefotaxima) pero no a las cefamicinas (cefoxitina), la ceftazidima y los carbapenems. Esta circunstancia quedara implcita dentro del fenotipo III y explicara la mayor incidencia de este fenotipo en K. oxyroca (35,6%) con respecto a K. pneumoniae (4,9%) (TABLA 26). En el caso particular de la hiperproduccin de la enzima Kl de K. oxytoca
(478).

se incrementan los valores de CMI para el aztreonam (8-128 gg/ml) (93,02,265,so3), antibitico no incluido en el anlisis fenotipico en nuestra serie. Por otra parte, las 8-lactamasas plasmidicas son ms frecuentes en K. pneumon!ae que en K. oxyroca, siendo SHV-l, TEM-l y TEM-2 las ms prevalentes (178,356,478,492,508,53,607). La hiperproduccin de TEM-l no afecta a las cefalosporinas de Y generacin y quedaran tambin incluidas dentro del fenotipo III. Por el contrario, es ms factible la individualizacin de las cepas con hiperproduccin de SHV-l (fenotipo VI) ya que afectan, aunque en menor medida que la hiperproduccin de 1<1, al aztreenam (2 gg/ml) y a diferencia de las anteriores, TEM-l y cromosmicas de Klebsiella, elevan los valores de CMI de la ceftazidima (8 pgml) sin modificar las de la cefotaxima (0,03 xgml) (447). En K. pneumon!ae, a diferencia de K. oxytoca, se constat la presencia de IIIPEA (oxiimino 8-lactamasas) (1,6%) todas ellas del tipo SHV, cuyo fenotipo (fenotipo V) se caracteriza por la sensibilidad a la amoxicilina/clavulnico y cefoxitina y resistencia a la cefazolina, cefuroxima. cefotaxima y ceftazidirna. Esta diferencia de una especie a otra est en concordancia con lo descrito por otros autores (27,28.167,538). El mayor porcentaje de cepas con 3IPEA en K. pneumoniae (1,6%), en comparacin con las encontradas en E. col! (0,2%), podra estar en relacin con el mayor nmero de enzimas descritas en Klebs!elIa y la posibilidad de una mayor frecuencia de conjugacin en este gnero ya que no existen diferencias a nivel de expresin entre ambos y tampoco mayor capacidad de estas enzimas para adquirir mutaciones en uno u otro huesped (270). Un fenotipo prximo al anterior (fenotipo VI), que aade resistencia a la cefoxitina, se correspondera con el que confieren las cefamicinasas (TABLA 4) o, ms probable en nuestro caso, con aislamientos con alteraciones en la membrana externa. La primera hiptesis, no encontrada en nuestro hospital, afectara a todos los Il-lactmicos con la excepcin de los carbapenems (342,445). Estas enzimas, por el momento infrecuentes, se han descrito en K. pneumon!ae: MIR-] (435), CMY-1,2 (40,45), MOX-l (236), LAT-1 (577) y FOX-1 (192). Las cefamicinasas MIR-1, CMY-2 y MOX-1 tienen una relacin demostrada con ampC de E. cloacae (79,435), C. fteund!! (43) y P. aerug!nosa
(236,315),

respectivamente. La segunda explicacin para el fenotipo VI, parcialmente 175

Discusin

extensible al fenotipo VII, estara en relacin con factores de permeabilidad. Esta participacin se ha puesto de manifiesto durante el tratamiento con cefamandol (579) o cefoxitina (433) de infecciones
por K. pneumoniae, demostrndose que la ausencia o disminucin de una de las dos porinas

fundamentales de 39-40 o 41 kD

un aumento en los valores de CMI para la cefoxitina y ceftazidima y en menor medida para la cefotaxima (2os,433,45s,509.582). Este mismo hecho se ha podido constatar en cepas de K. pneunwniae con BIPEA (205,433,582).
Por ltimo, la existencia de cepas resistentes a la ampicilina y sensibles a la ticarcilina

(=08,458) determina

(fenotipos VII) es menos frecuente que en E. col! y P. mirabilis (TABLAS 23, 25 y 26). Este fenotipoestara relacionado con una produccin moderada de 3-lactamasa cromosmica que afectara a la anipicilina pero no seria suficiente para sobrepasar el PCR de la ticarcilina. Alteraciones en la permeabilidad de la membrana externa determinaran, en este fenotipo, el incremento de CMI para la cefoxitina, cefotaxima y ceftazidima.
Con respecto a la evolucin de la sensibilidad a lo largo del sexenio 1987-1992, la

estabilidad de la resistencia a la ampicilina y ticarcilina tanto en K. pneumoniae como en K. oxytoca es coincidente con lo referido por otros autores (&4,17,42,474,538,587,6o6). Por el contrario, la
disminucin de la resistencia a cefazolina en K. oxyboca (19,1%), y de forma menos acusada en K.

pneumon!ae (4,8%), indicara una menor presencia de cepas con hiperproduccin de 3-lactamasa cromosmica o plasmidica a] final del periodo de estudio (FIGURA 2). En K. oxyroca, quedara refrendado por la disminucin paralela de la resistencia a la cefuroxima (3,3%) y la asociacin amoxicilina/cido clavulnico (8,9%), mientras que en K. pneumon!ae la menor presencia de cepas con estas caractersticas (478) redundara en una mayor estabilidad de estos dos antibiticos. Por otra parte, la disminucin de la resistencia de alto nivel de la cefazolina y la cefuroxima justificara el aumento de aislamientos en las concentraciones criticas intermedias (1-2 gg/ml). 1.3.- Proteus vulgaris. El anlisis de los patrones de resistencia a antibiticos 13-lactmicos en los 240 aislamientos de P. vulgaris confirma la diversidad fenotipica inferida por la 8-lactamasa cromosmica inducible de clase Ic (oxiiminocefalosporinasa o cefuroximasa) (9,23,378,485,503). Descrita inicialmente por Sawai y cok. (ss), es especfica de esta especie, si bien otras 8-lactamasas encontradas en P. penner! (98), P. cepacia (230,230), P. pseudomalle! (312) y X. maltophU!a (497,498) comparten similares caractersticas. Estas enzimas dep1 que oscila entre 6,9 y 9,5 (21,423) presentan, con independencia
de ste amplio rango, unas caractersticas cinticas similares: elevada tasa de hidrlisis (V~~) para

aminopenicilinas, cefalosporinas de 1~ generacin, cefuroxima y oxiiminocefalosporinas 176

Discusin

(z1,l20,423,7). A diferencia del resto de las B-tactamasas de la clase 1, son inhibidas por el cido clavulnico y otros inhibidores de 3-lactamasas (2,=o). El fenotipo de resistencia que confieren en su estado basal, incluye la ampicilina, cefazolina y cefuroxima pero no la cefoxitina, ceftazidima y cefotaxima (342,7). Esta ltima, a pesar de tener una elevada tasa de hidrlisis, posee una baja afinidad (1<) por lo que slo se ve afectada por el incremento de la cantidad del enzima, bien por induccin (=,12o,354,423,s63)o por desrepresin (617,307). A diferencia de otras series, en las que P. vulgaris se presenta siempre como resistente a las aminopenicilinas (537), detectamos en nuestro trabajo un bajo porcentajede aislamientos sensibles a la ampicilina y resto de los 8-lactmnicos estudiados (fenotipo 1, 2,8%) (TABLA 27). Este fenotipo se corresponderla con un nivel basal o nulo de produccin de 3-lactamasa similar al que se consigue cuando cepas inducibles son tratadas con agentes mutagnicos del tipo de la nitrosoguanidina (121,307). Un aumento en la cantidad del enzima dara lugar a una elevacin de los valores de CMI para la anipicilina, cefazolina y cefuroxima, sin afectar a la asociacin amoxicilina/clavulnico, ticarcilina, cefoxitina y cefalosporinas de Y generacin (fenotipo VI, 49,7%) que seria caracterstico de la 5-lactamasa cromosmica inducible de 1. vulgar!s (342,378,503,617). El fenotipo VI es el ms numeroso y posee resistencia disociada a la anipicilina y la ticarcilina. Mientras que en E. col! se relacionara con la sntesis de una 8-lactamasa cromosmica de clase Ib (351,503), en?. vulgaris pone de manifiesto la ausencia del opern equivalente a ampC de E. col! que es ocupado por al menos 4 genes no relacionados que participan junto con el opernfrd en el metabolismo energtico (oo). La desrepresin de la 3-lactamasa de clase Ic produce un fenotipo similar al que se genera cuando cepas de P. vulgaris en su estado inducible son tratadas con agentes inductores, alcanzndose valores de CMI para ticarcilina, amoxicilina/clavulnico y cefotaxima superiores a sus PCR (fenotipo IV). Su incidencia, 10,7%, es superior a la encontrada en estudios previos en nuestro laboratorio (87j88,34o), y ha variado a lo largo del sexenio, alcanzando mximos durante los aos 1988 y 1990. El estado inducido est limitado por la propia presencia del agente inductor y, particularmente en P. vulgaris, por el efecto antibacteriano paradjico que presenta esta especie en relacin con algunas cefalosporinas, entre ellas cefotaxima, por el cual slo a bajas concentraciones del antibitico inductor se inhibira el crecimiento bacteriano. Por el contrario, a altas concentraciones se inducira la produccin de grandes cantidades de 3-lactamasa que inactivaran el antibitico inductor (245, 246, 503). Con independencia de esta apreciacin, el fenotipo IV representarla mayoritariamente las cepas resistentes a la cefotaxima, ya que el fenotipo V (2,9%), que aade resistencia a la cefoxitina y ceftazidima, se correspondera, con toda probabilidad con la superposicin de diversos mecanismos: alteraciones en la nica porina de esta especie (379), 3-lactamasas plasmidicas (20,356,607), hiperproduccin de estas (617) o sntesis desreprimida de la 3-lactamasa de clase Ic (617,307). 177

Discusin

Considerando el PCR elegido para la cefotaxima (CMI =1ng/ml), el porcentaje de resistencia, 14,1% (TABLA 9), reflejara el nmero de cepas deP. vulgarLv con la B-lactamasa en estado desreprimido (67,3o7) junto a aquellas que elevan sus valores de CMI por alteraciones en la membrana externa (379). Si tomamos como referencia los puntos crticos establecidos por el NCCLS (399) (CMI >8 gg/ml) la resistencia a la cefotaxima seria del 6,1% (TABLA 15), inferior a la encontrada en aislamientos de UCI en Alemania (16%) (sn), Blgica (42%) (587), y ms cercano a los valores hallados en Francia (4,04,4%) (538). En un estudio multicntrico realizado en Espaa en 31 hospitales durante 1992 con muestras de UCI, la resistencia a la cefotaxima (>8 gg/ml) en P. vulgaris alcanz un 45% (373). La produccin de 3-lactamasas plasmidicas en P. vulgarLv es menos habitual que en P. mirabilis (120,356.607), con porcentajes que oscilan en distintos trabajos entre el 0% (78,304) y un 8,1% (eo~), siendo TEM-l, -2 (I=o,3s6,363,492,6o7),SHV-1 (363,492) yPSE-2 (492) las nicas enzimas caracterizadas en esta especie. Su codificacin, al igual que en el resto de las enterobacterias, confiere resistencia a la ampicilina y ticarcilina dando lugar a los fenotipos II y III. El primero de ellos, de muy baja incidencia (0,6%) compartira la sntesis plasmidica con un nivel muy bajo de la 3-lactamasa cromosmica que no afectara a la cefazolina y la cefuroxima. El fenotipo III (31,2%), el ms numeroso despus del VI, albergara la mayor parte de las cepas con 3-lactamasas plasmidicas y otras con una produccin elevada de la cefuroximasa inducible cuya sntesis afectara parcialmente a la ticarcilina superndose su PCR (88,307). Por el momento no se han descrito BIPEA P. vulgar-ls. Debemos resaltar que su presencia terica podra confundirse, sin la realizacin de oportunos estudios de transferencia y caracterizacin bioqumica o gentica, con la sntesis de las oxiiminocefaloporinasas en estado desreprimido. Estas ltimas, no slo elevan los valores de CMI para la cefotaxima y el aztreonam, y en menor medida la ceftazidima, sino que tambin, al ser inhibidas por el cido clavulnico, producen una sinergia
llamativa en la prueba de doble difusin con disco (observaciones personales no mostradas). Por otra

parte, el fenotipo V, en estrecha relacin con el VII (TABLA 27), eleva los valores de CMI para la cefoxitina y cefalosporinas de 32 generacin, pudiendo asociarse con alteraciones complementarias de la membrana externa. En coincidencia con otros estudios (474), el bajo nmero de cepas aisladas anualmente con respecto a otras especies impide apreciaciones adecuadas en la evolucin de la sensibilidad durante el perodo de estudio.

178

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1.4.- Enterobacter doacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacterfreundii, Morganella morganhl

y Serratia
El mecanismo de resistencia a antibiticos 8-lactmicos ms importante en este grupo de microorganismos es, por el momento, la produccin de 13-lactamasas cromosmicas de clase la
(83,122, 44,250,294.296,306,307,308,360,362,378,502.503,507). Bajo este epgrafe se alberga una gran

variedad de enzimas en cuanto a sus pl que, generalmente, se encuentran en la zona alcalina aunque algunas puedan enfocar en la zona cida (90,366,425,5o=,s03). Poseen un perfil de susbtrato tpico de
cefalosporinasa con una tasa de hidrlisis (V~) mayor para las cefalosporinas que para las penicilinas (95.213,502). El incremento dela sntesis enzimtica puede desarrollarse porun mecanismo

de induccin, por lo que se las adjetiva de inducibles, o por fenmenos de desrepresin resultantes de mutacin gentica (s9,95, 0j2=,195,294,296,306,307,383,48,488,502,506,507,618). Estos dos hechos, en cuyo proceso participan al menos 5 genes, ampC, ampR, ampG, oinpD y wnpE y varios mediadores (54,123,233,282,283,295,297,298,299,3 6,405,416), confieren unos fenotipos de resistencia a 3-lactmicos que se ajustan a patrones generalmente uniformes. No obstante, particularidades de expresin especificas de especie (63,177, 194,200,224,266,337,377,425,507,517,52 ,56 ,SM), la mayor o menor incidencia de 3-lactamasas plasmidicas (3,78,3o4.356,362,366,49,492,6o3,607) y la participacin de
alteraciones de la membrana externa (83,97.125, 144,207,208,252,379,408,410,5 16,576,602), permiten que

existan diferencias fenotipicas de un grupo a otro (TABLAS 28-31). En trminos generales, y al igual que en el resto de las enterobacterias, es posible, en funcin de la actividad de la ampicilina y la ticarcilina, separar 3 grandes grupos. El primero sensible a la ampicilina y ticarcilina, representado por un nico fenotipo (1) con un bajo nivel de produccin enzimtica, un segundo grupo con resistencia disociada que responde con mayor claridad a la produccin de 3-lactamasas cromosmicas (fenotipos VI y VII) y un tercero con resistencia a ambos antibiticos (fenotipo II-V), donde es ms difcil separar los fenotipos debidos a la produccin de 8-lactamasas plasmidicas de aquellos que confieren las 8-lactamasas cromosmicas. El primer fenotipo 0) representa una poblacin con un nivel enzimtico inapreciable (307) y es similar, fenotipicamente, al que se produce cuando una cepa con una 3-lactamasa cromosmica inducible de clase la se trata con agentes mutagnicos (nitrosoguanidina) que abolen la produccin
enzimtica (12,307,3,66). Este fenotipo, tambin denominado basal es ms frecuente en C.

freundil (18,2%), menos en E. cloacae y E. aerogenes (10,8% y 7,2%, respectivamente) y de muy baja incidencia en M. morgan! y A. marcescens (1,7% y 1,4%, respectivamente). La presencia de fenmenos inductivos, caractersticos de estas 3-lactamasas (59,122,195,294,296,4s,48s,so3,5o7), es til incluso para identificar niveles bajos de expresn enzimtica. El mejor ejemplo lo constituye el cido 179

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clavulnico que, siendo un excelente inhibidor de 3-lactamasas plasmidicas, ejerce un demostrado efecto inductor de 6-lactamasas cromosmicas de clase la (6=,sl,343,556,59s),de tal manera que el 4,2% de las cepas deE. cloacae sensibles ala ampicilina (CMI <l6gg/mI) tienen una CMI para la amoxicilina/clavulnico superior o igual a 16 gg/ml. La 8-lactamasa cromosmica de clase la caracteriza, al menos en su estado inducible o con bajaproduccin enzimtica, un segundo grupo de aislamientos que poseen resistencia a la ampicilina,
amoxicilina/clavulnico y cefazolina y son sensibles a la ticarcilina y cefalosporinas de 33 generacin
-

fenotipo VI

(122,307,342) (TABLAS 28-31). En nuestra experiencia, y con la excepcin de E.

aerogenes, el mayor porcentaje de los aislamientos pertenece a este fenotipo cuya incidencia vara desde un 72,0% para M. mor-gori!! hasta el 31,4% para E. aerogenes. La accin de agentes inductores, cefoxitina o cido clavulnico, sobre cepas pertenecientes a este fenotipo eleva la cantidad del enzima (3,384,5o7) y da lugar, en niveles altos, a un fenotipo similar al que se produce
cuando el gen ampR (gen regulador de la expresin del gen ampC) est permanentemente activado

(54,234,300,30,316,46). La produccin del enzima es muy elevada, hidrolizndose la cefotaxima, ceftazidima y ticarcilina (fenotipos IV, V). Con respecto a este ltimo antibitico es necesario sealar que si bien la afinidad de la ticarcilina por la 3-lactamasa cromosmica de clase la es alta (K,~ <1 gM), su tasa de hidrlisis es muy baja (V,~ <1 nniol, min~.mg-1) por lo que su inactivacin slo se favorece con la desrepresin, donde las concentraciones enzimticas son muy elevadas (286,502), En ausencia de niveles enzimticos muy altos, los valores de CMI pueden no incrementarse por encima del PCR (32 gg/ml) dando lugar a un fenotipo sensible para la ticarcilina y resistente a las cefalosporinas de 32 generacin (fenotipo VII).
Por otra parte, diferencias de afinidad de los metoxi-lV4actmicos por las distintas IIlactamasas en las diferentes especies justifican los distintos valores de

CMI para la cefoxitina que

se obtienen en los fenotipos que responden fundamentalmente a la presencia de 3-lactamasas

cromosmicas (fenotipos III a] VII). La Il-lactamasa cromosmica de clase la de M. mor-gori!!, a diferencia de lo que sucede en Enterobacrer, Cftrobacter y A. marcesceris, hidroliza dbilmente la cefoxitina. La hidrlisis es mayor en Enterobacrer y Citrobacter que en A. marcesceris, alcanzndose

unos valores de CMI superiores. En contraposicin a estas diferencias, en todos los casos, la cefoxitina es poco sensible al incremento del enzima (z2,307,502,67), no elevndose sustancialmente los valores de CMI con la desrepresin enzimtica. M. morganfl la CMI para la cefoxitina posee un valor modal de 8 gg/m] (64%) y slo un 5,9% de las cepas tienen una CMI superior a 16 gg/mi, por lo que la mayora de los aislamientos estan incluidos en los fenotipos IV y VI estn dentro de la categora sensible (CMI <16 gg/ml). Los
En

180

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aislamientos con CMI superiores a] PCR elegido (16 gg/m]) aadiran posibles modificaciones en la membrana externa (379,412). En A. mercescens, existe tambin cierta estabilidad de la cefoxitina frente a la 8-lactamasa cromosmica de clase la. La tasa de hidrlisis es baja por lo que posee una discreta actividad intrnseca (307,502). El PCR elegido (16 ~g/m1) divide la distribucin de aislamientos por lo que una parte importante de la poblacin incluida en el fenotipo VI seria sensible a la cefoxitina (CMI <16 ~g/ml) (TABLA 31). Aumentos en la cantidad del enzima, junto con modificaciones en las porinas, elevaran los valores de la CMI por encima del PCR (92,185, 204,208,511,576). La situacin que se dibuja en Enterobecrer y C!rr-obecrer- con respecto a la cefoxitina es bien diferente; en ambos casos menos de un 10% de los aislamientos son sensibles a este antibitico, demostrando su mayor labilidad a la accin de las 3-lactamasas cromosmicas sintetizadas en estos dos gneros (9o,3o7,5o=,s). Los resultados obtenidos para la cefuroxima confirman su labilidad a la accin de las 3lactamasas cromosmicas de clase la (3o7,5o2,617,s). En todas las especies, con la excepcin de A.

mer-cesceris donde casi el 100% de los aislamientos tienen unos valores de CMI superiores a 16 pg/ml, los aislamientos pertenecientes al fenotipo VI son sensibles a este antibitico. La elevacin
de la cantidad del enzima, por accin de agentes inductores o por desrepresin de la sntesis de 13-

lactamasa cromosmica, determina un incremento de la CMI para cefuroxima de 4 a 32 veces

(22,342,502). Este mecanismo no es nico ya que la sntesis de cantidades elevadas de 3-lactamasas plasmidicas (254) puede tambin comprometer la estabilidad de este antibitico. Los fenotipos IV, V y VII, con resistencia a la cefotaxima y ceftazidima mostraran en conjunto la incidencia de aislamientos con 13-lactamasas cromosmicas estblemente desreprimidas. Sin embargo, dentro de los fenotipos V y VII se podran tambin encontrar cepas que aaden alteraciones en la membrana externa, elevando los valores de CMI para la mayora de los filactmicos (83,97,379,408,410,516). La cifra de mutantes con 3-lactamasa estblemente desreprimida es mxima para E. eerogenes, cercana al 40%, mientras que en el resto se sita entorno al 20%. Refiriendo los datos a los puntos crticos de resistencia establecidos por el NCCLS (>8 gg/ml) (399), el porcentaje de resistencia seria del 5,7% para la cefotaxima y 10,7% para la ceftazidima en

M. mor-gen!!, 17,6% y 16,6%, respectivamente, en E. cloacee, 22,3% y 37,1% en E. oerogenes, 17,8% y 17,8% en C. freund!! y 8,6% y 1,4% en A. mer-cescens. En comparacin con otros estudios
realizados en Estados Unidos (543,606), Inglaterra (304), Francia (538), Blgica (587), Holanda (u) y Alemania (522) que utilizan los criterios del NCCLS, nuestra tasa de resistencia a cefotaxima es sensiblemente inferior para M. mor-genil, C. freundil y A. mercesceris, y similar para E. cloecee y

E. aer-ogenes. Los datos obtenidos en otros hospitales espaoles (373) estn en concordancia con los
observados en nuestro hospital para E. eerogenes y A. mercescens e inferiores a los encontrados en

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Al. mor-ganhl, C. freunil y E. cloacae. Estas diferencias, podran justificarse por el origen de los aislamientos, en nuestro caso de diferentes reas de hospitalizacin y en los estudios referidos de unidades de cuidados intensivos, donde el uso masivo de antibiticos 8-lactmicos ejercera una

presin selectiva y facilitara la seleccin de mutantes establemente desreprimidos

(381,455,52,513).

De los datos reflejados en la distribucin de aislamientos para cefotaxima y ceftazidima (TABLAS 21 y 22), tanto en M. morgan!! como en E. cloacae, C. freurid!! y A. marcesceris se observa una mayor afectacin de la cefotaxima que de la ceftazidima (fenotipo IV). En sentido
opuesto, en E. aer-ogenes la afectacin es mayor para la ceftazidima. La explicacin de este ltimo hecho no es sencilla ya que a bajas concentraciones tanto la cefotaxima como la ceftazidima poseen

una mayor actividad intrnseca en E. aer-ogenes que en E. cloacae. Con la desrepresin, y por tanto con mayor cantidad de enzima, los valores de cefotaxima son ms elevados en E. cloacae, mientras que la ceftazidima se ve ms afectada en E. Qerogenes. Podramos por tanto catalogar de ms sensible a E. aer-ogenes que a E. cloacae en su estado inducible, si bien la incidencia de mutantes con 3-lactamasa establemente desreprimida en el primero es mayor que en el segundo. Adems, una menor actividad enzimtica especfica de la 3-lactamasa cromosmica establemente desreprimida de E. aerogenes con respecto a E. cloacae (22) determinara que an cuando la proporcin de mutantes
es mayor en E. aerogenes estos serian ms sensibles o, expresado en otros trminos, que los

valores de las CMI dentro del rango de resistencia fuesen ms bajos.

La incidencia de resistencia a la cefotaxima (>2 gg/ml) en 1992 en M. morganhl (12,4%),

E. aer-ogenes (49,1%) y C. freund!! (20,8%) fue significativamente menor a la observada en 1987.

En E. cloacae y Y. mar-cescens, las cifras mximas de resistencia a este antibitico se obtuvieron en 1991, 30,5% y 33,9% respectivamente, disminuyendo ambas durante 1992. Es de resaltar, que el consumo de cefalosporinas de 32 generacin en nuestro hospital aument progresivamente desde

1987 hasta 1991 y disminuy durante el ltimo ao. Tomando como referencia el valor DDD/100
camas-da (dosis diaria definida referida para 100 camas-da) (413), el consumo de la cefotaxima

aument desde 0,8 en 1987 a 4,1 en 1991 y disminuy a 3,0, cerca del 25%, en 1992. Los valores correspondientes para la ceftazidima fueron de 0,9 en 1987, 1,4 en 1991 y 1,0 en 1992 (datos del Grupo de Trabajo en Poltica de Antimicrobianos del Hospital Ramn y Cajal), por lo que la presin
selectiva ejercida por el consumo de antimicrobianos podra haber disminuido determinando un

menor nmero de cepas con 8-lactamasas cromosmicas estblemente desreprimidas. La codificacin de B-lactamasas plasmidicas en estos gneros no es tan frecuente como en el grupo formado por E. coil, Salmonella spp. y P. mirabilis (3,78,242,3o4,3s6,366,492,oj. La

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diferenciacin fenotipica de los aislamientos con estas enzimas no es sencilla y slo el alto nivel de resistencia a carboxi- y acilureido-penicilinas facilitara su identificacin presutiva (254,342,363).
La baja frecuencia de 3-lactamasas plasmidicas de amplio espectro en M. mor-gan!! (531,607)

y la escasa referencia en otros estudios a la codificacin de 3IPEA en esta especie (252,322) explicara que entre los 595 aislamientos estudiados no hallamos encontrado cepas con produccin de estas enzimas. Estos datos estaran en concordancia con lo publicado recientemente por Sirot y cois. (538) en un amplio estudio multicntrico en el que no identificaron cepas de M. mor-ganul productoras de
BIPEA. Por el contrario, la incidencia de ~3-lactamasas plasmidicas en Enterobacter, Cfrrobacter y

A. marcesceris es algo mayor, siendo TEM-1 la ms frecuente (7s,ss,362,49,492,607). Estos dos

hechos incidiran en una mayor presencia de las 3IPEA en estas especies y que sean precisamente aquellas derivadas de TEM las que han sido caracterizadas con mayor asiduidad (28425,206, 252,453,539), aunque tambin las de tipo SHV pueden estar presentes (280,167,452,45).

En nuestra experiencia, entre los 520 aislamientos clnicos de C. fteund!! estudiados durante el periodo comprendido entre 1987 y 1992 no identificamos cepas con IIPEA. Por el contrario, se aisl una cepa de C. freunl! con resistencia transferible a la cefotaxima y la ceftazidima en las muestras de portadores fecales cuyo enzima responsable SHV-2 se caracteriz en el transconjugante. En Enrerobacter-, slo se pudo constatar la presencia de BIPEA en 2 aislamientos de los 5.822
estudiados, el primero de ellos, una cepa de E. cloacae, aislado en el contexto de la nica epidemia por BIPEA descrita en nuestro hospital y el otro un aislamiento poco frecuente, E. ger-gov!ae, con una 3-lactaniasa de pI, perfil de susbtrato y sensibilidad caracterstico de SHV-2. Por ltimo, slo una cepa de A. mar-cescens de las 1.060 estudiadas codificaba una IIIPEA, presentando un perfil de susbtrato caracterstico de TEM-4. La codificacin de las 3IPEA, que confieren resistencia a la cefotaxima y ceftazidirna, podra fenotipicamente confundirse en este grupo de microorganismos con la produccin de 5-lactamasas cromosmicas inducibles. Su diferenciacin fenotipica ser factible, en primer lugar, con el anlisis de la sensibilidad a carboxi- y acil-ureido penicilinas que tendrn unos valores anormalmente altos

caractersticos de la produccin de una il-lactamasa plasmidica (254,363) y en segundo lugar, por la sinergia de los inhibidores de 3-lactamasas con las cefalosporinas de Y generacin y el aztreonam.
Este grupo de microorganismos supone un ejemplo de la adaptacin de las bacterias a la presin selectiva ejercida por el uso masivo de los antibiticos 8-lactmicos, siendo cada vez ms frecuente constatar la adquisicin de mecanismos de resistencia ms eficaces que pueden, incluso, solaparse entre si. En un trabajo, recientemente publicado, que analizaba distintos aislamientos de 183

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E. aer-ogenes procedentes de UCI (1=5)se demostr que eran resistentes a las cefalosporinas de Y generacin por desrepresin enzimtica, resistentes al imipenem por alteraciones en la membrana externa y que codificaban adems una 3-lactamasa plasmidicas de amplio espectro (TEM-1) y/o una BIPEA (CAZ-6 TEM-3). Estos hallazgos determinan perfiles con resistencias mltiples por lo que la individualizacin fenotipica de los distintos mecanismos implicados no es tan evidente como en las cepas que responden a un solo determinante gentico de resistencia.

2.- IDENTInCACION Y AGRUPAMIENTO FENOTIPICO DE LAS il-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO. El anlisis del fenotipo de sensibilidad-resistencia frente a un grupo de antibiticos de una misma familia facilita, al amparo de la lectura interpretativa propugnada por Caurvalin (16), una aproximacin a los mecanismos bioqumicos de resistencia que los generan y a los determinantes genticos que los codifican. El perfil fenotipico en Enterobacter-!aceae que incluye resistencia a aminopenicilinas, carboxipenicilinas, cefalosporinas de 1a, 2a y y generacin y monobactmicos y sensibilidad a la asociacin de penicilinas con inhibidores de B-lactamasas, cefamicinas y carbapenems constituye un indicio claro de la presencia de las 3IPEA (oxiimino-B-lactamasas) (252). Asimismo, la sinergia entre el cido clavulnico y las cefalosporinas de Y generacin o el aztreonam facilita la identificacin inicial de estas enzimas (=59). En la actualidad, existen ms de 40 BIPEA derivadas o relacionadas con TEM-l,2 y SHV-l que responden, en trminos generales, a este perfil de resistencia (252) (TABLA 4). Una vez diferenciado el fenotipo de resistencia que caracteriza globalmente las IIIPEA es necesario realizar un anlisis fenotipico ms preciso que contribuya, dentro de sus posibilidades, a la individualizacin de estas enzimas. La expresin fenotipica de una 3IPEA varia segn la especie de Enrer-obacter!aceae donde se presente (278). Adems el fenotipo que determina puede superponerse con aquel que genera otra 3-lactamasa. Por ello, la presencia de las BIPEA en cepas con 3-lactamasas cromosmicas de clase 1 en estado desreprimido condiciona su identificacin a la realizacin de ensayos de transferencia plasmidica y al anlisis de los transconjugantes obtenidos. El estudio fenotipico de 7 prototipos de 3IPEA de tipo TEM (TEM-3,4,5,6,7,8, y 12) y 5 de tipo SHV (SHV-2,3,4,5, y 6) (TABLA 32 y 33), utilizando la misma cepa de E. col! como hospedador de los plsmidos que las codifican, nos ha permitido agrupar las distintas enzimas que responden a fenotipos comunes, evitando la posible influencia de la cepa que las alberga.

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El primer grupo fenotipico, grupo 1, incluye las enzimas que confieren un nivel de resistencia muy similar para la ceftazidima, aztreonam y cefotaxima (4-32 pg/ml): TEM-3, TEM-4, SHV-2 y SHV-3. Estas cuatro enzimas estn incluidas dentro del grupo 3 de Payne y Muyes (438) que se caracteriza por hidrolizar con mayor eficiencia la cefotaxima que la ceftazidima, si bien, la peor entrada de esta ltima al espacio periplsmico (4o) determina que sus valores de CMI sean muy similares a los de la cefotaxima. Asimismo, el grupo 1 es coincidente con el denominado fenotipo CTX o cefotaximasa definido por Pbilippon (7,453). Este grupo de enzimas es homogneo cuando se aplica el ensayo de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin (434). El perfil competitivo de TEM-3 y TEM-4 de una parte, asi como el de SHV-2 y SHV-3 por otra, es indistinguible, siendo necesario recurrir a la determinacin del p para diferenciarlas o al anlisis fenotipico de otros antibiticos 8-lactmicos (TABLA 32 y 33). Las enzimas de los grupos II (TEM-6, SHV-4 y 5> y 111 (TEM-5,7,8,12 y SHV-6) son agrupadas por Philippon (7,453) como ceftazidirnasas, denominndose fenotipos CAZb y CAZa, respectivamente. El primero de ellos muestra valores de CMI muy similares para la ceftazidima y el aztreonam (32-64 pg/mi), distancindose de los de cefotaxima (0,5-16 pg/m]). En el segundo, los valores de la ceftazidima (16-64 gglml> son ms altos que los del aztreonam (0,5-8 gg/mI) y stos que los obtenidos para la cefotaxima (0,5-1 ng/mI). Ambos fenotipos no se ajustan a los grupos definidos por Payne y Amyes (438), ya que algunas de las BIPEA agrupadas fenotipicamente se separan al utilizar como criterio los valores de eficiencia hidrolitica de la ceftazidima y la cefotaxima. El agrupamiento fenotipico no puede justificarse, en trminos moleculares, por una sola substitucin en la secuencia de aminocidos de las enzimas de las que derivan. Las 3IPEA incluidas en el grupo 1, TEM-3,4, SHV-2 y 3 presentan un cambio en la posicin 236, serma por glicina, que eleva la CMI para la cefotaxima (547). Asimismo, SHV-4 y 5, del grupo II, y TEM-8, del grupo III, tambin muestran este cambio, si bien aaden otras modificaciones que les confieren aspectos particulares (TABLA 3). Es de resaltar que TEM-8, an teniendo la substitucin de la serma por la glicina-236, slo alcanza un valor de CMI de 0,5-1 gg/mJ para la cefotaxima. Esta enzima posee adems una mutacin en la posicin 102, lisina por glutmico, que eleva, al igual que en las enzimas TEM-3 y TEM-4, el valor de la CMI para la ceftazidima (547,551). No obstante, la confluencia en TEM-8 de las substituciones que afectan a los residuos 236 y 102 y la presencia de otra mutacin en la posicin 162, serma por arginina, influye en los valores ms bajos de la cefotaxima con respecto a los que confieren otras 3IPEA. Todas las enzimas del grupo III, incluida TEM-8. muestran el cambio serma por arginina en la posicin 102, no alcanzndose un valor de CMI para la cefotaxima superior a 1 gg/ml (TABLA 32 y 33). Asimismo, considerando los datos de 185

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sensibilidad de otras enzimas con esta mutacin (322,401), TEM-9, TEM-10 y TEM-26 (VOU-1) podran quedar incluidas por sus valores de CMI para la cefotaxima (1-2 gg/ml) dentro del grupo III (252,48 1) y sin embargo se agrupan en el II, ya que al igual que TEM-6 muestran unos valores de CMI muy similares para la ceftazidima (64-128 gg/m]) y el aztreonam (32-128 g/mi) (42,252,48!). Un fenotipo nuevo, fenotipo ATM, recientemente establecido por Arlet y cois. (s) se caracteriza por una CMI para el aztreonam superior a la de ceftazidima y ambas por encima de la obtenida para la cefotaxima. Por el momento, la nica representante con estas caractersticas es la enzima TEM-22, cuya secuencia nucleetidica se desconoce. Su estudio bioqumico revel una tasa de hidrlisis baja para la cefotaxima, la ceftazidima y el aztreenam comparada con las obtenidas con la BIPEA TEM-3. Sin embargo, la elevada afinidad de la enzima TEM-22 por el aztreonam justifica los valores de CMI alcanzados para este antibitico. Por otra parte, el agrupamiento fenotipico de las BIPEA slo puede establecerse cuando en el estudio de sensibilidad se utiliza un amplio rango de concentraciones. Generalmente, los sistemas automticos o semiautomticos de microdilucin, entre ellos el sistema PASCO, emplean un nmero reducido de concentraciones por lo que la observacin de grupos fenotipicos est ampliamente limitada (FIGURAS 4 y 5). Asimismo, el bajo nmero de concentraciones impide la individualizacin fenotipica, que se facilita con el empleo de un amplio rango de concentraciones con el sistema clsico de dilucin en agar o con el sistema comercial E-test. Ambas tcnicas nos han permitido definir grupos fenotipicos en funcin de los valores de CMI para la ceftazidima, el aztreonam y la cefotaxima y definir caractersticas individuales para cada enzima. Las dificultades en la deteccin de ciertos aislamientos de Enterobacter!aceae con BIPEA por los modernos sistemas automticos o semiautomticos de identificacin y determinacin de CMI, ha sido previamente descrita (68,72,428). Sin embargo, la lectura interuretativade los resultados de sensibilidad obtenidos con el sistema semiautomtico PASCO nos permiti, en combinacin con la prueba de doble difusin con disco descrita por Jarlier y cdx. (259), una adecuada identificacin presuntiva de las cepas clnicas de Enrer-obacrer!aceae con BIPEA. Por el contrario, la individualizacin fenotipica requiri la utilizacin de la dilucin en agar con un rango amplio de concentraciones. Al unsono con otros estudios (67,291,451), es de resaltar que la aplicacin de los criterios establecidos por el NCCLS (399,400) a los datos obtenidos por el sistema semiautomtico PASCO categoriz errneamente como sensibles un alto porcentaje de los aislamientos con BIPEA: 55% para la cefotaxima y 30% para la ceftazidima (FIGURA 8). La ampliacin del rango de 186

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concentraciones por dilucin en agar y la consideracin de unos criterios ms restrictivos (TABLA 7) redujo este porcentaje a un 5% para la cefotaxima y un 2,5% para la ceftazidima, siendo un 0% cuando se consideraron ambos antibiticos simultneamente. La aplicacin de los criterios del NCCLS para la difusin por disco (398,400) habra categorizado errneamente estas cepas como sensibles a la cefotaxima en un 48,7% y en un 40,0% para la ceftazidima, siendo clasificadas como moderadamente sensibles un 41,2% y un 8,7%, respectivamente. Por tanto, la baja expresin de las BIPEA dificultara la deteccin en el laboratorio de las cepas con estas enzimas, y en particular si se estudian frente a una nica cefalosporina de 32 generacin. Slo un amplio rango de concentraciones de antibitico y la demostracin de las pequeas elevaciones de CMI que con frecuencia determinan estas enzimas (zs,zsz) facilitara su identificacin presuntiva. En un trabajo reciente, Meyer y cois. (374) constataron que la demora de un alio entre el aislamiento de una cepa de 1<. pneumoniae productora de 3IPEA y la identificacin del brote epidmico que haba generado, se deba a una interpretacin estricta de los criterios NCCLS y al emplee de un solo antimicrobiano como marcador de la resistencia a las cefalosporinas de
32

generacin.

Es un hecho constatado que, en ocasiones, la deteccin de las RIPEA se ha favorecido por su presencia en cepas con alteraciones en la permeabilidad (89), elevndose las CMI para las cefalosporinas de 32 generacin y el aztreonam (205,582). En nuestra experiencia la expresin de las distintas BIPEA (TEM-3,4,5,6,7, 12 y SHV-2,3,4,5,6) en dos cepas isognicas de E. col!, una de ellas ompP, increment los valores de CMI para todos los 3-lactniicos, siendo la cefpiroma la cefalosporina menos afectada (FIGURA 7). Este dato puede explicarse por la mejor penetracin y ms rpido acceso de la cefpiroma al espacio periplsmico en comparacin con la cefotaxima o la ceftazidima (4! ), de tal forma que las alteraciones en la membrana externa afectaran en mayor medida a estas dos ltimas cefalosporinas. Por otra parte, la simultnea elevacin de los valores de CMI para las cefalosporinas de
32

generacin y las cefamicinas en las cepas ompP dificultara la diferenciacin fenotipica de las BIPEA de tipo TEM y SHV de las cefamicnasas. Estas ltimas confieren unos valores de CMI incrementados para la cefoxitina (64-> 128 gg/ml), el cefotetan (2-128 pg/ml) y el moxalactam (2> 128 hg/ml). En nuestra experiencia la ausencia de la porina OmpF (FIGURA 6) en E. col!, slo elev parcialmente estos valores (2-4 diluciones) por lo que seria necesaria la presencia de otras mutaciones para modificar las CMI de las cefamicinas a un nivel similar al que confieren las cefamicinasas. En las cepas de 1<. pneumoniae con BIPEA de tipo TEM o SHV y alteraciones en la membrana externa,el incremento descrito para la cefoxitina (32-128 gg/nil) (205,433,582) es similar al obtenido habitualmente con las cefamicinasas (TABLA 4) (40,435,445,577), valores alejados de los encontrados por nosotros en las cepas de E. col! ompF con 3IPEA (4-8 gg/m]). 187

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La asociacin del cido clavulnico con la amoxicilina fue menos efectiva en las cepas de E. col! ompP (8/4-16/8 ~g/m1)con I3IPEA que en las cepas ompF+ con estas mismas enzimas (16/8-32/16). No obstante, los niveles de CMI fueron inferiores a los que se obtendran con las cefamicinasas (128/64->256/128 gg/mi) (40,45,=36,435,445,577),siendo ms cercanos a los valores descritos para las enzimas de tipo TEM con resistencia a los inhibidores de 8-lactamasas (3lactarnasas IRT) (32/16-64/32 ng/ml) (4s,~,se). Asimismo, la elevacin de los valores de CMI de las cefalosporinas de 32 generacin en las cepas con problemas de permeabilidad facilitara la deteccin de las cepas con BIPEA. Por el contrario, la disminucin de la actividad del cido clavulnico la dificultara puesto que sera menor la sensibilidad de la clsica prueba de la doble difusin con disco (259) que manifiesta la ampliacin de los halos de inhibicin de las cefalosporinas de V generacin con la aproximacin de un disco estandar de amoxicilina/cido clavulnico (20/10 gg). Sin embargo, la reduccin de la distancia entre los discos favorece la demostracin de la sinergia (datos no mostrados).

3.- 8-LACTAMASAS PLASMIDICAS DE ESPECTRO AMPLIADO EN Enterobacteriocae EN EL HOSPITAL RAMON Y CAJAL (1987 1992).
-

La descripcin por Knothe y cols.

(280)

en 1983 de tres cepas de K. pneumoniae y una de A.

marcescens con resistencia transferible a las cefalosporinas de 32 generacin suscit un rpido inters por las RIPEA, unido a un cierto temor del peligro que podra derivarse de su diseminacin. La localizacin de estas enzimas en plsmidos fcilmente transferibles (=55), su aparicin en numerosas ocasiones en forma de epidemias (sos) y la constatacin de que su presencia est ligada al amplio uso de antibiticos 8-lactmicos como la cefotaxima, ceftazidima o ceftriaxona (80,539) hizo pensar en una rpida dispersin similar a la que haba acontecido con la enzima TEM-1. Sin embargo, slo una de estas B-lactamasas, SHV-2, ha logrado sobrepasar barreras geogrficas y distribuirse a nivel mundial (sos); un nmero reducido, SHV-5, TEM-6 y TEM-1O, se ha aislado en al menos 10 paises (3,252,508) y el resto quedan circunscritas a un solo Hospital, Servicio o Unidad e incluso a un nico paciente (252,438,508). El seguimiento prospectivo de todos los aislamientos clnicos de Enter-obacter-!aceae del Hospital Ramn y Caja] desde marzo de 1987 hasta diciembre de 1992 nos ha permitido identificar 80 cepas con BIPEA, indicando una incidencia cercana al 0,4% sobre el total de aislamientos de Enterobacter!aceae (80/24.058), inferior a la descrita por otros autores(sos). En un estudio multicntrico realizado en Francia desde 1988 a 1990, que recoga todas las cepas de Enerobacter!aceae aisladas en el segundo trimestre de cada ao en 12 hospitales, se demostr una 188

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incidencia media del 1,5% (538). Una experiencia ms limitada realizada en 14 hospitales espaoles durante los aos 1989, 1990 y 1991, en la que se analiz exclusivamente la resistencia a la cefotaxima de 4.029 aislamientos consecutivos de Enzerobacrer-lacece recogidos durante un periodo de 15 das, detect 39 cepas supuestamente productoras de BIPEA, indicando una incidencia del 0,9% (3,o,6s). En este estudio, y al igual que en el realizado en Francia (538), en algunos hospitales no se detectaron cepas con BIPEA. Por el contrario, el elevado nmero de aislamientos con 3IPEA en centros incluidos en el estudio francs denotaba la presencia de brotes epidmicos. La mayora de los estudios epidemiolgicos sobre cepas productoras de BIPEA reflejan su incidencia en un corto periodo de tiempo y, con frecuencia, en el contexto de una epidemia (sos), por lo que los valores medios comunicados son siempre superiores a los encontrados por nosotros. Asimismo, es relativamente habitual que estos trabajos se limiten exclusivamente a reas concretas de hospitalizacin, generalmente unidades de cuidados intensivos, y a la identificacin de estas enzimas en el gnero Klebs!eila o en cepas de E. cdi, que son los que poseen con mayor asiduidad este mecanismo de resistencia (252,259,374,4s,s68). Este planteamiento impide conocer la prevalencia real de Emer-obacrer!aceae con BIPEA que varia, por los datos recogidos de la literatura, desde menos del 1% hasta un 74% de la cepas estudiadas (252,508). En Francia se han realizado desde 1985 diferentes trabajos multicntricos tendentes a estudiar la evolucin del nmero de cepas con BIPEA, refirindose la mayora a K. pneumoniae. En 1985 la incidencia en esta especie era inferior al 1%, elevndose hasta el 11% en 1988 (568). Referencias ms recientes indican que en 1990 la incidencia de cepas de K. pneumon!ae con BIPEA fue superior al 14% (538). En nuestro hospital y de forma retrospectiva, se detect un nmero muy limitado de cepas de 1<. pneumoniae y E. col! entre 1980 y 1986 con un fenotipo de resistencia que hacia presuponer la presencia de BIPEA (319). De forma prospectiva, en el presente estudio, se detectaron las primeras cepas con BIPEA en 1988: 3 cepas de E. col! aisladas en 2 pacientes de la Unidad de Cardiologia Peditrica que represent una incidencia anual inferior al 0,1% y la primera constatacin de este mecanismo en Espaa
(28).

El mximo nmero de aislamientos correspondi

al ao 1989 con 35 cepas (24 5. ar-!zonae, 8 E. col!, 2 K. pneumon!ae y 1 E. cloacae), representando una incidencia del 0,8%. Durante los dos ltimos aos, 1991 y 1992, este porcentaje ha sido del 0,2%, sensiblemente inferior a la media, no habindose constatado modificaciones en la tendencia durante 1993 (datos de este ltimo ao no incluidos). Si exceptuamos el alto porcentaje de aislamientos de A. ar!zonae (31,2%), que estuvo asociado a la nica epidemia por cepas con 3IPEA surgida en nuestro hospital, la distribucin en cuanto a especies (TABLA 50, FIGURA 27) es similar a la encontrada por otros autores 189

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(25245,sos). K. pneumoniae fue la especie con mayor nmero de aislamientos (33,8%), seguida de E. col! (31,2%) y A. ar-!zonae (31,2%). Es de resaltar que, a diferencia de otros estudios epidemiolgicos (167,=5z,45,sos),no se aislaron cepas de K. pneumoniae con IIIPEA de tipo TEM y no encontramos cepas de K. oxy:oca con resistencia a cefalosporinas de 32 generacin mediada por IIIPEA. Por el contrario, la identificacin y caracterizacin de una BIPEA en una cepa de E. ger-goviae constituira el primer aislamiento de este tipo de enzimas en esta especie. Por otra parte, el nmero de pacientes implicados, 44, manifiesta una baja incidencia y, en general, una repercusin epidemiolgica de escasa relevancia. No obstante, es de destacar que el 75% de los pacientes estaba relacionado con servicios quirrgicos o unidades de cuidados intensivos (TABLA 50, FIGURA 28). Esta mayor proporcin justifica que un 31,6% de las cepas se obtuviesen de muestras respiratorias, aunque al igual que en otros trabajos (19,259,291,374) un alto porcentaje se aisl en orinas (22,4%). El mayor nmero de cepas procendentes de heces (14,5%) con respecto a otros estudios (451,538,568) se debi a su bsqueda en la flora intestinal en los controles epidemiolgicos efectuados durante la epidemia por A. ar-izonae. La constatacin de este hecho reafirmara el papel de reservorio ejercido por el tracto intestina] y la necesidad de realizar una decontaminacin selectiva como medida epidemiolgica encaminada a la erradicacin de este tipo de cepas (81,127), puesto que su permanencia en la flora intestinal puede prolongarse incluso despus del alta clnica del paciente. Al igual que en otros trabajos (167,473), un nmero reducido de cepas fue aislado en pacientes procedentes de la comunidad (4 enfermos), constatndose que al menos uno de ellos haba estado previamente ingresado en el hospital. Asimismo, en el estudio de portadores fecales se aislaron 7 cepas de Enterobacrer-!aceae con 3IPEA en 5 pacientes, uno de ellos ingresado y el resto pacientes ambulantes que previamente haban estado en el hospital durante un periodo prolongado de tiempo (218 das). La persistencia de este tipo de microorganismos en la flora normal de los pacientes podra justificar su frecuente aparicin en reas concretas de hospitalizacin durante todo el periodo de estudio: unidades de cuidados intensivos y servicios quirrgicos. A este respecto, un 68,2% de los pacientes perteneca a la misma unidad de Cardiologia Peditrica, aislndose en ellos un nmero elevado de cepas (25) con la misma 3IPEA (SHV-2) a lo largo del tiempo de estudio. La estancia media de los pacientes con aislamientos de Enierobacteriaceae con BIPEA (49 1+28 9 das) fue considerablemente superior a la media de nuestro hospital durante el mismo periodo de estudio (12,9 das) y similar a la encontrada por otros autores para este tipo de pacientes (29,167). Es de resaltar que el tiempo transcurrido desde el ingreso hasta la obtencin de un aislamiento con BIPEA en estos pacientes (24,6 das) duplic la estancia media de nuestro hospital. Este largo periodo de tiempo favorecera tanto la colonizacin del paciente con este tipo de 190

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microorganismos como la seleccin ejercida por el tratamiento antibitico (48!). En nuestra experiencia, el 10% de los pacientes no cumpla criterios de infeccin (74) y slo un paciente del total no haba recibido tratamiento antibitico previo al aislamiento de la cepa productora de BIPEA. La seleccin de cepas con BIPEA ha sido demostrada in vitro mediante el crecimiento de cepas con 13-lactamasas de tipo TEM-1, TEM-2 SHV-1 sobre medios selectivos con cefotaxima o ceftazidima (438), presentando las enzimas identificadas idnticas caractersticas que 3-lactamasas de igual pI obtenidas in vivo. La administracin prolongada de cefalosporinas de 32 generacin, generalmente en asociacin con aminoglicsidos, constituye una de las causas ms estrechamente relacionadas con la aparicin de estas enzimas (9,so,259,48). Chanal y cok. (=9)han demostrado la posibilidad de aparicin de una nueva J3IPEA, CAZ-6 (TEM-24), a partir de otra ya existente, TEM-3, en un paciente tratado con una cefalosporina de Y generacin, reafirmando el papel selector del tratamiento antibitico previo. En nuestra experiencia, cada paciente recibi una media de 3 2 + 1,5 antibiticos, evidencindose que el 82,5% de los pacientes recibi al menos una cefalosporina de 32 generacin, en asociacin con un aminoglicsido en el 42,4%. No se demostr relacin entre el tipo de antibitico 3-lactrnico administrado, cefotaxima o ceftazidima, y la enzima caracterizada, 3IPEA de tipo TEM o 514V. Asimismo, con una alta frecuencia los plsmidos que codifican las BIPEA presentan tambin genes de resistencia a aminoglicsidos (255.259,449,451,532,541), por lo que el tratamiento combinado de cefotaxima o ceftazidima con un aminoglicsido podra favorecer la seleccin de estas cepas. El 97,5% de las cepas con IIIPEA aisladas en nuestro hospital eran resistentes simultneamente a aminoglicsidos, encontrndose presente otros marcadores de resistencia como sulfamidas, tetraciclinas y trimetroprim (TABLA 46). Por otra parte, el aumento del consumo de antibiticos en un hospital
(374)

o en reas

concretas de hospitalizacin (40!) tambin ha sido relacionado con el aislamiento de estas enzimas. Meyer y cok. (374) demostraron que el consumo de ceftazidima se haba incrementado un 600% durante los dos aos previos a la aparicin de una epidemia por K. pneumon!ae productora de BIPEA en su hospital. En nuestro estudio, slamente tres de los nueve pacientes involucrados en la epidemia por A. ar-izonae con resistencia a la ceftazidima haban recibido previamente cefalosporinas de 32 generacin. Sin embargo, se pudo constatar que, durante los 6 meses anteriores al aislamiento de las cepas resistentes, el consumo de ceftazidima se haba incrementado en un 76,9% con respecto al mismo periodo del alio anterior. El tratamiento antibitico instaurado tras el informe microbiolgico que identificaba el agente causal de la infeccin fue adecuado a la sensibilidad que presentaban las cepas con las 3IPEA en el 87,8% de los pacientes e inclua imipeneni (solo o en asociacin con un aminoglicsido) (78,7%), 191

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fluorquinolonas o cefoxitina ms amicacina. Por el contrario, en 4 pacientes se paut, a pesar del mecanismo de resistencia inherente, un tratamiento con cefalosporinas de 33 generacin, objetivndose, con independencia del nivel de sensibilidad a estos antibiticos, una evolucin desfavorable de los pacientes. El cambio teraputico por imipenem determin la evolucin favorable en tres de ellos, falleciendo otro paciente aunque por causas ajenas a la infeccin. El emplee de carbapenems podra incidir en una disminucin del los aislamientos de Enter-obacieriaceae con BIPEA. Sin embargo, la restriccin del uso de cefalosporinas de 32 generacin e implantacin de pautas con imipenem ha sido relacionado con la aparicin de infecciones por Acinetobacter multirresistente (374). El largo periodo de seguimiento de casi 6 aos nos ha permitido, adems de conocer la incidencia real de las 3IPEA en nuestro hospital, la identificacin y caracterizacin de diversostipos de enzimas: un primer grupo de Enterobaceriaceae con BIPEA de pl de 7,6, SHV-2 y SHV-6; un segundo grupo con enzimas de pI 5,9, TEM-4 y TEM-6/8 y un tercero representado por una IIPEA de tipo TEM con un pI de 5,4. SHV-2 fue la BIPEA ms frecuentemente caracterizada tanto con respecto al nmero de cepas estudiadas, 35 (43,7%), como de los pacientes en que se aisl, 25 (56,8%). Esta enzima, de distribucin universal, ha sido identificada en al menos 14 paises (sos). En Espaa se ha asociado tanto a brotes aislados (3o,496) como a epidemias nosocomiales (167, Liares comunicacin personal), siendo la primera BIPEA detectada en nuestro pas (zs). En nuestra experiencia esta enzima siempre surgi en pequeos brotes muy limitados que no afectaron a ms de dos o tres enfermos simultneamente aunque, epidemiolgicamente, es de resaltar que el 72% de los pacientes en los que se aislaron Enter-obacteriaceae productoras de SHV-2 pertenecan a la misma Unidad de Cardiologia Peditrica. La diseminacin de las cepas con BIPEA se ha relacionado con su presencia en plsmidos de carcter transferible, responsabilizndose a un mismo plsmido de una o varias epidemias (67,401,481). En un paciente de la Unidad de Cardiologia Peditrica se aisl, simultneamente en una muestra respiratoria, una cepa de K. pneumon!ae y otra de E. col! con el mismo perfil de sensibilidad e iguales bandas en el isoelectroenfoque (7,6 y 5,4). La caracterizacin en estas cepas y en sus respectivos transconjugantes de las mismas fl-lactamasas, SHV-2 y TEM-1, e igual enzima modificante de aminoglicsidos, AAC(3)VGL, indicara la transferencia in vivo de los genes de resistencia que las codifican. Esta hiptesis ha sido constatada por otros autores para diversas enzimas de tipo TEM: TEM-3 (6), TEM-12 (255) y CAZ-7 (TEM-16) (532) en las que se ha demostrado su asociacin a transposones (227,325532). La posibilidad de transferencia in vivo de 192

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las 3IPEA de tipo 514V ha sido previamente documentada en Espaa (167), sin que hasta la fecha existan referencias que indiquen la capacidad de transposicin de los genes que las codifican. La frecuencia de transferencia de la resistencia por conjugacin fue de 2x107 a o~ (moda ot, similar a la detectada por otros autores para este tipo de enzimas (279). Es un hecho incuestionable que las BIPEA han surgido a partir de modificaciones de ciertas bases en los genes que determinan la sntesis de secuencias enzimticas clsicas, TEM-,2 y SHV-1 (=79,548).En ocasiones, estas mutaciones afectan a un solo aminocido (=5=) condicin suficiente para modificar y ampliar el espectro hidrolitico de aquellas de las que proceden (94,288). No obstante, se suelen acompaar de una cierta prdida de eficacia hidrolitica y disminucin de la actividad enzimtica Este hecho no explicara, prescindiendo de otros factores como la permeabilidad (89,205,582), el rango de valores de CMI para determinadas cefalosporinas de 32 generacin y el aztreonam con el que puede expresarse un mismo enzima. En nuestra experiencia, una misma 3lactamasa dep1 7,6 (SHV-2), confiri en una coleccin de 24 cepas de K. pneumoniae un rango de
(89).

CMI para cefotaxima de 1 a 64 pg/m], de 0,5 a 32 pg/ml para ceftazidima, de 2 a 32 gg/ml para ceftriaxona, de 0,1 a 16 gg/m] para cefpiroma y de 0,5 a 16 para aztreonam (TABLA 34). El nmero relativamente elevado de cepas estudiadas con estas caractersticas 24 nos ha permitido establecer una relacin lineal entre la CMI de la ceftazidima (coeficiente de correlacin lineal, r=0,745) o la cefotaxima (r0,638) y la actividad enzimtica especfica, incrementndose la CMI para ambos antibiticos al aumentar la actividad enzimtica (FIGURA 14). Esta observacin,
-,

evidenciada anteriormente para TEM-1, TEM-2 y OXA-l (254,349) y las 8-lactamasas cromosmicas de clase la (311,502), no ha sido previamente demostrada para las BIPEA. En nuestro caso, a diferencia de las anteriores en las que se producen aumentos de actividad enzimtica de hasta 100 veces (254), el factor de elevacin fue inferior a 10. La enzima SHV-2 en estos aislamientos se acompaaba siempre de otra enzima plasmidica, TEM-1, que podra influir en los resultados obtenidos. Sin embargo, la hiperproduccin de TEM-1 condiciona un mayor incremento de la actividad enzimtica y est generalmente determinada por su presencia en plsmidos multicopia (339,395), posibilidad que no debe tenerse en consideracin con las BIPEA debido al mayor tamao de los plsmidos que las codifican (255). Por otra parte, podra formularse una hiptesis que estableciera una interrelacin entre la 3-lactamasa cromosmica de K. pneumon!ae o los genes que la regulan y la IIIPEA SHV-2, puesto que ambas pertenecen a la misma clase molecular y presentan una elevada homologa entre si (34,so,23s,37=,4o6,42o,529). Recientemente, Wu y cols. (613) han postulado la posible dependencia de la enzima KH, BIPEA relacionada con la 5-lactaniasa Kl de K. orytoca, de los genes cromosmicos de la cepa de K. oxytoca que la alberga, objetivndose una actividad enzimtica en los 193

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transformantes en E. cofl 10 veces menor que la obtenida en la cepa salvaje. En nuestra experiencia, se midi la actividad enzimtica en 15 transconjugantes en E. col! que presentaban al igual que las cepas donantes de 1< pnewnon!ae las dos Il-lactamasas, SHV-2 y TEM-1. El valor medio de la actividad enzimtica, 0,8490,27 mU/mm/mg protena, fue similar al obtenido con las 24 cepas de K. pneumoniae, 0,892+0 27 mU/mm/mg, si bien los coeficientes de correlacin con la CMI de ceftazidima (r=0,552) y cefotaxima (r=0,427) fueron ms bajos, posiblemente debido al menor nmero de cepas estudiadas. Otra hiptesis podra estar en relacin con los trabajos de Podbielski y cok (464) que demuestran que diferentes promotores pueden modular la expresin de la enzima SHV-2, alcanzndose distintos valores de CMI para la cefotaxima (rango 4-> 128 gg/ml). Asimismo, se ha constatado que algunas enzimas denominadas igualmente SHV-2 presentan otras modificaciones adems de la substitucin responsable de sus caractersticas cinticas, serma por glicina en el residuo 236 (TABLA 3) (180,463). Algunas de estos cambios se sitan en el pptido lder de tal manera que podran afectar la expresin final de la IIIPEA al modificarse los procesos de maduracin y secrecin enzimtica. Por ltimo, no debera tampoco descaflarse la posibilidad de una duplicacin de los genes bla, hiptesis demostrada slo para las I3IPEA con la enzima SHV-3
(407).

La utilizacin del perfil de sensibilidad, sinergia con los inhibidores de 3-lactamasas, determinacin del pl y transferencia de la resistencia a cefalosporinas de generacin til en la identificacin de la enzima SHV-2, fue insuficiente para la enzima SHV-6, siendo imprescindible la inclusin de otras tcnicas, hibridacin con sondas de AON y determinacin del perfil de
3a

substrato en funcin de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin (434). Dos cepas de E. col! y otra de K. pneumoniae con una banda dep1 7,6, mostraron unos valores de CMI (TABLA 35) para ceftazidima (4-32 gg/m]) y aztreonam (1-4 pgml) similares a los que confiere SHV-2 (252), pero distintos en relacin a la cefotaxima (0,2-0,5 pg/ml), ceftizoxima (0,06-0,1 g/ml) y ceftriaxona (0,1-0,5 ~g/m]),ms compatibles con TEM-5, TEM-6, TEM-7, TEM-8, TEM-12 (252) o la ltima 3IPEA de tipo SHV identificada, SHV-6, descrita por Arlet y cols. (17). La reaccin positiva en la hibridacin en colonia con sondas especificas de la familia SHV y ausencia de hibridacin con otra de la familia TEM, objetiv que nos encontrbamos ante una 3IPEA de tipo 514V. Adems, el perfil de substrato o inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin fue distinto del de SHV-2 (434), pero superponible al que obtuvimos con la enzima patrn SHV-6 de igual p que la BIPEA SHV-2 (FIGURAS 15 y 16). Con anterioridad a la caracterizacin de la enzima SHV-6, Shannon y cols.
(5=6)

describieron una cepa de K. pneumoniae con una B-lactamasa de pI 7,6 que conferia idntico nivel de resistencia. En ambos casos se obtuvieron unos perfiles de substrato muy similares a los de la 194

Discusin

enzima SHV-1, particularmente en lo referente a la baja Usa de hidrlisis de la cefrazidima. Esta caracterstica no es exclusiva de la f3-lactamasa SHV-l ya que algunas enzimas derivadas de ella, SHV-2 y SHV-3, tambin presentan esta particularidad (437). Recientemente, Petit y cok. (447) han confirmado que la hiperproduccin de la 8-lactamasa SHV-1 en K. pneumoniae y E. col! eleva los valores de CMI para la ceftazidima (8-16 pg/m]) y el aztreonam (2-8 gglnii) sin modificar los de la cefotaxima (0,03 gg/mi). Este fenotipo es similar al observado con la 3IPEA SHV-6 descrita por Ariel y cok. (7), la enzima encontrada por Shannon
y cok. (526) y el descrito en nuestras cepas. Sin embargo, los estudios de sensibilidad demostraron

la menor actividad de los inhibidores de 3-lactamasa en cepas hiperproductoras de SHV-1 (447) respecto de las cepas de K. pnewnon!ae con la enzima SHV-6 descrita por Arlet y cols. (17) y la encontrada por Shannon y cok. (5=6). En nuestro estudio confirmamos la efectividad de los inhibidores de B-lactamasas tanto en cepas con la 3-lactamasa prototipo SHV-6 (datos no mostrados) como en las cepas clnicas con la BIPEA de pI 7,6 de fenotipo SHV-6 (TABLA 39). Asimismo, el porcentaje de inhibicin mximo y la pendiente de inhibicin para los inhibidores de 3-lactamasas en el anlisis de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin, fueron superponibles a los del enzima SHV-6, siendo inferiores a los obtenidos con la 3-lactamasa SHV-l (FIGURA 16). Este hecho y los resultados con esta tcnica para otros antibiticos como la cefotaxinia facilitaran la diferenciacin entre la enzima SHV-6, SHV-l y su estado hiperproducido. Con independencia de esta observacin, serian necesarios estudios de secuenciacin que determinasen la complementariedad de la 8-lactamasa de estas cepas y la de la enzima SHV-6 e identificasen las mutaciones responsables de su fenotipo de resistencia. Las substituciones en los residuos 102 y 162, no descritas para la BIPEA de tipo 514V (TABLA 3), elevan los valores de CMI para la ceftazidima (11,547), por lo que esta nueva 3-lactamasa podra poseer alguna de estas dos modificaciones. Apane de los datos referidos en el presente trabajo, en Espaa no se ha identificado con anterioridad esta nueva enzima, SHV-6, aunque han sido previamente caracterizadas las enzimas SHV-2 (3,o6,s,167,496), SHV-4 (es) y SHV-5 (Cantn, Liares, Martnez-Beltrn, datos no publicados). Debemos consignar que en las heces de un paciente, incluido en el estudio epidemiolgico de los portadores fecales de Enter-obacteriaceae con 3IPEA, identificamos una cepa de C. freund!! con una enzima de pI 7,6, presumiblemente SHV-2, y en las heces de otro una cepa de K. pneumoniae y otra de E. col! con una 3-lactamasa de pI 8,0. El estudio de sensibilidad de estas ltimas mostr un perfil tpico de la codificacin de una BIPEA: resistencia a la ceftazidima (2-4 gg/mi), aztreenam (4-8 pg/ml) y cefotaxima (32-64 sg/mI) y sensibilidad a la cefoxitina (1-2 pg/ml) e imipenem (0,1 pg/m]). La sinergia en la prueba de doble difusin con disco fue positiva tanto en las cepas originales como en sus respectivos transconjugantes. Hasta la fecha no existen 195

Discusin

3IPEA descritas con un pl de 8,0, siendo SHV-4 de pI 7,75 (19), SHV-5 de pI 8,2 (205) y FEC-l dep 8,2 (355) las ms cercanas. Otras enzimas plasmidicas con un valor dep1 8,1, son ROB-I (366) y CEP-2 (=9=); ambas se inhiben por el cido clavulnico, pero, a diferencia de las anteriores, no confieren resistencia a las cefalosporinas de Y generacin. El va]or alcalino del pI de nuestra IIIPEA - 8,0 - y el particular fenotipo de resistencia que determina, valores de CMI para la cefotaxinia de 8 a 32 veces ms elevados que los de la ceftazidima y el aztreonam, indicaran la existencia de una 3IPEA no descrita con anterioridad. El segundo grupo de BIPEA identificadas en nuestro Hospital present un pl de 5,9, diferencindose claramente 2 subgrupos al analizar el fenotipo de resistencia que confieren. Hasta el momento se han descritoS BIPEA diferentes derivadas de TEM con un pI de 5,9-6,0: TEM-4,-6,8(CAZ-2),-15 y -17 (42,3o,3==,324,437).En todas ellas se produce una substitucin del glutmico de la posicin 102 de TEM-1 por la lisina, determinando, con la excepcin de TEM-17 (68), un elevado valor de CMI para la ceftazidima (32-128 gg/ml). Por el contrario, la CMI de la cefotaxima solo se muestra elevada con la enzima TEM-4 y TEM-15 (65.437). En nuestro estudio, los aislamientos relacionados con el Servicio de Pediatra, 7 cepas de E. col! y sus respectivos transconjugantes, posean un valor de CMI para la ceftazidima muy similar a] de la cefotaxima (4-8 ggml) (TABLA 40). El perfil de inhibicin competitivo de la hidrlisis del nitrocefin fue superponible a] obtenido con la BIPEA TEM-4 (FIGURAS 21 y 22) y similar al
observado por Papanicolaou y Medeiros
(434)

para esta enzima. Las cepas identificadas en la

Unidad de Cardiologia Peditrica con pI 5,9, que se correspondan con la epidemia por A. ar-!zonae y las encontradas en un enfermo seguido por la Unidad de Fibrosis Quistica, se caracterizaban por unos valores de CMI inusualmente elevados para la ceftazidima (16-1024 gg/ml) con respecto a los obtenidos para la cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona (0,5-8 pgml) (TABLA 40), estando en relacin con los descritos para la 3IPEA TEM-6 (42). Sin embargo, el perfil de inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin fue diferente por sus valores de inhibicin mxima de la

cefuroxima, ceftazidima, cefotaxima, cefoxitina y el cefotetan del obtenido con la enzima TEM-6,
distancindose en menor medida de la 3-lactamasa TEM-8 (FIGURA 20). Las cepas con la BIPEA de pI 5,9 hibridaron con la sonda especfica de la familia TEM, denominndose por sus caractersticas fenotipicas y bioqumicas, de forma preliminar, como TEM-6/S. Entre las cepas de A. ar-izonae de la Unidad de Cardiologia Peditrica destac la presencia de un aislamiento con un mayor nivel de resistencia a la ceftazidima (1024 pg/mJ) y otros antibiticos 8-lactmicos. Goussard y cois. (197) en el estudio gentico del gen blaTEM6 que codifica la enzima TEM-6 demostraron que la presencia de un elemento de insercin, al que

196

Discusin

denominaron IS1-like, elevaba el nivel de resistencia conferido por esta enzima. Este fragmento no es exclusivo de esta 8-lactaniasa, habindose identificado en un 47% de las cepas de

Enter-obacter!aceae con enzimas de tipo TEM, por lo que la participacin de este tipo de secuencias en esta cepa podra ser el determinante del incremento de los valores de CMI. Por otra parte, todas las cepas de A. ar-izonae procedentes de la epidemia de Cardiologa Peditrica presentaron igual perfil bioqumico y serolgico, evidenciando en el estudio epidemiolgico un posible origen comn (FIGURA 30). La resistencia a 3-lactmicos, al igual que lo descrito para otras enzimas, estaba unida a la de gentamicina y tobramicina pero no a la de amicacina, caracterizndose la enzima AAC(3)VGL. La codificacin por un plsmido relativamente pequeo (59 Kb) fcilmente transferible (frecuencia de conjugacin 2x108-4x105), la resistencia a
aminoglicsidos y la presin selectiva del consumo de antibiticos en esta rea concreta hicieron

posible, verosimilmente, su rpida dispersin. Medidas de control epidemiolgico, vigilancia

extrema de la disminacin de estos aislamientos y cambio de actitud en la terapia administrada evitaron su difusin a ms de los 9 pacientes en los que se localiz. Es de resaltar que sin ningn nexo epidemiolgico demostrable, se aisl en un esputo de un paciente ambulante seguido por la unidad de Fibrosis Quistica una cepa de A. ar!zonae y otra de E.

coli con un perfil de sensibilidad similar al de las cepas aisladas en la Unidad de Cardiologia Peditrica. La 8-lactamasa responsable present idnticas caractersticas (TEM-6/8) y en ambos
casos se constat la cotrarisferencia de la resistencia a la ceftazidima con la resistencia a gentamicina

y tobramicina pero no a amicacina [AAC(3)VGL]. La aparicin de una BIPEA en un lugar distinto y distante del inicial de aislamiento es un hecho relativamente frecuente que incluso se ha constatado
en continentes diferentes del inicial (44,205,249). La identificacin de una BIPEA inusual, TEM-6/8, en un patgeno poco frecuente, A. ar-izonae, elevara la importancia del hallazgo. En el gnero Aalmonella se han caracterizado, hasta la fecha, 3 tipos diferentes de BIPEA:

TEM-3 (CTX-1), CTX-2 y SHV-2 (6,51,52,98,24,29.3==,451,467,49o). Estas enzimas se han identificado en varias especies o serovariedades sin que existanreferencias previas que las publicadas por nuestro grupo que relacionen A. arizonae con las 3IPEA (348). Algunas especies de Aalmonella,
como A. w!en (24,2s,451), se han asociado a epidemias en unidades de neonatologia u otras, como

S. mbandaka (467), se han aislado en pacientes peditricos. Asimismo, en Espaa Roy y cok. (490) han comunicado una epidemia por Aalmonella spp. con resistencia transferible a cefalosporinas de 32 generacin que afect a 7 pacientes peditricos de una misma unidad.

197

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Con la excepcin de un solo trabajo que refiere la identificacin de una cepa de E. col) con la enzima TEM-4, no existen otros estudios en Espaa que evidencien el aislamiento de cepas
clnicas con BIPEA dep1 5,9

Tan solo se han caracterizado, dentro de las 8-lactamasas de tipo TEM, dos enzimas de pI 5,5 TEM-9 (165) y TEM-l0 (3) una de pI 6,3 relacionada con TEM-3 (67) y otras enzimas que confieren mayor resistencia a ceftazidima que a cefotaxima con un pl de 5,3-5,4 (495,496). Es de resaltar que en la bsqueda epidemiolgica de portadores fecales de
(65).
-,

Enrer-obacteriaceae con BIPEA se identificaron 4 cepas de E. col!, procedentes de 3 pacientes, con una enzima de pI 5,9. En tres de los aislamientos, la 3-lactamasa se acompaaba, al igual que la enzima TEM-6/8, de la enzima modificante de aminoglicsidos AAC(3)VGL que confiere resistencia a la gentamicina y tobramicina (189), pudiendo indicar un mismo origen clonal. Sin embargo, los valores de sensibilidad a cefotaxima son algo ms elevados, acercndose a los encontrados en los aislamientos con TEM-4. Payne y cois.
(438,442,443)

y Sougakoff y cois.

(548)

describieron la seleccin in vitro de

cepas con BIPEA a partir de aislamientos con TEM-1 y TEM-2 en presencia de ceftazidima, con caractersticas similares a otras enzimas aisladas de muestras clnicas (TEM-EI ,-E2.-E4,-7, CAZ-lo y CAZ-hi) (=s2A3s).La frecuencia de mutacin era inferior a 0~7 y el rango de pl oscilaba entre 5,3 y 6,5 con una mayor distribucin en torno a 5,4, siendo los valores de CMI para la ceftazidima (4-32 gg/ml) superiores a los de la cefotaxima (0,06-0,5 gg/ml). Con igual fenotipo de resistencia identificamos en nuestro hospital un tercer grupo de BIPEA con un pI 5,4 (TABLA 43) en 6 cepas
de E. col!, procedentes de 3 pacientes distintos que hablan recibido previamente antibiticos 3-

lactmicos (TABLA 50). El perfil de resistencia de las 6 cepas de E. col! con la Il-lactamasa de pI 5,4 y de sus respectivos transconjugantes (TABLA 43) tiene ciertas similitudes con el observado en aislamientos de E. col! que presentan hiperproduccin de su 3-lactamasa cromosmica: disminucin de la actividad de metoxi-B-lactmicos y elevacin selectiva de los valores de CMI de ceftazidima, conservando una mejor actividad la cefotaxima y la cefpiroma (296349,565). Asimismo, la menor actividad de los inhibidores de 3-lactamasa, observada con la tcnica de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin, acercara esta enzima a las 8-lactamasas cromosmicas. Por el contrario, el valor de su pI, 5,4, est alejado de los encontrados habitualmente en E. col! para las 3-lactamasas cromosmicas, 7,4-8,8 (351), aunque recientemente se ha descrito una 3-lactamasa cromosmica de la clase A en 1. aeruginosa con un pI de 5,4
(414).

En Espaa Royy cois. (495,496) han descrito cepas productoras de ceftazidimasas con pI 5,35,4 que hibridan con sondas de tipo TEM pero no muestran semejanza con TEM-l (pI 5,4) por tcnicas combinadas de isoelectroenfoque y electroforesis. Estas 3-lactamasas son muy similares a la encontrada por nosotros que por su pl podra tratarse de la enzima TEM-. No obstante, a 198

Discusin

diferencia de ella, el fenotipo que determina incluye resistencia o sensibilidad disminuida a la

cefrazidima y la cefotaxima y cierta prdida de actividad de las asociaciones de penicilinas e

inhibidores de 8-lactamasas, si bien estos ltimos demuestran sinergia con las cefalosporinas de
32

generacin (TABLA 45). Los datos obtenidos por la tcnica de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin son diferentes de los observado con otras enzimas dep1 5,4: TEM-l, TEM7, TEM-HaI e IRT-3 (FIGURAS 25 y 26). Esta ltima enzima confiere resistencia a los inhibidores

de 8-lactamasa y al igual que TEM-E1,-7,-19, y TEM-20

(=52,438)

ha surgido a partir de

modificaciones en la secuencia nucleotidica de TEM-1, mostrando igual p que su predecesora (66). La hibridacin en colonia con una senda especfica de la familia TEM indicarla que se trata de una nueva enzima relacionada con este grupo y el fenotipo que determina y perfil de substrato la

incluirla dentro de las I3IPEA. Con respecto a los resultados obtenidos con los inhibidores clsicos de las 8-lactamasas plasmidicas en las cepas de Ener-obacreriaceae productoras de BIPEA, el cido clavulnico disminuy de forma eficaz la CM] para cada antibitico en mayor medida que el tazobactam y el sulbactam, lo que est en concordancia con los trabajos de Bush (94) y Labia y cok. (zss). Estos
autores demostraron la mayor afinidad de los inhibidores de las 3-lactaniasas por estas enzimas que por sus predecesoras. En nuestro estudio, con la excepcin de la BIPEA de pI 5,4, los valores encontrados en el ensayo de la inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin corroboran esta afirmacin. La BIPEA de pI 5,4, se comport frente al cido clavulnico, sulbactam y tazobactam de forma muy similar a la descrita por Papanicolaou y Medeiros
(434)

para las enzimas TEM-5 de

pI 5,57 y TEM-9 de pI 5,56, frente a las que disminuye la actividad de los inhibidores de filactamasas. Asimismo, la presencia de una 8-lactamasa de amplio espectro, TEM-1, TEM-2 o SHV-

1, en una cepa con una BIPEA ha sido previamente relacionada con la disminucin de la actividad de los inhibidores de 8-lactamasas (259,278). Con la excepcin de 8 aislamientos de K. pneumoniae
con una BIPEA SHV-2, que presentaron adems una TEM-1 y que mostraron una CMI para cefotaxima de 64 pg/ml superior a la del resto de las cepas con estas dos enzimas, no se observ la disminucin de la actividad de los inhibidores de 8-lactamasas.

Por otra parte, el BRL 427 LSB, inhibidor de amplio espectro de estructura penmica con actividad tanto sobre 3-lactamasas plasmidicas clsicas como cromosniicas de las clases 1 y IV

(loo,46a), demostr una actividad comparable a la del cido clavulnico y el tazobactam frente a las
3IPEA SHV-2, SHV-6 y TEM-6/8, siendo el inhibidor menos activo frente a TEM-4. Por el contrario, fue ms activo que el cido clavulnico y el tazobactani frente a la BIPEA de pI 5,4, demostrando tambin buena actividad en aquellas cepas que presentaron adems de la BIPEA una

enzima de tipo cromosmico.

199

Discusin

La coexistencia de dos fl-lactamasas e incluso tres en una misma cepa no es un hecho nuevo ni infrecuente (3=2). TEM-1 es la enzima que se asocia de forma ms frecuente a una BIPEA, pudiendo localizarse en el mismo plsmido que la codifica. En nuestra experiencia el 51,2% de las cepas presentaron ms de una banda en el isoelectroenfoque, asocindose el 9,7% de stas con una 8-lactamasa cromosmica y un 90,2% con la TEM-1. Es de destacar que en un alto porcentaje de los casos (70,3%) la enzima TEM-1 cotransfiri con la correspondiente BIPEA, indicando con ello su posible presencia en el mismo plsmido. Adems de lo genes bIOTEM, los plsmidos que codifican las BIPEA presentan habitualmente otros genes de resistencia (255,259,449,451,532,541). Al igual que en otros estudios (66,451?>, la resistencia a los aminoglicsidos (97,5%), las sulfamidas (80%) o las tetraciclinas (43,7%) fueron los marcadores identificados con mayor asiduidad junto a las BIPEA. En la mayora de estos trabajos la resistencia a las cefalosporinas de Y generacin se asoci con la de amicacina y tobramicina sin afectar a la gentamicina, siendo responsable la enzima AAC(6)]V (6,19,127,=s9,4o6,449,532).En nuestra experiencia slamente un 14,1% delos aislamientos con resistencia a los aminoglicsidos, 4 cepas de K. pneumoniae con SHV-2 y 6 cepas de E. coil con TEM-4, mostraron unos valores de CMI para la amicacina superiores a 2 jtg/ml, identificndose en ellas la enzima AAC(3)VCG. La enzima AAC(3)VGL que confiere resistencia a gentamicina y tobramicina pero no a amicacina (189) fue la enzima modificante de aminoglicsidos caracterizada con mayor frecuencia (58,9%), asocindose tanto a BIPEA de tipo SHV (SHV-2) como de tipo TEM (TEM-6/8). Las enzimas ANT(3)(9) y APH(3), responsables de la resistencia a estreptomicina (82), y APH(3)I, que confiere resistencia a kanamicina y neemicina (82), tambin se encontraron asociadas a las BIPEA en el 24,3%, 21,8% y 14,1%, respectivamente. Estos datos de incidencia de enzimas modificantes de aminoglicsidos son cercanos a los descritos por Dornbusch y cols. (47) y Culebras (119) para el conjunto de Enrerobacreriaceae en nuestra rea geogrfica. El hallazgo de similares enzimas asociadas a las BIPEA en un hospital prximo al nuestro incidencia local de estas enzimas determinara su asociacin con las BIPEA.
(67)

sugerira que la

Aunque no es un mecanismo de origen plasmidico, la resistencia a quinolonas se detect en el 6,2% de las cepas, siendo inferior al de otras series que alcanzan incluso el 70% de los aislamientos (19,128285). La introduccin de un plsmido con el gen salvaje de la gyrA de E. col) 1<12 disminuy el valor de las CMI de las quinolonas en tan solo una cepa de K. pneumoniae con una SHV-2 y solo parcialmente en una A. marcescens con una TEM-4. Este hecho indicara, segn lo establecido por Hane y Wood (27) y Nakamura y cok. (392), que la resistencia a quinolonas en la cepa de K. pneumoniae se debe a mutaciones de la subunidad gyrA y slo parcialmente a sta en la de A. marcescens. Es de resaltar la presencia de una cepa reiteradamente aislada en el mismo 200

Discusin

paciente cuyo nivel de resistencia al cido na]idixico y fluorquinolonas no se vi afectada por la introduccin del alelo salvaje gyrA. Por el contrario, en las 3 cepas con resistencia a quinolonas identificadas en el estudio de portadores fecales de Enterobacrer!aceae con BIPEA se asoci siempre la resistencia a estos antibiticos con las mutaciones en vrA. El estudio realizado sobre BIPEA en nuestro medio ha permitido captar las primeras fases evolutivas de este nuevo y amenazante capitulo de las resistencias bacterianas. En slo pocos aos, una importante diversidad de enzimas de esta naturaleza ha aparecido en bacterias aisladas de infecciones clnicas, y, verosmilmente, empiezan a distribuirse en los microorganismos integrantes de la flora normal. Una limitacin a su expansin endmica podra estar constituida por la barrera que ofrecen las enterobacterias ya resistentes a otros antibiticos, constantemente seleccionadas por teraputicas de amplia utilizacin extrahospitalaria. Adems, la incompatibilidad plasmidica reducira a un nmero relativemente pequeo de vectores las posibilidades de diseminacin interbacteriana de las 3IPEA. Sin embargo, el uso incrementado de nuevas cefalosporinas particularmente si se
-

desarrollan cefalosporinas orales de la Y generacin podran cambiar este escenario a corto o medio pazo. La labor del microbilogo clnico debe incluir la realizacin de predicciones evolutivas de los mecanismos de resistencia. Para ello, es esencial la promocin de tres estrategias: 1) implementar la capacidad de deteccin de la resistencia por procedimientos fenotipicos o genticos
-

sencillos y asequibles; 2) realizar estudios de incidencia y evolucin de las cepas resistentes; y 3) proporcionar datos para el establecimiento de polticas eficaces de uso de antimicrobianos. El desarrollo de este trabajo se ha dirigido a cumplimentar este deber de la Microbiologa Clnica.

201

VI.- CONCLUSIONES

Conclusiones

El anlisis de la evolucin de la resistencia a antibiticos 8-lactmicos en 24.058 aislamientos de Enterobacreriaceae, obtenidos entre 1987 y 1992, nos ha permitido establecer un sistema de deteccin fenotpica de los mecanismos de resistencia basado en criterios interpretativos, con las siguientes conclusiones fundamentales: 1.En E. coil se detecta una disminucin en la incidencia del fenotipo debido a la produccin normal de B-lactamasa plasmdica y por tanto de la resistencia a la amnpicilina. No obstante, se produce un aumento significativo del fenotipo mediado por hiperproduccin y del ndmero de aislamientos inhibidos por concentraciones crticas intermedias (resistencia de bajo nivel). Asimismo, en el 0,2% de las cepas se detecta un fenotipo caracterfstico de IIIPEA. En Salmonella spp. se detecta un incremento significativo de la resistencia a la ampicilina con una tasa final del 25%, asociado aun fenotipo determinado por 8-lactamasas plasmdicas clsicas, y se caracteriza un fenotipo mediado por BIPEA ligado a una epidemia intrahospitalaria por 5. arizonae. 3.En 1. mirahilis y 1. vulgaris no se observan cambios sustanciales de comportamiento en cuanto a la incidencia de la resistencia, no habindose detectado cepas con BIPEA. 4.En K. pneurnoniae la incidencia del fenotipo debido a la hiperproduccin de 8-lactarnasa cromosmica constitutiva es significativamente menor que en K. oxyroca (4,9% Vs. 35,6%). Por el contrario, en el 1,6% de las cepas de K. pneumoniae se caracteriza un fenotipo mediado por IIIPEA no encontrado en K. oxyroca. 5.En E. cloacae, C. freundil M. morganil y 5. marcescens el fenotipo ms frecuente se asocia a la produccin de Il-lactamasas cromosmicas inducibles. La incidencia de aislamientos con resistencia a cefalosporinas de V generacin debida a la hiperproduccidn de estas enzimas
,

2.-

fue ms frecuente en E. aerogenes 0x43,3%) que en C. freundil (26,1%); 5. nzarcescens (22,5%), E. cloacae (21,9%) y U. morganhl (18,4%). Esta tasa de resistencia se estabiliza tras unos aos de incremento, probablemente debido al descenso en el consumo de cefalosporinas de Y generacin. Por otra parte, en Enterobacter y Serrada se caracteriza un fenotipo mediado por BIPEA.

202

Conclusiones

El estudio del fenotipo determinado por BIPEA en Enrerobacteriaceae permite extraer las siguientes conclusiones: 6.La incidencia media de Enurobacteriaceo.e con BIPEA entre 1981 y 1992 fue del 0,3%. La caracterizacin de la enzima SHV-2 en 3 aislamientos de E. col, en junio de 1988, supone la primera constatacin de este mecanismo de resistencia en Espaa. En 1989 se describe por vez primera en nuestro pas una epidemia intrahospitaiaria por Enterobacteriaceae (5. arizonae) productoras de BIPEA, TEM-6/8, y se caracteriza la enzima SHV-6. Asimismo, la identificacin de SHV-2 en una cepa de E. gergoviae constituye el primer hallazgo de una BIPEA en esta especie. 7.El reducido nmero de pacientes implicados, 44, denota una repercusin clnica poco relevante, aunque en el 82,5% existan criterios de infeccin. El 75,0% de los pacientes estaba relacionado con Servicios Quirrgicos o Unidades de Cuidados Intensivos; no obstante, el 9,1 % proceda del mbito extrahospitalario. El tratamiento previo con cefalosporinas de 32 generacin (82,5%) o en asociacin con un aminoglicsido (42,4%) y la prolongada estancia hospitalaria prevalecen como factores epidemiolgicos asociados. 8.El estudio de portadores fecales de Enerobacteraceae con BIPEA revel una incidencia del 0,5%, aislndose exclusivamente en pacientes ingresados o que recientemente haban permanecido en el hospital. En este grupo se han detectado tres tipos de BIPEA: SHV-2, TEM-4 y una tercera que por su elevado pI -8,0- y particular fenotipo de resistencia sugerira la existencia de una BIPEA no descrita con anterioridad. 9.El anlisis de la resistencia inferida por 12 prototipos de BIPEA en una cepa de E. col K12 permiti definir grupos fenotpicos en funcin del nivel de la resistencia a la ceftazidima, aztreonam y cefotaxima. Este agrupamiento slo es posible cuando en el estudio de sensibilidad se utiliza un amplio rango de concentraciones. En Enterobacreriaceae de origen clnico se han identificado tres grupos de BIPEA: de pl 7,6: SHV-2 y SHV-6; de pI 5,9: TEM-4 y TEM-6/8; y de pI 5,4. La aplicacin de los criterios del NCCLS calific errneamente como sensible el 55% de las cepas para cefotaxima y el 30% para ceftazidima. La consideracin de puntos de corte ms restrictivos (1-2 gglml) redujo este porcentaje al 5% y 2,5%, respectivamente.

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203

Conclusiones 11.SHV-2 fue la BIPEA ms frecuente respecto al nmero de cepas (43,7%) y pacientes en los que se aisl (56,8%). En K. pneumoniae evidenci una gran variacin en su expresin, demostrndose una relacin lineal entre los valores de CMI para cefotaxima y ceftazidima y la actividad enzimtica especfica. Esta observacin, constatada para las 8-lactamasas plasmidicas de amplio espectro, no ha sido previamente documentada para las BIPEA. SHV-6 se identific en 2 cepas de E. coil y 1 de K. pneumon!ae. El patrn de resistencia y los resultados de la tcnica de inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin la individualiz de las B-lactamasas SHV-1 y SHV-2 de igual pi. 13.TEM-6/8 se identific en 24 cepas de 5. arizonae, 1 de E. col! y 1 de E. cloacae en un brote epidmico en 9 pacientes de la Unidad de Cardiologia Peditrica y en 1 cepa de 5. arizonae y otra de E. col! aisladas en un paciente de la Unidad de Fibrosis Quistica. Esta enzima se caracteriz por un perfil de resistencia compatible con TEM-6 y una inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin prxima a TEM-8. La identificacin de una enzima inusual, TEM-6/8. en un patgeno poco frecuente, 5. arzonae, y la ausencia de referencias previas eleva la importancia de este hallazgo. 14.La BPEA dep1 5,4 se identific enE cepas de E. coil de 3 pacientes no relacionados. Esta enzima, de pl coincidente con TEM-1, mostr un perfil de resistencia similar al conferido por la hiperproduccin de AmpC en E. col! e inhibicin competitiva de la hidrlisis del nitrocefin prxima a las enzimas IRT, por lo que podra tratarse de una nueva BIPEA. 15.En las cepas de Enterobacreriaceae con BIPEA se observ un efecto sinrgico entre las cefalosporinas de Y generacin o el aztreonam y los inhibidores de B-lactamasas, mayor para el cido clavulnico que para el tazobactam y el sulbactam. El BRL 427 15B mostr una actividad comparable a la del cido clavulnico frente a SHV-2, SHV-6 y TEM-6/8, siendo el menos activo frente a TEM-4 y el ms efectivo en las cepas con la BIPEA de pI 5,4. 16.El 98,7% de las cepas clnicas de Enterobacreriaceae con BIPEA mostraron al menos un marcador asociado de resistencia a antibiticos no 8-lactmicos, principalmente aminoglicsidos (97,5%) y sulfamidas (80,0%). La enzima modificante de aminoglicsidos AAC(3)VGL, que confiere resistencia a la gentamicina y tobraniicina, fue la ms prevalente (58,9), mientras que la enzima AAC(3)VCG, que confiere adems resistencia a la amicacina, slo se encontr en el 14,1% de los aislamientos. El empleo de estos antimicrobianos incidira en la seleccin y diseminacin de las cepas con BIPEA.

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