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Conceptos básicos en Inmunohematología

Dr E Muñiz-Diaz
Laboratorio de Inmunohematología
Banc de Sang i Teixits
Barcelona (España)
Inmunohematología
• La IH es la parte de la Hematología que se ocupa de los
procesos inmunes relacionado con las células sanguíneas.
• Estos procesos están producidos por anticuerpos (Acs) que
reaccionan con antígenos (Ags) presentes en la membrana
de las células sanguíneas.
• Los Acs son inmunoglobulinas: las de clase IgG e IgM son
las más habituales.
• Los antígenos (Ags) son estructuras de la membrana
(proteinas, glúcidos, lípidos, o combinaciones de ellos) con
capacidad inmunogénica: capaces de desencadenar una
respuesta inmune.
Inmunohematología
• Los Ags y los Acs son los grandes protagonistas de la IH, y los
estudios inmunohematológicos realizados para el diagnóstico
de los procesos inmunes de la sangre se basan en poner en
evidencia la reacción Ag-Ac.
Reacción Ag-Ac
Ags en los
Hematíes
Anticuerpos Aglutinación
Hemólisis
Inmunohematología. Antígenos.
•La parte del Ag que reacciona con el Ac es el determinante antigénico
o epítopo.
•Cada antígeno está constituido por un número variable de epítopos.
Inmunohematología. Antígenos.
• Los Ags presentes en
los hematies son los
Ags eritrocitarios.
• Los Ags de las
plaquetas son los Ags
plaquetarios.
• Los Ags de los
granulocitos son los
antígenos
granulocitarios.
G
R
U
P
O
S
S
A
N
G
U
Í
N
E
O
S
Los Ags codificados por
un mismo Gen, o por genes
homólogos muy próximos
entre sí
Sistema de
grupo sanguíneo
Inmunohematología. Anticuerpos.
• Los Acs son proteinas
plasmáticas que se producen
en respuesta a un antígeno.
• Al realizar un proteinograma
aparecen varias bandas, con
2 grandes fracciones
correspondientes a la
albúmina y a las globulinas
(α1, α2, ß1, ß2 y γ).
• Los Acs se sitúan en la
fracción denominada γ, y por
su relación con la inmunidad
se denominan
Inmunoglobulinas (Ig).
Inmunoglobulinas
• Las Igs está formadas por 4
cadenas, dos pesadas y dos
ligeras, debido a su peso
molecular, que están unidas
por puentes disulfuro.
• Cada cadena tiene una región
constante en todas las Igs y
una variable.
• Se conocen 5 clases de Igs
(IgG, IgM, IgA, IgD, IgE) que
se diferencian entre sí por la
cadena pesada.
Región Fab
Región Fc
Inmunoglobulinas
Importancia clínica de los Acs
• Los Acs más importantes en
transfusión e IH son los de
clase IgG e IgM, y muy de
lejos, IgA.
• Los Acs de clase IgG son
“incompletos” porque no son
capaces de aglutinar
espontáneamente a los
hematies.
• Los Acs de clase IgM son
“completos o aglutinantes”
porque son capaces de
aglutinar espontáneamente a
los hematíes.
Clasificación de los Acs según su origen
• Naturales. Aparecen sin estimulación detectable.
La mayoría son IgM, o bien mezclas de IgG+IgM.
– Regulares. Aparecen siempre que se carece del antígeno
correspondiente (ABO).
– Irregulares. No siempre aparecen cuando no se posee el
Ag (P1, Le, E...).
• Inmunes. Se detectan después de un estímulo
antigénico (transfusión, embarazo...). Son casi
siempre IgG.
– También son Acs irregulares.
Clasificación de los Acs según el Ag
contra el que van dirigidos
• Aloanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag extraño no
presente en la persona que lo
produce.
– Los Acs dirigidos contra los
Ags eritrocitarios. Anti-Rh(D)
en un indivíduo Rh(D-).
• Autoanticuerpos: Dirigidos
contra un Ag propio.
– Son los responsables de los
procesos autoinmunes.
Procesos en IH que exigen la detección de Acs
• IH eritrocitaria
– Pruebas de compatibilidad transfusionales
– Enfermedad hemolítica del RN
– Anemia hemolítica autoinmune
• IH plaquetaria
– Trombocitopenia neonatal aloinmune
– Púrpura postransfusional
– Púrpura trombocitopénica autoinmune (PTAI)
• IH granulocitaria
– Neutropenia neonatal aloinmune
– Lesión pulmonar aguda-AT (TRALI)
– Neutropenias autoinmunes
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Aloanticuerpos
Autoanticuerpos
Autoanticuerpos
Autoanticuerpos
Una regla básica en el diagnóstico
inmunohematológico
La detección de un aloanticuerpo en el suero de un
paciente exige, siempre que sea factible, la confirmación
de la ausencia del correspondiente antígeno.
– Por ej. Una gestante portadora de anti-D debe ser Rh(D-).
1. Investigaremos la presencia de anticuerpos en su suero
• Suero problema + hematies de grupo conocido Rh(D+ y D-)
2. Comprobaremos la ausencia del Ag en la gestante
• Ac conocido (anti-RhD) + hematíes de la gestante
La reacción Ag-Ac es la base del
diagnóstico inmunohematológico
• Los resultados posibles de
la reacción Ag-Ac pueden
ser:
– Aglutinación
– Hemólisis.
• Las técnicas empleadas
para poner en evidencia
estos fenómenos son
fundamentalmente las
técnicas serológicas.
Hemólisis →
Aglutinación
Técnicas serológicas: Aglutinación
Es el agregado de hematíes que se forma cuando las
moléculas de Ac se unen a los determinantes antigénicos
(Ags) de múltiples células adyacentes.
– Algunas moléculas son capaces de unirse a los Ags y de interaccionar con
otras moléculas induciendo la aglutinación final (IgM).
– Otras moléculas sólo se unen a su antígeno pero no son capaces de hacerlo
con sus vecinas y de producir la aglutinación (IgG).
Técnicas serológicas: Aglutinación
La aglutinación es un
proceso químico reversible
que se produce en dos
fases:
– Fase de Sensibilización: unión del
Ac con el Ag.
– Fase de Aglutinación: formación
de puentes entre las células
sensibilizadas hasta constituir la
red que conduce a la aglutinación.
Son muchos los factores que
inciden en estas dos fases y
que podemos manipular para
aumentar, o disminuir, la
aglutinación.
Factores que afectan a la fase de
Sensibilización
1. Temperatura.
2. pH.
3. Tiempo de incubación.
4. Tipo de anticuerpo: clase de Ig.
5. Proporción de Ag y Ac.
6. Constante de afinidad del anticuerpo.
1. Temperatura
– Los Acs IgG reaccionan de
forma óptima a 37ºC
(“calientes”).
– Los Acs IgM reaccionan de
forma óptima a 4ºC o a TªA.
(“fríos”).
2. pH
– El pH óptimo para la reacción
está entre 6.9 y 7.2.
– Algunos Acs necesitan de un
medio ácido para actuar.
3. Tiempo de incubación
– El estado de equilibrio sin
potenciadores es de 15 a 60
min.
4. Tipo de Anticuerpo
– IgM: aglutinante en solución
salina.
– IgG: no aglutinante. Habrá
que potenciar la aglutinación.
5. Proporción de Ag y Anticuerpo
– Tiene que haber una relación
entre el número de moléculas
de Ac y el de lugares
antigénicos.
6. Constante de afinidad del Ac
– A mayor afinidad del Ac mayor
es la velocidad de asociación y
más lenta la disociación.
Factores que afectan a la fase de
Aglutinación
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CARGA POSITIVA:
CATIONES DEL MEDIO
HEMATIE
CARGA NEGATIVA:
SIALOGLICOPROTEINAS
DE LA MEMBRANA
1. Intensidad iónica del
medio (Potencial Z).
• El potencial Z es la
diferencia de potencial entre
el hematíe cargado
negativamente y la nube de
cargas positivas del medio.
• Es el responsable de la
fuerza de repulsión de los
hematíes.
2. Tipo de Ac
• Los IgM siempre aglutinan.
• Los IgG raramente (según la
localización del epítopo del Ag).
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nube de
iones Ig G
Ausencia de
aglutinación
Ig M
Aglutinación
35 nm
25 nm
14 nm
anticuerpo
incompleto
anticuerpo
completo
Potenciadores de la reacción Ag-Ac
Souciones de baja fuerza iónica (LISS)
- Aceleran la fase de sensibilización al disminuir la carga negativa.
- Suele requerir una sustancia no iónica para evitar la hemólisis (Glicina).
Albúmina
- Reduce la repulsión entre células (potencial Z) favoreciendo la aglutinación.
- Hace posible que Acs IgG sean capaces de unir hematíes adyacentes.
Enzimas
- Bromelina, ficina, papaina,tripsina, pronasa y neurominidasa.
- Reducen la carga negativa. Hacen aglutinantes a los Acs IgG.
- Mejoran el acceso a los lugares antigénicos.
Moléculas cargadas positivamente
- Son polímeros que aportan un exceso de carga positiva: polybrene, sulfato de
protamina, poli-L-Lisina, que pueden producir una aglutinación espontánea.
- Pueden dar falsos positivos.
PEG
- Es un polímero soluble que potencia la reacción Ag-Ac eliminando el agua que hay
alrededor de los hematíes.
- Útil para la detección de Acs de clase IgG.
El test de la antiglobulina (Test de “Coombs”)
En 1945 Coombs, Mourant y Race diseñaron una técnica
para poner en evidencia a los Acs que no eran capaces de
aglutinar directamente a los hematies (IgG).
1. La base es la utilización de un suero anti-Inmunoglobulina
humana o, anti-C, (suero antiglobulina) que actúa como un
puente de enlace entre los Acs que se han fijado.
2. Originalmente se empleó para demostrar anticuerpos Rh(D)
incompletos o no aglutinantes (IgG) en el suero.
3. Posteriormente, para detectar la sensibilización in vivo de
hematíes por anticuerpos, o factores del C, (autoanticuerpos)
en pacientes afectos de Anemia hemolítica autoinmune.
Es el test más importante en Inmunohematología
Inyección
plasma humano o de
Igs específicas
Suero de Coombs:
anticuerpos contra las
fracciones Fc de las Igs humanas
Antiglobulina Poliespecifica / Polivalente: Anti-Igs (mayorit. IgG) + C3d
Antiglobulina Monoespecifica: Anti IgG, anti IgM, anti IgA, anti C3d
¿Cómo se obtiene la antiglobulina humana?
Aplicaciones de la técnica de la antiglobulina
Prueba directa
AHAI: autoacs.
Hemólisis inducida por
fármacos.
EHRN: RN con CD+.
Reacciones aloinmunes:
- Ac fijado a hematíes
transfundidos.
Prueba indirecta
Tipificación:
-Ac conocido y Ag desconocido.
Detección e identificación
de Acs:
-Ac desconocido y Ag
conocido.
Pruebas cruzadas.
TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA
Test directo:
Indicaciones:
Anemia hemolítica autoinmune
Enfermedad hemolítica del recién nacido
Hemólisis por fármacos
Reacció hemolítica post-transfusional
TEST DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA
Test indirecto:
suero
paciente
hematies
reactivo
hematies
sensibilizados
anticuerpos
anti-IgG y/o C’
aglutinación
Indicaciones:
Detección e identificación de anticuerpos anti-eritrocitarios
Pruebas de compatibilidad pre-transfusional
Tipificación de antígenos eritrocitarios que no son visualizados
por aglutinación directa
Sensibilización: reacción Ag-Ac
El suero antiglobulina se une al fragmento Fc de los Acs IgG
El suero antiglobulina actúa como puente entre los Acs IgG
favoreciendo la aglutinación
Aglutinación final
Comparación entre el Coombs Directo
e Indirecto
La prueba exige una incubación previa
(suero+hematíes) antes de añadir la
antiglobulina humana.
Los hematíes son examinados
directamente con la antiglobulina
humana.
La técnica requiere 2 pasos. La técnica requiere 1 paso.
La sensibilización de los hematíes
se ha provocado al incubar el suero
en estudio con los mismos.
La sensibilización se ha producido
espontáneamente en el organismo del
paciente.
Detecta Acs (IgG) y/o C fijados
a los hematíes, procedentes del
suero en estudio.
Detecta Acs (IgG) y/o C
directamente fijados a los
hematíes en estudio.
Coombs Indirecto Coombs Directo
Métodos para observar la Aglutinación
La técnica en tubo Es la técnica estándar
Ventajas
Se pueden añadir aditivos
Permite la manipulación
Es visible la hemólisis
Desventajas
La aglutinación es inestable
Requiere experiencia en la
manipulación y lectura cuidadosa 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 0
Métodos para observar la Aglutinación
Aglutinación en columna / tarjeta La columna contiene gel, microesferas...
Utilizan aditivos (LISS) para potenciar la reacción Ag-Ac y reducir el tiempo
de incubación.
La reacción es semipermanente y puede evaluarse horas-días después.
Ventajas
Entrenamiento mínimo y poca
manipulación.
Se requieren pocos reactivos.
Desventajas
Requiren equipamiento
Muy sensibles
Equipamiento en la técnica de
aglutinación en columna
Prinicipio de la aglutinación en Gel
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
Hematíes K+
Hematíes K-
Ejemplo de tipificación de unos hematies Kell+
y de unos hematíes Kell- con anti-K
8 88 8 Se utilizan microplacas
de plástico con 96 pocillos.
8 88 8 Permite automatización.
8 88 8 Muy útil para grandes
series.
Técnica en fase sólida en microplacas
Métodos para observar la Aglutinación
Técnica en Fase Sólida (Microplaca)
•Hematíes o estromas
eritrocitarios de composición
antigénica conocida, fijados en los
pocillos de una
microplaca.
•Se añade el suero a estudiar y se
incuba; posteriormente
se lava la placa para eliminar el
exceso de anticuerpo.
•El anticuerpo fijado se detecta
añadiendo un reactivo de
antiglobulina conjugado en enzima
o con hematíes
sensibilizados recubiertos con
antiglobulina.
Ventajas:
- Sensibilidad parecida al PEG
- Larga caducidad
- Lectura de resultados automatizable.
Desventajas:
- La fase de lavado de las microplacas es delicado.
- Se puede automatizar, pero encarece los costes.
- No es práctica para muestras aisladas.
- Ideal para series largas de muestras.
Técnica en Fase Sólida (Microplaca)
El Complemento
• Es un sistema de 25-30 proteinas séricas y de la membrana que
actúan en cascada para producir diversos efectos biológicos,
entre ellos la lisis de los hematíes.
• Se encuentran en estado inactivo o de proenzimas, y tras su
activación se convierten en enzimas activos.
• La activación se produce:
– por vía clásica: reacción Ag-Ac
– por vía alternativa: bacterias, virus, proteinas o carbohidratos ajenos.
• Nueve componentes están numerados de C1 a C9.
Activación completa del Complemento
• C1qrs rompe C4 y C2 en 2 fragmentos: C4a y C4b y C2a y C2b.
• C4b y C2a se unen para formar la C3 covertasa que rompe C3 en C3a y C3b.
• C3 convertasa se une a C3b para formar la C5 convertasa que rompe C5 en dos
fragmentos, etc.
• El complejo de proteinas de “ataque” lo forman el grupo de C5 a C9 que acaban
produciendo agujeros en la misma y la hemólisis subsiguiente.
Activación incompleta del
Complemento (C3d)
Jka
Macrófago
Fc de Igs
Hematíe
Receptor macrofágico para el receptor Fc
Jk
a Jka
C1q
C1r
Ca
++
C1s
Ca ++
C4b
C2a
C3b
Receptor macrofágico para C3b
Macrófago
Hematie
Reacción transfusional
Reacción
retardada
Reacción
inmediata
Habitualmente extravascular
Anti-Jka y anti-Jkb
Intravascular / Extravascular
anti-A y anti-B
IgG
IgM
Activación completa del C
Activación incompleta del C
Técnicas moleculares. Aplicaciones
1. En pacientes transfundidos o con Coombs directo positivo
podemos determinar el genotipo. (Ej. Hemoglobinopatías).
2. Definir las variantes RhD y confirmar el carácter positivo o
negativo de la muestra.
3. Confirmar el grupo ABO en las discordancias sérico-hemáticas.
4. Buscar donantes con determinados genotipos (Ej. Dombrock)
cuando no se dispone de antisueros.
5. Determinar la zigosidad exacta de células de Panel (Ej. Fy(a+b-)
puede ser Fy
a
/Fy
a
, Fy
a
/Fy, Fy
a
/Fy
x
.
6. Análisis del genotipo fetal: RhD, Rhc, K. Permite aplicar un
programa profiláctico racional.
La técnica más común es la PCR: PCR-ASRA, PCR-ASP, Discriminación
alélica con tecnología Taqman.
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Gracias por su atención
Barcelona vista desde el Parque Güell