You are on page 1of 9

PRODUCCIÓN DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA) POR Bacillus sp. UTILIZANDO GLICEROL COMO FUENTE DE CARBONO.

Analía Banacore1, Guadalupe Martínez, Verónica Saravia
Departamento de Bioingeniería – Instituto de Ingeniería Química Facultad de Ingeniería – UdelaR. Julio Herrera y Reissig 565 CP 11300 – Montevideo – Uruguay. Tel: (+5982)7110871 – Fax: (+5982)7115446

RESUMEN El actual interés en la producción de bioplásticos, surge de la búsqueda de sustitutos de los plásticos derivados del petróleo, de manera de disminuir su impacto ambiental, reduciendo su persistencia en el medio ambiente y utilizando recursos renovables. Los PHAs son bioplásticos de origen microbiano, biodegradables y producidos a partir de fuentes renovables. En el presente trabajo de estudió la utilización de glicerol como sustrato para la producción de polihidroxialcanoatos (PHA), por un Bacillus sp.a escala de matraces. Este fue capaz de crecer a partir de glicerol, obteniéndose hasta una concentración de biomasa de 2,2 g/L, para una concentración inicial de glicerol de 5 g/L en un medio mínimo definido,con una acumulación de PHA menor al límite de cuantificación.

INTRODUCCION En la actualidad el plástico es un recurso de uso diario, que a la hora de ser desechado genera un impacto ambiental importante. De aquí nace el interés a nivel mundial de sustituir los plásticos derivados del petróleo por bioplásticos. Estos presentan la ventaja de ser biodegradables y a su vez provenir de recursos renovables. Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros biodegradables, producidos por algunos microorganismos como material de reserva de carbono y energía, que son almacenados en forma de gránulos en el citoplasma celular. La acumulación de PHA en algunas bacterias ocurre cuando existe en el medio una limitación en un nutriente esencial como N, P, Mg, O, K o S y exceso de fuente de carbono. También existen bacterias que no requieren una limitación nutricional, ya que la acumulación en estos casos se encuentra asociada al crecimiento (1).

1

naniuy@hotmail.com

acidos grasos libres. radiación ultravioleta y es impermeable al oxígeno (4). Medio de cultivo: El medio de cultivo esta constituido por: Na2HPO4 4. se intenta utilizar como sustrato de producción materiales renovables de bajo valor comercial como por ejemplo glicerol. y por consiguiente es de mayor interés industrial (6). metil esteres de acidos grasos y algunas trazas de sales (7). CaCl2H2O 0. el co-polímero que contiene PHB y PHV (polihidroxivalerato) es más flexible y resistente. El glicerol utilizado para componer los medios fue glicerol puro para análisis (Merck). y la determinación de la relación C/N más favorable respecto a la producción de PHB.5 g/L. Distintas cepas de Bacillus han mostrado características interesantes para aplicaciones industriales. MATERIALES Y MÉTODOS Microorganismo: El Bacillus sp.La capacidad de acumular PHA se ha detectado en varios géneros de bacterias. MgSO47H20 0. es el más conocido y caracterizado de los PHA. en estas bacterias la acumulación máxima de polímero se da justo previo a la esporulación. Los objetivos específicos son: la optimización de la concentración de glicerol en el medio para el crecimiento de Bacillus sp. El tiempo estimado para la degradación de PHB varía de algunos meses (en medio anaerobio) a años (en agua marina)(5). dado que poseen propiedades mecánicas similares a varios termoplásticos sintéticos(3). los PHA son fuertes candidatos para sustituir a los plásticos derivados del petróleo.06 g/L.45 g/L. La cepa se mantiene en TSB con 20% de glicerol a -70°C. Citrato de Amonio y Hierro III 0. es una desventaja para el desarrollo de este proceso (2) Entre los biopolímeros. fue aislado de un efluente lácteo por el Departamento de Bioingeniería de la Facultad de Ingeniería y seleccionado como productor de PHA en diversas fuentes de carbono. El medio de cultivo se esterilizó en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. El PHB es resistente al agua. a partir de glicerol como fuente de carbono. degradándose a lo largo de la misma. Las propiedades del material y por consiguiente su aplicación. como un crecimiento rápido en sustratos baratos. PHB. Sin embargo. Con el fin de disminuir el valor de producción de los PHA. Sin embargo. KH2PO4 1. (NH4)2SO4 1g/L. dentro de las cuales se encuentra Bacillus. El polihidroxibutirato. .01 g/L y 1 mL/L de metales traza. varían dependiendo de la composición del monómero. El glicerol crudo esta compuesto principalmente por glicerol. frente a los plásticos de origen petroquímico. Este hecho. un desecho de la industria de biocombustible. El objetivo de este trabajo es el estudio de la producción de polihidroxibutirato (PHB) por Bacillus sp.2 g/L. La gran desventaja que poseen los bioplásticos actualmente es el mayor costo de producción de los mismos.

Se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determinaron las concentraciones de glicerol y sulfato de amonio remanentes. en matraces de 2 L (300 mL) en un agitador orbital a 250 rpm y 35°C. 5.Optimización de fuente de carbono: Las concentraciones de glicerol ensayadas fueron: 1. Cuantificación de PHA: Los pellets obtenidos se secaron y se sometieron a un proceso de hidrólisis y propanólisis basado en el método prouesto por Riis et al. Cuantificación de amonio: La concentración de amonio residual fue realizada mediante un método potenciométrico con un electrodo de ion selectivo de amonio (Orion) y se expresa como g/L de (NH4)2SO4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Evaluación de la concentración óptima de glicerol Se realizaron ensayos preliminares en placa observándose que el Bacillus sp era capaz de crecer utilizando glicerol como fuente de carbono y presentaba acumulación de PHA . biomasa y PHA. utilizando agua MilliQ como eluente. Optimización de relación carbono/nitrógeno (CN): Para la concentración de glicerol óptima. Procedimientos analíticos: Cuantificación de Biomasa: La densidad celular se determinó mediante medidas de turbidometría a 600nm en espectofotómetro (Unico). (8) para la posterior cuantificación de los propil-esteres mediante cromatografía gaseosa. 11 y 17. equipado con una columna Agilent DB-WAX (30m x 0. Se tomaron muestras a diferentes tiempos y se determinaron las concentraciones de glicerol remanente y de biomasa. que se modificó para cumplir con las relaciones mencionadas. 5.5 µm) y detector FID. 10. a un caudal de 0. Cuantificación de glicerol: Las muestras se centrifugaron y los sobrenadantes se utilizaron para la determinación de la concentración de glicerol residual mediante HPLC (Cromatografía líquida de alto rendimiento) con un equipo Shimadzu con una columna Shodex sugar KS-801 (8 mm x 300 mm) a 55ºC. con un GC Shimadzu. 20 y 30 g/L.7 mL/min. Se utilizaron PHB y PHBV (Sigma) como estándares. Los cultivos fueron realizados en matraces de 2 L. Se realizaron los cultivos por duplicado. manteniendo la composición del medio salvo la concentración de (NH4)2SO4. El gas carrier utilizado fue H2 y el volumen de inyección 1µL. (300 mL) en un shaker orbital a 250 rpm y 35°C. pH inicial 7.25mm x0. se ensayaron las relaciones CN: 2.

20 y 30 g/L. para cada una de las condiciones ensayadas. Figura 2. Concentración de glicerol remanente a lo largo del tiempo para las concentraciones de glicerol inicial ensayadas. observándose un leve aumento de la biomasa a las 20 horas llegando a 0. se obtuvo el menor crecimiento. . Como se observa en la Figura 1. Figura 1: Concentración de biomasa a lo largo del tiempo para las concentraciones de glicerol inicial ensayadas. respectivamente. En las figuras 1 y 2.6 g/L de biomasa que coincide con una concentración de glicerol remanente próxima al límite de detección del método de cuantificación. está de acuerdo con la disminución del glicerol a las 20 horas. El crecimiento observado.4 g/L. en matraces agitados con concentraciones de glicerol de: 1. se muestran los valores obtenidos de biomasa producida y concentración de glicerol residual. cuando la concentración inicial de glicerol fue de 1g/L. por lo que se propuso realizar el estudio cultivando el Bacillus sp.(tinción con Negro Sudán). como se muestra en la Figura 2. 10. se alcanzó a las 36 horas un crecimiento de1. llegando a una concentración próxima a 0 a partir de ese tiempo. 5. Para el ensayo con una concentración inicial de 5 g/L de glicerol.

20 y 30 g/L de glicerol.. se podría inferir que el flujo de carbono se dirige por vías metabólicas que no implican la producción de biomasa. salvo para el caso de mayor concentración de glicerol que alcanza el nivel de biomasa máxima a las 50 horas de cultivo. es decir el mejor aprovechamiento de sustrato para la máxima producción de biomasa. Debido a que la fuente de carbono está en exceso en los ensayos con concentraciones superiores a 5 g/L. Para estudiar la acumulación de PHA por parte del Bacillus sp. se observa que para las concentraciones iniciales de glicerol mencionadas. Evaluación de relación CN Varios trabajos con bacterias del género Bacillus han reportado la importancia que la relación CN tiene en la capacidad de acumular PHA (4.Para evaluar la influencia de la relación CN para el Bacillus sp. Hay que considerar que el medio formulado es un medio mínimo. 11 y 17. se puede concluir que no existe una inhibición del crecimiento al aumentar la concentración de glicerol inicial. y se obtuvo una concentracion de biomasa similar. sería necesario complementarlo. por lo que para lograr mayores rendimientos. 5.En los ensayos a concentraciones de 10.25 0. . 20 y 30 g/L. registrándose un consumo de 5. por ejemplo con medios complejos (3. Tabla 1. 5 y 6).18 0. A partir de las 36 horas no se observan diferencias significativas. En la Figura 2. ya que a dicha concentración se obtuvo el mayor Yx/s. Rendimientos de producción de biomasa respecto al consumo de sustrato Glicerol (g/L) 1 5 10 20 30 YX/S (g/g) 0. se tomó la concentración de 5 g/L de glicerol. El mayor rendimiento de biomasa (0. . siempre existió glicerol residual. se presentan en la tabla 1. 5). se ensayaron las siguientes relaciones CN: 2. se observa una velocidad de crecimiento menor.dado que a las 20 horas se obtienen concentraciones de biomasa menores que para el caso de 5g/L de glicerol.25 g/g) se obtuvo para la concentración 5 g/L de glicerol en el medio de cultivo.09 0. Dado que se observaron diferentes consumos de glicerol para los ensayos de 10.15 A partir de este grupo de ensayos. 7 y 10 g/L de glicerol respectivamente. el crecimiento obtenido podría estar limitado por algún otro nutriente que no se encuentra en la cantidad suficiente en el medio definido presentado en la sección anterior.23 0. Los rendimientos de producción de biomasa en función del glicerol consumido (Yx/s) para cada uno de los ensayos.

5 11 y 17. 4 y 5. 5 11 y 17. es aquella en que se tiene la mayor concentración de amonio inicial. lo cual no se explicaría por limitación de nutrientes. Figura 3: Contenido de biomasa en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2. Esta concentración podría ser inhibitoria.En las Figuras 3. Figura 4: Contenido de glicerol residual en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2. respectivamente. La relación CN 2. El crecimiento obtenido es menor al registrado en los ensayos anteriores. ya que el N está en exceso y el resto de los componentes se mantuvieron en las concentraciones especificadas. La concentración de sulfato de amonio fue 5 veces mayor con respecto a la que se utilizó en los ensayos anteriores. explicando de esta forma el . se presentan la biomasa producida . el glicerol y sulfato de amonio remanentes.

presentan un comportamiento similar en lo que respecta a la formación de biomasa y el consumo de amonio. lo que hace suponer un cambio en la composición celular o en el metabolismo del microorganismo.2 g/L. Figura 5: Contenido de sulfato de amonio residual en los matraces en el tiempo de cultivo para las relaciones de CN: 2. al. Al aumentar la relación CN a un valor de 5. para CN 11 y 17 respectivamente.45 g/L.1 g/L. A dichos tiempos también se observa la máxima remoción de amonio. la cantidad de N agregado es menor. pero el porcentaje de nitrógeno removido es mayor. La fuente de nitrógeno se comportó como sustrato limitante para las relaciones CN 11 y 17.7 g/L y 0.7 y 1. con valores de 1. En el caso de la relación CN2. es decir disminuir la concentración de N con respecto al C. el sulfato de amonio podría haber actuado como inhibidor del crecimiento.4 g/L inhiben el crecimiento y puede ser responsable del comienzo de la fase estaconaria de Bacillus megaterium. En las figuras 3 y 4. El consumo máximo de amonio fue de 0. llegando a valores de 2. Sabra et. El consumo de sulfato de amonio a las 40 horas fue de 0. permaneciendo la concentración residual sin variación hasta el final del tiempo de cultivo.(9) reportó que concentraciones de amonio mayores a 0. Aunque la concentración mínima inhibitoria de crecimiento de fuente de nitrógeno depende del orígen de la fuente y de cada microorganismo. con una remoción del 83% del glicerol (figura 4). Al aumentar la relación CN.comportamiento observado. . En ambos casos se llega a una concentración de biomasa máxima a las 20 horas de cutlivo. la inhibición por sulfato de amonio ya ha sido reportada con anterioridad en Bacillus. 5 11 y 17. se observa que las relaciones de CN 11 y 17. se obtuvo la máxima cantidad de biomasa formada. La relación CN que permitió alcanzar una mayor concentración de biomasa fue la de 5 g/L .65 g/L respectivamente.

Esta capacidad de producción de PHB-co-HV por parte de un Bacillus sp.P. se constataron dos picos a tiempos de retención que corresponden a los esteres propílicos de butirato y valerato. HuG. HoKP and ChenGQ. que corresponde a un 5%. encontrándose por encima del nivel de detección pero por debajo del nivel de cuantificación. HuangH. por lo que se debe seguir estudiando otras condiciones que afectan el crecimiento y acumulación de PHA.a partir de glicerol. en Bacillus sp. Ivana Martins. 3. no es posible una cuantificación certera. T. C. Por todo lo anterior. S.. fue capaz de crecer a partir de glicerol. Misra.etc. En algunas de las muestras. dado que esas situaciones inducen la esporulación.2 g/L para la concentración de glicerol de 5 g/L. Roy: Large scale production and efficient recovery of PHB with desirable material propierties.R. Wu et al (2). A lo largo de todos los cultivos se verificó presencia de esporas mediante la tinción de frotis con verde malaquita. siendo de 5 % . Tito Lívio Moitinho Alves. A. Las relaciones de CN menores. 2-WuQ. Bucke. la concentración de PHA producida por esta bacteria. Marco António Záchia Ayub. Se determinó que para la relación CN 5 se obtiene mayor acumulación de PHA. en un medio mínimo definido. Production of poly-3hydroxybutyrate by Bacillus sp. REFERENCIAS 1-Débora Jung Luvizetto Faccin.). bajo las condiciones estudiadas es muy reducida. JMa5 cultivated in molasses media. Keshavarz.En lo que respecta a la producción de PHA. Nilo Sérgio Medeiros Cardozo. producen incluso menor acumulación de PHA. Rossano Gambetta and Argimiro Resende Secchi: Optimization of C:N ratio and minimal initial carbon source for poly(3-hydroxybutyrate) production by Bacillus megaterium. mostró que a diferencia de los cultivos estándar para la producción de PHA con altas relaciones CN (por ejemplo Ralstonia eutropha. CONCLUSIÓN El Bacillus sp. Se obtuvo una concentración de biomasa de 2. 84:1756-1761.S. J Chem Technol Biotechnol 2009. ChenJ. Rosane Rech. from . podría llegar a acumular dos monómeros distintos de PHA. La confirmación de la estructura molecular del PHA almacenado por este microorganismo podría incremenentar el interés por el desarrollo de un sistema de producción. era difícil promover la acumulación de PHA. Antonie van Leeuwenhoek 80:111–118 (2001). Pseudomonas putida. en caso que se confirme la presecia de PHV. se observó que los valores obtenidos por cromatografía gaseosa fueron muy bajos. Valappil. Se evidenció que el Bacillus sp. ya ha sido reportada con anterioridad (10) Debido a la baja proporción de PHA. Boccaccini.K. El mayor porcentaje de acumulación de PHA se determinó en la relación CN 5. I.

Cardona: Design and analysis of poly-3-hydroxybutyrate production processes from crude glycerol. 308-318 10-S. 285– 289. Halami: Production of polyhydroxyalkanoate from starch by the native isolate Bacillus cereus CFR06.the newly characterized Bacillus cereus SPV. Technol. Carlos Ricardo Soccol and Ashok Pandey: Polyhydroxybutyrate Production using Agro-industrial Residue as Substrate by Bacillus sphaericus NCIM5149. Arch. Abou-Zeid. J Ind Microbiol Biotechnol (2009) 36:837–843. 4.V. Carlos A. 6. A novel Bacillus sp. Srivastava: Computer simulated fed-batch cultivation for over production of PHB:A comparison of simultaneous and alternate feeding of carbon and nitrogen. 445. Estudiante de tesina de grado en el Departamento de Bioingeniería de Facultad de Ingeniería. 7.K. Analia Banacore. 24:805-812. Mai. . 3 (5). Higuita. estudiante de Licenciatura en Ciencias Biológicas opción Biotecnología y Licenciatura en Bioquímica.M. J. S. Research Journal of Microbiology (2008). 8.John A. Improving feeding strategies for maximizing polyhydroxybutyrate yield by Bacillus megaterium. Naranjo. Riis. Javier M. Biochemical Engeneering Journal 27(2006) 197-203. 9-W. A.Process Biochemistry 46 (2011) 310-317.-hydroxybutyric acid in microbiol biomass after hydrochloric acid propanolysis. M. World J Microbiol Biotechnol 2008. Braz. Juan C. 1988. Posada. Biol.1:pp.Prakash M. Vishnuvardhan Reddy. Journal of Biotechnology 132 (2007) 251258. Chromatogr. Mahmood. Gas chromatographic determination of poly. K.52 n. Jimmy A.Shilpi Khanna.17-23. V. Lopez. Jan/Feb 2009. 5-Nisha V Ramadas. Thirumala. W. Sudheer Kumar Singh. accumulating poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from a single carbon substrate. Sabra y D.