You are on page 1of 24

Seminario 4

Nocións de Bioloxía Molecular

S4

A Bioloxía Molecular
A Bioloxía Molecular ocúpase da comprensión dos mecanismos responsables da transmisión e da expresión da información xenética. Esta información xenética determina a estrutura e a función das células.

Defectos na pigmentación (piebaldismo) como resultado da mutación dun xen necesario para a migración normal das células responsables da pigmentación

A expresión dun só xene pode leva á formación de ollos en posicións inusuais

secuenciar e manipular xenes individuais derivados de calquera tipo celular .S4 ADN recombinante ¿Cómo illar e estudar xenes individuais? A tecnoloxía do ADN recombinante permite illar.

S4 ADN recombinante O primeiro paso no desenvolvemento desta tecnoloxía foi a caracterización das endonucleases de restricción: encimas que cortan o ADN en lugares específicos da súa secuencia Encimas de restricción que cortan en lugares específicos neste fragmento de ADN .

S4 Xeración de moléculas de ADN recombinante ADN recombinante A estratexia básica consiste en insertar un fragmento do ADN de interés nunha molécula chamada vector que se replica de forma independiente nunha célula hospedadora. .

un xen que lle confire resistencia á ampicilina (Ampr) e varios sitios de restrición (EcoRI. de maneira que só as que teñen plásmido sobreviven. no exemplo) que se poden usar para insertar distintos fragmentos de ADN. ¡¡¡millóns de copias deste ADN!!!! . As bacterias cultívanse nun medio con ampicilina. Cada colonia pode illarse e facerse medrar en grandes cantidades para illar os plásmidos recombinantes.S4 Bibliotecas de ADN ADN recombinante O plásmido (ADN circular que se replica independentemente do cromosmoma bacteriano) ten unha orixe de replicación (ori).

S4 Bibliotecas de ADNc ADN recombinante .

ADN total ou ADNc dunha célula PCR Polimerase da bacteria termoestable Thermus aquaticus PCR: Reacción en cadea da polimerase. O número de secuencias aumenta de forma exponencial. 30 ciclos de amplificación = 230 copias (uns mil millóns). . É un método alternativo para conseguir in vitro un gran número de fragmentos de material xenético a partir dunha soa copia de ADN.S4 ADN clonado. doblándose en cada ciclo.

be/~avierstr/principles/pcrani.html .S4 PCR http://users.ugent.

S4 Secuenciación de ADN A obtención de grandes cantidades de material xenético permite o seu estudo detallado. incluído a determinación da súa secuencia. .

S4 ADN recombinante .

S4 Hibridación de ácidos nucleicos A Hibridación In Situ permite localizar secuencias concretas de ácidos nucleicos (ADN ou ARN) nas células que os conteñen. É unha técnica con alta sensibilidade. . pois permite detectar unha secuencia vírica nunha soa célula dun tecido.

antisentido. Estabilidade: ADN-ADN < ADN-ARN < ARN-ARN .S4 Hibridación de ácidos nucleicos A HIS baséase na formación de híbridos en células (ou fraccións subcelulares) entre: . e portadora dun marcador que permita visualizala. a cadea do ácido nucleico investigado (ADN ou ARN) . unha sonda (de secuencia coñecida) complementaria.

P33.Inmunohistoquímica se o marcador da sonda ten propiedades antixénicas (HIS NON RADIACTIVA) . H3) Marcadores antixénicos: Son moléculas de tipo antixénicos acopladas químicamente ás bases nitroxenadas: Biotina (vitamina H) Digoxixenina (similar aos esteroides) Fluoróforos (Fluoresceína e Rodamina) A elección do marcador determina os sistema de revelado de híbridos que se empregará: .Autorradiografía no caso de sondas radiactivas (HIS RADIACTIVA) . ou modificados por adición dunha molécula antixénica Marcadores radiactivos: Isótopos radiactivos que emiten radiacións . P32.(S35.S4 Hibridación de ácidos nucleicos Marcadores: nucleótidos portadores de isótopos radiactivos.

S4 Detección da hibridación in situ Hibridación de ácidos nucleicos .

A imaxe mostra un color artifical xenerado por ordenador (variacións pequenas na lonxitude de onda de emisión de distintos fluoróforos poténcianse e móstranse como colores primarios distintos). Esto fai que resulte sencillo detectar delecións e translocacións entre cromosomas. . A combinación de sondas que hibridan só cun cromosoma particular produce un patrón único para cada cromosoma.S4 Hibridación de ácidos nucleicos Sondas de ADN específicas de distintas rexións de distintos cromosomas.

S4 WT Six3-/WT Hibridación de ácidos nucleicos Six3-/- Nos embrións Six3-/.falta o prosencéfalo .

Vermello: C>N Amarelo: C=N Verde: C<N . O ARN extraído de 2 tecidos que queremos comparar úsase como molde para sintetizar ADNc marcado con moléculas fluorescentes (exemplo: vermello para tecido canceroso e verde para tecido normal). Baséanse na obtención de sondas para os xenes que queremos identificar nun soporte sólido de maneira ordeada. Mediante un programa de análise de imaxe poden obterse os valores numéricos asociados a cada un dos puntos. A intensidade da fluorescencia emitida en cada punto é proporcional ao nivel da expresión do xen no tecido de partida. 1. Fabrícanse microarrays con fragmentos de ADN depositadas por un robot nunha placa multipocillo. Despois da hibridación realízase un escáner da fluorescencia e obtense unha imaxe da superficie do mesmo. Cada punto representa un xen determinado (máis de 10.S4 Hibridación de ácidos nucleicos Microarrays de ADNc.000 secuencias por microarray). 2. 3. Hibrídase cada placa 2 veces (unha co ARN de cada tecido).

S4 Análise funcional Expresión ectópica de un xen: inxección de ARNm .

S4 Análise funcional .

a expresión ectópica dun xen bloquea a división celular -Inxección en 1 blastómero -O ARNm distribúese uniformemente entre as células fillas -O número de células contabilízase de forma automatizada .S4 Análise funcional Neste exemplo.

S4 Perda de función : MO oligonucleotidos antisentido Análise funcional Ol-Gadd45 MO_Ol-Gadd45 5’-ATGACTTTCGAGGAGGTTCCGATCC-3’ 5’-GGATCGGAACCTCCTCGAAAGTCAT-3’ .

S4 Análise funcional No caso de Gadd45. a disminución da cantidade de proteína causa o aumento de morte celular. .

.S4 ¿Son correctas as seguintes afirmacións? Explica a resposta. o ADNc do cerebro é igual ao ADNc do pulmón. Para construir unha biblioteca de ADNc necesítase unha transcriptase inversa pero non é necesaria a ADN polimerase 4. Cuestionario 1. A inxección de oligonucleótidos antisentido aumenta a mortalidade das células. 5. No mesmo individuo. A PCR usa unha polimerase termoestable debido a que para cada etapa de amplificación a dobre cadea de ADN debe desnaturalizarse por calor 3. As nucleases de restrición cortan o ADN en sitios específicos que sempre se sitúan entre os xenes 2.