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La replicación de ADN en Escherichia coli

BY MATTHEW MESELSON AND FRANKLIN W. STAHL
GATES AND CRELLIN LABORATORIES OF CHEMISTRY, t AND NORMAN W. CHURCH LABORATORY OF CHEMICAL BIOLOGY, CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY, PASADENA, CALIFORNIA

Communicated by Max Delbrick, May 14, 1958

Introduction.-Estudios de la transformación bacteriana y bacteriaphage infection indican fuertemente que el ácido desoxirribonucleico (ADN) pueden portar y transmitir tario heredi información y puede dirigir su propia replicación. Las hipótesis para el mecanismo de la replicación del ADN difieren en las predicciones que toman en relación con la distribución entre moléculas de progenie de átomos derivados de moléculas parentales. Marcadores radioisotópicos se han empleado en los experimentos que influyen en la distribución de los átomos ción parentales entre moléculas de progenie en varios organismos. Nosotros anticipa que una etiqueta que imparte a la molécula de ADN una mayor densidad podría permitir un análisis de esta distribución mediante técnicas de sedimentación. Para este final, se desarrolló un método para la detección de pequeñas diferencias de densidad entre los

Fotografías de absorción ultravioleta mostrando sucesiva etapas en las bandas de ADN a partir de E. .410 rpm.410 rpm en una solución de CsCl como se describe en el texto. Distancia desde el eje de rotación aumenta hacia la derecha. El número al lado de cada fotografía le da el tiempo transcurrido después de llegar a 31.La figura 1. coli. Una alícuota de lisado bacteriano que contiene aproximadamente 108 células lisadas se centrifugó a 31.

cada una formará una banda en la posición donde la densidad de la solución de CsCl es igual a la densidad de flotación de esa especie. hemos observado la distribución del isótopo de nitrógeno pesada N15 entre moléculas de ADN tras la transferencia de un N ". 1). Densidad-centrifugación en gradiente de -.. la población bacteriana uniformemente 5 marcado con crecimiento exponencial a un medio de crecimiento que contiene el isótopo de nitrógeno ordinaria N'4. con el resultado de que en el equilibrio una sola especie de ADN se distribuye en una banda cuya anchura está inversamente relacionada con el peso molecular de la especie (fig. ' Esta tendencia de concentración se opone por difusión. Los gradientes de concentración y de presión dan lugar a un aumento continuo de la densidad a lo largo de la dirección de la fuerza centrífuga. En esta forma de ADN marcada con nitrógeno pesado (N15) puede ser La figura.770 rpm b:. Una pequeña cantidad de ADN en una solución concentrada de cloruro de cesio se centrifugó hasta equilibrio se acercó estrechamente. La separación entre los picos corresponde a una diferencia en la densidad de flotación de 0. Si varias especies de densidad diferentes de ADN están presentes. se centrifugó en una solución de CsCl como se describe en el texto La fotografía fue tomada después de 24 hounrs de centrifugación a 44. cm. Los procesos opuestos de la sedimentación y difusión entonces han producido un gradiente de concentración estable del cloruro de cesio. '0 Mediante el uso de este método.014 g. 2-a: La resolución de ADN N14 de N "1 de ADN por centrifugación de densidad-gradtient. 2a.macromoléculas. Fig. cada uno conteniendo aproximadamente 10" células lisadas. Una mezcla de N'4 y N "1 lisados bacterianos. Las macromoléculas de ADN presente en este gradiente de densidad son impulsados por el campo centrífugo en la región donde la densidad de la solución es igual a su propia densidad de flotación. Un trazado microdensitómetro que muestra la distribución de ADN en la región de las dos bandas de. .

Una discusión se ha dado "'de las consideraciones en las que dichas determinaciones se basan. 3. se llevó a cabo medio N14 añadiendo al cultivo en crecimiento de un exceso de diez veces de N14H4Cl. para dar una concentración de L 10 g / ml de cada ribósido.5 ciento de pureza isotópica por.81 horas en el Experimento 1 y 0. con aireación en un medio que contiene glucosa sales de cloruro de amonio como única fuente de nitrógeno. así como de varias fuentes posibles de error. guanina. Las bacterias marcadas uniformemente con N "5 fueron preparados por células lavadas en crecimiento durante 14 generaciones (a un título de 2 X 108/ml) en medio que contiene 100. A partir de entonces. Durante el período de muestreo para la densidad de gradiente de centrifugación. .-Escherichia coli B fue aumentado a 360 C. durante el período en que se están retirando muestras para la densidad de gradiente de centrifugación. el título real se mantuvo entre 1 y 2 X 108 por adiciones de medio fresco. Un cambio brusco de a continuación. Experimental. 3). ug / ml de N'5H4Cl del 96.-El crecimiento de las poblaciones bacterianas primero en N15 y N14 en el medio. "El crecimiento de las bacterias) la población fue seguido por el recuento de células microscópicas y por ensayos de colonias (Fig. Durante el crecimiento posterior del título bacteriana se mantuvo entre La figura. uracilo.resuelto a partir de ADN no marcado. Los valores de las ordenadas dan los títulos reales de los cultivos hasta el momento de la adición de N'4. el tiempo de generación era 0. citosina y en el experimento 2. La Figura 2 muestra las dos bandas formadas como resultado de la centrifugación de una mezcla de cantidades aproximadamente iguales de N14 y N15-ADN coli Escherichia. En este papel referencia se hará con el peso molecular aparente de las muestras de ADN se determina por medio de gradiente de densidad de centrifugación. Los valores de las ordenadas durante este último período se han corregido para los retiros y adiciones.85 horas en el Experimento 2. junto con ribosides de adenina y uracilo en el experimento 1 y ribosides de adenina.

3. La densidad de la Solución de CsCl aumenta hacia la derecha. El tiempo de muestreo se mide desde el momento de la adición de Ni4 en unidades del tiempo de generación. las células se lisaron por la adición de 0. Regiones de igual densidad ocupan la misma posición horizontal en cada fotografía.1 y 2 X 108/ml por adiciones apropiadas de mediano contiene ribosides N14 frescas.40 ml. Las muestras que contienen alrededor de 4 X 109 bacterias se retiraron de la cultura justo antes de la adición de N14 y después a intervalos de varias generaciones. de 15 por ciento de dodecil-sulfato de sodio y se almacena en el frío.01 Min. de una solución fría 0. etilendiamina tetra-acetato (EDTA) a pH 6. 6 trazados micro densitómetro de la Bandas de ADN se muestran en las fotografías adyacentes.10 ml. La figura4-a : Fotografías de absorción ultravioleta que muestran las bandas de ADN que resultan en gradientes de densidad centrifugación de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos después de la adición de un exceso de sustratos NI4 a un Ni creciente "cultura de la etiqueta. El grado de etiquetado de un especies de ADN corresponde a la posición relativa de su banda de entre las bandas de . Después de la resuspensión en 0. Los tiempos de generación para los Experimentos 1 y 2 se estimaron a partir las mediciones de crecimiento bacteriano presentan en la figura.01 M en NaCl y 0. El desplazamiento de la pluma microdensitómetro arriba la línea de base es directamente proporcional a la concentración de ADN. Cada muestra fue inmediatamente refrigerada y centrifugada en el frío durante 5 minutos a 1800 x g.770 rpm en las condiciones descritas en el texto. Cada fotografía fue tomada después de 20 horas de centrifugación a 44.

y se encontró ADN completo sin etiqueta. mientras que el ADN marcado se agote completamente. media etiqueta y sin etiqueta de ADN se encuentran presentes en cantidades iguales.70 ml." picos. La densidad de la solución resultante fue de 1.770 rpm) en un modelo Spinco E ultracentrífuga a 250 durante 20 horas. cm. de solución de CsCl tamponada a pH 8. Es decir. 4). El error en este procedimiento para la determinación del grado de etiquetado se estima en alrededor del 2 por ciento. Las bandas de ADN fueron entonces encontraron en la región de densidad de 1. Uno tiempo de generación después de la adición de N 14. que sirve como referencia de densidad. las subunidades se conservan. Para gradiente de densidad de centrifugación.5 con 0. Cuando se toma en cuenta la relación cantidades de ADN en los tres picos. momento en el que el ADN había alcanzado esencialmente equilibrio de sedimentación. Discusión -. La densidad de flotación de una molécula de ADN puede esperarse que varíe directamente con la fracción de etiqueta N15 que contiene.71 g. sólo la etiqueta media. Por lo tanto. 0. las moléculas se acumulan halflabeled. El nitrógeno de una molécula de ADN se divide por igual entre dos subunidades que permanecen intactas a través de muchas generaciones. el pico de densidad intermedia se encuentra para ser centrado en 50 ± [2 por ciento de la distancia entre el N "y NI. La observación de que los padres de nitrógeno se encuentra sólo en moléculas de medio marcado en todo momento después del paso de un tiempo de generación demuestra la existencia en cada molécula de ADN de dos subunidades que contienen cantidades iguales de nitrógeno. .000 x g. Cuando hayan transcurrido dos tiempos de generación después de la adición de N'4. El gradiente de densidad es constante en la región entre las bandas de ADN totalmente etiqueta y etiqueta. Fotografías de absorción ultravioleta tomadas durante el curso de cada centrifugación fueron escaneados con un densitómetro de grabación (Fig.010 MNL. Posteriormente. Estos resultados permiten las siguientes conclusiones que se pueden extraer en relación con la replicación del ADN en las condiciones del presente experimento. el grado de etiquetado de una especie parcialmente la etiqueta de ADN se puede determinar directamente a partir de la posición relativa de su banda de entre la banda de ADN totalmente marcado y la banda de ADN no marcado. Resultados -. éstos-media etiquetados o se observan moléculas "híbridos" por sí solo. del lisado dodecil sulfato se añadió a 0. Una prueba de la conclusión de que el ADN en la banda de densidad intermedia sólo está etiquetada medio-es proporcionada por el marco que muestra la mezcla de generaciones 0 y 1. El hallazgo de que en la segunda generación de moléculas de media etiqueta y etiqueta son encontrado en cantidades iguales muestra que el número de sobrevivir subunidades de los padres es dos veces el número de moléculas parentales inicialmente presente. 1. está aislado del resto de los componentes macromoleculares de lisado bacteriano. (44. que el ADN.marcado totalmente y ADN no marcado se muestra en el marco más inferior. Figura 4 muestra los resultados de la centrifugación en gradiente de densidad de lisados de bacterias en la muestra a diversos tiempos después de la adición de un exceso de sustratos N'4-que contienen a un N1 creciente "marcado cultura Se puede ver en la Figura 4. cm.9. hasta que ha transcurrido el tiempo de generación en generación. .71 g.-3.-3 Esto se centrifugó a 140.01 M de tris (hidroximetil) aminometano.

de acuerdo con whicheach molécula de los padres le transmite a la progenie de dos subunidades de moléculas y cada molécula de progenie recibe sólo una subunidad de los padres. "7 La estructura consta de dos cadenas de polinucleótidos enrolla helicoidalmente alrededor de un eje común. respectivamente. 5. recogidas en nitrógeno de subunidades. Esta declaración es un corolario de conclusiones 1 y 2 anteriores. subunidad de los padres. 4 Si las subunidades de los padres se habían separado de cualquier otro modo entre las moléculas hijas. Los resultados acto replicativa en una duplicación molecular. La base de nitrógeno (adenina. cada molécula hija recibe . o citosina) en cada nivel La figura. guanina.2.-Una estructura molecular de ADN ha sido propuesto por Watson y Crick. que representan a esas hijas que recibieron dos o no hay subunidades de los padres. Las conclusiones anteriores se representan esquemáticamente en la figura 5.El de Watson-Crick Model. Followinq replicación. no se habría encontrado en la primera generación de algunos totalmente etiquetados y algunas moléculas de ADN sin etiqueta.15 Se ha sometido a refinement'6 preliminar sin alteración de sus características principales y está apoyado por físico y estudios de química. 4. De ello se desprende que cada uno individuales resultados acto reproductivo moleculares en una duplicación del número de moléculas que entran en ese acto. cada molécula hija ha recibido una El hallazgo de que todas las moléculas de ADN son el tiempo-medio marcado una generación después de la adición de N'4 muestra que cada molécula hija recibe una subunidad parental ".-representación esquemática de las conclusiones el texto de los datos presentados en la figura. 3. El cada molécula de ADN se divide por igual entre dos Después de la duplicación. timina.

Cada molécula hija contiene una de las cadenas de los padres (negros) se combina con una cadena nueva (blanco). se conservan a través de en una cadena es hidrógeno unido a la base en el mismo nivel en la otra cadena. cada cadena sirve como plantilla para la síntesis de su complemento. cada molécula hija contiene una de las cadenas parentales emparejados con una cadena recién sintetizada (fig. que se resume a continuación. dando como resultado una complementariedad detallada entre las dos cadenas. Por consiguiente. Los resultados del presente experimento concuerdan exactamente con las expectativas del modelo de Watson y Crick para la duplicación del ADN. se debe enfatizar que no se ha demostrado que las subunidades moleculares que se encuentran en el presente experimento son cadenas de polinucleótidos individuales o incluso de que las moléculas de ADN estudiaron aquí corresponden a las moléculas de ADN individuales que poseen la estructura propuesta por Watson y Crick. Las subunidades duplicaciones sucesivas. 6). Requisitos estructurales permiten la aparición de sólo la base de enlaces de hidrógeno pares de adenina-timina y guanina-citosina. Esto sugirió a Watson y Crick "8 una hipótesis definida y estructuralmente plausible para la duplicación de la molécula de ADN. las dos cadenas se separan. De acuerdo con esta idea. la exposición de los sitios de enlace de hidrógeno de las bases. de acuerdo con las restricciones de emparejamiento de bases. las dos cadenas originales . Al continuar la duplicación. Sin embargo. 6 -.uno de estos. La figura. Entonces. Sin embargo. Ilustración del mecanismo de duplicación de ADN propuesto por Watson y Crick. alguna información se ha obtenido de las moléculas y sus subunidades.

y para el ADN de ternera-timo y de esperma de salmón purificada. en la región de densidades encontrados para el ADN del bacteriófago T2 y T4. 22 Rice y Doty22 han informado de que este colapso no va acompañada de una reducción en el peso molecular determinado a partir de dispersión de luz. Las moléculas de ADN derivadas de E. 21. cm-3. cada una con una cadena de los padres. coli por el método de Simmons19 seguido por desproteinización con cloroformo. ha encontrado calor que el ADN de E. La purificación adicional se llevó a cabo mediante dos ciclos de centrifugación gradiente de densidad preparativa en solución de CsCl. La solución altamente viscosa y elástica de ADN N14 se preparó a partir de un lisado de dodecil sulfato de E. 7. 8).23 de esperma de salmón Cuando este material es . 20. coli se diferencia importante a partir de ADN de esperma de salmón purificada en su comportamiento a la desnaturalización por calor. coli mediante lisis inducida detergente tienen una densidad de flotación en CsCl de 1. Es Denaturation. Estos resultados han sido corroborados por gradiente de densidad de centrifugación de DNA. 7 X 106. La exposición a temperaturas elevadas se conoce para provocar un colapso abrupto de la molécula de ADN nativa relativamente rígido y extendido y para poner a disposición para la titulación ácidobase de una gran fracción de los grupos funcionales que se presumen bloqueado por la formación de enlaces de hidrógeno en la estructura nativa. por lo que siempre se encontrarán dos moléculas.matrices permanecen intactos.71 gm. como el ADN de los lisados bacterianos (Figs. 19. Este ADN bacteriano purificado era encontrado que tienen la misma densidad de flotación y el peso molecular aparente.

. la pendiente en cualquier punto de una gráfica de este tipo es directamente proporcional al peso molecular promedio en peso de la ADN situado en la posición correspondiente en la banda.4 X 10. Sobre 2 fg.71 gm./cm. . La linealidad de este gráfico indica monodispersidad del ADN en bandas. se produce un aumento de la densidad de 0. cm -. En la ausencia de heterogeneidad densidad. la disminución en el tiempo de bandas debe ser ascribed10 a un aumento en el coeficiente de difusión.La figura.4.1 X 10.014 g. para la sal de sodio. g.-El cuadrado de la anchura de la banda de la figura.410 rpm a 250 en 7. La figura.057 gm. 7 trazan en función del logaritmo de la concentración relativa de ADN. / Ml. mantenido a 1000 durante 30 minutos.-microdensitómetro trazado de una fotografía que muestra la absorción en el ultravioleta densidad óptica en la región de una banda de N14 de E. Se obtienen los mismos resultados si el ADN de esperma de salmón se trata previamente a pH 6 con EDTA y dodecil sulfato de sodio. 'En este trazado la densidad óptica por encima de la línea de base es directamente proporcional a la concentración de ADN en elgiratoria celular centrífuga. Las divisiones a lo largo de la abscisa partieron intervalos de 1 mm. La posición del máximo indica una densidad de flotación de 1.75 molar de CsCl a pH 8. cm. lo que indica una extensa colapso de la estructura nativa.r3 sin cambio en el peso molecular aparente. correspondiente a un peso molecular de 7. El valor de la pendiente corresponde a un peso molecular aparente de la sal de Cs-ADN de 9. de calentamiento provoca una fuerte reducción en el tiempo requerido para la formación de la banda en el gradiente de CsCl.4. coli ADN en el equilibrio. 7. de ADN purificada como se describe en el texto se centrifugó a 31. El gradiente de densidad es esencialmente constante en la región de la banda y es 0. En el ausencia de un aumento en el peso molecular.2. ya sea en las condiciones empleadas por Rice y Doty o en el medio de centrifugación en CsCl. La concentración de ADN en el máximo es de aproximadamente 50. 8. Junto con el aumento de la densidad.

a) cuando un lisado bacteriano que contiene N marcado uniformemente "5 o ADN N14 de E. durante 30 minutos en el medio de centrifugación en CsCl. cm. Una mezcla de N14 calienta y se calienta N "lisados bacterianos La diferencia de densidad es 0. 9. La densidad de la línea de base se ha eliminado mediante sustracción. ADN marcado mitad contenida en un lisado de detergente de células de E. Una mezcla de N1 "lisados bacterianos calentadas y no calentadas lisado climatizada único que da una banda en la posición indicada lisado no climatizada esta en este experimento. .016 g. 9. 4 C:. coli se mantiene a 100 ° C .La figura. pero el peso molecular aparente Ofthe ADN bacteriano caliente se reduce a aproximadamente la mitad que el del material no calentado.770 rpm. coli N'5 cultivadas para una generación en medio N14 se calentó a 1000 C durante 30 minutos en el medio de . Se observan La disminución en el tiempo de bandas y un aumento de la densidad cerca de la que se encuentra tras el calentamiento de ADN de esperma de salmón (fig. A:.-La disociación de las subunidades de ADN de E. B: lisado climatizada de bacterias N16 cultivados para una generación en medio de crecimiento N14. como puede verse en la figura. el ADN híbrido contenida en este formas de lisado sólo una banda. para la comparación.015 g cm. Calefacción ha traído consigo un aumento de la densidad de 0.. Antes de desnaturalización por calor. coli a la desnaturalización por calor. -3 Y una reducción de alrededor de la mitad en el peso molecular aparente de la ADN. Cada curva suave conecta los puntos obtenidos por microdensitometría de una fotografía de absorción ultravioleta tomada después de 20 horas de centrifugación en solución de CsCl a 44.

mientras que el ADN bacteriano se disocia en las dos subunidades que se conservan durante la duplicación.-La estructura de ADN propuesto por Watson y Crick dio a luz una serie de propuestas sobre cómo esta molécula podría replicar. Los resultados presentados aquí dan una respuesta detallada a la pregunta de esta distribución y al mismo tiempo dirigir nuestra atención a otros problemas cuya solución debe ser el siguiente paso en el avance hacia una completa comprensión de la base molecular de la duplicación del ADN. Esta posibilidad fue probada por un examen gradiente de densidad de una mezcla de N'5 ADN climatizada y ADN N14 climatizada (fig. Conclusion. Estos resultados permiten a dos interpretaciones diferentes. cm. C) conduce a la conclusión de que los dos subunidades moleculares de hecho han disociado tras el calentamiento. y que las subunidades se conservan a través de muchas duplicaciones. El esquema para la duplicación del ADN propuesto por Delbrfick24 está gobernado por lo tanto fuera. Nos encontramos con que el nitrógeno de una molécula de ADN se divide en partes iguales entre dos subunidades físicamente continuos.015 gm. Por otro lado. entonces debemos conceder que la molécula de ADN bacteriano es una estructura más compleja de lo que es la molécula de ADN de salmón. ¿Cuáles son las estructuras moleculares de las subunidades de ADN de E. Este comportamiento sugiere que el calentamiento de la molécula híbrida produce la disociación de la subunidad NI5-que contiene de la subunidad N'4. Para recapitular. 9. La estrecha semejanza entre los productos de ADN de calentamiento híbrido (Fig. C).-mediante centrifugación en gradiente de densidad. coli que se transmiten intactas a cada molécula hija? ¿Cuál es la relación de estas subunidades entre sí en una molécula de ADN? ¿Cuál es el mecanismo de la síntesis y la disociación de las subunidades in vivo? Resumen. 9 B) y la mezcla de productos obtenidos a partir de calentar N14 y ADN N'5 por separado (Fig. que. Resultados de este tratamiento en la pérdida del material de medio marcado original y en la aparición de cantidades iguales de dos especies nuevas de densidad. Puesto que el peso molecular aparente de las subunidades así obtenidos se encontró que cerca de la mitad de la molécula intacta. . Cerca del mínimo de la producida por el etiquetado N'6 del ADN sin calefacción. 9. continuas. entonces debemos suponer que las subunidades de ADN de salmón están unidos entre sí con más fuerza que los de la ADN bacteriano. Por un lado. se puede concluir también que las subunidades de la molécula de ADN que se conservan en la duplicación son estructuras individuales. después de la duplicación. coli N'5 sustituido de manera uniforme a medio N'4. -. pero el ADN de salmón conserva su peso molecular inicial. hemos podido observar la distribución de N'5 entre las moléculas de ADN de la bacteria después de la transferencia de un crecimiento exponencial de la población de E. si se supone que las moléculas de ADN de salmón no contienen estas subunidades. La diferencia de densidad entre las dos especies es 0. Estas propuestas hacen predicciones específicas sobre la distribución de los átomos de los padres entre las moléculas de progenie. si suponemos que el ADN de salmón contiene subunidades análogas a las que se encuentran en el ADN de E. cada uno con aproximadamente la mitad del peso molecular aparente inicial (fig. coli. La última interpretación cuestiona la suficiencia del modelo de ADN de Watson y Crick para explicar la distribución observada de los átomos de nitrógeno de los padres entre la progenie moléculas. 9. cada molécula hija recibe uno de estos.centrifugación en CsCl. coli se calentó bajo condiciones similares colapso y someterse a un aumento de densidad similar. tanto de esperma de salmón y ADN de E. b).