INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a biotehnologiei în viaţa omului, în toate domeniile de activitate. Cu a utorul metodelor biotehnologice s-au făcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu însuşiri favorabile şi cu randamente sporite faţă de materialul de la care s-a plecat. !ezvoltarea biologiei moleculare din ultima umătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme simple ca mod de organizare "bacterii, dro dii, alge, etc.#, organisme unicelulare. $dată cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunile acumulate anterior erau valabile şi dacă e%istau şi alte procese specifice modului comple% de organizare. Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să se gândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar celule. &roblema care a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de la prelevarea de pe planta mamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe până la regenerarea "refacerea# unei noi plante. ' ungerea la cultura in vitro nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi multe cercetări, la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat. (n )**+, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizează substanţele ce determină formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primele încercări de culturi de ţesuturi au fost făcute în ),-+, de către .aberland, din nefericire, fără rezultatele dorite. &rimele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să apară din anul ),++, când /nudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in vitro iar 0obbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale. &e baza conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţine informaţia genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, în anul ),1+ 2orel şi 2artin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a e%plantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze. (n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitânduse şi degenerarea soiurilor din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă. (n anul ),3+, după mulţi ani de studii şi încercări, 2urashige şi S4oog, au reuşit să elaboreze un mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care 5 cu mici modificări 5 poate fi utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi. 0euşita e%perienţelor lui Co4ing în ),3- privind izolarea enzimatică a protoplaştilor din mezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producerea de hibrizi somatici. 'nul ),33 este considerat drept începutul etapei moderne a cercetărilor privind cultura de e%plante vegetale in vitro. 'ceastă etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea de tehnici eficiente în generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu a utorul protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici "electrofuziune, vectori virali transmiţători de gene izolate# s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi6 pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc. 'tât pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetică.

CAPITOLUL I 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI APLICABILITATE
1.1.1 Definiţie (n sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau celule vegetale. 0euşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în care e%plantul creşte. 7%plantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă "organ, ţesut, celulă# care se desprinde de pe planta donor "planta mamă#, şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură. 7voluţia e%plantului este diri ată de operator în funcţie de scopul urmărit. 'cesta poate evolua formând o nouă plantă "sau mai multe plante - neoplantule#, prin stimularea dezvoltării organelor aeriene "tulpina şi frunzele# şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor. 7%plantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. 8otipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o plantă identică cu planta mamă. 8eoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi e%prima acest caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule. 'stfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie ţesuturile, de e%emplu6 traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma şi nucleul, nu sunt totipotente. 'cest aspect este e%plicat chiar prin faptul că întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu. 9a plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. 0ămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. 'ceste celule sunt mici în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem. 2eristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini. 1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e #'&$'"i&(" in )i$"( Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de plantă "marcote, butaşi, altoi#, la multiplicarea in vitro se folosesc e%plante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice "celule, protoplaşti#, e%plante care în condiţii normale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. !in acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele condiţii6 -prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a e%plantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil e%plantelor:

-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu "temperatură, lumină, umiditate# în limitele optime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit: -stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere: -asigurarea unei asepsii depline pe tot flu%ul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flu% de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.* D(+enii ,e !-&i#!"e ! #'&$'"i&(" in )i$"( !atorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară, etc. (n agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari. 'vanta ele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim6 -asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantităţi mici de material vegetal. 8eoretic, se asigură o multiplicare e%ponenţială, prin care în circa 3 luni se pot obţine ) milion de plante: -se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce şi productiv: -necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe verticală pe ;-1 nivele suprapuse: -obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte e%plante de ţesuturi generative "cu n cromozomi#: -dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care în condiţii normale sunt imposibil de obţinut: -selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători: -se evită efectul sezonier de pepinieră: -se pot obţine seminţe artificiale: -se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire: -asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale de cultură: -asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avanta e, e%istă specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care, deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional. 7%istă însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a plantelor, cum ar fi6 -necesitatea unui laborator cu dotările minime6 instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare: -necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro: -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie: -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la metodele cunoscute de multiplicare: -e%istă riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor:

-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele specii.

1. PROCESE .ORFOFIZIOLOGICE E/PLANTELOR CULTIVATE IN VITRO

LA

NIVELUL

7%plantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică, se vor integra noilor condiţii de viaţă, îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un nou ciclu de viaţă. (n dependenţă de mediul de cultură, de natura inoculilor, de seria de operaţiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculări, de condiţiile de cultură şi de scopul urmărit, după dediferenţierea celulelor şi regenerarea de noi celule, evoluţia acestora poate fi diri ată. <noculii pot fi menţinuţi într-o stare primară de organizare cum ar fi6 culturi de celule în suspensie "fără a intervenii formarea de agregate celulare# sau de calus, ori pot fi induse procese de citodiferenţiere, de morfogeneză sau organogeneză. 1. .1 Dife"enţie"e! Celulele meristematice, divizându-se continuu, dau naştere la noi şi noi celule care, treptat, cresc şi suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere. (n procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar specifice celulelor meristematice, evoluându-se spre calităţi proprii specializării funcţionale a diferitelor tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor intra. (n primele faze de diferenţiere se remarcă o modificare ultrastructurală şi funcţională a celulelor, fenomen denumit citodiferenţiere. &e măsura diferenţierii, volumul celulei creşte, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma devine peliculară şi parietală, se e%tinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia celulei. &lastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, în funcţie de rolul îndeplinit de celule. $dată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări secundare de genul depunerilor de celuloză, lignină, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care conduc treptat la o îngreunare a comunicării intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor "de e%emplu la sclerenchim#. Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Celulele care compun un ţesut sau organ nu posedă acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal. Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate e%ercitând un anumit rol în dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie, şi care stă la baza interrelaţiilor dintre ţesuturi, ce servesc la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale, respectiv la organogeneză. !upă diferenţiere şi generarea de noi celule se a unge la situaţia în care celulele neoformate tind să se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere, histodiferenţiere, cu organizarea de ţesuturi "histogeneză#, de organe "organogeneză# şi în final regenerarea unei noi plante. !iferenţierea celulară in vitro nu este foarte variată, unele funcţii sunt reduse sau simplificate în timp ce altele sunt amplificate. 1. . De,ife"enţie"e! #e&'&!"0 !ediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată în celulă meristematică, recâştigând aptitudinea de a se divide.

!ediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau în cazul traumatizării organelor şi al generării, la locul rănirii, de calus. &rocesul de dediferenţiere este comple% şi se instalează în momentul în care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declanşează transformări la nivel molecular. (n cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază, puţine celule devin centrii generatori de noi şi noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de restituţie. (n caz de traumatism organele din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în inducerea şi stimularea proceselor de dediferenţiere. !eci, fitohormonii, condiţiile de cultură, natura ţesuturilor implicate, starea lor fiziologică şi vârsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de regenerare. 'ptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul plantelor şi chiar şi în cadrul subunităţilor structurale, morfofuncţionale, care alcătuiesc un organism, e%istând diferenţe mari în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia, la celule aparţinând aceluiaşi organ sau chiar ţesut. Celulele e%plantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea să-şi reorganizeze un mod de viaţă, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi funcţional în celule meristematice, apte de multiplicare. 'ptitudinea celulelor e%plantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită la specii, organe şi ţesuturi variate. =azele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel6 ).prima faza de dediferenţiere6 -amorsarea proceselor de dediferenţiere: -producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice unui ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect şi structură cu cambiul. +.a doua fază de dediferenţiere6 - dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem primar: -generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi "centre organogene#, ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante: -generarea, prin proliferarea celulelor dediferenţiate, a unui calus neorganizat, structurat omogen. 9a nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni. 1. .* Re1ene"!"e! 0egenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă. &rin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, ţesuturilor sau celulelor vegetale se e%ploatează la ma%im capacitatea regenerativă a celulelor e%plantelor, respectiv se pune în valoare manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare. 8eoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. !in celule somatice sau obţinut plante diploide, iar din celule generative, prin androgeneză şi ginogeneză, sau regenerat plante haploide. Ca şi în cazul dediferenţierii celulare, se poate spune că şi în regenerare e%istă o mare variabilitate în ceea ce priveşte reactivitatea celulară, capacitatea regenerativă este manifestată sau nu de către o celulă vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori endogeni şi e%ogeni. =actorii endogeni ce oacă un rol esenţial în regenerare sunt6 vârsta celulelor, gradul de diferenţiere, capacitatea de a se dediferenţia, conţinutul în hormoni, natura balanţei hormonale şi echipamentul enzimatic. =actorii e%ogeni implicaţi în regenerare

sunt6traumele şi natura acestora "stresul datorat introducerii unui e%plant în cultura in vitro#, precum şi condiţiile de mediu. 8otipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar e%primarea sa aparţine numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. 'cestea sunt celule competente morfogenetic în a răspunde la variaţi stimuli şi care, în condiţii specifice, pot da naştere la tulpini, rădăcini sau embrioni. >umărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi e%primă potenţialul organogen sau embriogen se află sub controlul mai multor factori. S-e#i!. 7%istă specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii care regenerează prin embriogeneză, dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro. Gen($i-'&. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au potenţial regenerativ. 'stfel, s-au evidenţiat genotipuri ?culturabile@, ce au permis o regenerare uşoară din orice tip de ţesut, dar şi genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a făcut cu mare dificultate şi cu rezultate slabe. N!$'"! e2-&!n$'&'i. 9a unele specii "lucerna# toate tipurile de e%plante generează calus regenerativ. 9a altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea anumitor e%plante, de e%emplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenţele foarte tinere şi microsporii generează calusuri regenerative. V3"%$! e2-&!n$e&(". Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine decât cele provenite din e%plante mature. (n embriogeneza somatică directă, e%primarea totipotenţei depinde de stadiul de dezvoltare al e%plantelor. Sunt capabile sa parcurgă embriogeneza directă celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei şi sinergidele. 'lţi factori care influenţează regenerarea sunt6 starea fiziologică a plantei donor, compoziţia mediului de cultură, vârsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea şi calitatea luminii, stresul "biotic sau abiotic#. 1. .4 .("f(1ene5! in vitro (ntrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare, specifice acestui tip de cultură, vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest conte%t, vom descrie procesele de morfogeneză sesizabile la nivelul e%plantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza şi embriogeneza. Aibliografia e%istentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice de natura e%plantelor: pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază relaţia care e%istă între genotip şi competenţa morfogenetică a e%plantelor cultivate in vitro. Basil "),*C# a considerat ca factor decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice, starea fiziologică şi de dezvoltare a e%plantului. !eci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiţionează regenerarea şi reacţia e%plantului , altfel spus un răspuns morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci când e%plantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. =olosirea unor e%plante mai tinere sau mai avansate în dezvoltare, faţă de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen. 2orfogeneza la culturile in vitro este influenţată, în mare măsură de anumiţi factori6 -conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul e%ogen de regulatori de creştere: -sărurile minerale prezente în mediul de cultură "mai ales natura sursei de azot#: -natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură: -prezenţa în substrat a unor compuşi organici, în special al unor aminoacizi: -prezenţa, natura şi concentraţia gazelor "$+, C$+, C+.C# dizolvate în mediu sau e%istente în atmosfera din recipientele de cultură:

-prezenţa în substrat a unor e%tracte comple%e, de origine biologică, sau a cărbunelui activ: -factorii fizici "lumina, temperatura#. !eci lumina, temperatura, potenţialul osmotic al mediului, starea fizică a acestuia, tipul vaselor de cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza. >u se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură, de substanţele introduse iniţial în mediul de cultură sau de către comple%ul ionic, format în substrat, ca o consecinţă a autoclavării, sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului, sub acţiunea inoculilor, afectează morfogeneza. ).+.C.) $rganogeneza in vitro $rganogeneza in vitro este un proces foarte comple% care depinde care depinde de o serie întreagă de fenomene biologice, aflate în antecedenţa momentului e%plantării ţesuturilor. &ână în momentul e%plantării ţesuturilor, celulele viitorului e%plant au parcurs, împreună cu sistemul cărora le aparţineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte în care diferitele cerinţe fiziologice au fost satisfăcute, mai mult sau mai puţin. !intre aceste cerinţe amintim raportul endogen în fitohormoni şi conţinutul endocelular în nutrienţi, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu săruri minerale. !e modul în care au fost asigurate aceste cerinţe, prealabile e%plantării, vor depinde, în mare măsură, reacţia e%plantelor, capacitatea regenerativă şi mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivaţi din acestea. 'spectele menţionate au fost foarte clar relevate, mai ales în cazul studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a tulpinilor recalcitrante în a genera rădăcini adventive. !e e%emplu, pentru inducerea înrădăcinării tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurtă durată, a lor cu soluţie nutritivă, conţinând )-- mgDl '<A. Cu toate acestea, nici o tulpină nu a înrădăcinat dacă tulpinile au fost păstrate, pe o durată lungă de timp, în acest mediu: rădăciniţe s-au diferenţiat şi au crescut numai după ce e%plantele caulinare au fost scoase şi reinoculate pe un alt mediu, lipsit de au%ină "8ei%eira, ),*)#. !in cele prezentate, s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în obţinerea unei anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare ale inoculilor, alegerea e%plantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in vitro, în procesele de morfogeneză. '.0izogeneza in vitro En anumit fragment e%plantat se comportă, în linii mari, ca un minibutaş. 7l diferă de un butaş normal, întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene, are muguri şi eventual frunze. 2ugurii şi frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să sintetizeze anumiţi compuşi hormonali. 7%plantul însă, din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale, nu mai beneficiază de susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în totalitate dependent de mediul de cultură. (n acest caz factorul genetic, mărimea e%plantului vârsta plantei mamă, starea fiziologică a celulelor pe care le deţine, sunt tot atâţia factori care concură la evoluţia ulterioară a inoculului. Eneori, însă, in vitro, se produce o pierdere a capacităţii rizogene, mai ales ca urmare a practicării unor repicări "subculturi# succesive. Se pune problema păstrării sau a redobândirii capacităţii rizogene. =actorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales, cei care cauzează pierderea aptitudinii rizogene sunt în mică măsură cunoscuţi.

9umina poate e%ercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slabă sau în urma unei perioade scurte de acţiune "3-- lucşi mai puţin de o orăDzi#. 8emperatura optimă pentru rizogeneză este aceea de +3 oC. Eneori, însă, se recomandă practicarea unei alternanţe între o temperatură scăzută "1-)1 oC# şi ridicată, în prezenţa luminii, a au%inei şi a unui mediu bogat în glucide. (n cele mai multe cazuri, formarea rădăcinilor este localizată polar. 0ădăcinile se formează la polul radicular al e%plantului, în timp ce generarea mugurilor este localizată la polul foliar. 'portul de au%ină, în concentraţie ridicată, poate perturba polaritatea. (n concentraţii optime au%ina stimulează rizogeneza. A.Caulogeneza in vitro =ormarea de muguraşi in vitro, denumită şi caulogeneză, respectiv formarea de centri vegetativi, este esenţială atunci când se urmăreşte, de e%emplu, multiplicarea sau ?reconstituirea@ unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatică. <nducerea caulogenezei, a formării de muguraşi şi tulpiniţe, la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro, este stimulată de prezenţa în mediul de cultură a citochininelor, adeseori, în condiţiile asocierii acestora cu au%inele. !e asemenea trebuie menţionat şi faptul ca formarea de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii celor două categorii de fitohormoni. 0euşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor două tipuri de fitohormoni, ci şi a realizării unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în funcţie de specie, de provenienţa şi natura inoculului. Se poate spune deci, că nu este important doar raportul fitohormonal, ci şi natura şi concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. Eneori, se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia de au%ină. 'lteori, cel mai mare număr de muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ ridicate de citochinină. !ar nu e%istă reguli general valabile. 'deseori fiecare e%perienţă reprezintă un caz aparte, iar reacţia e%plantelor, la balanţa hormonală din substrat, variază mult, în dependenţă de tipul materialului vegetal. 9a calus, în inducerea caulogenezei, se obţin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea succesivă a acestuia, într-o primă etapă, pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de +,C!, fie în prezenţa unei au%ine mai slabe ca eficienţă, dar administrată în concentraţie mare, asociată eventual cu o citochinină, în concentraţie moderată. 'cest calus subcultivat pe un mediu cu aport scăzut în au%ină şi cu un conţinut ridicat în citochinină, ar putea conduce cu succes la declanşarea procesului de înmugurire. =actorii e%terni "lumina, temperatura, calităţile fizice ale mediului# sunt controversaţi în ceea ce priveşte efectele lor asupra caulogenezei. 'cţiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor şi de etapele parcurse anterior. Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală, în general se apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă. 8emperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză este aceea de +1 oC. =olosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate e%ercita un efect benefic asupra producerii proceselor de morfogeneză. 'stfel, la orhidee, se cunoaşte că menţinerea protocormilor în stare submersă favorizează multiplicarea acestora, dar este inhibată organogeneza. 8recerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declanşează organogeneza. !acă după o perioadă de menţinere a protocormilor pe mediu agarizat "câteva săptămâni# se submersează protocormii, prin acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată, sau cu apă distilată sterilă, se reuşeşte o stimulare a proceselor de organogeneză "Cachiţă, ),*;#. 9a monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată. 'ptitudinea cerealelor de a forma muguri in vitro este foarte variabilă. 'deseori această capacitate, la nivelul

calusului, se pierde în timp, pe măsura practicării unor subcultivări succesive "mai ales la grâu#. ).+.C.+ 7mbriogeneza somatică &rocesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză. <ndiferent de tipul embriogenezei, punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică celulă. 7mbriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere embrioni. 'şadar dintr-o celulă a sporofitului, pe cale se%uată se pot genera embrioni care se aseamănă foarte mult cu embrionii zigotici. 7mbrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicării repetate a unei celule somatice şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative. 7mbriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către SteFard şi colab. "),1*# şi de către 0einert "),1*, ),1,#. (n inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adăugarea în mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor naturale, aflate din abundenţă în acest produs natural. &rin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în cercetările de embriologie e%perimentală. 'stfel, s-a putut stabili6 -capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă, aparent banală şi că această aptitudine nu este numai un apana al zigotului rezultat din fecundare: -embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de prezenţa unui anumit mediu constituit din albumen, aşa cum este cazul la embrionul zigotic: -atât embrionul zigotic, cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute în embriogeneza clasică şi anume6 celula generatoare dă naştere la un masiv celular care, treptat suferă o succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpilă sau torpedo. (n embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea e%plantelor se realizează eliberarea celulelor din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul plantei, moment în care se rup nu numai legăturile trofice şi fitohormonale avute, ci se sistează şi eventuala prezenţă a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimică controlau şi blocau dezvoltarea haotică a celulelor unui organism. 1. .6 7!8i$'!ţi! %!' !ne"1i%+'& .abituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea schimbărilor ereditare survenite spontan, la un moment dat, în raport cu cerinţele de aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice: acestea privesc lipsa de reacţie, de răspuns, a materialului biologic, la anumiţi fitoefectori, regulatori de creştere sau vitamine, prezenţi în mediul de cultură. .abituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii e%ogeni, ci priveşte o gamă mai largă de probleme, unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie de manifestări fiziologice. 'stfel, e%plantul detaşat, lipsit de punctul vegetativ "dominanţa apicală#, trece prin transformări particulare, specifice noii stări fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot prezenta un comportament deosebit "Gautheret, ),*-#. 2ecanismul habituaţiei este încă necunoscut. Se ştie doar că, e%istă anumiţi factori de mediu care favorizează instalarea acestor fenomene. !intre ei amintim6 au%inele "mai ales +,C!# şi temperaturile ridicate.

1. .9 Vi$"ifi#!"e! %!' %$i#&(5i$!$e! =enomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor şi tulpinilor şi a fost semnalat la culturile de salată în seră "Gautheret, ),*-#. Se apreciază că, în cazul acestui fenomen, în anumite condiţii "cum ar fi e%ces de umiditate#, organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare, înlocuindu-se aerul din ele. (n condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară brusc. 7le suferă transformări morfofiziologice, frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate şi casante, prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. 'spectul general este degenerat. Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele diferenţiate în cele două ţesuturi, palisadic şi lacunar. 2eristemele lăstarilor vitrificaţi sunt mai mici decât la cei normali. Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină. S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se reduce foarte mult procesul de vitrificare. !e asemenea ridicarea concentraţiei de agar la )),)H reduce vitrificarea "$rli4oFs4a, ),*1#. Concentraţii mai mari de -,*H de agar duc însă la scăderea ratei de multiplicare şi de aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.

CAPITOLUL II .1 FENO.ENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO
8ehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la aceeaşi premiză6 posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu "temperatură, lumină, compoziţia mediului de cultură, p., umiditate# necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii artificiale de mediu, în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o anumită direcţie, cum ar fi formarea de noi lăstari "micropropagarea#. 8ehnicile de cultură in vitro, pe lângă aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui număr de probleme6 -menţinerea unui e%plant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ: -permiterea creşterii normale a unui e%plant reprezentat de o structură organizată "meristem, vârf de creştere sau mugure#: -inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe sau embrioni somatici: -inducerea proceselor de dediferenţiere, în cazul unor e%plante formate din celule diferenţiate "fragmente de tulpină, frunză, peţiol, rădăcină, etc.# rezultând o nouă organizare tisulară: -inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus. 'ceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere endogeni de tipul au%inelor "primul grup de fitohormoni recunoscut#, giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. 'ceste substanţe par a determina orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci când se încearcă e%plicarea unor fenomene fiziologice.

.1.1 Re1'&!$("ii ,e #"e:$e"e 7%istenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. >umeroase lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor, dar nu leau putut identifica decât mult mai târziu. &rimii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa au%inelor, în urul anului ),;C, giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu, în anii I1-. 'ceste trei tipuri de regulatori de creştere e%ercită o acţiune stimulativă asupra metabolismului celular. 7%istă şi substanţe cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat în anul ),31 şi substanţele fenolice identificate câţiva ani mai târziu. !e asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscută ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor. 7tilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor. 'ceste substanţe sunt endogene, ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante. 7%istă şi fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali, prezentând o acţiune fiziologică similară. 8oate aceste substanţe, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de creştere şi au anumite caracteristice comune6 -acţionează într-o concentraţie foarte mică, în concentraţie mare sunt to%ice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide: -acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori, funcţia lor fiind determinată de balanţa hormonală stabilită între ei: -intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel încât noţiunea de hormon "cu un efect rizogenic sau caulogenic specific# a fost abandonată. $ diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi suficient de repede, pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor practice. .1.1.1 A'2ine&e 'u%inele au fost descoperite în urma unor e%perimente asupra coleoptilului la Gramineae. >umele de au%ine provine din grecescul au%ein 5 a creşte, determinând elongarea celulelor "au%esis 5 creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule#. 7ste un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C)-.,$+> cunoscut sub numele de acid J- indolil acetic "=ig.)#.

=ig.) 'cidul J- indolil acetic '. &roprietăţile fiziologice ale au%inelor

'u%inele intervin în multe fenomene fiziologice, iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de interacţiunile cu alţi regulatori de creştere. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că6 -e%ercită o acţiune clară asupra elongării celulare, aceste efect urmează creşterii plasticităţii peretelui celular şi penetrării apei în celulă. 'poi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime: -modifică permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descărcare de ioni de .K, determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o absorbţie de ioni de /K: -influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza '0>-ului ribozomal "ribozomii participă la sinteza proteinelor#: -stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială "acest tip de acţiune a determinat insuccesele din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro#: 'cest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare, numite calus: -acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie, etilena intervine în schimb în reglarea nivelului de au%ină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare: -acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe, în particular asupra fenomenelor de dominanţă apicală: -determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor: -au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale destinate comerţului de flori tăiate: 'ceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a au%inei deoarece concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de concentraţia celorlalţi fitoregulatori. 2odul de acţiune al au%inelor. >u se poate da un răspuns precis, dar cercetările în domeniu au evidenţiat e%istenţa unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici au%inei. &e baza acestei ipoteze au rezultat următoarele concluzii6 -în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon: -în funcţie de afinitatea receptorului pentru au%ină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii. 'u fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere, de aici se poate e%tinde ideea e%istenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni. A. 'u%inele în plante 8oate plantele sintetizează au%ine, sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza au%inelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor şi în florile şi fructele tinere. 'u%inele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele tinere, dar în cursul transportului lor sunt descompuse de au%in-o%idaze, ceea ce înseamnă că au%inele sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. 'stfel, au%inele sunt prezente într-o concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere, în mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea şi elongarea celulelor. C. 'u%inele sintetice !e când au fost identificate au%inele, s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora, care au generat în celulele vegetale efecte similare au%inelor endogene, ceea ce confirmă

e%istenţa receptorilor pentru au%ine. 2ai mult, fiind influenţaţi mai puţin de activitatea au%inenzimelor , vor putea avea un efect prelungit în plante. &rintre numeroasele substanţe folosite, cele mai importante sunt6 -acidul.indolil butiric "'<A#: -acidul naftalen acetic "'>' 5 =ig.+# şi derivaţii săi6 acidul naftoo%iacetic "'>$'# şi naftilacetilamida ">'!#: -acidul +,C diclorfeno%iacetic "+,C !#.

=ig.+ 'cidul naftalen L-acetic (n practică, au%inele endogene pot fi folosite, fiind mai puţin to%ice dar şi mai puţin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea au%in-o%idazelor. !e aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de to%icitate. (n aplicaţiile agricole, compuşii au%inici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în urma tăierilor anuale din pomicultură, în evidenţierea fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare, ca urmare a efectului invers e%ercitat de acidul abscisic. Mi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează. .1.1. Gi8e"e&ine&e 'semeni au%inelor, efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate. &rimele observaţii "),+3# au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă "Giberella fujikuroi# care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. 7%tractul apos din ciupercă a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea e%istenţei unei substanţe responsabile de aceste efecte. &rima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau G'; "un comple% izolat în ),;, şi numit ?giberelina '@#. 'ceastă primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total apro%imativ cincizeci de gibereline. 'ceştia sunt toţi compuşi endogeni. (n practică, giberelinele folosite sunt e%tracte purificate. Cea mai folosită giberelină este G'; "=ig.;# şi mai puţin folosite sunt amestecul G'CKG'N sau G'N. 7ste posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice, având în vedere că primele gibereline sintetice au fost obţinute prin anii I*-.

=ig.; 'cidul giberelic 8oţi aceşti compuşi au un nucleu similar "nucleul giberelic# diferind doar prin calitate şi poziţia substituenţilor în nucleu. '. &roprietăţile fiziologice ale giberelinelor &roprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic "G';#. >u toate giberelinele au activitate similară, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline. &rincipalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt6 -acţionează asupra elongării internodurilor, uneori determinând rezultate spectaculoase "e%6 s-au obţinut plante de varză cu tulpina de ; m#, dar nu asupra tuturor speciilor. !oar unele dintre varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de G';, în general varietăţile pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. 'cidul giberelic acţionează şi asupra pedunculilor florali, împiedică maturizarea timpurie "cu )1 până la +- de zile la Cyclamen# sau alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate "e%6 la viţele de vie cu ciorchini denşi, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor la%e#: -în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor, care, în absenţa acestora, prezintă un aspect globular: -stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit că la seminţele de orz, acumularea L-amilazei, o enzimă cu rol în transformarea amidonului în zaharuri solubile, este datorată acidului giberelic, care acţionează direct sau după asocierea cu un receptor. Giberelinele acţionează, de asemenea, în prezenţa au%inelor, şi sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei au%in-o%idazelor: -acţionează asupra înfloririi, având ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori, astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute "morcov#. 9a alte specii, ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire, prezenţa giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fără formarea florilor "sfeclă#. 'ceste contradicţii în aparenţă au o e%plicaţie simplă6 în plantele prezentate mai sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii, pe când în celălalt caz asupra procesului de înflorire. 'stfel, giberelinele, îşi e%ercită doar rolul de stimulatori ai elongaţiei neinfluenţând, în acest caz, procesele fiziologice normale: -acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr, mandarin, prun: -e%ercită o acţiune comple%ă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor dorminzi, atunci când condiţiile climaterice "temperaturi scăzute# nu permit acest lucru, inducând şi ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea: -în organogeneză, acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. &ar a se opune fenomenului de dediferenţiere, neputând fi folosite in vitro în acest scop, acţionând însă

asupra meristemelor apicale sau a%ilare şi asupra butonilor florali, prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora. A. Giberelinele în plante Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. Enele gibereline se pot întâlni doar în plante, altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe "acizii giberelici ),;,C,N,,#. Enele plante posedă doar un fel de gibereline, în alte specii se află şi acţionează mai multe tipuri de gibereline. 9ocurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere, în mugurii foliari şi florali, în lăstarii activi, în vârful rădăcinilor şi în embrioni. Giberelinele circulă liber prin plantă fără e%istenţa unei polarităţi fiind asociate deseori zaharurilor, eliberându-se în situsurile ţintă. .1.1.* Ci$(#;inine&e Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire. Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui comple% chimic activ de natură purinică, care nu a putut fi iniţial identificat. 'ceste rezultate au dat posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor şi în ),13, S4oog a izolat, din '0> denaturat, o substanţă activă numită ?chinetina@. Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni6 -zeatina "=ig.C# -izopenteniladenina, a cărei compuşi sintetici sunt6 chinetina "/in 5=ig.C# "3furfurilaminopurina# şi benziladenina "A'&# "3-benzilaminopurina#.

a# b# =ig.C Citochinine6 a# zeatina, b# 4inetina Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau în asociere cu zaharuri. '. &roprietăţile fiziologice ale citochininelor Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care6 -au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. (n acest proces citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fără acţiunea au%inelor, cele două complementându-se reciproc. 'u%inele favorizează duplicarea '!>, iar citochininele permit separarea cromozomilor: -au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor, fiind însă antagonice rizogenezei:

-e%ercită un efect de stimulare a metabolismului celular, favorizând sinteza proteinelor, prin rolul ce-l oacă în compoziţia '0>-ului de transfer şi prote ând metaboliţii de acţiunea enzimelor hidrolitice. 'cest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic: -e%ercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea a%ilară: Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. &roprietăţile citochininelor permit rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus, cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dediferenţiere. A. Citochininele în plante &rima citochinină endogenă a fost identificată în ),3; în embrioni imaturi de porumb, de unde şi numele de zeatină, urmată de izopentenil adenina "<&'#, descoperită puţin mai târziu în plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. 8oate plantele conţin citochinine sintetizate în special în rădăcini şi în embrioni. 'plicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a metabolismului e%ercitat de citochinine la acest nivel. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor endogene localizate în aceste organe. Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate. Se presupune ca ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca în cazul aplicaţiilor pe frunze. .1.1.4 E$i&en! 7tilena "fig.1# este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. 7tilena se află în plante în cantităţi infime şi poate fi produsă de toate părţile acesteia.

=ig.1 7tilena &rincipalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt6 -determină iniţierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosită la început pentru coacerea fructelor la lămâi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş: -accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor, fiind folosită atunci când se urmăreşte recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini: -induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae "ananas#, o proprietate folosită în horticultură: -modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o e%ercită asupra polarităţii transportului au%inelor: -are acţiune favorabilă asupra tuberizării. 'ceste proprietăţi au unele puncte comune cu au%inele "înflorirea Bromeliaceaelor, corelaţii de creştere# iar unele antagonice "căderea frunzelor şi fructelor, tuberizarea#.

'cţiunea antagonică a etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza, concentraţia şi circulaţia lor. 'plicaţiile practice ale etilenei, dificil de utilizat în starea sa gazoasă, au făcut progrese doar după descoperirea acidului +-cloro-etan fosforic. 'cest produs, aplicat prin pulverizare penetrează ţesuturile, unde se eliberează etilena. 8oate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena, însă cantitatea cea mai mare se sintetizează în fructe, apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite. .1.1.6 In;i8i$("i !i #"e:$e"ii 2ulte substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor, printre substanţele endogene enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic.

'. <nhibitorii fenolici <nhibitorii fenolici, într-un număr mare în plante, inhibă metabolismul şi intervine în multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere, fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. 7i intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor, la început prin încetinirea creşterii acestora urmată de stoparea totală a acesteia. >u se ştie e%act rolul şi mecanismul lor în inducerea stării de latenţă. (n culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură, unde se o%idează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea e%plantelor, de aceea în unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-o%idante sau adsorbanţi pentru a deto%ifia mediul. 7%istă câteva e%emple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr. A. 'cidul abscisic 'cidul abscisic "fig.3# a fost identificat în ),31 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele. 'cest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante "lipsa apei, rănire, căldură e%cesivă#. 7%istenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. (ncetinirea activităţii plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.

=ig.3 'cidul abscisic &roprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici. 'stfel, cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt6

-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor: -determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu, ceea ce poate influenţa închiderea stomatelor: -acţionează asupra înfloririi. 'plicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în condiţii perfecte de periodism, poate inhiba complet înflorirea acestora "Volubilis# sau inhiba parţial "C enopodium rubrum#, sau chiar stimula înflorirea "!lumbago#. (n cazul în care plantele de zi scurtă sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora. 'plicat asupra plantelor de zi lungă, acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt supuse unor condiţii normale de fotoperiodism "spanac, "olium temulentum#. 'ceste observaţii pot conduce la supoziţia că nopţile lungi favorizează sinteza acidului abscisic, dar această supoziţie este prea simplă pentru e%plicarea modului diferit de acţiune a acidului abscisic. 'cidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro, şi în funcţie de speciile folosite şi de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat. C(n#&'5ii 0egulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora, dar prezenţa acestora nu este constantă. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeaşi etapă fiziologică. Bariaţia continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea momentului de recoltare a e%plantului. 8ehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai importante sunt au%inele şi citochininele. 0aportul citochinină5au%ină influenţează procesele fiziologice din e%plante, determinând evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. 'stfel, după S4oog, comportamentul fiziologic al e%plantelor va fi6 -dacă raportul au%ine 5 citochinine este mare, se induce rizogeneza: -dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea, e%plantele tind spre o funcţionare caulogenică: -dacă raportul este apropiat de unitate, e%plantele au tendinţa să genereze formaţiuni calusare. 'ceastă schemă generală este întotdeauna valabilă, chiar dacă e%istă variaţii în funcţie de tipul de e%plant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. &e lângă aceşti fitoregulatori principali e%istă şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar în cele mai multe cazuri aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.

. ALEGEREA E/PLANTULUI
Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un individ întreg similar plantei donor. 'ceastă capacitate denumită ?totipotenţa celulară@, indică faptul că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi, proprietate ce este tot mai mult e%ploatată în culturile in vitro. Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor, cel puţin pentru moment, să se folosească în practică această calitate, însă cu cât cercetările avansează, cu atât numărul acestora va creşte. 7ste mai uşor de ales un grup de celule, de e%emplu un e%plant, capabil să reacţioneze în condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. 2icropropagarea face posibilă obţinerea

de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă, însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică atunci când e%plantul este supus anumitor condiţii. (nainte de a decide criteriile de selecţie ale unui e%plant este necesară cunoaşterea evoluţiei fiziologice ce va a uta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plantă atunci când este detaşat de planta mamă. . .1 E$!-e&e fi5i(&(1i#e !&e 'nei -&!n$e (n conte%tul reproducerii se%uate se poate preciza, într-o manieră simplistă, că ciclul de viaţă al unei plante se împarte în patru stadii principale. '. 7mbriogeneza 7mbriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. $ul astfel format este prote at de ovul unde începe să se dividă. Celulele se organizează la început într-o masă sferică "faza globulară a embrionului#, apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare "faza cordiformă a embrionului dicotiledonat# după care se dezvoltă structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula şi radicula "stadiul de torpedou al embrionului#. !e la acest stadiu începe diferenţierea celulară. Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări programate şi mai mult datorită unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în anumite condiţii se vor comporta similar unor celule gametice, dând naştere unor organe sau embrioni, de această dată somatici. (n momentul de faţă, nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Se presupune că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule, dar şi cu mediul de cultură, determină un schimb de semnale biochimice, ce modulează funcţionarea fiecărei celule. (n conte%tul ipotezei mai sus menţionate, diferenţierea celulară intervine ca urmare a două cauze6 pe de o parte, datorită eredităţii genetice a celulei "fiecare celulă are acelaşi echipament informaţional genetic#, în care acţionează programul embriogenic, iar pe de altă parte, datorită poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. 'ceste structuri filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice programul informaţional spre un anumit tip de celulă. Sfârşitul acestei prime etape este marcat, în general, după ce substanţele sunt depozitate în albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminţei, ce induce intrarea embrionului în starea de latenţă. Seminţele pot fi apoi diseminate, putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din mediul încon urător. A. Stadiul vegetativ Când condiţiile e%terne sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează şi din embrion ia naştere o nouă plantă. !e creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de meristeme6 meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular, ce determină creşterea părţii subterane a plantei. 2eristemul caulinar are o structură bine definită, fiind alcătuit dintr-o parte e%ternă, epiderma de două sau trei straturi numită tunica, şi o parte internă sau corpus. (ntr-o secţiune transversală se poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă, încon urată de un inel de celule aflate în diviziune activă, celule responsabile de creşterea tulpinii. !iviziunea începe de la inelul iniţial6 zona epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre e%terior, iar spre interior în parenchim cortical şi vase conducătoare. Centrul este umplut de meristemul medular. 2eristemul caulinar are o funcţionare ritmică programată genetic cu o precizie aflată, în primul rând, în aran amentul filota%ic al frunzelor "distribuţie

corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii# şi, în al doilea rând, în forma frunzelor. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi clasificarea plantelor se bazează aproape e%clusiv pe caracterele morfologice. <poteza prezentată mai sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar celei privitoare la meristeme. 9a început, plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei, primele frunzuliţe, deseori conturate în interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de frunze uvenile. &lanta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură, rădăcinile transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. (n schimb, rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive bogate în glucozide, vitamine şi de asemenea în regulatori de creştere. 'ceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei.

=ig.N 2eristem apical Corelaţiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante "arbore, tufiş, tulpini întortochiate sau împrăştiate, etc#. 'ceastă arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. (n contrast frunzele îşi menţin forma.

=ig.* 2eristem radicular

'ceastă diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică, în general, informaţii despre întâietatea mugurilor, care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de moştenirea genetică. Stadiul vegetativ durează, în funcţie de specie, de la câteva săptămâni la câteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. (n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. 'ceastă succesiune, care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului încon urător, este determinată de stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu "temperatură, lumină, secetă, umiditate, etc#. &lantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea, substanţele glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau părţile aeriene ale plantelor ierboase se usucă. 'tunci când revin condiţiile favorabile "latenţa mugurilor este indusă de obicei de temperaturile scăzute# reîncep creşterile, formarea frunzelor şi a părţilor aeriene. C. Stadiul reproductiv Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar. <nelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. !iferenţierile încep la margini unde se formează staminele şi părţile fertile ale plantei6 staminele şi pistilul. =lorile angiospermelor sunt considerate lăstari modificaţi constituite dintr-un a% central şi ane%ele sale sterile "periantul# sau fertile "staminele şi pistilul#. 'ceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de diferenţiere sunt similare. <nstalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă, în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă. 2odificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile climatice nu au nici un efect, fie de variaţiile climatice "temperatură, lumină, umiditate#, caz în care planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul reproductiv. 9a unele specii, e%istenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate duce la împiedicarea înfloririi. =loarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem, asigurând prin fertilizare, continuitatea speciei. 9a unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. 'ceastă caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani "Saintpaulia, cerenţelGeum urbanum, căpşun, etc#. !acă aceste meristeme sunt induse artificial să înflorească, plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale. Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt concludente, ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. Se pot cita câteva modele de culturi in vitro, în care, variind componentele mediului de cultură şi proporţia fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive. !. Stadiul de senescenţă Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfârşitul vieţii lor, fructificarea epuizând rezervele, rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod normal, schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. 9a speciile perene, această etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante, ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de atac. >u este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor să intervină cel puţin la începutul acestui stagiu fiziologic "acidul abscisic şi etilena, alături de alţii#.

'ceastă scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. 'stfel, interacţiunile pe distanţă scurtă, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor vegetative şi regenerative. 'lt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor să recunoască mediul încon urător şi variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. &lanta va putea să se adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în anumite locusuri, circulând în direcţia unui punct ţintă ce răspunde la acel stimul. (n cursul deplasării lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice e%istente în plante. 'ceste interacţiuni sunt de aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat, nu doar starea prezentă a mediului încon urător al celulei, ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. !atorită acestui fapt, la recoltarea unui e%plant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic şi de vârsta plantei donor, dar şi de organul de pe care se prelevă, precum şi de mărimea şi natura fragmentului e%cizat. . . Se&e#ţi! e2-&!n$e&(" <n f'n#ţie ,e %$!,i'& fi5i(&(1i# :i )3"%$! -&!n$ei +!+0 (n funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor e%plantele pot reacţiona diferit la condiţiile culturii in vitro. (n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de e%plante, potenţialul de adaptabilitate al e%plantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta plantei mamă. (n cursul embriogenezei, embrionii pot fi e%cizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură dacă se află în stadiul globular, putând reproduce un individ normal şi complet. 'ceastă tehnică prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea "potenţialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu e%cepţia cazului strict de autogamie#. &e de altă parte, această tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. (n unele cazuri, de încrucişare interspecifică sau intergenerică, când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul, această tehnică permite creşterea şi dezvoltarea normală a acestor embrioni. Oesuturile embrionare sunt uşor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obţinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor speciilor studiate. 'cesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din e%plante bătrâne. (n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută. !upă germinarea în stadiul uvenil, ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi este sursa multor succese în domeniu. $dată cu înaintarea în vârstă a plantei donor, potenţialul de cultură in vitro a e%plantelor prelevate de la acesta se diminuează. 'cest fenomen este specific mai ales plantelor perene, şi în mod deosebit la arbori. 9a aceste specii, calitatea tehnică a lemnului nu este măsurabilă, cu e%cepţia arborilor adulţi. (n acest stadiu, totuşi, pentru multe specii, iniţierea culturii doar din butaşi nu mai este posibilă, deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică ridicată. 7%istă două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole6 -una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. (n acest caz lăstarii par a avea caracteristici uvenile şi înrădăcinează mai repede "de e%emplu la nuc şi eucalipt#. 9a aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul uvenil, probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor: -a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a coniferelor. 'ceastă tehnică permite re uvenilizarea şi obţinerea de altoi. En altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. 'ltoiul

creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. !upă mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele uvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire. 9a culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. &rima frunzuliţă ce se formează are caractere uvenile "prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă#. 0e uvenilizarea observată este deseori obţinută din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în funcţie de specie. (ntoarcerea la stadiul uvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule. 2ecanismele e%acte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure. Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro. Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar rezultatele sunt în general slabe sau incomplete. . .* Se&e#ţi! e2-&!n$e&(" <n f'n#ţie ,e )3"%$! e2-&!n$'&'i &roblemele legate de vârsta e%plantului apar la speciile perene în care se poate distinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. 'stfel, primele e%perimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi. !e-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. &rimăvara organele cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul au%inelor, giberelinelor şi citochininelor. Bara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. !e aceea, nu e surprinzător faptul că e%plantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu. !e aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Enele e%plante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt e%cizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de au%ină este ma%imă. 9a speciile cunoscute de a ca ?recalcitrante@ la cultura in vitro, pentru realizarea re uvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern în vederea stimulării rizogenezei. . .4 Se&e#ţi! e2-&!n$e&(" <n f'n#ţie ,e !+-&!%!"e! -&!n$ei ,(n(" !upă determinarea stadiului şi perioadei optime e%plantele pot fi prelevate. !upă tipul de organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri6

).7%plantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, ape%urilor caulinare, meristemelor şi ape%urilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate "de e%emplu, organe#. !acă mediul de cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile e%plantului şi conduce la dediferenţierea celulelor, generând calus. Etilizarea acestui tip de e%plante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii. <nteresant de amintit este faptul că e%plantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. 9a mai multe plante la care corelaţiile de creştere sunt puternice, e%plantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Enele cercetări au evidenţiat faptul că această ?memorie@ aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem. +.7%plantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze, flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică. &entru aceste e%plante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. !ar, în acest caz, diferenţele între specii sunt uriaşe. Enele specii, cum ar fi violetele de &arma, sunt capabile să regenereze din toate părţile plantei "peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule#, alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi #ctinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Enele specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din e%plantele amintite, iar la unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane. (n general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar şi tulpini tinere. . .6 Se&e#ţi! e2-&!n$e&(" <n f'n#ţie ,e +0"i+e! :i n!$'"! !#e%$("! 2ărimea e%plantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât e%plantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi mediul de cultură va avea o influenţă limitată. (n cazul e%plantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece e%plantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii de creştere e%istenţi. 7%plantele organizate cuprind în general un nod, un ape% sau un mugure "solzii protectori sunt înlăturaţi#, fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul diferenţierii a%ilare, va bloca creşterea apicală. &entru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni foarte mici, e%istă o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub această mărime supravieţuirea e%plantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor. !imensiunile e%plantelor variază între 1 şi )- mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare a materialului vegetal, sub aspectul e%cizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. !e e%emplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia, de ),1: ;: 1 şi N mm, s-a observat că doar fragmentele de peste ; mm au generat plantule normale. =ragmentele de ),1 mm au generat două tipuri de rezultate6 unele e%plante s-au veşte it, iar altele au format doar rădăcini. =ără îndoială, în

ultimul caz, au%inele prezente în mediu au ucat cel mai important rol, pe când în cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în oc şi fitohormonii endogeni. Se pot fasona e%plante din diferite tipuri de ţesuturi6 epidermal, cortical, parenchim medular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Oesuturile corticale şi cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. &arenchimul medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii de creştere, un e%emplu fiind dat de S4oog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre au%ine şi citochinine. !in ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre stadiul caulogenic "lăstari#, rizogenic "rădăcini#, calusogenic sau reproductiv. 'cest e%periment confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra e%plantelor de dimensiuni reduse. Cel mai mic e%plant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi mecanic sau enzimatic. &rotoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

.* R=SPUNSUL E/PLANTELOR ÎN CULTUR=
&rima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea viabilităţii "pe lângă problema asepsiei# e%plantului. !eseori se poate observa, după fasonarea e%plantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură, fenomen datorat o%idării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, o%idare ce are efect to%ic asupra celulelor vegetale. 2ai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre e%plant şi mediul de cultură. >u toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a e%plantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia e%plantelor într-o soluţie antio%idantă "soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de -,1 H respectiv -,-1H#, imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau deto%ificante, cum ar fi cărbunele activ ") până la C gDl# sau polivinilpirolidonă "1 până la )-gDl#. $dată rezolvată această problemă este necesară orientarea e%plantului, în funcţie de natura sa, în direcţia dorită de operator. .*.1 E2-&!n$e #' %$"'#$'"0 "',i+en$!"0 7%plantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode. &rima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a fitohormonilor din clasa au%inelor şiDsau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică. !upă iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza e%plantelor. 7ste de dorit ca aceste e%plante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică e%istenţa unui dezechilibru între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. !upă formarea calusului, ce are rol protector "asemeni calusului format la o rană# se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea tulpinii "a%ului principal#. 'ceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele specii ornamentale "crizanteme, garoafe# sau pe două medii succesive, la speciile lemnoase. &rimul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un nod "microbutăşire#. 'l doilea mediu, îmbogăţit cu au%ine "cel mai frecvent, acidul indolil acetic#, serveşte ca mediu de înrădăcinare "#ctinidia, măr, numeroase specii lemnoase#.

' doua metodă constă în blocarea creşterii ape%ului caulinar favorizând regenerarea şi dezvoltarea lăstarilor laterali "a%ilari#, caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină "de la ) la )-mgDl#. 9ăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere, fără hormoni sau cu acid giberelic în concentraţie mică. (n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor, mediu adiţionat în general cu au%ine. Etilizarea acestui tip de e%plante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui număr foarte mare de subculturi şi, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate. .*. E2-&!n$e #(n%$i$'i$e ,in ,ife"i$e $i-'"i ,e ţe%'$ 'ceste e%plante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare structurală, putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ "tulpină, frunze, rădăcini# sau generativ "a% floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct#. Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere, adică sa se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. 'cest tip de reversie este mai uşor de obţinut la celulele vegetale şi mai greu la cele animale. $bservaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în procesul dediferenţierii6 se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se măreşte, citoplasma devine mai densă. !upă realizarea acestor modificări celulele încep să se dividă, stadiu denumit histogeneză, uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a au%inelor. (n al doilea stadiu, numit organogeneză, citoplasma celulară devine şi mai densă, cu vacuole mici şi nucleu voluminos. Celulele păstrează capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o masă meristematică ce se va dezvolta întrun nou individ. $bservând un e%plant în cultură se observă formarea, mai întâi, a unei formaţiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să se dediferenţieze. !acă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică, nu se mai formează calus şi deci tot e%plantul moare. Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă, de e%emplu la Begonia re$, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor glandulari. (n general celulele ţintă, adică celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, în special cele provenite din tunică, dar pot avea şi alte origini. 'ceste celule se vor organiza într-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantulă întreagă cu tulpini şi rădăcini, cum este cazul la Begonia şi Saintpaulia. 9a alte specii, cum ar fi !elargonium, se observă în primul stadiu formarea de calus "calusogeneza#, unde celulele regenerante se divid activ, şi doar în al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelaşi mediu de cultură sau pe alt mediu, se dezvoltă meristemul ce va da naştere noii plantule. Când se formează meristemul prezintă, în funcţie de specie, acelaşi mod de a se dezvolta ca şi e%plantele organizate, doar că se cere un mediu mai comple% pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltării complete până la stadiul de plantulă. 'l doilea proces de organizare, mai puţin frecvent, este acela în cursul căruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmând etapele embriogenezei. Bom vorbi astfel de embrioni sau embriogeneză somatică. 'cest fenomen, descris pentru prima dată la celule de morcov, a fost descoperit la mai multe specii, atât anuale cât şi perene. Ca o trăsătură generală, inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de compoziţia mediului de cultură, dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare. (n multe cazuri embriogeneza somatică, este precedată de formarea de calus, în acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv "=ig ,#.

(n cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii a ung în stadiul globular, apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un embrion capabil să genereze o plantulă "=ig )-#. &entru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de cultură. &rimul asigură formarea embrionilor, putând servi şi ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor. Eneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici şi creşterea plantulelor, în timpul acestor subcultivări are loc diluţia fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor.

=ig. , 7mbrioni somatici de morcov regeneraţi din calus Etilizarea e%plantelor diferenţiate este foarte avanta oasă deoarece sursa de e%plante este nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. (n funcţie de răspuns, aceste e%plante prezintă unele dezavanta e la nivel genetic. (n primul rând, celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi e%istă probabilitatea ca celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante.

a

b

c

=ig.)- 7mbrioni somatici de citrice6 a# în stadiul globular, b# în stadiul cordiform, c# generând o plantulă (n al doilea rând, cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz în care, datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta modificări la nivel genetic "modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificări citoplasmatice#. 'ceastă variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a fost chiar folosită pentru inducerea de mutanţi, prin stimularea formării calusului pe medii adecvate fitohormonal şi chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creşterea

probabilităţii mutaţiilor. !upă fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat că printre plantulele neoformate unele prezentau modificări morfologice evidente mai ales citoplasmatice. (n consecinţă, de fiecare dată când propagarea unei specii necesită trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calităţii genetice a plantelor obţinute. Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetările asupra culturilor ce au pornit de la e%plante diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere, a căror echilibru în mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să funcţioneze într-un ritm ales de operator, ţinând cont de echilibrul endogenic. >u se ştie nici în prezent care este modalitatea de a determina e%act concentraţia şi balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori e%ogeni, dar pe de altă parte, aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul dorit. 'ceste cercetări, ce sunt încă incomplete, sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor aplicaţii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a început să fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III *.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE
(ncăperile destinate cultivării in vitro a e%plantelor vegetale trebuie să fie6 luminoase, lipsite de igrasie, să prezinte instalaţii de iluminare, canalizare, curent electric, toate în perfectă stare de funcţionare. $rice defecţiune poate perturba desfăşurarea normală a lucrărilor efectuate în acest laborator. (n toate compartimentele laboratorului trebuie asigurată o curăţenie perfectă, praful şi murdăria constituind surse de infecţii. 8oate operaţiunile, cum ar fi6 repartizarea mediilor de cultură, prelevarea, dimensionarea şi inocularea e%plantelor vegetale se realizează în condiţii aseptice. $ condiţie esenţială în reuşita unei culturi in vitro constă în realizarea unei asepsii perfecte, atât a materialului biologic cât şi a mediului de cultură. (n cazul în care această asepsie nu este asigurată, în mediul de cultură pot apărea infecţii microbiene şi fungice în circa +-1 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietăţilor substratului de cultură, eliberarea de to%ine, modificarea p.-ului şi astfel dezvoltarea e%plantelor este inhibată. *.1.1 O"1!ni5!"e! %-!ţii&(" <n$">'n &!8("!$(" ,e #'&$'"i in vitro 9aboratorul de culturi in vitro trebuie să cuprindă mai multe încăperi, grupate în funcţie de lucrările care se e%ecută în ele, în două zone6 -%ona nesteril& 5 cuprinde6 spălătorul, camera de distilare a apei, laboratorul de preparare a mediilor, laboratorul de testare a infecţiilor, camera pentru sterilizarea sticlăriei şi a mediilor de cultură, camera de creştere, camera frigorifică, camera de aclimatizare, seră şi solarii: -%ona steril& 5 este constituită dintr-o cameră sau incintă sterilă. !imensionarea încăperilor şi dotarea lor cu aparatură depinde de specificul muncii prestate "cercetare, producţie sau miniproducţie#.

A. Z(n! ne%$e"i&0 ).Spălătorul !estinaţie6 este încăperea în care are loc spălarea sticlăriei şi recipientelor destinate culturilor in vitro. 'ceastă încăpere trebuie să fie organizată astfel6 -să fie prevăzută cu ciment pe os şi cu canalizare în pardoseală: -spălarea sticlăriei se va face în bazine de capacitate corespunzătoare, în funcţie de volumul de muncă e%istent în laborator: -să fie dotat cu o chiuvetă cu apă caldă şi rece, suporturi pentru uscarea sticlăriei, dulapuri pentru depozitarea sticlăriei, coşuri pentru gunoi: -poate să fie dotată şi cu un distilator pentru apă. 2odul de spălare6 -se pregăteşte sticlăria care urmează a fi spălată: -se elimină resturile de mediu şi resturile vegetale din vasele de cultură: -mediile de cultură cu agar se colectează şi se aruncă la gunoi: -în cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator: -se pune sticlăria la înmuiat în apă caldă cu detergent, în bazinele destinate spălării: -se efectuează spălarea propriu-zisă folosind perii utilizate în spălarea sticlăriei: -se clăteşte sticlărie în apă de robinet şi apoi în două reprize de apă distilată: -se aşează sticlăria pe suporturile speciale destinate uscării acesteia. Se consideră sticlăria curată atunci când la suprafaţa acesteia nu mai aderă nici o picătură de apă. +.Camera pentru sterilizare !estinaţie6 este locul în care se efectuează sterilizarea mediilor de cultură, a apei distilate şi a vaselor de cultură. $rganizare6 -trebuie să fie prevăzută cu pardosea din ciment şi instalaţie de canalizare, sa fie racordată la reţeaua de gaze, conectată la curent electric şi să posede o sursă de apă: -este dotată cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate: trebuie să e%iste două tipuri de autoclave6 unul conectat la reţeaua de curent electric "fig. )# iar celălalt având ca sursă de energie gazul metan: sterilizarea vaselor cu mediu de cultură se realizează în casolete metalice sau coşuri de sârmă: -în unităţile cu activitate mai redusă sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate se poate face şi în 4u4te: -este dotată cu etuve pentru sterilizarea sticlăriei. ;.Camera pentru prepararea mediilor de cultură !estinaţie6 este încăperea în care se realizează prepararea mediilor de cultură. $rganizare6 -trebuie să fie spaţioasă şi iluminată corespunzător: -trebuie să fie dotată cu instalaţii de canalizare, curent electric, gaz, apă curentă: -pardoseala trebuie să fie acoperită cu un material uşor lavabil, iar mesele să fie placate cu faianţă sau folie melaminată pentru a fi uşor de întreţinut: -această încăpere va fi dotată cu etuve, pupinele pentru presterilizarea instrumentarului, agitatoare magnetice, băi marine, p.-metru "=ig.+#, frigider, congelator,

distilator "=ig.;#, balanţă tehnică şi balanţă analitică "=ig.C#, precum şi un variat sortiment de sticlărie. C.Camera de creştere !estinaţie6 este destinată păstrării inoculilor în condiţii optime în vederea creşterii şi dezvoltării acestora. $rganizare6 -trebuie să fie perfect curată, faianţată, bine izolată de mediul e%tern, dotată cu instalaţie de curent electric, sistem de climatizare: -camera va fi ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură, având poliţe situate la distanţe de C--1- cm, fiecare poliţă având sistem de iluminare ce poate fi întrerupt separat: -iluminarea se realizează cu tuburi fluorescente, realizând o intensitate luminoasă de ;----C--- lucşi: -fotoperioada în camera de creştere trebuie să fie, de regulă, de )3 ore lumină şi * ore întuneric: studii recente "8eodorescu 'l. şi colab., ),,C,),,1# reliefează că durata Pzilei@ poate fi redusă fără probleme la )--)+ ore realizându-se astfel importante economii de energie: -nivelul temperaturii trebuie să fie, în general, între ++-+CoC: în funcţie de specie, scopul urmărit şi tipul de cultură aceasta poate varia între )1-;-oC: -umiditatea din camera de creştere trebuie să fie cuprinsă între N--N1H: reducerea umidităţii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultură cu consecinţe grave asupra plantelor: -pentru culturile pe mediu lichid, în camera de creştere trebuie sa e%iste unui sistem de agitare, pentru asigurarea o%igenării ţesuturilor e%plantului inoculat. B. Z(n! %$e"i&0 Camera sterilă !estinaţie6 în această încăpere se e%ecută repartizarea mediului de cultură precum şi prelevarea, sterilizarea şi inocularea e%plantelor sau subcultivarea materialului biologic crescut in vitro. $rganizare6 -trebuie să fie cât mai izolată de restul încăperilor din zona nesterilă pentru a preîntâmpina vehicularea germenilor: -trebuie să fie prevăzută cu instalaţii de gaz, curent electric, dar fără apă curentă şi canalizare: -pardoseala va fi placată cu gresie, iar pereţii cu faianţă: -cea mai importantă dotare din camera sterilă este hota cu flu% de aer steril: sunt două tipuri de hote 5 cu flu% de aer orizontal şi flu% de aer vertical, ambele fiind dotate cu baterii de filtre ce permit reţinerea particulelor mai mari de -,+ micrometri: ele trebuie să permită lucrul a două persoane concomitent: cele mai folosite sunt hotele cu flu% de aer orizontal: -hota cu flu% de aer steril trebuie să posede sistem propriu de iluminare şi posibilitatea ataşării a )-+ becuri de gaz: -înainte de începerea lucrului cu cel puţin +- minute hota se porneşte pentru a se realiza sterilizarea incintei de lucru: în acelaşi timp se pune în funcţiune lampa EB şi se pulverizează alcool în interiorul hotei: -alte dotări în camera sterilă sunt6 scaune rotative pentru personalul care lucrează la hotă, dulapuri pentru sticlăria sterilă, cuptor cu microunde, măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii şi a celorlalte materiale folosite în perioada de lucru:

-înainte de începerea lucrului personalul se va spăla pe mâini în antecameră, iar în camera sterilă se va clăti cu alcool şi va purta echipamentul specific6 halat alb, boneta şi mască pe figură. *.1. D($0"i&e ne#e%!"e <n$">'n &!8("!$(" ,e #'&$'"i in vitro Sticl&ria Se utilizează toate tipurile de recipiente de sticlă, folosite într-un laborator de chimiebiologie. 7ste bine ca vasele să fie din sticlă termorezistentă de tip &Qre% sau din silicat de bor. (ntr-un laborator sunt necesare pipete, cilindri gradaţi, baloane cotate, pahare Aerzelius, pahare 7rlenmaQer, pâlnii, vase &etri, sticle şi borcane pentru reactivi. Se are în vedere tipul de vase utilizate pentru inocularea materialului biologic, pentru a evita pasarea repetată a plăntuţelor chiar dacă mediul de cultură nu a fost epuizat, ceea ce conduce la risipă de substanţe chimice. !e reţinut6 orice recipient nou din sticlă eliberează, cu ocazia primei utilizări, compuşi to%ici în mediul de cultură. !e aceea, se recomandă ca sticlăria nouă să fie spălată cu apă şi detergent şi apoi limpezită, după care se umple cu apă bidistilată şi se autoclavează de +-; ori câte ;- minute. !upă această operaţiune se poate utiliza în inoculări. !in ce în ce mai des, pentru inoculări, se folosesc vase speciale din material plastic autoclavabile şi cutii &etri din material plastic de unică folosinţă, care sunt livrate steril. #paratura 'i dispo%itivele !otările necesare într-un laborator de culturi in vitro sunt "=ig.))#6 -hota cu flu% de aer steril: -autoclav: -aparat de distilat şi bidistilat apa: -frigidere de mare capacitate: -agitatoare magnetice: -balanţe analitice şi tehnice: -p.-metru: -etuve: -microscoape şi lupe binoculare: -centrifugă: -aparat pentru repartizarea mediului de cultură: -aparat de fotografiat. (nstrumentar (n lucrările de culturi in vitro se lucrează cu instrumentar de tip chirurgical6 -pense de diferite forme şi mărimi: -foarfeci: -bisturie, cuţite, lame de ras: -ace, anse, seringi. Substanţe necesare (n laboratorul de culturi in vitro se utilizează o serie de substanţe6 -săruri anorganice: -compuşi organici: -reactivi de uz comun: -substanţe indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal: -alte materiale chimice6 detergenţi, săpunuri, praf de curăţat, alcool, amestec cromic.

a

b

c

d

e

f

g

h

i

=ig.)) !otările necesare într-un laborator de culturi de celule şi ţesuturi vegetale a# etuvă: b# p.-metru: c# microscop binocular: d# lupă binoculară: e# distilator: f# balanţă analitică: g# centrifugă: h# balanţă tehnică: i# autoclav

CAPITOLUL IV 4.1 CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE
4.1.1 .e,i'& ,e #'&$'"0 7%plantele vegetale pentru a putea trăi, după desprinderea de planta donator, au nevoie de condiţii speciale de cultură, să fie prote ate de agenţii patogeni "asepsie totală# şi să aibă ca sursă de hrană o soluţie nutritivă comple%ă, formată din apă, săruri minerale, substanţe organice şi fitohormoni. &entru menţinerea e%plantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfi%iate, mediul de cultură se solidifică cu un agent de solidificare. Soluţia nutritivă comple%ă lichidă sau solidă se numeşte mediu de cultură sau substrat de cultură. 'cest mediu de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie comple%ă deoarece e%plantul nu are capacitate de a se hrăni autotrof, el trăieşte heterotrof pe baza substanţelor e%istente în mediu. (n funcţie de scopul urmărit, evoluţia e%plantului poate fi diri ată prin modificarea compoziţiei mediului, obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei. Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie, soi şi fază de dezvoltare, cerinţele fiind diferite şi în funcţie de e%plantul folosit, momentul de prelevare şi zona din care s-a prelevat, chiar în cadrul aceluiaşi soi. (n prezent se cunosc şi se utilizează o serie de medii de cultură ce poartă numele celor care le-au creat6 Rhite, 2urashige-S4oog, >itsch, Gamborg, .eller "8abelul C.)#. Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe, cât şi prin studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii, studii privind absorbţia şi desorbţia, schimbul ionic care e%istă între plantă şi mediul încon urător. (n prezent se cunosc destul de bine modificările pe care le suferă plantele când elementele chimice sunt în e%ces sau în deficit. 8rebuie evitate pe cât posibil aceste stări de stres pentru plante atât la cultura în câmp, cât mai ales la culturile in vitro. 4.1.1.1 C(+-(5iţi! #;i+i#0 A. C(+-':ii !n("1!ni#i :i "(&'& &(" A-! 'pa reprezintă componentul esenţial al vieţii, al materiei vii. 7ste utilizată în tot ?flu%ul tehnologic@ de producere a plantelor in vitro, de la spălarea materialului vegetal şi a vaselor de cultură, până la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente şi elemente de diluţie până la concentraţia dorită. &ierderea apei din ţesuturi provoacă perturbări metabolice direct proporţionale cu cantitatea de apă pierdută. Stresul hidric este suportat de plante dacă este de scurtă durată şi dacă nu se atinge nivelul de veşte ire. (n această ultimă fază plantele sunt capabile de rehidratarea ţesuturilor puse în condiţii favorabile de umiditate, dacă deficitul de apă se menţine plantele mor. 9a culturile in vitro e%istă momente când e%plantele pot să-şi piardă turgescenţa prin pierderea apei, momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită, pentru asigurarea succesului culturii. Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere, deoarece soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni. 8rebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiilor utilizate în funcţie de starea

de vegetaţie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin e%osmoză. &relevarea e%plantelor trebuie făcută repede, altfel datorită dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraţie, prin rănile care sunt mari comparativ cu mărimea lui. 2anipulările sub hotă trebuie făcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidratează relativ uşor e%plantele care stau descoperite. &e timpul creşterii e%plantelor în camera de creştere, vasele trebuie să fie închise pentru a evita pierderea apei prin transpiraţie, ce ar determina concentrarea mediului în elemente nutritive, ar provoca crăparea mediului şi ca atare slaba creştere a culturilor. &entru respectarea strictă a concentraţiilor soluţiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilată, deci eliberată de ionii minerali pe care îi conţine. 9a spălarea materialului vegetal după sterilizare se foloseşte apă sterilă, sterilizare ce se face în autoclav odată cu sterilizarea mediului sau separat. S0"'"i&e !n("1!ni#e Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri. Cele mai utilizate sunt6 azotaţii, fosfaţii, clorurile şi sulfaţii de Ca, /, 2g, 2n, 'l, =e, 2o, Sn, Cu, >a, etc. 'bsorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni, utilizarea uneia sau alteia din săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie. (n funcţie de cantitatea de elemente ce se foloseşte în mediu, elementele se împart în6 -macroelemente - utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor 5 C, $, ., >, /, Ca, &, S, 2g: -microelemente sau oligoelemente, utilizate în concentraţii de micromoli. T!8e&'& 4.1 &rincipalele medii de cultură utilizate în culturi in vitro "după Street, ),NN#
C(n%$i$'enţi 7e&&e" ?;i$e Ni$%#; +1A& Macroelement /Cl >a>$; 2gS$C % N.+$ >a.+&$C % .+$ CaCl+ % +.+$ CaCl+ />$; >a+S$C ">.C#+S$C >.C>$; /.+&$C Ca">$;#+ % C.+$ Microelemente =eS$C % N.+$ >a+7!8' % +.+$ 2nS$C % .+$ 2nS$C % C.+$ /< >iCl+ % 3.+$ CoCl+ % 3.+$ SnS$C % N.+$ CuS$C % 1.+$ -,-) -,-) -,-; ),-,-; N,-,N1 ;,+N,* ;N,; +1 )-,-,-+1 +N,* ;N,; ++,; -,*; -,-+1 *,3 -,-+1 +N,* )-,-,N1 -,-+1 +,-,-+1 N13-+1)+1 N1 31 N+)3,1 *+-;-)*1 )33 ,1N+3* ;NCC),-)31)N+1)1)1+1-);C .'"!%;i1e S@((1 G!+8("1

.;A$; =eCl; % 3.+$ >a+2o$C % +.+$ 'lCl; =e"S$C#; C(n%$i$'enţi ("1!ni#i <nozitol 'cid >icotinic &irido%ină .Cl 8iamină .Cl Glicină 'cid folic Aiotină Saharoză

),),-,-; -

),1 +,1 -,-1 -,-) -,-) ;,+H

)-,-,+1 )-1 -,1 -,1 + -,1 -,-1 +H

3,+ -,+1 )--,1 -,1 -,) +,;H

;,-,+1 )-),),)+H

!iferenţele ce e%istă între diferite reţete de mediu, constau în raportul dintre diferiţi ioni. 0olul fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte în mediu, de concentraţia lui, de natura e%plantului. (n prezent se cunosc principalele reţete utilizate pentru speciile cultivate care se pretează la cultura in vitro. 'colo unde nu s-a e%perimentat încă, trebuie făcute tatonări pentru găsirea celei mai adecvate compoziţii pentru mediu. Carenţele pentru elementele minerale in vitro se manifestă după +-; subculturi, deci târziu, când nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. !e e%emplu > are rol important în embriogeneza somatică, în funcţie de forma lui nitrică sau amoniacală influenţează vitrificarea. Carenţa de > duce la acumulări de antociani în vacuolele celulelor, iar dacă aceasta persistă provoacă dereglări în metabolismul glucidelor şi proteinelor. &otasiul influenţează creşterea ţesuturilor, carenţa determină o dezvoltare slabă. (mpreună cu calciul, reglează permeabilitatea membranelor celulare, a fluidităţii protoplasmei, intervine în schimbul ionic la nivelul membranelor. 2agneziul întră în compoziţia clorofilei, carenţa provocând dereglări grave în structura frunzei. 2icroelementele e%ercită roluri metabolice şi fiziologice diferite de cele ale macroelementelor. <ntră în compoziţia multor combinaţii organo-metalice comple%e, cu valoare biologică ridicată de tipul enzimelor, care controlează întreg procesul metabolic al plantelor. B. C(+-':ii ("1!ni#i Sursele de carbon Biaţa in vitro este aproape în e%clusivitate heterotrofă, în special în primele faze ale e%istenţei, până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare plantulă sau lăstar. !atorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus care să asigure carbonul organic necesar în metabolism. &rincipalele surse de carbon sunt glucidele. 'cestea sunt substanţele cele mai utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă energetică. !ozele pe litru sunt de cca. +-;H în funcţie de faza de vegetaţie şi tipul de e%plant folosit. !intre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor culturilor in vitro. 'minoacizii Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi, faşă de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaugă în mediu sub formă de compuşi simpli sau complecşi. &rincipalii aminoacizi utilizaţi sunt6 glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina etc.

Bitaminele &lantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu şi ţesuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat e%perimental ca in vitro ţesuturile şi plantulele răspund favorabil la adaosul e%ogen de vitamine în cantităţi mici. 2a oritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavării, dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil asupra culturii. &rincipalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt6 -tiamina "vitamina A), aneurina#, se foloseşte în concentraţii cuprinse între -,)-)mgDl: stimulează creşterea vegetativă, sporirea biomasei produsă in vitro: -pirido%ina "vitamina A3#, -,)-) mgDl: precursor a unor coenzime, catalizând reacţii de baza în metabolismul aminoacizilor: -riboflavina "vitamina A+#, -,)-) mgDl, rezistentă la temperaturi ridicate "+*-oC#: inhibitor al creşterii rădăcinilor, rol în metabolismul celular: -acidul pantotenic "vitamina A1#, este mai puţin utilizat ca atare: pantotenatul de calciu se foloseşte în concentraţii cuprinse între -,1-+,1 mgDl: -cobalamina "vitamina A)+#, este mai rar folosită, stimulează sinteza nucleoproteidelor: -acidul nicotinic "vitamina A;, niacina#, -,1-1 mgDl, rezistent la temperaturi ridicate "+;C-+;NoC#: rol în metabolismul intermediar: -biotina "vitamina .#, -,) mgDl: stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor: -acidul folic, -,-) mgDl: efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină: la întuneric are efect to%ic: -acidul para-aminobenzoic, ) mgDl: stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei: -acidul ascorbic "vitamina C#, )-)-- mgDl, prin autoclavare se distruge în bună parte: este activator general al metabolismului celular: -vitamina 7 "tocoferolul#, măreşte sensibilitatea celulelor la au%ine: -inozitolul "mio-inozitolul, mezo-inozitolul, he%ahidro%i-ciclohe%an#, )---)--- mgDl: este considerat atât vitamină cât şi glucid: stimulează diviziunea celulară. =itoregulatorii =itohormonii, fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de creştere şi dezvoltare. 7%istă fitohormoni endogeni, sintetizaţi de plante şi fitohormoni e%ogeni sau de sinteză. Oesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au nevoie, fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună creştere a e%plantelor. Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt au%inele, citochininele şi giberelinele. A'2ine&e 5 sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de citochinine. 'u%ina naturală descoperită este '<' "acidul indolil-acetic# care se produce şi prin sinteză pe cale industrială. Cele mai folosite au%ine de sinteză sunt6 -<A' "acidul ; indolil butiric#: '>' "acidul naftilacetic#: +,C! "acidul +,C diclorfeno%iacetic#: '>$' "acidul beta nafto%iacetic#. 'cţiunea au%inelor este foarte comple%ă datorită intreacţiunii pe care o are cu alte substanţe regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice. 0olul au%inelor poate fi redat astfel6 -stimulează diviziunea celulară: - influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui celular:

-modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni: -rol important în dominanţa apicală: -inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare: 'u%inele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri, frunze, fructele tinere şi bobocii florilor de unde circulă în toată planta. Cel mai mult se folosesc '>' şi +,C! care sunt mai stabile, nu se o%idează în prezenţa luminii. +,C! este mult utilizată pentru inducerea şi creşterea calusului şi pentru rizogeneză. 9a calus asigură friabilitate mare uşurând separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza somatică. Ci$(#;inine&e sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe, seminţe, etc., iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic. &rima citochinină izolată a fost chinetina, e%perimentată cu succes la culturile in vitro. 9a scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina "A'&#. (n prezent se folosesc pentru culturile de ţesuturi patru citochinine dintre care două naturale "+ <& şi zeatină# şi doua de sinteză "chinetina şi A'&#. 7fectul fiziologic al citochininelor constă în6 -acţionează asupra diviziunii celulare alături de au%ine: -stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus: -stimulează formarea lăstarilor laterali: -stimulează sinteza proteică: -inhibă formarea rădăcinilor. Aiosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni, iar migrarea este dependentă de cea a glucidelor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor autoclavarea. Gi8e"e&ine&e sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra celulei, cu rol în stimularea creşterii, înfloririi şi fructificării. Cea mai utilizată giberelină este acidul giberelic "G';# fiind şi cea mai activă. 'cţiunea fiziologică este următoarea6 -produce alungirea internodiilor tulpinilor: -stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor. Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere, în mugurii activi, în embrioni şi vârful rădăcinilor, circulând în plante prin vasele liberiene. &entru meristeme giberelina este indispensabilă în vederea alungirii lor. 9a alte tipuri de e%plante nu se recomandă giberelina deoarece inhibă dediferenţierea celulară. E$i&en! a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în culturile in vitro. 0olul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel6 -e%ercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor: -induce senescenţa ţesuturilor: -are rol în transportul au%inei: -se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite: -inhibă e%tensia celulară. A#i,'& !8%#i%i# este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor. &oate fi utilizat pentru6 -inducerea latenţei embrionilor somatici: -inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o perioadă mai lungă: -inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării: -are rol antagonist cu au%inele şi giberelinele. 'genţii de solidificare Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid, utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele e%perienţe şi la cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele caracteristici6

-formează cu apa un gel care se topeşte la )--oC şi se solidifică la C1 oC, rămânând solid în condiţii normale de cultură: -nu este to%ic pentru plante şi nu este asimilat de plante: -nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în mediul de cultură, faţă de reţeta de mediu folosită: -nu reacţionează cu constituenţii mediului. Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită, între -,1-)H. Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc6 -agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura protoplaştilor şi în prepararea gelului pentru electroforeză: -acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor, suspensiilor celulare şi pentru încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale: -phQtagelul "Gelrite# produce un gel limpede. Se foloseşte în concentraţii de ),1-+,- H şi se gelifica la +N-;)oC. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un p. mai acid, asigurând solidificarea mediului şi în aceste condiţii. C. A&$e %'8%$!nţe '$i&i5!$e A,enin! are rol regulator în mediul de cultură, favorizează formarea mugurilor adventivi, stimulează creşterea şi alungirea ape%urilor cât şi rata de multiplicare. Se pare că are o acţiune sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. !e regulă se foloseşte sub formă de sulfat de adenină, în doză de C--*- mgDl. C(+-':ii fen(&i#i stimulează creşterea calusului, favorizează înrădăcinarea, creşterea lăstarilor şi a ratei de multiplicare. 're o acţiune sinergică cu a au%inelor, în special cu '<'. !upă unii autori are rol în prevenirea degradării au%inelor. !intre compuşii fenolici cel mai utilizat este fluoroglucinolul şi procaina. =loroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi arborilor, se găseşte în seva brută, mai ales la măr. &rocaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor, stimulează creşterea biomasei e%plantelor, a conţinutului în pigmenţi, stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea plantelor. !ozele utilizate sunt cuprinse între -,)-)- mgDl. S'8%$!nţe&e !n$i(2i,!n$e se utilizează pentru prevenirea brunificărilor e%plantelor şi a mediului, în special, la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari, evitând o%idarea lor. Se folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea prelevării e%plantelor, fie se adaugă în mediul de cultură. !intre substanţele antio%idante, cele mai folosite sunt6 acidul ascorbic "1--)-- mgDl#, acidul citric ")1- mgDl#, cisteina .Cl ")-- mgDl#. P(&i)ini&-i"(&i,(n! BPVPC este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea fenolilor, împiedicând astfel o%idarea lor cu brunificarea şi moartea e%plantului. Se foloseşte în concentraţii de +1--)--- mgDl. C0"8'ne&e !#$i) este un cărbune vegetal, bine mărunţit ce se adaugă mediului, cu scopul de a absorbi şi bloca substanţele to%ice din mediu. &oate avea acţiune şi asupra fitohormonilor "au%ine#, blocându-le parţial efectul, are acţiune de inhibare a formării calusului, stimulează embriogeneza, favorizează formarea rădăcinilor. Eneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii, de a completa compoziţia mediului, cum sunt6 laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. &rezenţa acestora în mediul de cultură este facultativă.

4.1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e fi5i#e !&e 'n'i +e,i' ,e #'&$'"0 2etabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa mediului de cultură. 0ădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu mediu lichid pot produce doar lăstari vegetativi, în timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. 'legerea tipului de mediu de cultură, lichid sau solid, prezintă o importanţă deosebită. 9a mediul solid, concentraţia de agar-agar, precum şi calitatea acestuia au un efect distinct. 2asa calusului de cartof se dublează atunci când concentraţia de agar-agar din mediu creşte de la -,* la )H, iar microbutaşii de anghinare prezintă fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraţie de agar-agar de -,3H , ce dispare atunci când concentraţia agarului creşte la ),)H. Concentraţia optimă de agar variază în funcţie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului folosit şi de p.-ul mediului. (n general, consistenţa mediului de cultură creşte odată cu p.-ul acestuia. 8recerea unor e%plante pe mediu lichid poate constitui o fază necesară în procesul de micropropagare, ca în inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus în mediu lichid. (n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate în mediu lichid cu agitare pentru a induce lăstărirea a%ilară multiplă. Biteza de agitare a mediilor lichide este în general scăzută atunci când se cultivă organe "cca )rpm# şi ridicată în cazul culturii de suspensii celulare "cca )-- -)1-rpm#. !acă în alte tipuri de culturi nu se acordă o mare importanţă schimbului de gaze, la culturile in vitro schimbul de gaze cu e%teriorul prezintă o mare importanţă pentru inoculi. Schimburile de gaze se realizează prin difuzie, diferenţele de concentraţie între gazele din interiorul containerelor şi cele din mediul ambiant e%terior, precum şi variaţiile de temperatură influenţând aceste schimburi. $rganogeneza indirectă la morcov este stimulată de reducerea concentraţiei de o%igen, pe când înrădăcinarea lăstarilor a fost stimulată de creşterea acesteia. 2ai multe e%perimente au dovedit că difuzia liberă a o%igenului în ţesuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenică a acestora. 'lte studii au demonstrat că intervenirea unei modificări în schimburile de gaze dintre ţesuturile cultivate in vitro şi mediu a indus apariţia unor modificări în morfologia plantulelor. !e aceea, este demn de luat în considerare şi tipul de vas de cultură folosit pentru culturile de celule şi ţesuturi, precum şi de capacele utilizate6 capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc. En alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele regenerate in vitro este p.-ul. (n practică, a ustarea p.-ului se face la 1,1-1,* în timpul preparării mediului de cultură. 8otuşi, în dese cazuri p.-ul mediului scade în timpul autoclavării sau chiar în timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se ştiu încă foarte puţine despre efectele acestor variaţii ale p.-ului şi despre cauzele determinante.

4. FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZ= CULTURILE DE ŢESUTURI
&rincipalii factori ai mediului încon urător sunt lumina şi temperatura. Emiditatea relativă este irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge valori de apro%imativ )--H. 4. .1 L'+in! Cerinţele faţă de lumină pot fi divizate în mai mulţi parametri6

-intensitatea luminii pe unitatea de suprafaţ& e%primată în RDm+ "unitatea lu% nu ar mai trebui folosită ca unitate de măsură a intensităţii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesităţilor unei plante#: -durata ilumin&rii, e%primată în oreDzi: -calitatea spectral& a luminii primite de plante. &entru culturile de ţesuturi, fotosinteza nu este o activitate necesară atâta timp cât energia este furnizată sub forma carbohidraţilor. 8otuşi, unele cercetări au evidenţiat că fotosinteza nu este eliminată în totalitate din culturile de ţesuturi vegetale, dar este considerabil redusă probabil datorită prezenţei zaharurilor în mediu. >umeroase studii au dovedit că lumina este indispensabilă reglării multor procese morfogenetice. '.<ntensitatea luminoasă $ intensitate luminoasă foarte mare poate duce la pierderi importante în culturile in vitro. Etilizarea unei intensităţi luminoase de 1- RDm + "apro%imativ )----lucşi# în camerele de creştere, intensitate folosită în mod obişnuit în fitotron, duce la încetinirea creşterii şi scăderea capacităţii de regenerare la multe specii vegetale. <ntensitatea luminoasă optimă culturilor in vitro variază între 1 şi +1 RDm+ ")----1--- lucşi# cele mai folosite valori fiind de )- până la )1 RDm+. deseori, în faza a treia a micropropagării, se urmăreşte creşterea treptată a intensităţii luminoase în vederea aclimatizării plantulelor la condiţiile de lumină din fitotron. A.!urata iluminării >u e%istă multe date cu privire la influenţa fotoperiodismului asupra morfogenezei ţesuturilor in vitro, aşa cum e%istă dovezi clare ale influenţei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo. Se pare că în medie, calitatea luminii "intensitatea T durata luminii# este importantă dezvoltării armonioase a plantulelor în condiţii aseptice de cultură. (n practică, marea ma oritate a camerelor de creştere au o durată a iluminării de )3-)* oreDzi. Cerinţele faţă de durata de iluminare, din camerele de creştere sunt diferite în funcţie de natura e%plantului, scopul urmărit dar şi de specia la care se e%perimentează. 'stfel, la grâu, în cazul culturii de antere, în vederea obţinerii de produşi androgenetici, s-a dovedit că, anterele cultivate în primele şase săptămâni la întuneric, vor forma un procent mai ridicat de produşi androgenetici. !upă această perioadă, culturile vor fi incubate în condiţii normale de fotoperioadă cu )3 ore lumină şi * ore întuneric. C.Calitatea luminii >umeroase studii au evidenţiat că spectrul luminos influenţează procesele fiziologice şi morfologice ale celulelor cultivate in vitro. 9umina albastră "cca C3Nnm# sau violetă "cca C),nm# induce formarea de lăstari din calus de tutun, iar cea roşie "cca 33-nm# induce rizogeneza. 'ceste rezultatele asemănătoare altora indică faptul că procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenţii fotoreceptori, cum ar fitocromul. (n mod normal, lumina ?de zi@ conţine radiaţii în principal albastre, iar lumina numită ?lumină albă@ conţine radiaţii roşii, dar nu se cunosc cu e%actitate curbele spectrale de emisie ale acestora. (n general, tuburile fluorescente albe aflate în comerţ sunt adecvate culturilor de ţesuturi. (n ultimul timp au apărut în comerţ două tipuri de tuburi fluorescente6 tuburi cu ?lumină caldă@ şi tuburi cu ?lumină rece@, astfel că, o combinaţie între cele două tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivită pentru culturile incubate în camerele de creştere.

4. . Te+-e"!$'"! (n general, temperatura folosită în camerele de creştere este de ++-+CoC. 'ceste temperaturi sunt la pragul critic, deoarece în interiorul vaselor de cultură temperatura poate fi cu + până la CoC mai mare decât în camera de creştere. &ractic, temperatura din camera de creştere trebuie să fie cu + oC mai mică decât cea necesară speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt obişnuite la temperaturi mai scăzute decât speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate să se seteze temperatura în camera de creştere la +-U) oC , iar pentru cele tropicale la +1U) oC. !e asemenea, temperatura în camera de creştere va fi diferită şi în funcţie de scopul urmărit în cultura in vitro. 'stfel, la cartof, s-a observat că o temperatură de cca ), oC, influenţează pozitiv formarea minituberculilor, în timp ce la grâu, cultura de antere necesită o temperatură de cca +NoC. !e aceea, se recomandă ca fiecare unitate de cercetare să beneficieze de cel puţin două camere de creştere, în care temperatura să poată fi reglată în funcţie de necesităţile e%plantelor şi tipurilor de culturi e%istente. (n natură, plantele sunt supuse unor fluctuaţii de temperatură, iar reproducerea lor în camera de creştere ar fi fără îndoială avanta oasă. 8otuşi, prea puţine studii au fost făcute în aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevantă.

CAPITOLUL V 6.1 ASEPSIA ŞI ASEPSIZAREA
$ condiţie esenţială, în realizarea culturilor de celule şi ţesuturi vegetale, este asigurarea unei perfecte sterilizări, nu doar a mediului de cultură şi a recipientelor, ci şi a tuturor celorlalte componente unei culturi in vitro, cum ar fi materialul biologic, instrumentar dar şi a suprafeţelor în care se desfăşoară astfel de activităţi. Căile posibile de infecţie trebuie e%cluse cu rigurozitate. Contaminarea cu microorganisme a recipientelor, mediului de cultură şi materialului biologic se poate produce foarte uşor, atât în faze incipiente, în momentul inoculării, cât şi în momentul repicării culturilor: alteori infecţiile se produc în mod pasiv, datorită ineficienţei sistemului de închidere a vaselor de cultură, a manipulării lor neatente, sau a dezvoltării întârziate a unor germeni care au stat în stare latentă în ţesuturile profunde ale inoculilor. 6.1.1 S$e"i&i5!"e! "e#i-ien$e&(" ,e #'&$'"0 (ntrucât, o serie de microorganisme au spori rezistenţi la temperaturi ridicate şi la diferiţi agenţi sterilizanţi, se recomandă presterilizarea prin căldură uscată, a sticlăriei, în etuve, prealabil introducerii mediului de cultură în recipiente. 'poi se va proceda la o resterilizare a recipientelor cu medii, prin căldură umedă, respectiv, prin autoclavare. Sterilizarea prin căldură uscată se va face la )3- oC, timp de +-; ore, întrucât e%istă anumite forme de bacterii termorezistente. !urata e%punerii sticlăriei la temperatură ridicată depinde şi de modul în care aceasta a fost spălată, dacă a fost sterilizată prin autoclavare, prealabil deschiderii flacoanelor infectate, precum şi în dependenţă de gradul de infectare al atmosferei din laborator. !acă însă se depăşeşte temperatură de sterilizare a sticlăriei, peste )*- oC se poate produce degradarea calităţii acesteia şi eliberarea de compuşi to%ici în mediul de cultură.

&entru a preîntâmpina infecţiile rebele se recomandă, în primul rând o corectă curăţire a sticlăriei, prin menţinerea acesteia minim patru ore în amestec cromic. Spălarea se va face cu multă atenţie, întrucât o spălare incorectă poate reprezenta primul pas în realizarea unei infecţii în masă a flacoanelor cu pierderi uriaşe de material biologic şi mediu de cultură. Sticlăria nouă va fi folosită abia după spălarea şi autoclavarea acesteia, umpluta fiind cu apă distilată, pentru a preîntâmpina trecerea unor ioni din sticlărie în mediul de cultură. (n unităţile cu activitate intensă se recomandă spălarea mecanică a sticlăriei, întrucât astfel creşte operativitatea muncii, beneficiind astfel şi de o temperatură mai ridicată a apei de spălare, faţă de spălarea manuală. $ foarte bună curăţire a recipientelor poate fi asigurată prin spălarea acestora cu a utorul ultrasunetelor. $biectele din sticlă, cutiile &etri, pipetele, lamele de microscop, se împachetează în hârtie, iar pachetele se aşează în tăvi metalice şi se sterilizează în etuvă, în condiţii de căldură uscată, la )+- oC, timp de )-+ ore. 'sepsizarea aparatelor introduse în hota cu flu% de aer steril "microscop, lupă binoculară, etc.# se va face prin ştergerea lor periodică cu alcool N- o. &reîntâmpinarea infecţiilor derivate din incorecta pregătire a recipientelor de cultură se face, în primul rând, prin manipularea corectă a acestora, avându-se în vedere şi faza de transport a lor de la autoclav până la hota cu flu% de aer steril. (n condiţii de producţie se recomandă chiar utilizarea autoclavelor cu deschidere dublă. (n acest caz, recipientele de cultură se introduc în autoclav dintr-o încăpere situată în afara perimetrului steril şi se vor scoate printr-o a doua uşă, direct în camera sterilă, ele fiind transportate cu un risc minim de a mai putea fi contaminate. 2etodele moderne utilizate în ultimul timp presupun utilizarea recipientelor de cultură din material plastic, fie de unică folosinţă, livrate steril de către furnizor, fie reutilizabile care pot fi sterilizate prin autoclavate. 6.1. S$e"i&i5!"e! +e,ii&(" ,e #'&$'"0 :i ! !-ei ,i%$i&!$e !upă prepararea mediilor de cultură, în cel mai scurt timp se va proceda la autoclavarea acestora. (n vederea autoclavării, vasele prevăzute cu dopuri înfiletante nu vor fi închise etanş pentru a permite astfel accesibilitatea aburului încălzit în recipientele cu mediu: în caz contrar, sterilizarea mediilor se produce defectuos, doar căldura nefiind suficientă în sterilizarea substratului de cultură folosit in vitro, căldura umedă fiind aceea care distruge germenii. 7%istă diferite tipuri de autoclave, electrice sau folosind gazul ca sursă de energie, cu orientare verticală sau orizontală, de capacitate mare sau mică. 7senţial este ca autoclavul să funcţioneze la parametri stabiliţi, care să asigure asepsizarea corectă a mediilor de cultură, distrugând germenii, fără a altera şi degrada substanţele încorporate în substratul de cultură. (n general se recomandă autoclavarea mediilor şi a apei distilate, la temperatura de )+) oC "echivalentă cu presiunea de ) atmosferă#: durata menţinerii recipientelor cu medii în autoclav depinde de volumul de lichid, respectiv de mediul introdus în flacoane, după cum urmează6 -vase de mediu conţinând între +--1- ml 5 +- minute la )+)oC : -vase de mediu conţinând între 1--1-- ml 5 +1 minute la )+)oC : -vase de mediu conţinând între 1---1--- ml 5 ;1 minute la )+)oC. Supraautoclavarea mediilor de cultură conduce la o alterare a proprietăţilor şi calităţilor acestora şi la o deteriorare a raportului ionic. Subautoclavarea mediilor duce la dezvoltarea de colonii de microorganisme şi care fac ca mediul să fie inutilizabil. &entru a ne asigura că nu ratăm o serie e%perimentală este indicat să amânăm inocularea şi câteva recipiente cu mediu să le ţinem +-; zile într-un incubator la ;N oC. (n acest mod ne vom convinge de calitatea sterilizării substratului de cultură.

(n laboratoarele de mică capacitate, care nu deţin în dotarea lor autoclave, sau pentru sterilizarea unor cantităţi reduse de mediu de cultură, se pot utiliza 4u4te în care se va introduce apă, astfel încât să se asigure umiditatea necesară formării vaporilor. !urata sterilizării va fi de )1-+1 minute, în funcţie de volumul de mediu, din momentul în care a început să se evacueze aburul prin supapă. !eschiderea 4u4tei se va face după depresurizarea acesteia. 2ediile de cultură lichide pot fi sterilizate şi la rece, prin filtrare. &entru acest mod de sterilizare sunt preferate nucile filtrante din sticlă cu porozitatea de ) micron. 'vanta ul acestor nuci filtrante este ca se pot refolosi. Substanţele termolabile folosite la prepararea mediilor de cultură "zeatina, acidul giberelic, tiamina, pirido%ina # se sterilizează prin filtrare folosind filtre de unică folosinţă "2illipor# şi se adaugă în mediul de cultură la o temperatură a acestuia cuprinsă între C1-1-oC. =iltrele 2illipor au porozitatea cuprinsă între -,1--,+ microni, fiind livrate steril de către producători, ceea ce presupune utilizarea lor numai în hota cu flu% de aer steril. Sterilizarea la rece a unor substanţe termolabile se mai poate face şi prin dizolvarea lor în alcool, eter etilic sau acetonă, acestea evaporându-se uşor, după care substanţa solidă solubilizată se va dizolva în apă distilată sterilă şi apoi în condiţii aseptice se va adăuga mediului de cultură aseptic. 6.1.* S$e"i&i5!"e! +!$e"i!&'&'i 8i(&(1i# &rovenienţa materialului vegetal va constitui un prim reper în alegerea modului de sterilizare a organelor donatoare de e%plante. Substanţele alese pentru asepsizarea materialului biologic, concentraţia acestora şi durata sterilizării vor fi selecţionate în funcţie de calitatea materialului biologic. 7stimările de acest tip se fac fie prin aprecieri de ordin subiectiv, fie pe baza e%ecutării unor e%perimente de tatonare. Gradul de infecţie şi procentul de viabilitate realizat în cultură ne a ută în adoptarea celei mai bune metode de sterilizare. !e regulă, rădăcinile sau organele subterane sunt purtătoare de nenumăraţi germeni, iar sterilizarea lor poate ridica probleme. 2ugurii şi tulpinile cu lenticele, precum şi organele cu pilozitate ridicată prezintă inconvenientul aderării sporilor şi a germenilor la nivelul formaţiunilor epidermale, ceea ce creează serioase impedimente în sterilizare cu atât mai mult cu cât, în momentul imersiei lor în soluţia dezinfectantă, se interpune, între suprafaţa epidermei şi soluţie, un strat de aer, peliculă care împiedică accesibilitatea dezinfectantului la epidermă. &entru micşorarea tensiunii superficiale în soluţia de sterilizat se vor adăuga câteva picături de 8Feen +- sau 8Feen *-. !ezinfectantul trebuie să fie suficient de puternic încât, în scurt timp, să distrugă microorganismele aderente la suprafaţa organelor dar, totodată, să nu pătrundă prea mult în profunzimea acestora. $ altă condiţie pe care trebuie să o îndeplinească agenţii dezinfectanţi este aceea de a putea fi îndepărtaţi cu uşurinţă de pe materialul biologic, prin spălări succesive cu apă distilată sterilă. !ezinfectanţii utilizaţi frecvent asigură o sterilizare de suprafaţă, dar foarte multe bacterii, virusuri sau micoplasme sunt localizate în celule situate în profunzimea organelor, ceea ce ridică probleme deosebit de complicate privind depistarea şi prevenirea dezvoltării lor. &entru a reduce posibilitatea apariţiei unor astfel de infecţii, dar şi pentru a cunoaşte cu e%actitate natura lor, este obligatorie efectuarea unui control fitopatologic sever al plantelor donatoare de e%plante. 9a unele plante "muşcate, 4iFi# se pot lua măsuri mai speciale de dezinfectare. 'stfel materialul se introduce în alcool ",3 o# după care acesta va fi trecut rapid trecut prin flacără, iar după aprindere va fi plon at în apă distilată sterilă.

En dezinfectant cu utilizare frecventă, cu acţiune rapidă şi eficientă este alcoolul etilic. 8rebuie avut în vedere faptul că alcoolul este liposolubilizant, coagulează proteinele, după pătrunderea lui în celule şi cauzează o deshidratare puternică a ţesuturilor. Ca atare, fragmentele de organe vor fi plon ate un timp foarte scurt în alcool ";--3- secunde# după care vor fi introduse rapid în apă distilată sterilă. 2aterialul biologic puternic infectat, după spălare în apă, imersie în alcool şi apoi în apă distilată sterilă, necesită o continuare a sterilizării cu unul dintre agenţii de sterilizare utilizaţi frecvent "tabelul 1.)#. $bişnuit se utilizează soluţiile de hipoclorit de calciu şi sodiu în concentraţii variabile. !e regulă, se procedează la imersia în dezinfectant a unor fragmente mult mai mari, ca dimensiune, decât viitorul inocul "pentru a prote a celulele e%plantului de necrozele provocate de către agentul sterilizant#. 9a nivelul suprafeţelor secţionate, hipocloritul cauzează o albire a zonelor traumatizate, sub acţiunea directă a clorului, ceea ce ne dă şi o certitudine privind eficacitatea dezinfectantului. (ntrucât zonele albite sunt traumatizate, respectiv distruse de către agentul sterilizant, ele vor fi îndepărtate, în momentul delimitării şi fasonării e%plantelor. 8abelul 1.) 'genţii de sterilizare utilizaţi frecvent în culturile in vitro "după Street, ),NN#
>r. crt. ). +. ;. C. 1. 3. N. Compus chimic .ipoclorit de calciu .ipoclorit de sodiu 'pă o%igenată 'pă bromată 'zotat de argint Clorură mercurică 'ntibiotice Concentraţia utilizată ,-)- H +-1 H )--)+ H )-+ H )H -,)-) H C-1- mgDl Eşurinţa de înlăturare KKK KKK KKKKK K K K KK !urata sterilizării "minute# 1-;1-;1-)1 +-)1-;+-);--37ficacitate f. bună f. bună f. bună f. bună f. bună Satisfăcătoare !estul de bună

.ipocloritul este puternic alcalin şi, în unele cazuri, se recomandă ca în prima clătire cu apă distilată sterilă să se adauge câteva picături de acid clorhidric diluat, acidulând astfel uşor apă distilată sterilă: operaţiunea are drept scop e%tragerea clorului prezent în straturile superficiale de celule. &entru îndepărtarea soluţiei dezinfectante se recomandă clătirea repetată, în cinci reprize, cu apă distilată sterilă, a câte )--)1 minute fiecare. 'tât în cursul sterilizării cât şi al clătirii, materialul vegetal trebuie agitat continuu. 6.1.4 S$e"i&i5!"e! <n#0-e"i&(" :i ! %'-"!feţe&(" $ primă măsură, cu caracter preventiv, constă în menţinerea unei curăţenii e%emplare în încăperile destinate laboratorului de culturi de celule şi ţesuturi vegetale. (nainte de efectuarea tuturor operaţiunilor dintr-un astfel de laborator, se impune sterilizarea cu radiaţii EB a încăperilor şi mai ales a camerei sterile, unde se e%ecută cea mai importantă etapă 5 inocularea pe medii aseptice.

0adiaţiile EB vor fi întrerupte, cu apro%imativ ;- minute înainte de începerea operaţiunilor în zona sterilă, întrucât periclitează sănătatea operatorilor. $zonul acumulat în încăperi, în cursul iradierii va fi lăsat să difuzeze pasiv din zonele sterilizate. Casoletele cu recipiente, conţinând mediile sterile sau flacoanele după inoculare, vor fi stocate în apropierea surselor de EB. (n cazul în care mediile, după autoclavare, nu sunt utilizate imediat, ele pot fi păstrate pentru câteva zile în camerele frigorifice, la C oC. (nainte de începerea activităţilor de inoculare în hota cu flu% de aer steril, se şterge suprafaţa de lucru cu alcool N- o, iar incinta sterilă se pune în funcţiune cu +--;- minute înainte de orice activitate pentru ca flu%ul de aer steril să baleeze suprafaţa de lucru. !acă se lucrează şi se inoculează la cca +- cm de flacără, pericolul de contaminare cu germeni este minim. (n perioada e%ecutării operaţiunilor în hota cu flu% de aer steril, este indicată îndepărtarea bi uteriilor, a ceasului şi brăţărilor de pe mâini şi sterilizarea cu alcool N- o a degetelor, insistând la unghii. <nstrumentarul cu care se va lucra în camera sterilă, este bine să fie presterilizat, fie în baia electrică de aseptizat instrumentar chirurgical fie în pupinel, timp de cca o oră, sau prin menţinerea acestora sub acţiune directă a razelor EB. (nainte de începerea operaţiunilor, instrumentele vor fi introduse în alcool şi flambate, apoi vor fi aşezate pe diverse suporturi "cutii &etri sterile, tăviţe folosite doar în hotă, etc.# pentru a se răci. 7le vor fi utilizate pentru dimensionarea e%plantelor abia după răcire, în caz contrar, temperatura ridicată a acestora poate traumatiza profund e%plantul. <nstrumentele tăioase, după introducere în alcool, se trec prin flacără, timp de o fracţiune de secundă, iar apoi vor fi plon ate într-un recipient cu apă distilată sterilă. =lacoanele cu medii, atunci când modul de obturare îl permite, prealabil deschiderii lor vor fi trecute prin flacără, rotindu-se gâtul acestora astfel încât flacăra să a ungă în contact cu toată circumferinţa deschiderii. !upă scoaterea dopurilor, sau capacelor, flacoanele vor fi flambate din nou, apoi se e%ecută inoculare urmând ca la final operaţiunea de flambare să se repete. $peratorii care e%ecută lucrări în camera sterilă, la hota cu flu% de aer steril, trebuie să fie bine instruiţi din punct de vedere teoretic, să fie echipaţi corespunzător, cu halate albe, bonetă şi mască pe figură, pentru a evita e%pirarea direct pe materialul vegetal. !e asemenea, la hotele care permit lucru a două persoane concomitent, acestea vor evita discuţiile între ele, rezumându-se la strictul necesar. 7ste indicat ca personalul să-şi spele mâinile cu apă şi săpun, înainte de începerea activităţii, după care atât înainte cât şi în mod repetat, în timpul operaţiunilor efectuate, să se clătească cu alcool N- o.

CAPITOLUL VI 9.1 INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO
9.1.1 A%-e#$e 1ene"!&e -"i)in, #(n,iţii&e !%e-$i#e ,e #'&$'"0 &rima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este asepsia. 2ediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor, creşterea cărora este mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea proceselor fiziologice ale ţesuturilor cultivate. !e aceea un laborator de culturi de ţesuturi este organizat şi păstrat într-o asepsie strictă asemeni unei săli de operaţie. &rincipalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt6 )# #erul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.

+# )esuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şiDsau bacterii. Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ "rădăcini, bulbi, tuberculi#. Aacteriile şi ciupercile se dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor, în vasele conducătoare libero-lemnoase sau în spaţiile intercelulare, caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este recomandată. ;# Corpul uman, care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie. 2etodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt6 a# &rodusele chimice, care distrug microorganismele6 -hipoclorit de sodiu: -hipoclorit de calciu: -mercurobutol: -cloridă mercurică: -produse bactericide şi fungicide: -etanol N--*-H. b#Aecuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. c# 'erul cald6 la )+-oC timp de +- minute "autoclav#, căldură umedă pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei sau )*- oC timp de +-; ore, căldură uscată "etuvă# pentru sterilizarea sticlăriei. d# 0azele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori. e# Sisteme de filtrare a aerului6 se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai mari de -,++Vm. =iltrarea este realizată de un ventilator-e%tractor ce asigură o ventilaţie constantă cu o viteză optimă şi are avanta ul de a menţine steril aerul din incinta hotei cu flu% laminar. (n momentul de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevăzute cu hote cu flu% laminar de aer steril. 9.1. P"e-!"!"e! +e,i'&'i ,e #'&$'"0 !atorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este necesară alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. &e parcursul preparării se vor bifa, pe rând, toate elementele măsurate şi introduse, ţinându-se seama cu stricteţe de volumul final al mediului. Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a soluţiilor stoc, erorile, corecţiile, provenienţa agarului, calitatea apei. (n aparenţa sunt factori ce nu prezintă o mare importanţă, dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte mare măsură de calitatea mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus. 7tapele preparării unui mediu de cultură sunt6 )#!iluţia sărurilor minerale6 macro- şi microelemente, apoi a ustarea la volumul final. +#2ăsurarea p.-ului, corectarea cu /$. )->: în general p.-ul este de 1,1-1,*. ;#'diţia zaharurilor "sucrozei# urmată de adiţia agarului, care se adaugă în ploaie în timp ce mediul este amestecat tot timpul. C#Sterilizarea mediului de cultură la )+-oC între +--;- minute, în funcţie de cantitatea de mediu din recipient. 1#'dăugarea vitaminelor şi hormonilor "sterilizaţi prin filtrare# în mediu se face atunci când temperatura mediului a unge la C--1- oC. 3#0epartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după adiţia vitaminelor şi fitohormonilor. $bservaţii 2ediile de cultură pot fi preparate în vase 7rlenmeQer, dacă se prepară cantităţi mici "mai puţin de un litru#, iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în 4u4tă.

&entru cantităţi mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent. !acă mediul conţine substanţe labile termic, substanţele vor fi dizolvate separat, apoi sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil. 'cest procedeu se e%ecută în hota cu flu% laminar de aer steril. !acă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate, adiţia mediului de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de apro%imativ C-oC, după ce gura vasului 7rlenmeQer în care se află mediul s-a trecut prin flacără pentru flambare. ' ustarea p.-ului se face de preferat cu p. metrul înainte de sterilizarea mediului. ' se evita hârtia de p. deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui p. corect se reflectă în succesul culturii in vitro. 'garul şi zaharoza nu schimbă p.-ul mediului, de aceea a ustarea acestuia se face înainte de adiţia celor două componente. &entru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente au%iliare, în care se va goli o cantitate apro%imativ egală cu cea necesară preparării mediului de cultură, din care se va lua cu a utorul pipetei cantitatea optimă. 9.1.* I5(&!"e! :i in(#'&!"e! e2-&!n$e&(" !in punct de vedere teoretic, toate părţile unei plante pot constitui e%plante pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, datorită totipotenţei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera în mod normal un individ întreg, identic cu planta donor. !in punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse două tehnici obligatorii6 -stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă întreagă cultivată în condiţii nesterile "prima etapă a micropropagării vegetale#: -menţinerea asepsiei unei culturi de a iniţiate prin transplantarea inoculilor în condiţii aseptice pe alte medii de cultură "etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare vegetativă#. &rima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei sterilizări corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură. #.Sterili%area ţesuturilor Sterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro este dificilă deoarece gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substanţe chimice, în diferite concentraţii cu durate diferite de timp pentru imersarea ţesuturilor. (n general, părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin infectate cu bacterii şi fungi decât cele subterane. !ificultatea sterilizării constă în necesitatea absolută de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel încât să nu se distrugă şi celulele vegetale "care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii#. !e aceea, este absolut necesară stabilirea unui timp optim de imersare a ţesuturilor în soluţiile sterilizante. !rept e%emplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt6 -fasonarea peţiolului în fragmente de apro%imativ )cm lungime: -imersia fragmentelor de peţiol în etanol N-H timp de +- secunde: -imersia în hipoclorit de calciu CH timp de )+ minute, cu agitarea continuă a vasului în care se realizează imersia: -efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului de sterilizare.

Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca"$Cl#+ deoarece nu penetrează ţesutul vegetal. 7ste totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie preparat imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin agitare continuă timp de apro%imativ )- minute, după care, soluţia formată se filtrează, iar filtratul se utilizează imediat. Concentraţiile standard folosite sunt de CH şi *H, iar timpul de imersie variază între 1 şi ;- de minute. 'lţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt6 Hipocloritul de sodiu, >a$Cl - acest produs este comercializat în pungi de plastic cu titrul colorimetric de C*o. Se folosesc concentraţii între 1H şi +-H vDv. 8impul necesar pentru realizarea unei sterilizări optime la o diluţie de 1H este de la 1 minute la ;- de minute. 'cest produs penetrează ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea capacităţii regenerative a ţesuturilor cultivate in vitro. Biclorura mercuric& "otravă puternică#, .gCl+ 5 este un sterilizant foarte eficient, folosit în doze mici de ordinul -,-)H până la -,-1H. 7ste dificil de înlăturat deoarece are aderenţă crescută la ţesuturi, necesitând clătiri repetate, fiind recomandate cinci-şase clătiri comparativ cu trei în alte cazuri. *ercurobutol 5 este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii. Conţine un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa, dar este foarte dificil de înlăturat necesitând efectuarea a două, trei clătiri cu alcool etilic de N-H. 8rebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează numai la suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă sterilizarea lor. (n unele cazuri sterilizarea e%plantelor nu este necesară, cum ar cazul meristemelor bine prote ate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor prote ate în spic. B.!reg&tirea ec ipamentului necesar sterili%&rii 'i lucrului la ota cu flu$ laminar steril (nainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de fasonare şi inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal, activităţi ce se realizează în condiţii sterile, este necesară pregătirea hotei cu flu% laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate. Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape6 - se şterg, cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de N-H, toate suprafeţele orizontale şi verticale din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru: - se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei: - se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei: - se porneşte lampa EB, iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia. (n cazul hotelor cu flu% de aer laminar "alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele# steril este suficient, ca înainte de utilizare, să se şteargă cu alcool etilic N-H toate suprafeţele interioare, în special suprafaţa de lucru. 9a acest tip de hotă, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil. &regătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului6 - se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz, după înmuierea în alcool ,-H: este recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument: - instrumentele se imersează în alcool etilic N-H în vase de sticlă dacă nu se foloseşte flambarea şi în alcool de ,--,3H dacă se doreşte flambarea acestora: - hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizează prin autoclavare:

- vasele &etri sterilizate în prealabil în etuvă la )*-oC timp de +-;ore se scot, din pachetele de hârtie sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate, doar în hota sterilizată: - mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil doar la hotă, când aceasta este pornită: - se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu: - se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă, pentru clătirea materialului vegetal, sau a instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool, fără flambare. C.+peraţiunile ce se e$ecut& la ota cu flu$ de aer steril 2enţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi necesare6 - înainte de a începe lucrul la hotă, operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun "preferabil cu mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă#, să-şi suflece mânecile halatului până mai sus de coate, să-şi frece palmele, încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool N-H sau cu mercurobutol şi să se clătească cu apă distilată sterilă: - mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de N-H, de fiecare dată când vin în contact cu materiale nesterile "păr, haine, etc#: - instrumentarul se schimbă des, după două până la ma%imum cinci e%plante, şi se sterilizează prin flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă: - e%plantele se fasonează cu a utorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină, mai ales când se doreşte obţinerea unor e%plante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau e%trase cu a utorul pensetelor cu vârf subţire, în cazul anterelor, ovulelor, etc: - e%plantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro: - orice e%plant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de lucru sterilă, va fi eliminat: - dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura în os: - gâturile borcanelor, vaselor 7rlenmeQer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra becului de gaz: - odată cu terminarea lucrului, alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise, pentru siguranţă. 9.1.4 .enţine"e! #'&$'"i&(" (n general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de )+RDm+ "apro%imativ +1-- lucşi# la o temperatură de +--+1o şi un fotoperiodism de )3 ore lumină şi * ore întuneric. $dată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor, care se văd în general după câteva zile. 9.1.6 Infe#ţii&e :i #!'5e&e !-!"iţiei !#e%$("! 'pariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. !upă simptomele manifestate putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie. !acă este generată de o ciupercă, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o te%tură mată sau pufoasă, de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. !enicillium generează un miceliu de culoare gri mat, pe când , i%opus nigricans, care se şi multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare, sau aruncare, formează miceliu de culoare închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră.

!acă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase în interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. 'ceastă pastă este uneori colorată roz sau galben. Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de cultură, şi dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi e%plantul. !acă infecţia porneşte din alt punct al mediului de cultură, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficientă a mediului sau din apa condensată pe capacul recipientului de cultură. (n unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavării, de aceea este necesară clătirea sticlăriei în clorură lichidă. 'tunci când se observă dezvoltarea unui miceliu de !enicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a operatorului. 2anipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de cultură in vitro, generând infecţii ale culturilor se poate datora6 vorbitului în timpul lucrului la hota cu flu% de aer laminar steril, sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului, transportul microorganismelor de la e%plantele infectate la cele neinfectate. Se poate ca, în cursul culturii, să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii, caz în care mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora. 8otuşi, culturile pot fi infectate şi cea mai sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu +gDl peptonă "un component obligatoriu în mediile de creştere ale bacteriilor#. &rin această metodă se testează culturile şi de elimină vasele de cultură infectate, obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii. 9.1.9 P"(8&e+e $e;ni#e +in("e #e -($ #!'5! -ie",e"i <n #'&$'"i&e in vitro Se poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii, iar alteori, în aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. &roblema poate fi dată de condiţiile de cultură, care sunt rareori identice, condiţiile climaterice din camera de creştere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. En singur detaliu minor în aparenţă, poate schimba întreaga evoluţie a culturii, de aceea atenţia şi meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui operator in vitro. (n continuare se prezintă câteva e%emple concludente6 - creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu e%teriorul ceea ce duce la încetinirea creşterii inoculilor: - utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica funcţionarea ţesuturilor: - unele capace căptuşite conţin cleiuri to%ice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare în apa condensată, să otrăvească ţesuturile: de aceea, este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli înainte de folosirea capacelor: - condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din e%teriorul vasului este cu câteva grade mai mică decât cea din interior, cauza putând fi e%punerea directă a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare. 9.1.D .e$(,e ,e iniţie"e ! 'n(" $i-'"i ,e #'&$'"i ,in ,ife"i$e e2-&!n$e 9.1.D.1 C'&$'"! ,e "0,0#ini Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate. 8ehnicile de cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a cercetărilor efectuate în această direcţie. 'stfel, Rhite a dovedit că rădăcini detaşate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate. (n general, se utilizează rădăcina primară, embrionară, prelevată de la plantulele formate prin germinarea seminţelor în condiţii aseptice. &rincipala problemă care se ridică, în

acest caz, este aceea a realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. Sămânţa sănătoasă, cu tegumentele întregi, nelezate, are ţesuturi embrionare neinfectate. Seminţele pot fi dezinfectate folosind agenţi puternici de sterilizare întrucât prezenţa tegumentului prote ează formaţiunile embrionare de to%icitatea soluţiei de sterilizare. 'stfel, un e%emplu de realizare a sterilizării, izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei rădăcini primare prelevate de la o plantulă de mazăre. 'pro%imativ +- seminţe de mazăre, cu tegumentul întreg, se introduc întrun vas 7rlenmaQer, în apro%imativ +1- ml alcool etilic N-o: se agită seminţele, iar după cca )secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de hipoclorit de calciu )-H, timp de +- minute, toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. !upă cele +minute se decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de apă distilată sterilă. !upă clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide, ca urmare a infiltrării apei sub tegument, iar seminţele întregi se inoculează, tot în condiţii sterile, în vase &etri, în care a fost repartizat un mediu de cultură 2S "2urashige-S4oog# simplu constituit din soluţia stoc de macroelemente şi agar 3,1H. Seminţele se incubează la întuneric, în condiţii controlate, timp de C* ore, după care, când rădăciniţa plantulei atinge lungimea de apro%imativ +- mm, în condiţii aseptice, se detaşează vârful rădăciniţei "cca 1-)- mm# şi se inoculează tot în vase &etri, )-+ e%planteDvas, pe un mediu de cultură constituit din macroelemente şi zaharoză, p.-ul fiind 1,* "0einert şi Weoman, ),*+#. Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza şi medii mai comple%e, clasice, iar ca sursă de carbon organic poate fi folosită glucoza în loc de zaharoză. Creşterea rădăcinilor in vitro are loc pe medii de cultură lichide neagitate. Silnic se poate urmări dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia &etri a unei hârtii milimetrice. !e obicei, după +) zile de cultură se constată o plafonare a creşterii, moment în care se recomandă subcultivarea rădăcinilor, prin e%cizarea ape%ului şi transferarea lui pe mediu proaspăt. Subcultura se poate face şi la interval de N zile. !upă apro%imativ două subculturi, este oportună introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic, în dozele normale, utilizate pentru alte tipuri de e%plante. &rin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul au%inelor asupra celulelor radiculare. Street precizează că au%ina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de tomate cât şi diviziunea celulelor meristemului apical. Etilizând culturi de rădăcini, pe diferite tipuri de medii, ca şi compoziţie şi consistenţă, s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni de creştere, al elementelor chimice sau al unor substanţe organice, în formarea rădăcinilor, în creşterea lor, precum şi urmările carenţării celulelor lor în anumite elemente. &rin e%trapolarea acestor rezultate, s-a reuşit îmbogăţirea, an de an, a cunoştinţelor privind funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general. !e asemenea, din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus, mai ales din cele principale sau din cele îngroşate secundar. &rocesele de organogeneză, la nivelul rădăcinilor netransformate în calus, se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. Geneza de muguraşi şi tulpiniţe are loc la nivelul ţesutului calusal, provenit din rădăcini, sau pe e%plante radiculare. 9.1.D. C'&$'"! ,e +e"i%$e+e 2eristemele sunt ţesuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-şi menţin, în tot cursul vieţii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formând mereu noi celule. 2eristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor "tulpini sau rădăcini#, fiind meristeme apicale, de tip primar, cu rol în creşterea în lungimea organelor: meristeme primare găsim şi în straturile profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. 9a organele ce suferă procese de modificare secundară morfo-anatomică, îngroşări, întâlnim meristeme

secundare, respectiv cambiul şi felogenul. !e regulă, prin termenul de cultură de meristeme se înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare. 2asivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară ma%imum 1-- V "2argara, ),*+# sau altfel spus, cca -,) mm diametru şi -,+1--,;- mm lungime "/artha, ),*)#. (n cazul în care se depăşeşte această dimensiune, vorbim despre o cultură de ape%. Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare, ce le conferă capacitatea de a se menţine într-o continuă stare de proliferare, cum ar fi6 -au pereţii celulari subţiri, celulozici, nemodificaţi secundar: -sunt bogate în citoplasmă, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine reliefaţi: -vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi. (n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt mici, strâns unite între ele, fără spaţii intercelulare. 2eristemele primare au celule de forma poligonală iar meristemele secundare au formă tabulară. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziţie radială, respectiv toate celulele generate dintr-o celulă meristematică mamă sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat naştere. Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi corpusul. 9a meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă la tulpină. =orma, mărimea şi conformaţia meristemului apical, caulinar variază mult la diferitele specii dar, în mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale6 meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme şi meristemul de angiosperme. 2eristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă, este prote at în mugur. 7l poate fi apical, a%ilar sau adventiv. 2ugurele este constituit dintr-un a%, în ape%ul căruia se află meristemul. &rin diviziunea continuă a meristemului rezultă celule care, pe măsură ce se îndepărtează de ape% se diferenţiază funcţional. Celulele e%terne ale masivului tisular "numit con de creştere sau vârf vegetativ# se pliază, iar protuberanţele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se diferenţiază în primordii foliare sau florale. !e regulă, în primordiile florale se produce o creştere a intensităţii ratei de multiplicare celulară, aceşti muguri devin mai bombaţi, mai voluminoşi. Celulele din zona centrală se diferenţiază în %ilem, floem şi ţesut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se întâlnesc primordii transformate fie în frunzuliţe, din ce în ce mai mari, fie în boboci, respectiv în componente florale. 2ugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată, graţie faptului că deţin ţesuturi tinere, slab diferenţiate şi celule meristematice. 2eristemele apicale posedă o relativă autonomie, fapt încă insuficient argumentat şi dovedit e%perimental. (n evoluţia in vitro a e%plantelor meristematice, un rol important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor. &rimordiile florale recoltate în faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transformă în floare. 'deseori, funcţie de specie, la nivelul învelişurilor florale se poate induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive. Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în cele metamorfozate "rădăcini tuberizate#. !e regulă, cambiul constituie o principală zonă regenerativă. Oesuturile inoculate pe medii aseptice, de regulă, diferenţiate morfofuncţional, trebuie să se dediferenţieze, fenomen ce se petrece în etape succesive, până la reîntoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. =enomenul de dediferenţiere

celulară se produce şi spontan, de e%emplu în cazul iniţierii unor meristeme, sau al genezei de rădăcini secundare din celulele periciclului radicular. !ediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus, dediferenţiere primară, din care se poate a unge la un stadiu de dediferenţiere secundară, când o parte din celulele calusului se transformă în meristeme, generatoare de rădăcini sau tulpini. !ediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de promeristeme şi de iniţiere a organogenezei. (n cultura de meristeme, meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare subiacente acestuia. Aall "),C3# a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de "upinus albus şi -ropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. 'ceste e%perimente au relevat potenţialitatea organogenetică a diferitelor părţi ale ape%ului. (n prezent, o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei meristemului cultivat in vitro, în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ, precum şi a rolului primordiilor. 7ste evident faptul că un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, îşi poate manifesta totipotenţialitatea sa reală: în condiţiile inoculării lui împreună cu primordiile, ori in situ, această capacitate este mascată de corelaţiile e%istente ca urmare a prezenţei alături de meristem şi a celorlalte ţesuturi. !ezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui însoţit de primordii, este dependentă de fitohormonii de creştere prezenţi în mediul de cultură. Se pare că primordiile, chiar în faza în care frunzele sunt abia schiţate, se pot transforma fie în frunze, fie în muguri floriferi. 7%perienţele de microchirurgie ale lui RardlaF "),C,#, Steeves "),3+#, .aight şi /oehnert "),3,#, precum şi ale altor autori, au permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă morfofuncţional. &roblema transformărilor morfologice şi structurale, în cadrul proceselor de tranziţie care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală, precum şi a celor legate de reversia meristemelor iniţial florale, în meristeme vegetative constituie punctul de plecare în multiplicarea vegetativă in vitro, pornind de la e%plante constând din boboci sau din învelişuri florale. 9a conopidă, în faza de preinflorescenţă, 2argara "),*+# se pot distinge trei categorii de meristeme6 vegetativ, de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor. !efinitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical, din vegetativ în floral, depinde de o serie de factori e%ogeni 5 fotoperioadă, temperatură 5 sau endogeni 5 specie, hormoni. (n condiţiile cultivării unor e%plante in vitro, celulele ţesuturilor inoculate pe medii aseptice suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme. !in aceste meristeme, prin rediferenţiere, vor lua naştere organe. $rganogeneza constituie momentul de bază în asigurarea multiplicării vegetative. !e multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice, aflate întrun stadiu tânăr, nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini, sau în meristem generator de tulpini, fiind numite promeristeme. 8ot legat de activitatea meristematică incipientă, e%istă şi un alt termen, întâlnit în literatura de specialitate 5 meristemoid "8orreQ, ),33#. 'ceastă noţiune se referă la formaţiuni meristematice, abia schiţate, cu direcţie de dezvoltare nedeterminată, aparent identice din punct de vedere morfologic. Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate că a%a caulinară şi cea radiculară, în evoluţia filogenetică, au o origine comună. !iferenţierea funcţională a meristemului se face, probabil, în stadiul de promeristem: în cazul meristemoizilor pot fi de a identificate trei tipuri de meristeme ce evoluează în6 meristem proliferativ, meristem generator de rădăcini şi meristem de tip caulogen. !ar nu se cunoaşte dacă aceşti meristemoizi sunt identici sau prezintă de a amprenta determinismului lor funcţional, radicular şi caulinar. 2eristemele radiculare, funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii6

-meristem apical 5 situat în vârful rădăcinilor: -meristem lateral 5 format pe rădăcina principală: -meristem adventiv 5 provocat în a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe, care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. <nducerea formării acestor meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi, marcote sau organe de rezervă: -meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv. 2eristemele caulinare pot fi împărţite astfel6 -meristeme apicale "terminale# 5 derivate din muguraşul embrionului: -meristeme a%ilare 5 aflate la a%ila frunzelor: -meristeme adventive 5 formate pe diverse organe: -meristeme neoformate 5 generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro. =ormarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic şi hormonal. =actorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a proceselor de organogeneză. .ormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori cu rol hotărâtor în direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor, în meristeme radiculare sau caulinare. 'u%inele intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar citochininele în neogeneza de muguraşi. 7%plantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi de micropropagare a o serie de specii de interes economic. 'stfel, se poate concluziona faptul că, la plantele superioare e%istă o diversitate de meristeme clasificate, după localizarea lor în plantă. 2eristemele mai pot fi clasificate şi în alte două categorii6 -meristeme histogene 5 care produc obişnuit numai ţesuturi: -meristeme organogene 5 care dau naştere la ţesuturi ce formează organe: Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structură şi funcţiune, meristemele caulinare sunt deosebit de comple%e structural şi funcţional. 7le variază ca aspect şi potenţialitate, de la o specie la alta. 2eristemele caulinare, terminale, constituie, în fapt, un microbutaş, întrucât vârful vegetativ al plantei, inoculat in vitro îşi formează un propriu sistem radicular, în partea sa bazală. (n consecinţă, acest tip de meristem este frecvent folosit în tehnicile de multiplicare şi de propagare accelerată a plantelor, pe medii aseptice. &otenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este, de regulă, e%trem de mare. 7le se adaptează bine la condiţiile in vitro, suportă uşor traumatismul provocat de e%plantare, reluându-şi activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice, generând plante. 'cest fapt presupune atât creşterea a%ei mugurelui şi a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzuliţelor, cât şi neogeneza de rădăcini. (n final, meristemul terminal, apical sau a%ial generează una sau mai multe plante, în funcţie de balanţa hormonală prezentă în mediul de cultură. 2eristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridică probleme speciale, întrucât ele aparţin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce îngreunează o alimentare optimă a lor cu apă, cu nutrienţi şi hormoni. 'cest lucru constituie impedimente fiziologice care, pe plan funcţional, se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative a celulelor lor, soldată cu o scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme. 2eristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în tot cursul vieţii plantei. 7%cepţie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical în decursul sezonului de iarnă se află în stare de latenţă. &rin intermediul culturii de meristeme 5 apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o rapidă multiplicare clonală a plantelor, îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice.

&rin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare, fapt deosebit de important în horticultură, asigurându-se astfel o multiplicare clonală. En alt aspect, foarte important, care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor, este acela al obţinerii de material săditor sănătos, în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen. &lantulele generate in vitro din meristeme, însoţite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în condiţiile înmulţirii vegetative a plantelor. >umai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura, într-o oarecare măsură, eradicarea parţială, temporară, a virozelor, ştiut fiind faptul că, chiar şi prin seminţe se transmit o serie de viroze. !ar nenumărate plante horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau, la unele soiuri, multiplicarea prin seminţe este dificilă "orhidee#, ori seminţele nu sunt fertile, ceea ce a făcut ca înmulţirea acestora pe cale vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. &e de altă parte, multiplicarea plantelor pe cale ase%uată, prin metode de înmulţire vegetativă clasică, a condus la degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării, an de an, a infecţiilor virale. 'stfel, o cultură sănătoasă de garoafe "0udelle, ),NN#, înmulţite timp de cinci ani prin butăşire clasică, a prezentat o răspândire în masă a virozelor, multe din ele, cauzând degenerări. 8otodată, multiplicarea vegetativă, prin metode tradiţionale, are drept consecinţă şi o perpetuare a unor mutaţii somatice. Birozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi şi căpşun, în floricultură şi în arboricultură, întrucât reduc vigurozitatea plantelor, scad potenţialul productiv al acestora, producţia realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a calităţii lor. Autaşii obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi realizează un procent scăzut de prindere. &e de altă parte, din cauza menţinerii în cultură a unor plante virozate se creează pericolul transmiterii virusurilor şi la alte plante, prin vectorii biologici prezenţi în cultură. &rimele încercări de cultivare a e%tremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca fiind realizate încă din ),++, de către /otte şi de către 0obbins, la mazăre şi porumb, dar fără mare succes. Elterior, în ),C3, Aall a reuşit să obţină plante din ape%uri meristematice la "upinus albus şi la -rapaeolum majus. &ână în urul anilor ),C,-),1- cultura propriu-zisă de meristeme nu era cunoscută, abia începând din anul ),C,, prin lucrările lui Retmore şi 2orel s-au pus bazele cercetărilor sistematice privind cunoaşterea reacţiei e%plantelor meristematice la condiţii de cultură, precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate în condiţii variate de mediu. !acă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Aall, în schimb prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui 2orel "),1,-),3-#. <nspirat fiind de rezultatele obţinute între anii ),C,-),1- de către 9imasset şi Cornuet, 2orel a avut intuiţia de a cultiva in vitro meristeme apicale de apro%imativ N1-)-- Vm lăţime şi )1-+-- Vm înălţime, cu )-+ primordii foliare. 7%perienţele efectuate de 9imasset şi Cornuet au constat în urmărirea, prin analize serologice, a gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distanţe de ape%. 7i au constatat o distribuţie inegală a virusurilor în corpul plantelor şi au observat un gradient mai scăzut de infecţie virală, pe măsura apropierii de vârful vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redusă infecţie virală a fost semnalată în sucul e%tras din frunzele aflate încă în mugur. &ornind de la aceste fapte, 9imasset şi Cornuet au e%tirpat, aseptic o calotă de ţesut apical sau meristem şi câteva primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun, lezată printr-o scarificare superficială. !upă trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de tutun, pe care s-a amplasat e%clusiv calota meristematică, au fost virozate în proporţie de 3-H, în

timp ce frunzele pe care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului "primordii foliare mai îndepărtate de meristem# s-a infectat în procent de )--H. 'ceste e%perienţe ia condus pe 9imasset şi Cornuet la concluzia că în ape%ul caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este oprită. (ncă din ),1+, 2orel şi 2artin au intuit faptul că, pornind de la plante virozate, prin e%plantarea şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obţine o plantă sănătoasă, conservând, în acelaşi timp, caracterele genetice ale plantei mamă. 'ceastă ipoteză a fost atestată de către 2orel şi 2artin prin e%perienţe efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat şi pus în practică de către 2orel şi 2artin. 8ulpinile generate in vitro, neposedând rădăcini, au fost transformate în minibutaşi. 'ceştia au dat naştere la plante libere de viroze. 'u urmat apoi cartofii şi orhideele. (n ),1N, Xua4 a remarcat că metoda lui 2orel şi 2artin este posibil de aplicat, cu aceleaşi rezultate, la garoafe. !in acel moment s-au demarat cercetările în scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare şi producere a unui material săditor sănătos, cu randament economic asigurat, având ca obiectiv obţinerea de flori de calitate superioară. (n acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la atacul viral. !acă prelevarea se face de la o plantă neinfectată, sau care prezintă o infecţie virală slabă, atunci cresc şi mai mult şansele de a preleva e%plante meristematice, lipsite de infecţii virale. !in păcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. 7le se pot îmbolnăvi tot atât de repede ca şi oricare altă plantă. !e regulă, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigură multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutaşi, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o plantaţie mamă, donatoare de meristeme ori chiar de butaşi, plantaţie e%ecutată în condiţii speciale de protecţie, încât plantele să fie ferite de atac zoopatogen. Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin e%plante meristematice, asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. 'stfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu .usarium roseum, iar la !elargonium şi /iffenbac ia eradicarea bacteriozelor sistemice "Ral4eQ, ),N,#. Cercetările recente au dovedit însă, că nu toate meristemele sunt libere de infecţii virale. <nvazia meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul meristemului, al virusului şi de specia plantei parazitate. Cu cât e%plantele meristematice sunt mai mici, cu atât şansa prelevării de celule lipsite de virusuri este mai mare, dar cu cât inoculul meristematic este mai mare, cu atât este mai ridicată capacitatea lor regenerativă. >u toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică "2artin, ),NN#. !e e%emplu, la cartof, virusul Y poate fi înlăturat, prin înmulţire meristematică, numai în procent de )H. Enele virusuri pot e%ista chiar şi în meristemele apicale ".ollings, ),3+#. 8ermoterapia vine în a utorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de combatere a infecţiilor virale, la plante. 8ermoterapia a fost elaborată de către /un4el, în ),;3. 'ceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între ;1-;,oC, timp de +-C săptămâni. (n cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică: ele rămân la nivelul celulelor în care au fost surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic. Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează, cu şanse foarte mari de reuşită, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. (n consecinţă, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil e%plantării, tratamentului termoterapeutic. !ar, în această situaţie, descreşte vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scăderea capacităţii de supravieţuire şi de regenerare a celulelor meristematice. &e durata termoterapiei, ape%ul se alungeşte iar virusurile, nemultiplicându-se, rămân în celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce înlesneşte prelevarea unor e%plante apicale mai mari de până la ) mm, micşorând

pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului, infectate cu germeni fitopatogeni. (n consecinţă, e%plantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată, ceea ce compensează epuizarea fiziologică, cauzată de termoterapie. /assanis "),1-# a dovedit că unul din virusurile cartofului, localizat în frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. !ar tot /assanis a precizat că la tomate e%istă virusuri a căror activitate este suprimată abia la *-oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe cercetători să prelungească durata termoterapiei, de la câteva zile la câteva luni şi să ridice temperatura de la ;1 la C-oC "Xua4, ),NN#. .a44aart şi Xua4 "),3C#, e%perimentând cu meristeme e%cizate de la crizanteme, de până la ) mm lungime cu +-; primordii foliare, au constatat că prelungirea duratei de termoterapie de la )--+- zile la ;- zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la , la ,-H dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp "până la 1--3- zile#nu a condus la depăşirea procentului de plante devirozate. (n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în decursul cultivării ţesuturilor in vitro. 'stfel, .ollings şi Stone "),3C#, au reuşit această performanţă la garoafe, iar Ral4eQ şi colab. "),3,# la cireş. 'ceastă eradicare endogenă a virozei, în interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecinţă a traumatizării celulelor e%cizate. Cu cât a fost mai mic fragmentul de ţesut e%cizat, cu atât traumatismul a fost mai puternic şi efectul endogen, distructiv, e%ercitat asupra virusului, a fost mai mare "Ral4eQ, ),*-#. !e regulă însă, este imposibil să regenerăm anumite specii de plante din fragmente atât de mici de ţesuturi: ori în alte condiţii, nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare încât să se producă o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele e%plantate, soldată cu suprimarea atacului viral. 7%plicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre ustificări de ordin molecular. Ena din ipoteze susţine că e%istă o competitivitate între celula gazdă şi parazit, în ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie: altă ipoteză, susţine că celula meristematică utilizează '0> viral, sau că substanţele generate în urma traumatizării celulelor ar suprima virusurile prezente în celule. (n anul ),N*, Ral4eQ, a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro a ţesutului gametofitic femel, respectiv ovare sau ţesut nucelar, sau a meristemului floral. 8rebuie subliniat şi marele merit pe care 2orel l-a avut în intuirea importanţei deosebite a descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave, precum şi a direcţiilor aplicative pe care le-a deschis această tehnică, efectuată în condiţii aseptice. Cele mai mari realizări le-a avut 2orel în multiplicarea in vitro la orhidee. 'stfel, în anul ),3;, 2orel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. 'cestea se refereau la faptul că meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, generează un glomerul de )-+ mm, de culoare verde, numit protocorm. &rin ruperea şi cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă globuloasă, un glomerul de cca ;-C mm slab diferenţiat histologic, constituită dintr-un parechim, cu celule mari, sărace în citoplasmă şi cu vacuole întinse. (n partea centrală a glomerulului se disting câteva fascicule vasculare. =ragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. (n anul ),N*, 2urashige afirma că, dintr-un meristem de orhidee, în decursul unui an, prin fragmentări şi subcultivări repetate ale protocormilor, se pot obţine cca C milioane de noi plante de orhidee. &rotocormul produs in vitro este asemănător cu protocormul de germinaţie, rezultat din embrionii seminţelor. (n ),1,, 2artin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu e%plante, în care să fie conservat materialul biologic meristematic sănătos. &rin această tehnică, astăzi, materialul vegetal generat in vitro este uşor conservat, ţesuturile deţinând nealterată, întreaga lor capacitate regenerativă.

Baloarea mare a culturii de meristeme constă deci în6 -asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor, generat in vitro: -eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni: -creşterea la ma%imum a coeficientului de multiplicare, în cel mai scurt timp, a unui e%emplar vegetal: -obţinerea unui material săditor uvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiţionale de înmulţire vegetativă: -conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici, pentru o lungă perioadă de timp, într-o anumită fază de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce să asigure, oricând, necesarul de material săditor solicitat pe piaţă: -conservarea germoplasmei în bănci de gene. (n e%tinderea rapidă a acestor practici, în regim industrial a predominat factorul economic rezultat, în primul rând, din aspectele fitosanitare, respectiv din obţinerea unor culturi viguroase, sănătoase. 'stfel, cartoful, plată e%trem de importantă atât în hrana omului şi pentru industrializare dar şi în hrana animalelor, a beneficiat primul de e%tinderea metodelor de redresare a vigurozităţii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivând in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumărate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent în ţesuturi, ceea ce epuizează planta şi scade, considerabil recolta. &ierderile sunt cifrate la )1-+1H. !in nefericire, nu toate tipurile de virusuri pot fi în egală măsură combătute. 'stfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des în cultură "', W, 2, S, Y# virusul ' este mai uşor de îndepărtat, comparativ cu virusul Y. 2ultiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. 'stfel, în =ranţa, cifra de afaceri realizată, în categoria florilor tăiate, prin vânzarea garoafelor, ocupă locul doi iar e%portul horticol francez este reprezentat în proporţie de *-H de garoafe, ,-H dintre acestea provenind din mutaţii de culoare, practicate la tipul american de garoafă creat de Rilliam Sim, în ),;,. 2ultiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de e%emplare. Conservarea calităţilor sale genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale. <nfecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult şi capacitatea de înrădăcinare a butaşilor. (n laboratoarele unei singure unităţi se produc anual, in vitro, cca )- --- de garoafe. (nmulţirea meristematică a permis vindecarea garoafelor şi de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de ! ialop ora cinerescens0 .usarium o$ysporum0 şi a bacteriozelor !seudomonas caryop ylli şi !ectobacterium part enii. !e o mare importanţă este cultura orhideelor, obţinerea de material săditor devirozat la garoafe, căpşun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori şi arbuşti. !ar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea, ca scop în sine, numai eradicarea bolilor ci pur şi simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. 'ceastă metodă este cu atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat. Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar şi anume6 -unele procedee vizează cultivarea e%clusivă a celulelor conului meristematic, fără primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, în dependenţă de dimensiunea redusă a e%plantelor şi de consecinţele traumatismelor provocate: -altele privesc obţinerea de material săditor devirozat, e%plantele constând din meristeme recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare, lungimea e%plantelor fiind de până la 1-- Zm, respectiv -,+1--,N mm: -altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule, în timp scurt utilizând e%plante mai mari de )-1 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme a%ilare şi de muguri adventivi pe ape%ul iniţial. (n oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea, cu mare atenţie şi pricepere, a plantelor mamă, donatoare de e%plante. 7ste de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într-

o perioadă de creştere activă. 9atenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică aplicarea unor tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergenţa meristemelor. 'legerea e%plantelor, sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultură folosit, regimul din camerele de creştere influenţează supravieţuirea e%plantelor. 0estabilirea proceselor biologice, de diviziune şi de regenerare precum şi sensul desfăşurării histo şi organogenezei, diferenţierea de plante, dezvoltarea lor şi apoi capacitatea adaptativă a acestora la mediul normal sunt influenţate atât de factori endogeni, cât mai ales de cei e%ogeni, în special de balanţa hormonală şi de regimul de lumină, respectiv de temperatură. !e regulă meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapidă creştere. Cu toate acestea şi meristemele laterale, prelevate din mugurii a%ilari, pot fi folosite în culturile de meristeme. 9a crizanteme din 1--- de vârfuri meristematice, ;+H din mugurii apicali, terminali, au crescut, generând plante mature, în timp ce numai )*H din mugurii laterali au format noi plante. 2ărimea e%plantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. Când se are în vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe, e%plantul nu trebuie să depăşească -,1 mm dar nici să fie mai mic de -,+ mm, deoarece, în acest caz, este dificilă înrădăcinarea plantulelor generate din meristeme. (n cazul în care s-a aplicat corect termoterapia e%plantul poate fi mai mare, de până la ) mm. (n camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă să fie de +C---+3-- lucşi, în regim de fotoperioadă cu )3 ore lumină şi * ore întuneric. (n alte cazuri, lumina trebuie intensificată la ;1---C--- lucşi, iar la conifere se poate a unge chiar la o intensitate de peste )- --- lucşi. 8emperatura trebuie să fie stabilizată între ++-+1oC. Eneori e%istă indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de iluminare, cerute de un anumit tip de cultură, potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei anumite etape de dezvoltare a inoculilor. (n literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. 'stfel, se specifică că meristemele de garoafe supravieţuiesc, în proporţie mai mare, dacă sunt recoltate primăvara sau toamna devreme: meristemele recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze "Ban $s, ),3C#. 9a cartof, meristemele recoltate primăvara sau vara, de timpuriu, înrădăcinează mult mai repede în raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului. (n ceea ce priveşte substratul de cultură, de cele mai multe ori, se utilizează medii de cultură solide. 9a cartof, garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. &.-ul mediului de cultură poate constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului cultivat in vitro. 'stfel, de regulă, p.-ul de 1,1-1,* este indicat ca fiind optim: după autoclavare, p.-ul scade, iar în decurs de o săptămână de la cultivarea ţesuturilor, p.-ul descreşte până aproape de 1,C. En p. iniţial scăzut inhibă formarea rădăcinilor. (n compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente, =e7!8', vitamine, aminoacizi şi o sursă de carbon organic, reprezentată, de regulă de zaharoză în concentraţie de +-;H. >atura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta, în funcţie de scopul urmărit. 'stfel, pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere '>' şi '<', care însă folosite timp îndelungat pot duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. (n acest caz, se recomandă subcultivarea e%plantelor pe medii lipsite de au%ine. Citochininele stimulează creşterea meristemelor, mai ales în cazul în care ele se fală în latenţă, precum şi formarea de nenumăraţi muguraşi. Concentraţia fitohormonilor de creştere variază în diferitele faze de evoluţie ale meristemelor. &lantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile in vitro, fiind trecute în condiţiile mediului septic. 7le vor fi transferate în ghivece mici, în amestec de perlit cu pământ. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic,chiar neînrădăcinaţi, această operaţiune putând determina înrădăcinarea lor. AuQs "),3,#

recomandă transferarea timpurie în sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, întrucât rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură folositoare în sol, iar prelungirea duratei de menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură, ridică ne ustificat costul materialului plantat rezultat. 'tunci când plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic, eventuala prezenţă a virusurilor şi gradul de infecţie. 2etodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta. (n ),NN, Clar4 şi 'dams au pus la punct un procedeu 79<S' de identificare a prezenţei virusurilor, iar în ),N;, !erric4, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate în determinările de virusologie vegetală. &entru a uşura e%actitatea investigaţiilor este de dorit să se facă o analiză a infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum şi în cultura, sau culturile apropiate. !upă stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie menţinute în condiţii speciale fie că ele sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute, în recipientele lor de cultură, pe medii aseptice, fie că sunt cultivate în teren, într-un perimetru ferit de infecţii, metodele fiind menite să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor. 2etodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum şi a unei cantităţi limitate de material iniţial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi e%trem de scăzute. (n aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. &rimele încercări de crioconservare au fost făcute de către Seiberg în anul ),N3, la garoafe. Elterior sa reuşit şi conservarea altor tipuri de inoculi6 calus, celule sau protoplaşti. 8ehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare, cu rol în prevenirea daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor, respectiv formarea cristalelor de gheaţă. Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfo%idul "!2S$# şi glicerolul "/artha, ),*), citată de Cachiţă, ),*C#. 2eristemul este ţesutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi scăzute, graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. 'stfel, el îşi poate păstra întreaga capacitate regenerativă, întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime de mediu, celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. 2eristemul se pretează cel mai bine conservării prin crioconservare, celulele lui fiind sărace în vacuole şi având o citoplasmă densă. &entru e%ecutarea operaţiunilor de congelare, îndeosebi pentru coborârea gradată a temperaturii, e%istă dispozitive speciale. $ metodă accesibilă preconizează introducerea flacoanelor cu inoculi într-o baie de alcool, mediu în care se produce descreşterea gradată a temperaturii. (n anul ),*-, !ale şi colab. 'u pus la punct o metodă de stocare la temperaturi scăzute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constând în conservarea îndelungată a plantelor, generate in vitro, prin menţinerea lor la temperaturi de +-CoC, în regim de * ore lumină pe zi si o intensitate de ;-- lucşi. Cultura poate fi menţinută astfel )--)) luni, după care se recomandă ca aceasta să fie transferată pe mediu proaspăt. $ altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro. &lantele provenite atât din meristeme cât şi din e%plante de altă natură, prezintă un grad de uvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. 'stfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui obţinut prin metodele tradiţionale6 butăşire, marcota , altoire. [uvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic, de e%emplu la plantulele de căpşun, diferenţiate din meristeme. 9a căpşun, frunzele tinere sunt întregi, în timp ce frunzele plantelor bătrâne sunt trifoliate. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la inoculi în momentul în care se depăşeşte faza de morfogeneză, constând în proliferarea a noi muguri a%ilari, prin repicări repetate şi cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină.

En caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate meristeme apicale. En e%emplu îl constituie plantele lemnoase, multianuale. 7%plantele sau butaşii prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare. 9a aceste plante se practică diferite metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri in vitro, altoiri de ape%uri de plante adulte pe tinere plantule. Sfecla constituie un alt e%emplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte scăzută capacitate organogenetică. !e aceea se recomandă inducerea formării de meristem prin repicări succesive. $ problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii aseptice, într-o stare primară, întrucât în cazul în care se inoculează un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpină floriferă, e%istă pericolul ca anumiţi factori de mediu să inducă formarea florilor sau invers, să grăbim, prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de mediu, transformarea unui mugur vegetativ, în mugure florifer. 0eglarea fotoperioadei şi sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la C--1- gDl sunt factori care par să determine transformarea ape%ului vegetativ în florifer. 9a numeroase plante, detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă ţesuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, generând muguraşi. 'deseori, se formează muguri a%ilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui să se formeze boboci. <nocularea in vitro, pe medii, cu sau fără fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescenţe tinere conduce la formarea a numeroşi muguri. 9a conopidă, prelevarea unui mic e%plant din ape%ul preinflorescenţei şi cultivarea lui pe mediu lichid, cu o au%ină "'<'#, provoacă reveria ţesuturilor din florifere în vegetative. 'stfel, poate fi înmulţită planta pe cale vegetativă "Crisp şi colab., ),NC, citat de Cachiţă,),*C#. $riginea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea, în direcţia diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă, într-o anumită fază de dezvoltare a plantelor sau a organelor. 0euşita este dependentă de vârsta ţesutului, de specie şi de condiţiile de mediu. 'mbele tipuri de meristeme, diri ate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante. 9.1.D.* C'&$'"! ,e #!&'% Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule deţinând o structură histologică uniformă. !e regulă, când este tânăr, posedă celule nediferenţiate, care se divid activ. En anumit tip de calus se produce şi în mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, având rol în cicatrizarea rănilor, fie se formează la baza butaşilor plantaţi pentru înrădăcinare, constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive. (n funcţie de obiectivul urmărit, obţinerea de calus poate constitui un scop în sine, alteori apariţia şi dezvoltarea lui poate fi un dezavanta . <nducerea formării de calus cât mai friabil constituie scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei culturi de protoplaşti. <nstabilitatea genetică a celulelor sale şi poliploidizarea facilă a lor, în anumite condiţii de cultură, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări, selectându-se linii cu calităţi speciale. 2ultiplicarea clonală, via calus nu este posibilă tocmai din cauza facilei poliploidizări a celulelor sale. &e această cale se practică însă înmulţirea regenerativă, rapidă a unei specii, fără a avea siguranţa conservării genotipului. 9a unele specii6 morcov, tutun, crizanteme din calus se pot obţine uşor plante. 9a specii ierboase "bumbac#sau la plante lemnoase "ste ar#, geneza de plante din calus este e%trem de dificilă. 'tunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă, formarea de calus în porţiunea bazală a e%plantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un

fenomen care perturbă diri area proceselor de morfogeneză. 'stfel, administrarea unei balanţe hormonale neechilibrate, face ca la baza e%plantului să se genereze calus, cauzând dezvoltarea preponderentă a rădăcinilor, în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers, se formează unul sau mai mulţi muguraşi, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat şi subcultivat pe un mediu cu sau fără au%ină. 'ceastă metodă se practică cu succes, atunci când se procedează la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale "Saintpaulia şi Gerbera#, constând în desprinderea de propaguli, de pe un ţesut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniţial, situat în porţiunea bazală a coloniei de propaguli. Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită, întrucât el poate fi înmulţit şi cultivat la nesfârşit, atunci când, periodic, se procedează la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. =iecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. Calusul crescut la +1oC se recomandă a fi repicat la un interval de C-3 săptămâni, în dependenţă de natura ţesuturilor din care a provenit şi de condiţiile în care a fost cultivat. >umai prin subcultivări repetate poate fi conservată vitalitatea celulelor sale. !acă calusul nu este subcultivat în timp util, se produce o îmbătrânire a celulelor sale, masa tisulară îşi schimbă culoarea, din gălbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuşie sau galben-brună: uneori culoarea calusului devine roşiatică sau vişinie, datorită formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar. &rovenienţa calusului şi natura inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. Street "),N;# precizează că trecerea calusului în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a cantităţii de antociani. !e altfel, s-a constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor "Gautheret, ),1,, citat de Cachiţă, ),*C#. (n general, prezenţa luminii şi natura acesteia intensifică acumularea în celule a antocianilor. 'ntocianii sunt sintetizaţi însă şi la întuneric. 'stfel 7ri4sson "),3N# iradiind o cultură de celule de Haplopappus cu raze EB, a izolat o linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de antociani. =itohormonii de creştere şi natura acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. 'stfel, au%ina inhibă, iar citochininele stimulează formarea antocianilor "Street, ),NN: /alinin, ),*)#. 8emperatura scăzută, carenţa de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide stimulează sinteza de antociani. Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o creează, întrucât şi un conţinut ridicat de >aCl stimulează formarea acestor pigmenţi. 9a plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă, decât la gimnosperme sau la monocotiledonate. &e măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură, în profunzime se diferenţiază centri vasculari, ori noduli organoformatori. (n morfo şi organogeneza calusului un rol determinant îl au mediul de cultură şi condiţiile de cultură, natura ţesuturilor din care a provenit calusul şi vârsta acestora. =ormarea, creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia fitohormonilor de creştere, prezenţi în mediile de cultură. !e regulă, concentraţiile ridicate de au%ină conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente au%ine în inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul +,C diclorfeno%iacetic "+,C!# şi acidul +,C,1 triclorfeno%iacetic "+,C,1 8#, folosite în concentraţii cuprinse între )-)- mgDl. (n general, calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă diferită, chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. 'stfel, prin inocularea de liber secundar, muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat în +,C!, se a unge uşor la formarea de calus. Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte, legate între ele, sau pot fi mai la%e, formând un calus friabil, grun os, separabil în fragmente granulate, de mărimi diferite, mai greu dezagregabile, sau spumos, ce se separă în formaţiuni tisulare fine, adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule. Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost detaşate e%plantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de creştere prezenţi în substratul de cultură şi uneori de condiţiile de cultură.

Capacitatea organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal este dependentă atât de factorii endogeni şi e%ogeni, de numărul repica elor făcute, de condiţiile de cultură şi de vârsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar şi după cinci ani, îşi menţin o potenţialitate ridicată de a regenera plante "la tutun#. Calusul provenit din plantele monocotiledonate "cereale# are o capacitate regenerativă scăzută, evaluată la câteva săptămâni "Conger, ),*)#. !intr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar, ce conţine un număr de apro%imativ 1- --- celule. !upă cca şase săptămâni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspăt, se numeşte calus secundar. Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un calus de tip neregenerativ ce prezintă, de regulă, o creştere lu%uriantă, din el diferenţiindu-se rădăcini, şi uneori muguraşi, dar niciodată plante ">abors, ),*+#. 'ceste două tipuri de calus au mai fost denumite calusuri embriogene şi neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare albă-lăptoasă, spre galbenă, ori galbenă-verde. Citologic se remarcă zone compacte, cu celule nediferenţiate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o masă cristalină, transparentă, de culoare albă, brunie sau verde. 'cest tip de calus prezintă o consistenţă mai la%ă, fiind mai friabil, desfăcându-se uşor în pachete de celule. 0egiunile friabile prezintă celule mari, mult vacuolizate. 'ceste regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi dar niciodată plante. >abors a fost primul care a dovedit că cea mai ridicată capacitate regenerativă, menţinută timp îndelungat o prezintă calusul embriogen, denumit de tip regenerativ. 8ot >abors a observat că acest calus regenerativ tinde să devină neregenerativ: după producerea acestei reversibilităţi procesul este definitiv, întrucât cele două forme sau tipuri de calusuri, diferite funcţional, nu sunt interconvertibile. !e altfel, cele două tipuri de calusuri necesită fitohormoni diferiţi, în doze variate, atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. !e regulă, calusul neregenerativ creşte abundent, în timp ce calusul regenerativ are o creştere mult mai lentă, chiar şi pe medii potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a acestuia. &entru a preîntâmpina dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus regenerativ omogen sau cel puţin predominant ca masă, într-o populaţie de celule calusale. >abors a remarcat şi faptul că ceea ce la un anumit moment, într-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului, pare să fie ţesut de tip neregenerativ, poate genera, în continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate şi subcultivate "Cachiţă, ),*C#. =recvent, cele mai bune medii de cultură, adecvate creşterii optime a ţesutului calusal, nu constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. (n general, mediul 9insmaier-S4oog "),31# sau cele de compoziţie similară, respectiv sărace în azot cu p.-ul 1,1 sunt de preferat. 9a cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului +,C,1 triclorfeno%iacetic, având efect pozitiv în susţinerea creşterii calusului. 'cest mediu însă nu este cel mai potrivit pentru inducerea şi menţinerea proceselor regenerative. (n general, calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. !ar şi la calusul bogat în zone regenerative acestea reprezintă numai cca )-)-H din totalul masei calusale. !acă regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să impulsioneze şi să susţină procesele regenerative, celulele lui vor da în final naştere la plante. Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar, prin menţinerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivări de întreţinere. &e altă cale se pot identifica şi izola insulele de calus regenerativ, pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizându-se transferarea lor pe un mediu de creştere adecvat.

(n decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric decât din cei crescuţi la lumină. 0egiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la întuneric. &rocentul de formare al calusului regenerativ creşte însă la calusul crescut în condiţii de întuneric. 9a grâu, calusul trebuie transferat la interval de cinci săptămâni, pe mediu potrivit inducţiei diferenţierii de plante. 9a calusul de grâu, regenerarea se realizează pe un mediu lipsit de fitohormoni de creştere: astfel din calusul de tip regenerativ, în cca +-1 săptămâni după transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. &e un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai creşte. !acă calusul este mi%t, componenta neregenerativă continuă să crească mult: concomitent, însă, din porţiunile de calus de tip regenerativ, în cultură se diferenţiază şi plante. !upă două subcultivări ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni de creştere, potrivit inducerii neoformării de plante, se recomandă transferarea calusului rămas, pe un mediu conţinând au%ină, pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia. &lantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise, conţinând perlit, care va fi udat cu apă de la robinet, urmând ca după )-+ săptămâni, plantele bine înrădăcinate, să fie transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit. Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule, cultivându-l pe medii lichide, obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri. (n vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape6 -alegerea materialului vegetal, din care se va e%ecuta prelevarea e%plantelor. Calusul poate fi obţinut din e%plante provenite din diverse surse6 seminţe, embrioni, rădăcini, ţesut de rezervă, frunze, ramuri, antere, ovare: -prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de scopul propus. 'tunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultură oarecare, conţinând substanţe anorganice "macro şi microelemente# şi substanţe organice "sursă de carbon organic, vitamine, aminoacizi şi fitohormoni#, iar solidificarea mediului se realizează cu agar: -sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură: -pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării e%plantelor. Se realizează curăţirea organelor şi dezinfectarea lor, folosind diverse procedee în funcţie de tipul de e%plant utilizat: -dimensionarea e%plantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de tipul de organ folosit ca sursă de e%plante: -inocularea e%plantelor se realizează în condiţii aseptice, la hota cu flu% de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării culturii: -incubarea inoculilor se face fie la întuneric, fie la lumină, de regulă la temperatura de o +1 C: -observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp: -subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectuează la cca C-3 săptămâni, fiind obligatorie pentru menţinerea viabilităţii calusului. 7ste importantă ţinerea unei evidenţe stricte a numărului de subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal: -urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în care a fost cultivat calusul, de provenienţă şi de vârsta acestuia. Oesutul calusal are o utilizare variată. 7l constituie unul din materialele biologice asupra căruia se pot aplica diferiţi agenţi selectivi, în scopul obţinerii de linii rezistente, pentru selecţionarea de plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit factor de stres. >abors "),*+# a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii

ridicate de >aCl, substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură. 'stfel, a raportat obţinerea de plante de -riticum0 +risa şi !ennisetum tolerante la concentraţii ridicate de >aCl "-,3--,,H#, precum şi la #vena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la -,-;H. 9a grâu, cel mai bun calus, care răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obţinut din rădăciniţa embrionară, dezvoltat în condiţiile germinării cariopselor pe medii aseptice. 'tunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de grâu se sterilizează, după care, la microscop, se detaşează embrionii, evitându-se lezarea acestora şi inoculându-i pe mediu de cultură. 2ediul de cultură recomandat pentru grâu "cariopse sau embrioni imaturi# este 9insmaier-S4oog, conţinând macro şi microelemente, vitamine, sursă de carbon "zaharoză#, fitohormoni "+,C! sau +,C,1 8# şi agar. 'genţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de cultură, preparat pentru inducerea formării de calus, fie se adaugă în substratul de cultură destinat repicării calusului. (n cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a culturii de calus, o varietate în mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului selectiv în cauză, se realizează o reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobândite stabilizate, transmisibile descendenţilor. S-a constatat că stabilitatea caracterelor dobândite este dependentă de durata în care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp în care s-a operat selecţia. &entru a fi atinsă o stabilă toleranţă, chiar şi în condiţiile absenţei îndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt necesare cel puţin şase luni de călire şi selecţie, prin subcultivări repetate. 2enţionăm că şi în situaţia unor e%perimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenţierii capacităţii regenerative a calusului, în calus de tip regenerativ şi neregenerativ. >umai din calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante: calusul de tip neregenerativ este inutilizabil în acest gen de e%perimente. Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite e%perimente de fiziologie, în studierea problemelor de morfogeneză, în urmărirea unor modificări ultrastructurale, în analize de ordin biochimic, sub acţiunea unor anumiţi factori, administraţi e%ogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul. (n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reacţiei celulei vegetale la o serie de substanţe sau condiţii de cultură, permiţând efectuarea unor e%perimente de fiziologie privind6 creşterea, reacţia la pesticide, no%e, ioni grei, respiraţia, morfo şi organogeneza, testarea viabilităţii celulare, a biogenezei unor produşi primari sau secundari de metabolism. 9.1.D.4 C'&$'"! ,e e+8"i(ni :i en,(%-e"+ Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practică în diferite scopuri, atât pentru cercetări de fiziologie a seminţei cât şi în e%perienţe de hibridări intersoiuri, interspecii şi intergenuri. (ncă din ),-C, .anning a demonstrat posibilitatea cultivării pe medii aseptice a embrionilor de ,ap anus şi Cac learia pe soluţii minerale cu adaos de zaharoză, obţinând plantule transferabile în sol. 2etodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecţionate continuu. Ban Xverbee4 şi colab. "),C)# au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui 9ee "),11# şi 2orel "),13# să efectueze e%perienţe de multiplicare in vitro folosind ca material iniţial embrioni e%traşi din seminţe coapte. Seminţele au fost sterilizate, după care au fost îmbibate în apă, )+-+C ore, şi apoi, în condiţii aseptice a fost izolat embrionul. 7mbrionii pot fi cultivaţi in vitro, ca atare sau se operează detaşări de fragmente embrionare, sau sunt cultivaţi în scopul obţinerii de calus, care este utilizat ulterior în alte

e%perimente. 7%istă şi practici constând în grefarea de embrioni pe endospermul aparţinând altor specii sau genuri, operaţie denumită hibridare in vitro. &roblemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de e%plante, comple%e. En rol deosebit revine momentului în care se e%ecută e%plantarea embrionului, respectiv timpul scurs după fecundare, din clipa formării zigotului şi până la inocularea lui in vitro, perioadă care e%primă vârsta embrionului în zile. $vulul fertilizat adăposteşte zigotul care, după formare, începe să se dividă şi se hrăneşte din rezervele endospermului. (n această fază celulele embrionului sunt heterotrofe: pentru creşterea şi dezvoltarea lor ele au nevoie de6 glucide, aminoacizi, vitamine şi hormoni. (n această etapă e%plantarea embrionului şi inocularea lui pe medii aseptice creează probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continuării proceselor de creştere şi de dezvoltare. !e regulă, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice în momentul în care sunt formate cotiledoanele, respectiv când începe diferenţierea internă a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogenă a structurii embrionare variază de la specie la specie şi uneori este dependentă de condiţiile meteorologice. (n unele cazuri, când este importantă izolarea timpurie a embrionului de sub acţiunea plantei mamă, poate fi realizată o creştere corespunzătoare a acestuia numai dacă embrionul este izolat împreună cu nucela sau cu ţesutul nutritiv, sau dacă se detaşează ovulul în întregime realizându-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunzătoare ca şi compoziţie. &rin cultura in vitro de embrioni se poate preîntâmpina avortarea sau dezvoltarea anormală a embrionilor ca urmare a instalării unei incompatibilităţi între embrion şi ţesutul nutritiv, aşa cum este cazul hibrizilor se%uali intervarietăţi interspecii şi intergenuri, sau al formării de hibrizi sterili. Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridică mari probleme, cultura de embrioni maturi este mult mai uşor de realizat. 7mbrionii maturi necesită un mediu de cultură simplu, care are în compoziţia sa săruri minerale şi o componentă glucidică. 'dăugarea la mediul de bază a vitaminelor "acidul nicotinic, acidul ascorbic, pirido%ină# impulsionează creşterea ţesuturilor, iar adăugarea fitohormonilor de creştere are drept scop urmărirea evoluţiei embrionilor în prezenţa acestora, pentru a asigura stimularea creşterii unui anumit organ sau pentru inducerea formării de calus. (n mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomandă adiţionarea unor e%tracte naturale6 hidrolizat de caseină, lapte din nucă de cocos, suc din fructe de tomate sau e%tract de endosperm. (n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiţia ca ei să fie e%plantaţi în acea fază de formare care să le permită, în continuare parcurgerea evoluţiei fireşti a proceselor de ontogeneză şi să se respecte integritatea lor morfoanatomică: cu cât stadiul în care au fost prelevaţi a fost mai timpuriu cu atât şi factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai complecşi şi greu de reprodus. (n timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similară cu cei dezvoltaţi în condiţii naturale, sau prezintă chiar un uşor avans în creştere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt plăpânde, iar în sol dovedesc o creştere mai lentă şi sunt mai firave. Cultura de embrioni imaturi, recoltaţi foarte tineri, uneori conduce la obţinerea de plantule malformate, chiar dacă mediile de cultură au o compoziţie adecvată dezvoltării acestora. (n unele cazuri, după polenizarea interspecifică sau intergenerică, dezvoltarea embrionilor a fost e%trem de lentă, ceea ce a făcut ca e%plantarea embrionilor şi cultivarea lor in vitro, să fie imposibilă. 8aira şi 9arter "),N*# au tratat ovulele fertilizate cu acid 7-aminon-caproic, facilitând astfel, creşterea embrionilor hibrizi, realizaţi între grâu şi secară, depăşind barierele fiziologice care împiedicau creşterea acestora. !eci, pretratamentul florilor femele cu anumiţi regulatori de creştere, după polenizare, impulsionează creşterea embrionilor până la faza în care ei pot fi e%traşi şi cultivaţi, cu succes, pe medii aseptice.

&rin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante mature din hibrizi de trifoi +n % Cn, îmbinându-se caracterul de perenitate cu cel al calităţii fura ului realizat "7vans, ),3+#. 0ezultate bune s-au obţinut şi în regenerarea de plante din embrionii altor specii fura ere, obţinându-se hibrizi interspecifici de *elilotus0 "otus0 ! aseolus0 şi *edicago. 8ot prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante la specii ale căror seminţe nu germinează "banane# sau a celor care se înmulţesc greu prin seminţe "specii forestiere#. (n unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de latenţă, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metodă eficientă în scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor. !e asemenea, embrionii pot să servească şi ca ţesuturi de plecare în multiplicarea şi propagarea rapidă a unor plante "la specii ornamentale# atunci când acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de e%plante. $ atenţie deosebită trebuie acordată aspectelor teoretice şi practice pe care le ridică problemele de embriologie e%perimentală la gimnosperme. Cea mai veche cultură de embrioni la gimnosperme este citată ca fiind efectuată de către Schmidt în anul ),+C, când a cultivat pe un mediu organic embrioni de !inus sylvestris. 2ai târziu, în ),;3 0ue a reuşit cultivarea in vitro a embrionilor proveniţi de la câteva specii6 !inus resinosa0 !icea canadensis0 -suga canadensis şi !seudotsuga men%iensii şi a demonstrat, totodată, că embrionul imatur de gimnosperme "de +-C mm# poate fi cultivat pe medii aseptice, până la stadiul de plantulă. 7%perimentele ulterioare au reliefat faptul că embrionii de gimnosperme pot fi crescuţi in vitro, în lipsa megagametofitului "Cachiţă, ),*C#. 9a cultura de embrioni, presiunea osmotică, sau sursa de carbon organic, oacă un rol important în evoluţia acestora, atunci când embrionii sunt e%cizaţi şi sunt cultivaţi in vitro. !e e%emplu, embrionii de !inus strobus0 pe mediu 2urashige-S4oog, cun un conţinut de ;-3H zaharoză şi hormoni, vor genera plantule, în timp ce pe un mediu cu numai )-+H zaharoză, se constată o serioasă limitare a dezvoltării primordiilor radiculare. &rin cultivarea in vitro a embrionilor de -a$aus embryo s-a reuşit scoaterea acestora din starea de latenţă, odată cu detaşarea şi desprinderea lor de sub acţiunea megagametofitului. Cultura de endosperm constituie un e%celent instrument pentru studierea problemelor de morfogeneză şi se referă la cultura endospermului de tip secundar, derivând din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar, având celule triploide, gimnospermele având un endosperm de tip primar. 'mbele tipuri de endosperm deţin un rol important în alimentarea şi susţinerea creşterii embrionilor. 9a plantele dicotiledonate, de regulă endospermul este consumat în primele faze ale dezvoltării embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor. &rimele e%perimente constând în proliferarea endospermului imatur de porumb au fost efectuate încă din anul ),;; de către 9ampe şi 2ills. 9a 0ue, în anul ),CN, a realizat creşterea nelimitată a endospermului de porumb. Cercetările menţionate au deschis calea unor e%perimente prin care s-a dovedit că acest ţesut iniţial are o capacitate ridicată de proliferare, formează uşor rădăciniţe, muguraşi şi chiar plantule. (n această direcţie, Straus şi 9a 0ue în ),1C, au obţinut rezultate e%celente cultivând endosperm de porumb, la )+ zile de la polenizare. Cele mai bune varietăţi, potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat. 7ndospermul de porumb, la * zile după polenizare, nu creşte pe medii aseptice. !eci, pentru reuşita iniţierii culturii este important stadiul în care se află diferenţierea celulelor embrionului. 7ndospermul matur, doar la câteva specii sau varietăţi, corespunde scopului inducerii formării de calus şi anume6 1ea mays0 "olium0 Santalum0 ,icinus0 Coffea arabica0 Croton0 !etroselinum ortense. !intre acestea numai la unele specii se manifestă procese de organogeneză. 7ndospermul de porumb, de ricin, precum şi la alte specii, generează o masă

de calus în continuă creştere, fără organogeneză, în timp ce la nivelul valusului de !etroselinum se observă embriogeneza. Cultura de embrioni oferă un important instrument în cercetările de embriologie şi în embriogeneza e%perimentală, constituind un sistem de tip monitorial în redarea fazelor de creştere ale diferitelor părţi componente ale embrionilor. 'ceste etape pot fi studiate în dependenţă de natura substratului de cultură, de vârsta embrionului, în funcţie de condiţiile de mediu, oferind importante informaţii privind interferenţa diferitelor etape metabolice cu regulatorii de creştere, procesele de depozitare ale substanţelor de rezervă în ţesuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, în formarea şi creşterea embrionilor. 9.1.D.6 C'&$'"! ,e ()!"e, ()'&e :i ,e ţe%'$ n'#e&!" (n hibridare poate e%ista, adeseori, o incompatibilitate între partenerii se%uali. !e aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de către ovule a autopolenizării ori a polenizării încrucişate, învingându-se astfel barierele de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la încrucişări, operaţiunile fiind făcute în scopul obţinerii de seminţe viabile. <ncompatibilitatea dintre ovule şi polen este provocată de către diferite cauze, de ordin endogen şi anume6 o primă selecţie a polenului se face la nivelul stigmatului. 'ceasta poate prezenta o conformaţie morfologică necorespunzătoare, împiedicând angrenarea ornamentaţiilor e%inei polenului pe vilozităţile stigmatului: pe de altă parte, natura umedă sau uscată a suprafeţei stigmatului poate constitui un impediment în reţinerea polenului pe stigmat şi în crearea mediului optim: substanţele secretate de către celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum şi creşterea tubului polinic. (n unele cazuri e%istă o autoincompatibilitate naturală, generată de faptul că plantele care trebuie încrucişate prezintă diferenţe morfologice constând în mărimea polenului, amplasarea anterelor în floare etc. 'lteori, maturitatea organelor se%uale se face în momente diferite, caz în care se impune ca, în prealabil, polenul să fie recoltat şi să fie conservat, pentru o anumită perioadă de timp. 7%perimentele de polenizare şi fecundare artificială in vitro trebuie precedate de o cunoaştere a bilogiei florilor cu care se doreşte efectuarea e%perienţelor, atât în ceea ce priveşte morfologia, etapele de morfogeneză cât şi a compatibilităţii şi a incompatibilităţii, a antezei şi a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. &e de altă parte trebuie făcute testări prealabile cu privire la mediile de cultură adecvate menţinerii microsporilor la un potenţial biologic şi într-o stare optimă de viabilitate, pentru asigurarea creşterii tubului polinic, pentru menţinerea viabilităţii părţilor componente ale pistilului. &olenizarea şi fecundarea artificială in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea în contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele e%cizate. 'plicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practică în cazul speciilor compatibile se%ual, când nu e%istă impedimente morfofiziologice, privind fi%area şi germinarea polenului la nivelul stigmatului. &rin această metodă s-a reuşit autopolenizarea la #ntirr inum majus "Esha, ),31#, în schimb la !etunia violacea, specie autocincompatibilă s-a constatat că autopolenizarea in vitro a fost urmată de o creştere a pistilului dar după un timp acesta s-a brunificat "Shivanna, ),31, citat de Cachiţă, ),*C#. !eseori, însă, polenizarea şi fecundarea in vitro a ovulelor au eşuat, în condiţiile utilizării tehnicilor constând în folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la reproducerea aceloraşi încrucişări, dar operând cu ovare sau ovule.

2eritul primei culturi de ovare îi revine lui 9a 0ue "),C+#, care a reuşit cultivarea in vitro a ovarelor de "ycopersicon pimpinellifolium, neobţinând, însă în final seminţe viabile. (n această perioadă, >itsch "),C,-),1)# a cultivat in vitro ovare de "ycopersicon esculentum0 Cucumis angeria0 ! aseolus vulgaris şi 2icotiana tabacum. 2ediile de cultură au fost comple%e şi au conţinut ca fitohormoni6 acidul +,C diclorfeno%iacetic şi acidul +,C,1 triclorfeno%iacetic. $varele au fost recoltate fie înainte de polenizare fie după ce polenizarea s-a petrecut în mod natural. (n vitro ele au crescut, dar în final nu au format seminţe. &rin tehnicile de cultură in vitro a ovarelor au fost obţinuţi hibrizi din încrucişarea hibrizilor diploizi de Brassica c inensis şi autotetraploidul Brassica pekinensis "<nomata, ),3*#. .ibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare între cei doi părinţi. 9a +ry%a sativa şi la Ha3ort ia turgida, 2a umdar a obţinut, în anul ),N-, plantule din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice. 2itra "),N+# a reuşit obţinerea de embrioizi din pereţii ovarelor nepolenizate de Citrus aurantifolia şi Citrus sinensis, cultivate in vitro. (n general cultura de ovare serveşte la inducerea artificială a poliembrioniei, la seminţele care, normal, sunt monoembrionare. 7%istă numeroase cercetări care atestă rolul deosebit pe care îl oacă părţile florale în dezvoltarea fructului. 'stfel, 2aheshFari şi 9al "),3), citaţi de Cachiţă, ),*C# e%perimentând cu flori e%cizate, cultivate in vitro, au constatat la (beris amara formarea unor fructe normale, numai dacă, în condiţiile inoculării lor la o zi după polenizare, acestea prezentau caliciu. 9ipsa caliciului poate fi suplinită prin adăugarea în mediul de cultură a unui surplus de zahăr. (n cazul în care florile au fost e%cizate şi inocularea s-a făcut la opt zile după polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimţită. Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct între polen şi ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic până la sacul embrionar. (n acest mod, s-a realizat actul de fecundare între indivizii îndepărtaţi filogenetic, înlăturându-se barierele incompatibilităţilor genetice şi obţinerea, în final, de seminţe viabile. (ncă din anul ),;+, Rhite a încercat să cultive ovule de #ntirri inum, dar a obţinut calus, generat din integumentele ovulului. 'poi, 9a 0ue cultivând in vitro ovule de 4ryt ronium americanum, observat o creştere a acestora fără ca să obţină maturizarea lor. (n anumite cazuri, de e%emplu la ovulele de ,ibes rubrum, în condiţiile cultivării in vitro a acestora, s-a observat apariţia fenomenelor de poliembrionie. 7mbrionii izolaţi au continuat să prolifereze numeroşi alţi embrioni "SatQ4o, ),N1#. S-a constatat că ţesutul placentar e%ercită un efect pozitiv asupra creşterii ovulelor cultivate in vitro, favorizând formarea şi maturarea seminţelor. Se presupune că ţesutul placentar cedează ovulelor anumite substanţe stimulatoare. Substanţele respective nu prezintă o specificitate, întrucât ovule fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe placentă de Capsicum. (n condiţiile cultivării acestora in vitro, ovulele s-au maturizat şi au format seminţe viabile. &ot fi cultivate in vitro atât ovule fertilizate cât şi ovule nefertilizate. $vulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate în condiţiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic. 7%istă perspective mari în ceea ce priveşte realizarea prin culturi in vitro a unor polenizări încrucişate, interspecifice şi intergenerice care în condiţiile obişnuite, în natură duc fie la incapacitatea embrionului format în a-şi menţine viabilitatea, fie sămânţa rezultată se dovedeşte inaptă în a suporta dezvoltarea embrionului. (n literatură se citează hibridul realizat între "olium perene şi .estuca rubra, utilizându-se ovule detaşate din floare, la cinci zile de la polenizare. &lantele rezultate au fost asemănătoare cu .estuca rubra.

(nvingerea barierelor morfo-fiziologice creează posibilitatea realizării de hibrizi interspecifici care, în viitor, pot prezenta un interes economic ma or şi care în mod natural nu pot fi obţinuţi prin hibridare se%uată. S-au reuşit realizarea de e%perimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. &ornind de la acest tip de ţesut, in vitro se poate induce poliembrionia. 'stfel, în ),N3, 2ullins şi Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera 5 Cabernet Sauvignon, specie în mod normal monoembrionară. !in ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele căruia s-au diferenţiat embrioizi, ceva mai mari decât embrionii zigotici. &lantulele rezultate au fost viabile. 9a fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspăt, recoltat în perioada iniţierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales în cazul urmăririi realizării de polenizări interspecifice sau intergenerice. (n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculării, polenul să fie testat în ceea ce priveşte capacitatea germinativă, creşterea tubului polinic şi să se studieze comparativ eficienţa câtorva reţete de medii de cultură, în vederea asigurării unei creşteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea şi susţinerea întregului potenţial biologic al celulei generative şi a celei vegetative. (n cazul în care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar să se apro%imeze dacă tubul polinic are o lungime corespunzătoare pentru a fi asigurată accesibilitatea lui la ovule: în caz contrar se renunţă la cultura de pistile şi ovulele vor fi e%cizate şi cultivate ca atare. (n acest mod, va fi facilitată fecundarea şi se preîntâmpină epuizarea celulei generative, în decursul parcurgerii traseului de la stigmat, până la sacul embrionar "Cachiţă, ),*C#. Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor şi a altor părţi florale, precum şi a ansamblelor de componente florale a permis completarea cunoştinţelor actuale privind funcţionarea organelor respective şi privind biologia fecundării, a formării embrionului, a seminţei şi a fructului. 'ceste cunoştinţe servesc la obţinerea de noi succese în învingerea barierelor incompatibilităţilor e%istente în hibridarea se%uată, fapt deosebit de important, întrucât prin înmulţirea se%uată se poate reînnoi continuu, potenţialul biologic al plantelor, îmbogăţindu-se zestrea ereditară, cu caracterele moştenite de la doi părinţi, posedând acumulări genetice diferite. 9.1.D.9 C'&$'"! ,e #e&'&e &oate fi definită ca o creştere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu de cultură lichid. (n funcţie de momentul în care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus în momentul iniţierii culturii şi mult mai accentuat în perioada optimă de creştere. 'gregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente dezmembrări a celulelor inoculate, a separării şi individualizării parţiale a acestora. !e asemenea ele pot fi şi rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fără separarea celulelor, iar în astfel de cazuri frecvenţa agregatelor creşte pe măsura atingerii perioadei ma%ime de diviziune celulară. Elterior deşi frecvenţa diviziunilor scade, mărirea agregatelor celulare se datorează creşterii în volum a celulelor. Cea mai perfectă cultură de celule nu este alcătuită numai din celule libere. &entru a reduce numărul de agregate se practica filtrarea culturii. 'gregatele care persistă şi după filtrare vor deţine ma%imum C-)- celule, uniforme din punct de vedere genetic "Street, ),N3#. Gradul de dispersare a celulelor, într-o suspensie celulară, depinde de durata creşterii celulelor în cultură, originea acestora, compoziţia mediului şi condiţiile de cultură "Street, ),NN#. 2ediul de cultură optim, de cultivare la celulele de gimnosperme diferă de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate, dar şi faţă de mediul folosite la dicotiledonate. Enul din constituenţii mediului de cultură de care depinde menţinerea

celulelor în suspensie sunt fitohormonii de creştere care pot influenţa cultura celulelor in vitro prin natura lor şi concentraţia folosită. 'stfel un conţinut ridicat de au%ină determină creşterea numărului de celule în suspensie, iar reducerea conţinutului în acest fitohormon, descreşte capacitatea celulelor de a se separa "8orreQ şi 0einert, ),3+#. !e asemenea s-a constatat că procesele de agregare celulară sunt influenţate şi de prezenţa în mediul de cultură a etilenei dar şi de creşterea concentraţiei în glucide. $ cultură celulară ideală trebuie să fie omogenă din punct de vedere morfologic şi biochimic. >umai o cultură de celule individualizate, obţinute prin clonarea unei singure celule, menţinută în condiţii care să păstreze stabilitatea nucleară, constituie un material biologic valoros pentru operaţiunile de mutageneză, în izolarea de linii celulare, în selectarea de mutanţi, de un anumit tip. Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate genetică în cadrul populaţiei de celule "Cachiţă, ),*C#. &entru menţinerea celulelor într-o stare activă de diviziune şi astfel creşterea gradului de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp. !in momentul iniţierii unei culturi celulare şi până în momentul practicării unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numeşte ciclu de creştere a culturii. (n decursul acestui ciclu se produc schimbări în ceea ce priveşte viteza de diviziune şi de creştere a celulelor. Se distinge o fază incipientă de creştere a vitezei de multiplicare celulară, urmată de o perioadă de plafonare a frecvenţei diviziunilor, după care, fără o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate într-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse în acelaşi flacon de cultură. (n aceste condiţii creşterea încetează atunci când nutrienţii de bază din mediu s-au redus sau au fost epuizaţi. 7%istă şi sisteme închise de cultură care asigură reîmprospătarea continuă a mediului consumat: celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de cultură acţiune care asigură funcţionarea sistemului şi recoltarea biomasei produse. (n acest sistem se realizează un echilibru între cantitatea de mediu introdusă în sistem şi mediul evacuat. !urata menţinerii în condiţii de viabilitate a unei culturi, fără a se produce modificări, depinde de specie, de condiţiile de cultură, de epuizarea din mediu a constituenţilor, care pot limita diviziunea şi creşterea, de p.. !ea asemenea o%igenul şi glucidele din mediu pot influenţa creşterea, astfel că o reducere a celor două componente determină reducerea sau chiar stoparea creşterii celulelor. Subcultivarea celulelor înainte de finalizarea perioadei e%ponenţiale de creştere a celulelor permite obţinerea unor populaţii de celule mai stabile. &rin încorporarea în mediul de cultură a unor concentraţii reduse de enzime se poate realiza separarea celulelor, întrucât enzimele, în diluţii adecvate, nu influenţează negativ rata de creştere, permiţând obţinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic şi metabolic. 0ata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de creştere a culturii se modifică din momentul iniţierii culturii, până la oprirea diviziunilor. $ primă fază, imediat după inoculare, constă într-o întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere, dar în următoarele )- zile numărul de celule per unitatea de volum creşte e%ponenţial, urmând apoi faza de staţionare şi apoi faza de declin. =aza e%ponenţială de creştere se caracterizează ca o perioadă finită de timp, în care rata de creştere a biomasei, raportată la unitatea concentraţiei de biomasă este constantă. =aza de creştere e%ponenţială este e%tinsă în condiţiile în care cultura este iniţiată cu o densitate redusă a celulelor per unitatea de volum "Cachiţă, ),*C#. &entru a menţine culturile într-o fază de creştere e%ponenţială trebuie prevenită situaţia limitării nutrienţilor din mediu ca o consecinţă a epuizării acestora. (n acest sens se impune subcultivarea frecventă a celulelor. 7ri4sson a subcultivat cultura de Haplopappus

gracilis şi la un interval de C* ore. 9a o cultură de #cer pseudoplatanus, !orre şi colab. "),N)# au realizat subculturile la un interval de N zile, obţinând o densitate iniţială de + % )-1 celuleDml. &entru culturile de celule se pot folosi următoarele tipuri de dispozitive6 -fermentatoare 5 de cca ) l sau chiar mai mari, utilizate şi în cultura cu volum de mediu limitat, stabilit iniţial: -chemostate 5 pentru cultura continuă, deschisă: -fitostate 5 chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate în care rata de creştere şi densitatea celulară sunt menţinute constante, prin fi%area unei rate de introducere a factorilor nutritivi şi hormonali: -turbiostate 5 sistem deschis de cultură continuă, în care mediul proaspăt se adaugă în momentul creşterii turbidităţii culturii şi a eliberării, prin spălare şi eliminare a e%cedentului de celule. $ cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi. Cea mai folosită metodă constă în realizarea în mediul de cultură lichid a unei suspensii utilizând ca material iniţial calus, pentru ca să se realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de calus, condiţie ce poate fi îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balanţă hormonală adecvată scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul +,C diclorfeno%iacetic, în diferite concentraţii. (n cazul în care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar şi în condiţiile agitării mediilor de cultură lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului şi diluarea agregatelor celulare mici în mediu de cultură proaspăt. !e asemenea, în acelaşi scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul lichid şi recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel că, coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci când se reiniţiază suspensia celulară "Street, ),N3#. $ altă metodă constă în omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderată, în omogenizator de sticlă şi apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate. (n acelaşi scop se pot utiliza protoplaşti obţinuţi prin digestie enzimatică. Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei cantităţi de mediu, dintro cultură de a e%istentă, având o densitate cunoscută de celule, diluând-o cu mediu proaspăt. !ensitatea celulelor în subcultură nu trebuie să depăşească iniţial -,1-+,1 % )-1 celuleDml. (n decurs de )1-+1 zile densitatea va creşte până la cca C % )-3 celuleDml "Street, citat de Cachiţă, ),*C#. Cultura de celule prezintă foarte multe avanta e. 7%istă specii care constituie modele în ceea ce priveşte reacţia la condiţiile create şi la care procesele de citodiferenţiere, de organogeneză şi embriogeneză pot fi controlate şi diri ate în sensul dorit "morcov, tutun#. 'stfel, cultura de celule prezintă avanta e deosebite în efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creşterii, citodiferenţierii, ale metabolismului celular. !e asemenea cultura de celule, fiind constituită într-o populaţie omogenă de celule se poate folosi în vederea inducerii variabilităţii genetice şi selecţiei de mutanţi, prin e%punerea culturii la acţiunea unor anumiţi agenţi fizici sau chimici. Enul din marile obiective urmărite prin culturile de celule îl constituie acela al selectării de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, săruri, etc. &rin astfel de e%perimente au fost create linii celulare mutante, iar modificările genetice operate la nivel celular pot fi regăsite în plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaţie. Selectarea liniei celulare se poate face uşor prin etalarea suspensiei pe medii de cultură solide, recoltarea efectuându-se în perioada creşterii e%ponenţiale "Cachiţă, ),*C#. Capacitatea regenerativă depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora, vârsta culturii, compoziţia substratului şi de condiţiile de cultură.

(ntrucât e%perienţele de ameliorare şi genetică din câmp sunt costisitoare, necesitând multă forţă de muncă şi suprafaţă mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste e%perimente se simplifică, reducându-se activitatea, în prima fază, doar în laborator, astfel că se reduc atât suprafeţele de lucru cât şi timpul necesar obţinerii rezultatelor dorite. (n plus materialul biologic valoros obţinut, prin cultura de celule se poate păstra timp îndelungat prin crioconservare, în azot lichid. $ problemă deosebită este aceea a obţinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele cultivate pe medii aseptice deşi au clorofilă nu pot supravieţui în lipsa zahărului din mediul de cultură. (n încercările făcute pe medii aseptice s-a constatat că succesul cultivării ţesuturilor şi celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim, înregistrându-se o rată scăzută a creşterii acestora. Bigurozitatea slabă a celulelor crescute în astfel de condiţii a fost e%plicată printr-o activitate fotosintetică scăzută, datorată unor deficienţe de cultură, care împiedică dezvoltarea cloroplastelor şi a fotosintezei. Wamada şi colab."),N*# s-au ocupat de această problemă şi au a uns la concluzia că în realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie să se aibă în vedere selectarea de celule care produc multă clorofilă. 9umina puternică stimulează sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraţie scăzută de zaharoză. &rezenţa în mediul de cultură a unor concentraţii ridicate de zaharoză inhibă sinteza clorofilei. Culturile de celule au implicaţii practice deosebite în industria aşa zisă de tip fermentativ, după modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele în scopuri industriale. Mi în culturile de celule s-a asimilat şi adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele în care se cultivă celule. 9a plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produşii secundari de metabolism sunt depozitaţi în vacuole, nefiind e%cretaţi în mediul de cultură. 9a suspensiile celulare, derivând din plantele superioare, durata de fermentaţie este de cca )- ori mai mare decât la culturile de tip microbian. En aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de cultură. Aiotransformarea poate fi utilizată pentru diferite tipuri de reacţii6 hidro%ilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiţia de carbon, ruperea lanţului de carbon. Culturile în mediu lichid prezintă avanta ul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienţii, se asigură un schimb de gaze optimizat, se evită nea unsurile provocate de o eventuală orientare polară neadecvată, precum şi depozitarea şi concentrarea în urul celulelor a produşilor de metabolism, eliminaţi în mediu. 9.1.D.D C'&$'"! !&$(" $i-'"i ,e e2-&!n$e 8eoretic, oricare parte a plantei poate fi folosită ca e%plant pentru iniţierea culturilor in vitro. <nducerea neoformării de ţesuturi este dependentă de specie, de natura organului, de mărimea e%plantului, natura ţesuturilor prezente în e%plant, sezonul în care s-a recoltat organul, modul de sterilizare, compoziţia mediului de cultură, orientarea lor pe mediu precum şi balanţa hormonală folosită în mediul de cultură. !e regulă, în afară de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al inflorescenţelor, cotiledoanelor şi mai rar, în porţiunea internodală a tulpinilor se constată e%istenţa unei capacităţi regenerative, a cărei intensitate depinde de specie, de vârsta organului din acre se prelevează ţesuturile, mărimea e%plantului, orientarea lui pe mediu de cultură, de compoziţia mediului sau de condiţiile din camera de creştere. (ntr-un e%periment efectuat de 9azăr şi Cachiţă "),*--),*+#, cu e%plante de crizantemă de natură diferită, cultivate pe mediu de bază cu adaos de '<' "+ mgDl# şi A' "+mgDl# s-a constatat că, în afară de meristeme, alte tipuri de e%plante folosite 5 de la peduncul floral, peţiol, inflorescenţa, minibutaşi 5 frecvent au generat calus. 9a nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de organogeneză, pe suprafaţa superioară, formare de muguraşi

iar pe cea inferioară, generarea de rădăciniţe. !in meristemele apicale, după două luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. !in meristemele a%ilare, diferenţierea plantelor s-a făcut mai lent. &lantele formate din meristeme au avut o conformaţie proporţionată şi s-au adaptat bine la viaţa mediului septic. 7%plantele nodale şi cele constând din teaca frunzelor, au generat, pe un e%plant, un număr variabil de muguraşi. !intre aceştia unul până la trei s-au dezvoltat, ceilalţi rămânând în diferite faze de creştere. separaţi şi subcultivaţi pe medii proaspete au format rădăciniţe şi s-au dezvoltat normal. <noculii constând din e%plante de formă cilindrică "e%. internod#, au prezentat o pregnantă polaritate morfogenetică, chiar dacă e%plantul a fost acoperit de calus. &rocesul de organogeneză a fost şi mai scăzut la fragmentul desprins din mi locul peţiolului frunzelor. (n general, inoculii constând din internod şi mai ales cei dimensionaţi din peţiol au generat mult mai mult calus decât cei de formă şi mărime similară, obţinuţi din peduncul floral. 7%plantele dimensionate din porţiunea limbului foliar, în care nervura principală a frunzei era bine reprezentată, au generat o cantitate mai redusă de calus, în schimb au dat naştere la muguraşi, din care s-au format plante "9azăr şi Cachiţă, ),*+#. (n general, lăstăraşii formaţi la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpiniţelor formate din meristeme, ceea ce atestă că din celulele calusului se pot diferenţia plantule cu o conformaţie particulară, diferită de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurată, pe această cale înmulţirea clonală. Concluzia finală a constat în aceea că regenerarea şi diferenţierea rapidă a noi plante sa realizat din inoculii meristematici. 9ăstarii pot fi transformaţi în minibutaşi şi prin aceasta se ridică coeficientul de multiplicare a clonei respective. Se poate deci concluziona că, în funcţie de specia la care se doreşte e%perimentare, dar ţinând cont şi de scopul urmărit, natura e%plantului este diferită, iar rezultatul preconizat a se obţine este influenţat de o serie de factori, de la compoziţia mediului de cultură, natura fitohormonilor de creştere şi concentraţia acestora, până la vârsta organului donor sau condiţiile din camerele de creştere. 7%istă, aşadar, o ?gamă@ variată de posibilităţi de inducere a unei culturi in vitro, astfel că se pot depista pentru fiecare specie de cultură, ornamentală sau forestieră, sursele de e%plante cele mai potrivite în vederea realizării unor astfel de e%perienţe. <ar acolo unde literatura nu oferă posibilităţi de inducere a culturilor de celule, e%perienţa cercetătorului poate permite depistarea prin tatonări a celor mai bune metode în vederea realizării obiectivelor în acest domeniu.