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British Journal of Dermatology Volume 170, Issue 1, pages 7886, January 2014

Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 previene la apoptosis de la clulas edoteliales derivadas del Hemangioma
Y. Ji,1,2 S. Chen,1,3 K. Li,1 X. Xiao,1 T. Xu1 and S. Zheng1 1Division of Oncology, Department of Pediatric Surgery, Childrens Hospital of Fudan University, 399 Wanyuan Road, Shanghai 201102, China Current address: 2Department of Pediatric Surgery and 3Pediatric Intensive Care Unit, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China

Dra. Mara Cecilia Isernia

Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Introduccin
Hemangioma infantil (IHS): tumor vascular ms comn de la infancia, que afecta a un 5-10% de todos los nios. Dramtico crecimiento y el desarrollo de una masa desorganizada de los vasos sanguneos. Involucin espontnea lenta comienza en aproximadamente 1 ao de edad y contina durante 7-10 aos Un tercio de las clulas apopttica de los hemangiomas en involucin se han identificado como clulas endoteliales (EC).

British Journal of Dermatology Volume 170, Issue 1, pages 78-86, 13 JAN 2014 DOI: 10.1111/bjd.12592 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bjd.12592/full#bjd12592-fig-0001

Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Introduccin
Este alto nivel de apoptosis de las CE, a pesar de la proliferacin celular en curso, puede explicar la disminucin de la tasa de crecimiento observado en las fase involutiva del ciclo de vida del tumor.

Para la mayora de los nios con IH, las lesiones son pequeas y no representan una amenaza o potencial de complicacin, pero en algunos casos, IHs crecen de manera espectacular y destruyen el tejido y pueden incluso poner en peligro la vida

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Introduccin
Las clulas endoteliales derivadas de hemangioma (HaemECs) son distintas de las EC que recubre los vasos normales, tanto a nivel de la transcripcin y funcionales.

VEGF regula la proliferacin de CE, la migracin y la diferenciacin a travs de interacciones con VEGFR-2.

Adems de estimular la proliferacin y migracin de EC, VEGF inhibe la apoptosis de las CE de forma concomitante. Participacin de una sealizacin autocrina dependiente de VEGF en clulas madre hematopoyticas y la supervivencia de clulas malignas, lo que conduce a la activacin de VEGFR-2.
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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Objetivo
Se presenta una serie de estudios que se realizaron para determinar si la sealizacin autocrina del VEGF poda manipular la supervivencia HaemEC. El VEGF, tiene un papel clave como un importante factor angiognico en IHS.

Nuestros resultados demuestran que la activacin persistente de VEGFR-2 en HaemECs, junto con la funcionalidad de la sealizacin autocrina del VEGF, desempean papeles crticos en la supervivencia de HaemECs.

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Materiales y Mtodos Reactivos


Medio basal endotelial (EBM-2) y SingleQuot (factor de crecimiento epidrmico humano, VEGF). Suero bovino fetal (FBS) Propranolol, Metoprolol

Inhibidor del VEGFR-2

Albmina de suero bovino (BSA)

Kit ELISA para VEGF de annexin V/propidium

La fluorescena-isotiocianato

Los anticuerpos policlonales primarios que reconocen el VEGF-A y Bcl-2

kits de ensayo colorimtricos -9 caspasa-3

Los anticuerpos para VEGFR-2, VEGFR-fosfo-2 (Tyr1175), Akt y fosfoAkt (Ser473)

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Preparacin

Este estudio fue aprobado por el Comit de tica del Hospital de Nios de la Universidad de Fudan.

Tejidos del IH fueron removidos quirrgicamente (cuero cabelludo)

Consentimiento informado se obtuvo de los padres del paciente para todos los tejidos obtenidos en el estudio.

El diagnstico clnico de la neoplasia vascular fue confirmada por el Departamento de Patologa del Hospital de Nios de la Universidad de Fudan en base a la tincin de GLUT-1 (marcador especfico de tejido del hemangioma)

Los tejidos se utilizaron inmediatamente para el aislamiento de clulas.

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Preparacin

ECs fueron cultivadas en placas de 60 mm recubiertas con gelatina en EBM-2 suplementado con 20% de FBS inactivado por calor,

Las clulas se cultivaron en aire humidificado que contiene 5% de CO 2 a 37 C.

Despus de un perodo de incubacin de 24 h para permitir la unin de las clulas en un medio estndar, las clulas se lavaron dos veces con solucin salina tamponada con fosfato (PBS).

La apoptosis fue inducida por la privacin de suero usando EBM suplementado con 0,1% de BSA y penicilinaestreptomicina en ausencia de FBS.

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Preparacin

La estructura nuclear de las clulas se examin utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus.

El anlisis cuantitativo se realiz por tincin TUNEL, contando el verde fluorescente (apoptosis de las clulas) en tres campos seleccionados al azar.

La muerte celular mediada por la apoptosis de ECs se examin con un mtodo de doble tincin utilizando un kit de deteccin de la apoptosis annexinV/PI.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Preparacin

HaemECs o HUVEC se sembraron a 1,0 10 5 clulas por pocillo en placas de 24 pocillos en medio de cultivo completo. Despus de 24 h, las clulas se lavaron en PBS y se incubaron en medio libre de suero que contiene 0,1% de BSA.

Las clulas se incubaron durante 24 h, y se recogieron los medios condicionados, se centrifugaron y se almacenaron a -80 C.

Niveles de VEGF en medio acondicionado se determinaron utilizando el kit de VEGF ELISA.

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Preparacin

Se realiz anlisis de activacin de la caspasa usando las caspasa-3 y caspasa-9 (kits de ensayo colorimtrico).

Este ensayo se basa en la deteccin espectrofotomtrica del cromforo p -nitroanilide ( p NA) despus de su escisin por caspasa-3 o la caspasa-9 desde el sustrato marcado.

La absorbancia producida por el cromforo p NA se midi utilizando un lector de microplacas automtico a 405 nm. La actividad de caspasa se present como un porcentaje del control.

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Preparacin
Las muestras de protenas se separaron mediante electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron electroforticamente a una membrana de nitrocelulosa.

Las clulas se recogieron usando tampn de lisis RIPA B que contiene un cctel inhibidor de la proteasa.

La membrana se bloque con TBST (10 mmoles L -1 de TrisHCl, pH 7,4, 150 mmol L -1 de NaCl, 0,1% de Tween 20) .

La membrana se lav tres veces y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado. Las bandas de protenas se visualizaron mediante fluorografa mejorada asociada-ECL.

Un anlisis de la varianza ( anova ) seguido de Tukey t test se realiz, y un P -valor <0,05.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Resultados
HUVEC privadas de suero tena una prevalencia mucho mayor de la apoptosis y demostr ncleos apoptticos tpicos cuando se cultivan durante 12 h en comparacin con las clulas cultivadas en medio que contiene suero 10%. HaemECs resisti la apoptosis cuando se cultiva en condiciones libres de suero durante 12 h.

Un mecanismo de supervivencia rescat a los HaemECs de la apoptosis en condiciones libres de suero.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Resultados

El VEGF promueve la supervivencia de ECs privadas de suero aumentando el nivel de la protena anti-apopttica de Bcl-2.

Niveles de protena de Bcl-2 disminuyeron cuando la HaemECs fueron tratados ya sea con el VEGF Ab o PTK787.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Resultados
La inhibicin de la sealizacin de PI3K/Akt en HaemECs fue acompaado por una reduccin en la expresin de Bcl-2 y el aumento de la caspasa-3 y la caspasa-9

Estos resultados ponen de relieve la participacin de la va PI3K/Akt en la supervivencia de HaemECs.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Resultados
El Propranolol, que inhibe la proliferacin de CE, la angiognesis y el crecimiento tumoral, estimula de forma concomitante la muerte CE.

El Propranolol y ICI118551 afectaron la tasa de supervivencia de HUVECs mas que HaemECs, aunque metoprolol ( selectiva 1 bloqueante) no tuvo ningn efecto sobre la supervivencia de cualquier tipo CE.

La sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR-2 en HaemECs puede inducir resistencia general a los estmulos apoptticos.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Conclusiones
El presente estudio encontr que las HaemECs que estn en fase de proliferacin poseen caractersticas bsicas similares pero una mayor supervivencia en comparacin con los EC normal HaemECs puede adquirir progresivamente fenotipos alterados como resultado de un microambiente anormal. En IHS, se ha informado de un proceso de mltiples etapas que implica mutaciones tanto en el compartimento intersticial y mesenquimales, lo que sugiere una posible interaccin recproca entre HaemECs y las clulas circundantes. Alternativamente, se podra especular que HaemECs se originan a partir de clulas progenitoras, que son conocido para mostrar mayor proliferacin y capacidades de clonacin.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Conclusiones
La estimulacin de la apoptosis CE puede inhibir el suministro de sangre del tumor y resultar en la regresin del tumor.

Un inhibidor de VEGFR-2 reduce drsticamente la supervivencia de HaemEC, y el bloqueo de VEGF con un anticuerpo anti-VEGF tiene efectos similares.

Las clulas malignas y EC derivadas del cncer, HaemECs pueden ser capaz de adaptarse al entorno fsico anormal del tumor al someterse a una forma de reprogramacin que implica un aumento de la resistencia a la apoptosis y regulacin por incremento de un polipptido VEGF

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Conclusiones
Mecnicamente, el VEGF activa la va PI3K/Akt promotora de la supervivencia. La activacin de Akt a su vez estimula la expresin de protenas anti-apoptticas, tales como Bcl-2, y de ese modo inhibe la ejecucin de la apoptosis. Adems, la Akt activa la NO sintasa endotelial, lo que lleva a una mayor sntesis de NO, que promueve la supervivencia de las CE mediante la inhibicin de la actividad de la proteasa cistena de la caspasa-3.

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Conclusiones
La apoptosis inducida por Propranolol podra ser parcialmente anulada por una regulacin de VEGF, en concreto una accin autocrina que implica VEGFR-2, en HaemECs. la apoptosis inducida por propranolol HaemEC puede no ser especfica en la CE sino ms bien un fenmeno ms comn

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Sealizacin autocrina del VEGF/VEGFR2 regulan apoptosis de HaemECs

Conclusin

El presente estudio demostr que el VEGF/VEGFR-2 que regula la HaemECs, se mantiene gracias a una sealizacin autocrina, lo que permite la activacin persistente de las vas de supervivencia intracelular y por lo tanto promueve la supervivencia HaemEC.

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