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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE MEDICINA Y PSICOLOGIA MANUAL DE BIOQU ÍMICA BASICA
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Código: L1M-N3-002

No.de Revisión: 1

Efectividad: 2008-2

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L1M-N3-002 No.de Revisión: 1 Efectividad: 2008-2 Facultad de Medicina y Psicología Manual de Laboratorio de
L1M-N3-002 No.de Revisión: 1 Efectividad: 2008-2 Facultad de Medicina y Psicología Manual de Laboratorio de

Facultad de Medicina y Psicología

Manual de Laboratorio de Bioquímica Básica

y Psicología Manual de Laboratorio de Bioquímica Básica Laboratorio 1 Autor(es): MC Raquel Cortes Talavera Firma:
y Psicología Manual de Laboratorio de Bioquímica Básica Laboratorio 1 Autor(es): MC Raquel Cortes Talavera Firma:

Laboratorio 1

Autor(es): MC Raquel Cortes Talavera

Firma:

Fecha: Julio 2007

Revisó: QFB Ma, de la Luz Ibarra Arias

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Fecha: Julio 2007

Autorizó: Dra. Sara Cortés Bargalló

Firma:

Fecha: Julio 2007

1

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INDICE

TEMA

PAGINA

Portada

1

Índice

2

Introducción

3

Reglamento de laboratorio de Bioquímica Básica

5

Medidas de Bioseguridad

7

Protocolización de las prácticas

8

Práctica No. 1 Métodos y técnicas de análisis

9

Práctica No. 2 Espectrofotometría

16

Práctica No. 3 Enzimología

24

Práctica No. 4 Digestión y absorción

30

Práctica No. 5 Calorimetría

35

Práctica No. 6 Proyecto de Investigación en Bioquímica Básica

42

Práctica No. 7 Determinación de Triglicéridos

45

Práctica No. 8 Gluconeogénesis

49

Práctica No. 9 Cetogenesis

54

Práctica No. 10 Colesterol

58

Práctica No. 11 Determinación de Urea

63

Práctica No. 12 Determinación de bilirrubinas

67

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INTRODUCCIÓN

La Bioquímica es la ciencia que estudia los procesos químicos de los seres vivos desde dos

puntos de vista: estructural y funcional. Mediante el primero conocemos la distribución

espacial de la materia viva; con el segundo, su devenir en el tiempo.

La aproximación morfológica conduce al estudio de las formas propias del ser vivo; la

aproximación funcional estudia funciones, es decir, variaciones temporales que se dan en el

mismo con el fin de mantener su organismo en un estado estacionario y de reproducir en otro

ser vivo su material genético. De todas las funciones, ninguna hay más generalizada que la

que llamamos “Metabolismo”, es decir, el conjunto de reacciones químicas que un organismo

es capaz de llevar a cabo.

Para comprender la influencia de la Bioquímica sobre la Biología, es preciso conocer los

elementos químicos de la materia viva y las estructuras completas de muchos compuestos

biológicos (proteínas, azúcares, lípidos, nucleótidos, vitaminas y hormonas) y su

comportamiento durante las reacciones metabólicas.

Será preciso conocer la estequiometría y los mecanismos de un gran número de reacciones.

Además el conocimiento de los principios básicos de la termodinámica es esencial para

entender de qué manera obtienen los seres vivos la energía de los alimentos.

El propósito de este manual es proporcionar al alumno los recursos necesarios para un buen

desarrollo de las prácticas, así como brindarle información básica que utilizará durante el

proceso de las mismas.

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Este manual consta, de doce prácticas de laboratorio, diez de las cuales se enfocan a temas

que están íntimamente relacionados con procesos metabólicos que realiza la célula dentro del

organismo, lo cual le permitirá al alumno conocer y comprender de una mejor manera el

funcionamiento del cuerpo humano. Las otras están enfocadas a la elaboración de proyectos

de investigación en el área.

OBJETIVO GENERAL

Proporcionar al alumno los conocimientos básicos de los diferentes métodos analíticos que

se utilizan en un laboratorio de análisis clínicos, así como brindarle las herramientas

prácticas, con las cuales será capaz de evaluar el funcionamiento de los diferentes procesos

metabólicos que lleva a cabo el organismo.

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REGLAMENTOS

Los alumnos deberán cumplir con el Reglamento interno de Laboratorio de la Facultad de Medicina Tijuana, el reglamento interno del Laboratorio de Bioquímica Básica y las medidas de Bioseguridad.

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA BÁSICA

1. El alumno no puede entrar y salir a voluntad del laboratorio. Debe esperar fuera del laboratorio hasta que el maestro llegue. Deben presentarse con un máximo de 10 minutos de retardo, después de esa hora no podrá entrar y la puerta permanecerá cerrada.

2. Al inicio del semestre el Maestro integrará equipos de trabajo a los que les asignará una mesa. En caso que aplique se les indicará los microscopios que utilizarán durante el semestre, así como la bitácora de registro correspondiente.

3. Se les asignarán gavetas y se les proporcionará una llave al responsable del equipo para que hagan una copia de la misma, la cual tendrán que entregar al final del semestre.

4. En la primera sesión se les proporcionará material básico de Laboratorio suficiente para la realización de sus prácticas firmando el recibo correspondiente. El material perecedero (No desechable) deberá ser entregado al finalizar la última práctica del semestre. En caso contrarío deberá reponer el material faltante antes de finalizar el semestre.

5. Está estrictamente prohibido el uso de zapatos destapados (huaraches, chanclas, etc), teléfonos celulares e ingerir cualquier tipo de alimento durante las prácticas de Laboratorio.

6. Los alumnos designarán un representante del grupo y un suplente, quienes tendrán la responsabilidad de registrar la práctica en la Bitácora Semanal de prácticas de Laboratorio del Sistema de Gestión de Calidad (SGC) con código: LC-N4-001.

7. Las prácticas de Laboratorio de Bioquímica Básica requieren que el alumno aporte el siguiente material para su protección personal, el cual deberá ser presentado durante la primer semana de clase y guardado en la gaveta que se le asigne: jabón para las manos, toallas de papel, guantes de látex, un plumón indeleble para marcar sus tubos y lo que indique previamente el instructor.

8. Los alumnos y maestros según sea el caso tendrán la obligación de registrar los materiales que aporten o salgan del Laboratorio en el Diario del Laboratorio.

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9. Deberán acudir al Laboratorio horas antes, al día que les corresponda la práctica, para la toma de su muestra de sangre (podrán conseguir muestras idóneas o tomar la muestra con anticipación a la fecha de la práctica). Es indispensable hacerlo por la mañana y en ayuno cuando sea necesario.

10. A la hora de su práctica debe contar con el material (muestra) necesario, en caso contrario no podrán realizar la práctica. El horario establecido para este fin es de 7:00 a 8:30 horas.

11. Es responsabilidad del alumno el horario extra clase que utilice para la obtención de muestras, realización de su proyecto o cualquier actividad relacionada con el laboratorio.

12. Los alumnos supervisados por el maestro registrarán en la Bitácora de Control de pacientes y servicios LC-N4-015 del SGC, las muestras (pacientes) y los resultados obtenidos en cada una de las determinaciones.

13. Los alumnos supervisados por el maestro son responsables de la separación, envase y

deposito en el área temporal del Laboratorio de los Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos.

14. Los alumnos son responsables de que las llaves de agua y gas queden debidamente cerradas al finalizar la práctica.

15. Los alumnos deben dejar limpia su mesa de trabajo y el material utilizado antes de retirarse del laboratorio.

16. Los alumnos deben contestar las encuestan de satisfacción de usuario LC-N4-006 cuando se le asigne.

17. Cuando sea necesario deberán presentar quejas o sugerencias llenando el formato LC-N4-006 y depositándolo en el Buzón de quejas.

18. En caso de suspensión oficial, la práctica podrá realizarse en la fecha programada para reposición de práctica.

19. En caso de que alguna práctica sea suspendida porque el alumno no cuente con su muestra en las condiciones requeridas, la práctica se dará por vista.

20. El alumno que no cumpla total o parcialmente el reglamento o ponga en riesgo la seguridad de sus compañeros, la primera vez será expulsado de la clase. En caso de reincidir no tendrá derecho a prácticas de laboratorio durante el semestre.

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MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. No hacer uso de lápiz labial u otros cosméticos en el Laboratorio.

2. Los coágulos de sangre, el suero y el plasma deben ser depositados en el recipiente de

RPBI correspondiente que se encuentra en el área temporal de Residuos Peligrosos

Biológico infecciosos.

3. Las agujas deben ser colocadas en el recipiente rígido rojo de RPBI que se encuentra

en el área temporal de Residuos Peligrosos Biológico infecciosos.

4. Los algodones, jeringas sin aguja, guantes de látex, papel absorbente contaminado y

los aplicadores de madera deben ser depositados en la bolsa roja de RPBI ubicada en

área temporal de Residuos Peligrosos Biológico infecciosos.

5. Siempre deben hacer uso de pipetadores para dispensar los reactivos.

6. Los alumnos que tengan pelo largo deben mantenerlo recogido para evitar accidentes

de trabajo.

7. Las mesas deben limpiarse al final de la práctica con solución clorada o fenol al 5%.

8. Siempre deben usar guantes de látex para trabajar en el Laboratorio.

9. Deben tener en su mesa de trabajo exclusivamente el material requerido para la

realización de la práctica.

10. Al entrar al Laboratorio deberán colocar sus mochilas o útiles en su gabinete

correspondiente que se encuentra ubicado en dicha área.

11. En caso de cualquier accidente personal o de material de trabajo debe notificarse

inmediatamente

al

maestro

o

instructor

verbalmente

y

registrar

en el diario del

Laboratorio.

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PROTOCOLIZACIÓN DE LAS PRACTICAS

1. El alumno deberá contar con su manual de prácticas. En caso contrario no podrá ingresar al laboratorio.

2. Deberá leer previamente la práctica correspondiente y realizar una investigación preliminar por equipo antes de cada práctica, para reforzar los conocimientos o conceptos que requiera; debiendo entregar dicha investigación el equipo al ingresar al laboratorio.

3. Antes de la práctica y a consideración del instructor se cuestionará a los alumnos de forma verbal, sobre el tema que corresponda.

4. Al inicio de la práctica se proporcionará el método que se utilizará, el cual puede variar dependiendo de la clase de reactivos que se disponga al momento del desarrollo de la misma. (depende del laboratorio de fabricación)

5. Después de leer la práctica deberá realizar un diagrama de flujo de forma sencilla y entendible por sus compañeros de equipo.

6. Siguiendo el diagrama de flujo, realizará la práctica de laboratorio correspondiente.

7. Deberá anotar sus resultados y conclusiones en su manual, en el espacio designado para ello.

8. Al finalizar la práctica se analizarán y discutirán los resultados obtenidos.

9. Deberá anotar sus resultados en la bitácora correspondiente.

10. Cada alumno entregará al finalizar el semestre su manual con sus resultados y conclusiones tanto personales como de equipo.

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MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ANÁLISIS

PRACTICA No. 1. Tema teórico al que apoya: Metodología del Laboratorio de Bioquímica.

OBJETIVOS

Al finalizar la sesión el alumno será capaz de:

Diferenciar entre un análisis cualitativo y un análisis cuantitativo.

Argumentar qué método de Laboratorio es más conveniente utilizar en la

determinación de un analito.

Explicar la utilidad de los diferentes métodos de análisis en el Laboratorio.

FUNDAMENTO

La determinación de un analito en el Laboratorio puede llevarse a cabo a través de dos tipos

principales de análisis: Análisis cualitativo; basado en la identificación por medios químicos,

de la presencia de una sustancia o sustancias que se encuentran en una muestra de orina,

suero, heces fecales o plasma.

Análisis cuantitativo; que es la medición de la cantidad de sustancia específica que se

encuentra en la muestra a analizar. Este método es el que tiene interés para nosotros.

Es por ello que al inicio de este curso se discute el trabajo en un Laboratorio y se analizan los

diferentes métodos y técnicas de análisis, para poder comprender con mayor facilidad cada

uno de éstos; ya que serán parte de la herramienta a utilizar durante la realización las

prácticas.

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METODOS CUANTITATIVOS

1. GRAVIMÉTRICOS.

Donde la sustancia que se analizará se precipita bajo la forma de sal insoluble o bien se

extrae con algún solvente. El peso seco del precipitado o del extracto es una medida de la

cantidad de sustancia que contenía la muestra analizada. Estos métodos se utilizan rara

vez en el Laboratorio porque requieren grandes cantidades de muestra.

2. VOLUMÉTRICOS.

Estos se basan en la medición de la cantidad de una sustancia presente en una muestra, a

través de titulación.

3. COLORIMÉTRICOS.

En estos métodos la muestra se somete a una reacción química cuyo producto final es

coloreado. La intensidad de color de la sustancia final depende de la concentración del

analito analizado. En este grupo se encuentran los siguientes:

MÉTODOS COLORIMÉTRICOS

Fotometría.

Dentro de los métodos colorimétricos, un gran número de determinaciones que se

realizan habitualmente en el laboratorio, utiliza medidas de energía radiante, ya sea

emitida, absorbida o reflejada. Estas medidas se determinan a través de técnicas

fotométricas. Las técnicas fotométricas tienen su fundamento en las interacciones de las

radiaciones electromagnéticas sobre la materia.

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Radiaciones Electromagnéticas

Pueden considerarse como un conjunto de corpúsculos, llamados fotones, los cuales

llevan asociada una onda. La energía de radiación esta relacionada con la longitud de

onda. Las longitudes de onda más cortas poseen mayor energía que las longitudes de

onda más largas. De tal manera que podemos hablar de un espectro electromagnético

constituido por las radiaciones electromagnéticas, mismo que se ha dividido en varias

regiones, de acuerdo con la longitud de onda (λ) y la energía.

Rayos X (1-100 nm)

Ultravioleta (100-390 nm)

Visible (390-700 nm)

Infrarrojo (700-100 000 nm)

Microondas (100 000- 1 000 000 nm)

Fotometría de Absorción

Está basada en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud de onda de un medio que absorbe.

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L1M-N3-002 No.de Revisión: 1 Efectividad: 2008-2 • Fluorimetría Los fluorométros, son los instrumentos

Fluorimetría

Los fluorométros, son los instrumentos que se utilizan para cuantificar la fluorescencia emitida por algunas sustancias. Un gran número de compuestos presentan el fenómeno de la fluorescencia, la mayoría de los cuales son sustancias que tienen enlaces múltiples, conjugados con electrones excitados que previamente han absorbido radiación y que, de esta forma vuelven a su estado fundamental.

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TÉCNICAS DE LABORATORIO

Técnicas Inmunológicas

La reacción entre un antígeno y un anticuerpo dirigido específicamente contra él, da lugar a un complejo antígeno-anticuerpo. Esta reacción específica se ha utilizado ampliamente en los laboratorios para la detección y cuantificación de una gran cantidad de sustancias en diversos medios biológicos. En la actualidad hay un gran incremento de estas técnicas, entre ellas se pueden citar:

Técnicas de aglutinación directa

Técnicas de aglutinación indirecta

Inhibición de la aglutinación

Pruebas de fijación de complemento

Técnicas con anticuerpos fluorescentes

En este tipo de pruebas, los anticuerpos frente a la sustancia que se va a medir se une

a colorantes, que producen con luz de una determinada longitud de onda. Una vez que se ha tenido lugar la reacción antígeno-anticuerpo se elimina el exceso de anticuerpo marcado.

Los complejos antígeno-anticuerpo, que producen fluorescencia se detectan con un microscopio de fluorescencia o con un citómetro de flujo, si se trata de células.

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Técnicas de Inmunoensayo

Son técnicas inmunológicas de cuantificación, que emplean también reacciones antígeno-

anticuerpo pero además utilizan marcadores de antígenos o de los anticuerpos.

Los marcadores más empleados son:

Isótopos radioactivos (radio inmunoensayo)

Enzimas (enzimoinmunoensayo)

Compuestos fluorescentes (fluoroinmunoensayo)

En la actualidad este tipo de técnica es muy utilizada en las siguientes determinaciones:

Hormonas (FSH, LH, ACTH, HGC, T3, T4, TSH, Insulina, Glucagón)

Fármacos ( Digoxina, Digitoxina, Fenobarbital, Carbamacepina)

Marcadores Tumorales (CEA, PSA, Alfafetoproteína, CA 15-3, CA125)

Proteínas ( Mioglobina, Ferritina, IgE, Haptoglobina)

Enzimas ( CK-MB, Fosfatasa Ácida Prostática )

Técnicas de PCR ( Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Tiene como propósito hacer un número enorme de copias de un gen. Requiere de tres pasos

fundamentales:

1. Desnaturalización a 94 ºC

2. Reconocimiento a 54 ºC

3. Extensión a 72 º

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Efectividad: 2008-2

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RECURSOS MATERIALES:

Manual de práctica de Laboratorio de Bioquímica Básica.

DESARROLLO DE LA PRACTICA:

El alumno analizará y discutirá en equipo cada uno de los métodos señalados, especialmente

los métodos espectrofotométricos.

RESULTADOS:

CONCLUSIONES:

EVALUACION: Participación verbal y conocimientos.

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ESPECTROFOTOMETRIA

Práctica No. 2 Tema teórico al que apoya: Técnicas y métodos de laboratorio. Método calorimétrico.

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Utilizar adecuadamente el espectrofotómetro.

Utilizar curvas de calibración para obtener valores a partir de las absorbancias.

Describir las fuentes de error analítico que interfirieron en la obtención de sus

resultados en la práctica.

Manejar la media (X) y la desviación estándar (DS).

FUNDAMENTO

Dentro de la fotometría de absorción, uno de los aparatos más utilizados en la determinación

de las concentraciones de los analitos es el espectrofotómetro; que es un instrumento que

utiliza medidas de absorción de las radiaciones electromagnéticas. Además éste será nuestra

principal herramienta de trabajo, ya que en él se harán las lecturas de absorbancia para la

determinación de las concentraciones de los diferentes analitos a determinar durante el

semestre.

Las determinaciones por espectrofotometría requieren que se lleve a cabo previamente una

reacción química específica que varia según el analito a determinar. Los productos finales de

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esta reacción se cuantifican utilizando la lectura de la absorbancia de la muestra, así como la

de estándares conocidos (calibradores).

Es importante obtener los valores de desviación estándar ya que las determinaciones en el

laboratorio requieren de un control de calidad.

El principio del Espectrofotómetro esta basado en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la

intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud de

onda de un medio que absorbe.

es atravesada una longitud de onda de un medio que absorbe. Absorbancia. Y 0 X Concentración

Absorbancia.

Y 0 X
Y
0
X

Concentración en mg/dL

CURVA DE CALIBRACION (A)

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Y

Transmitancia.

0

1 Efectividad: 2008-2 Y Transmitancia. 0 X Concentración en mg/dL CURVA DE CALIBRACION (B) RECURSOS

X

Concentración en mg/dL

CURVA DE CALIBRACION (B)

RECURSOS NECESARIOS:

Muestra biológica:

Muestra de suero sanguíneo obtenida en ayunas*.

Material:

Pipetas serológicas.

Micropipetas de 5, 10. 20 y 30 uL.

Puntillas de micropipeta.

Bulbos.

Tubos de ensaye.

Baño María a 37 ºC.

Espectrofotómetro y aditamentos

Calculadora*

Regla, lápiz, marcador indeleble y papel milimétrico*

Gradilla, tubos y papel absorbente

El que indique su instructor*

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Reactivos:

Reactivo de glucosa. Calibrador o estándar. Control normal y anormal. Agua destilada. Insertos *Insumos y muestra que deberá ser proporcionado por el alumno.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Elaboración de una curva de calibración

1.1 Realice la determinación en cuatro muestras de un estándar de glucosa en las siguientes

concentraciones; 50, 100, 200 y 300 mg/dl, siguiendo la técnica que se le proporcione en el

laboratorio.

1.2 Leer utilizando la cubeta apropiada en el Espectrofotómetro de la siguiente manera:

Ajuste a cero con agua destilada.

Lea cada uno de los estándares de menor a mayor concentración (color)

Registre los valores obtenidos en su manual en la tabla no.1

1.3 En papel milimétrico grafique la concentración correspondiente contra la absorbencia que

obtenga al leer; (eje de las Y) las absorbancias de cada una de las cuatro determinaciones

realizadas del estándar de glucosa, (eje de las X) las concentraciones obtenidas.

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1.4 Trace una línea tratando de unir los cuatro puntos o bien que ésta pase lo más cercano a la

de ellos.

2. Medición de glucosa en un suero problema

2.1 Simultáneamente a las determinaciones del estándar de glucosa, realice las

determinaciones de cada una de las muestra de los sueros de los pacientes (P) y un control

normal.

Todas estas determinaciones

laboratorio.

debe realizarlos con la misma técnica que proporcione

el

2.2 Lea de igual forma que el anterior en el espectrofotómetro y registre la absorbancia de

cada una de sus muestras.

Utilizando la absorbancia del estándar de 100 mg/dl. Calcule la concentración de las

determinaciones de glucosa realizadas a través de la siguiente ecuación y regístrelos en la

tabla No.2:

[P] = X = Abs p / Abs st x [St]

[P] =

Concentración del problema

Abs p = Absorbancia del problema

[St] =

Abs st = Absorbancia del estándar

Concentración del estándar

dónde:

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2.3 Utilizando la curva de calibración interpole en la gráfica que obtuvo de los estándares los

valores de las absorbancias obtenidas de sus problemas y regístrelos en la tabla no.3. y

calcule la concentración de glucosa de las muestras de los problemas .

RESULTADOS Tabla No. 1

Concentración de los Estándares

Absorbancia de los Estándares

1 = 50

mg/dL

1 =

2 = 100 mg/dL

2 =

3 = 150 mg/dL

3 =

4 = 200 mg/dL

4 =

Tabla No.2

Absorbancia

de

los

Concentración

de

los

Problemas

problemas

1=

1=

2=

2=

3=

3=

4=

4=

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2.5 Con los datos de la tabla no.2, obtenga la media y la desviación estándar de los valores de glucosa del problema, mediante las siguientes ecuaciones:

X= x n

X = Media de los valores obtenidos

x = Suma de todos los problemas

n = Número de muestras

DS = Desviación estándar

DS =

√∑( X-X )²

n-1

2.6 Al igual que en el paso anterior calcular la media y desviación estándar con los datos de

la tabla no.3. Utilizando las mismas ecuaciones.

Tabla No.3

Concentración de los Problemas

[ X ]

X -

X

( X - X )²

1 =

     

2 =

     

3 =

     

4 =

     

5 =

     
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CONCLUSIÓNES:

MECANISMO DE EVALUACIÓN

Sesión de discusión de los resultados obtenidos por medio de los dos métodos utilizados.

Elaboración de un argumento que justifique los valores que se obtuvieron a través

de los diferentes cálculos realizados.

BIBLIOGRAFÍA:

Mathews/Van Holde. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Editorial McGraw-Hill * Interamericana 2000

Lehninger. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Ediciones Omega .S.A. Barcelona 1985

Harper BIOQUÍMICA. 15ª Edición. Editorial Manual Moderno

http://www.mediben.com/Nutsem2.htm

M.J.Lynch/S.S. Raphael/L. D. Mellor/P.D. Spare/M.J.H.Inwood. Métodos de Laboratorio Segunda edición/ Tomo I. Editorial Interamericana IBQ. Arcelia Terriquez. Cuadernillo de apuntes de Análisis Instrumental I. Tijuana, BC 2001 IBQ. Arcelia Terriquez. Cuadernillo de apuntes de Análisis Instrumental II. Tijuana, BC 2001

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ENZIMOLOGIA

Practica No. 3 Tema Teórico al que apoya: Enzimología.

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Describir las variaciones que sufre una enzima en su actividad al modificar la

temperatura de su medio ambiente.

Describir el papel de una enzima al catalizar una reacción, señalando la

reacción que cataliza la Fosfatasa alcalina (FA) y Alaninaminotransferasa

(ALT)

FUNDAMENTO

Una enzima (catalizador), es una sustancia que aumenta la rapidez o velocidad de una

reacción química, sin verse alterada ella misma en el proceso global.

La sustancia sobre la que actúa una enzima se denomina sustrato de esa enzima, por lo que

los polipéptidos son sustratos apropiados de la tripsina. En esta sesión se realizarán las

determinaciones de FA y ALT .

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Aminotransferasa

Las aminotransferasas, antes llamadas transaminasas, son las indicadoras que se usan más

frecuentemente como, marcadores de enfermedad hepática. Estas enzimas catalizan la

transferencia reversible de sus respectivos aminoácidos (ácido aspártico y alanina) hacia el

grupo alfa-ceto del ácido cetoglutárico obteniéndose así ácido oxalacético y ácido pirúvico de

esos aminoácidos respectivos y ácido glutámico.

La reacción que se lleva a cabo en laboratorio es la siguiente:

L alanina + oxo-glutarato

ALT

Fosfatasa alcalina

Piruvato + L-glutamato

Es un grupo de enzimas que hidrolizan los enlaces éster de los fosfatos orgánicos e inorgánicos en las células, se encuentra en la mayoría de los órganos de nuestro cuerpo incluyendo hígado, hueso, intestino delgado, riñón, placenta y leucocitos. La que se encuentra en suero la mayoría proviene del hígado y en menor proporción de intestino. Los niveles en suero varían con la edad y sexo.

El substrato empleado en este procedimiento es p-nitrofenil fosfato(4-NPP) que es hidrolizado por la fosfatasa alcalina a fósforo inorgánico ligado a p-nitrofenol.

La formación de color es proporcional a la actividad de la fosfatasa alcalina.

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RECURSOS NECESARIOS:

Muestra biológica:

Muestra de suero sanguíneo en ayunas.

Material y equipo:

Pipetas serológicas.

Micropipetas.

Puntillas de micropipeta.

Bulbos.

Tubos de ensaye

Gradilla

Baño María a 37 ºC

Espectrofotómetro y aditamentos

Calculadora, lápiz y marcador indeleble

Papel absorbente

Insertos del reactivo.

Reactivos:

Reactivo de ALT.

Reactivo de Fosfatasa alcalina.

Calibrador ó estándar

Controles normal y anormal

Agua destilada.

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DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1.

Determinación de la actividad enzimática de Alanina Aminotransferasa (ALT)

1.1

Realice el corrimiento de un blanco, estándar, controles y problema de ALT, a las

temperaturas de 25, 37 y 60 grados centígrados; siguiendo la técnica que se disponga

en el laboratorio.

1.2 Lea en el espectrofotómetro la absorbancia de cada una de sus muestras y registre

los valores obtenidos en su manual.

1.3 Calcule la actividad enzimática de ALT de su muestra problema y controles a

través de la siguiente ecuación y anote los resultados en su manual.

[ P ]

[ P ] = X =

Abs p/Abs st x

[ st ]

= Concentración del problema

Abs p = Absorbancia del problema [St] = Estandar Abs st= Absorbancia del estandar

CALCULOS:

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2. Determinación de la actividad enzimática de Fosfatasa Alcalina ( FA )

2.1 Realice las determinaciones de FA con un blanco (H2O), estándar o calibrador, sueros control y problema a las siguientes temperaturas: 25°c, 37°c y 60°c, siguiendo la técnica de que se disponga en el laboratorio.

2.2 Lea en un espectrofotómetro la absorbancia de cada determinación, obtenga las

lecturas a las distintas temperaturas y registre los valores obtenidos en su manual.

2.3 Calcule la actividad enzimática de FA en cada determinación problema (3) y

control (3) utilizando la ecuación anterior. Anote los resultados en su manual.

RESULTADOS :

Absorbancias

Temperatura

Absorbancias del Estándar

Absorbancias del Control

Absorbancias del Problema

 

ALT

FA

 

ALT

FA

ALT

FA

T. Ambiente

           

37

C

           

60C

           

Temperatura

   

Concentración del Problema

Concentración del Control

   

ALT

FA

 

ALT

 

FA

Temperatura ambiente

       

37

C

       

60C

       
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VALORES DE REFERENCIA DE ALT:

7 – 33 mU/ml.

VALORES DE REFERENCIA DE FOSFATASA ALCALINA

En adultos

40 a 140 U/L

En niños menores de 2 años

85-235 U/L

En niños entre 2 y 8 años

65-120 U/L

En niños entre 9 y 15 años

60- 300 U/L

En adolescentes entre 16 y 21 años

30- 200 U/L

CONCLUSIÓN

MECANISMO DE EVALUACIÓN

Sesión de discusión de resultados obtenidos, basada en los conceptos termodinámicos de la función de una enzima y su relación con los procesos metabólicos. Elaboración de un argumento que justifique los valores que se obtuvieron a través de los cálculos realizados. Comparándolos con los de referencia.

BIBLIOGRAFÍA: Mathews/Van Holde. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Editorial McGraw-Hill * Interamericana 2000 Lehninger. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Ediciones Omega .S.A. Barcelona 1985 Harper BIOQUÍMICA. 15ª Edición. Editorial Manual Moderno

http://www.mediben.com/Nutsem2.htm

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DIGESTIÓN Y ABSORCION. Prueba de Tolerancia a la Lactosa.

Práctica No. 4 Tema Teórico al que apoya: Digestión y Absorción de Carbohidratos.

OBJETIVOS

Al término de la práctica el alumno será capaz de:

Definir la digestión como un proceso químico y mecánico. Comparar el destino de los nutrimentos absorbidos en el intestino delgado. Distinguir los trastornos de deficiencia de disacaridasa. Describir las manifestaciones en el déficit congénito o adquirido en la intolerancia a la lactosa.

FUNDAMENTO

La digestión y la absorción tienen lugar fundamentalmente en un largo tubo al que se denomina intestino delgado, el cual inicia a nivel del píloro, serpentea por las partes central e inferior de la cavidad abdominal, y finalmente se continúa con el intestino grueso.

La pared del intestino delgado consiste en las mismas cuatro capas que componen a la mayor parte del tubo digestivo; sin embargo, la mucosa y submucosa presentan

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modificaciones que permiten al intestino delgado completar prácticamente los procesos de digestión y absorción. Existen varias formas de valorar la función intestinal en cuanto a absorción y digestión de los nutrientes, aquí nos enfocaremos solo a una de ellas que es la prueba de tolerancia a la lactosa, donde se valora la actividad enzimática de la Lactasa.

RECURSOS NECESARIOS:

Pipetas serológicas.

Micropipetas.

Puntillas de micropipeta.

Bulbos.

Tubos de ensaye

Gradilla

Baño María a 37 ºC

Espectrofotómetro y aditamentos

Calculadora, lápiz y marcador indeleble

Papel absorbente

Insertos del reactivo.

Muestra biológica:

Muestra de suero sanguíneo en ayunas. Muestra de suero sanguíneo después de ingerir los 50 y 25 g de lactosa a los 30, 60, 90 y 120 minutos. 50g de lactosa diluida en agua. 25g de lactosa diluida en agua

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Reactivos:

Reactivo de glucosa.

Calibrador ó estándar de glucosa

Controles.

Agua destilada.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1. Procedimiento en suero

1.1 Se toma una muestra de sangre por la mañana en ayunas. Enseguida se procede a

beber 50 y 25 gr. de Lactosa diluidos en agua, según corresponda. A los 30, 60, 90 y 120 min. se obtiene muestra de sangre.

1.2 Se determina la concentración de glucosa en la muestra en ayunas, se mide la

glucosa en sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos después de haber ingerido la Lactosa.

1.3 Realice la determinación

de un blanco, estándar, control y los cinco problemas

de glucosa de acuerdo a el procedimiento de que se disponga en el laboratorio.

1.4 Leer las absorbencias en el espectrofotómetro de todas las muestras a determinar.

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1.5

A

partir

de

las

absorbencias

obtenidas

para

cada

muestra

determine

la

concentración correspondiente de la manera siguiente:

Glucosa mg/dL = Absorbancia problema [estándar] Absorbancia estándar

1.6 Con las concentraciones obtenidas hacer una curva contra absorbancia en papel milimétrico.

RESULTADOS Tabla No.4

Absorbancia de los Problemas

Concentración de los Problemas

Ayunas =

   

30

min

=

 

60

min

=

 

90

min

=

 

120 min

=

 
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CONCLUSIONES:

MECANISMO DE EVALUACIÓN

Sesión de discusión de resultados obtenidos.

Elaboración de un argumento que justifique los valores que se obtuvieron a través de los cálculos realizados. Verificar si se llevó a cabo la hidrólisis de Lactosa y por lo tanto la absorción de la misma, así como corroborar si la curva dio dentro de los lineamientos estimados en pacientes sanos.

BIBLIOGRAFÍA: Mathews/Van Holde. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Editorial McGraw-Hill * Interamericana 2000 Lehninger. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Ediciones Omega .S.A. Barcelona 1985 Harper BIOQUÍMICA. 15ª Edición. Editorial Manual Moderno http://www.mediben.com/Nutsem2.htm M.J.Lynch/S.S. Raphael/L. D. Mellor/P.D. Spare/M.J.H.Inwood. Métodos de Laboratorio Segunda edición/ Tomo I. Editorial Interamericana www.tuotromedico.com www.medlineplus.com

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CALORIMETRÍA

Práctica No. 5

Tema teórico al que apoya: Metabolismo de Hidratos de carbono, requerimientos:

valor calórico

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Determinar su metabolismo basal por medio de ecuaciones de regresión

múltiple.

Explicar la biotransformación de la glucosa conforme ocurre su

catabolismo a través de la glucólisis, descarboxilación del piruvato y el

ciclo de Krebs.

Calcular el gasto calórico tanto en hombre como en la mujer de acuerdo a

su actividad.

FUNDAMENTO

La energía liberada en la oxidación de los alimentos, o en la de los propios

componentes del organismo durante el ayuno, se transforma cuantitativamente en

calor. Si la temperatura corporal no varía, la determinación del calor emitido por un

sujeto constituye una forma teóricamente correcta de medir el recambio calórico de

dicho sujeto.

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La producción de calor es expresada tradicionalmente en Kilocalorías ( Kcal ) , recordando que 1 Kcal es la cantidad de calor necesaria para elevar en 1º C la temperatura de 1 Kg de agua.

Se distinguen dos tipos de Calorimetría:

Calorimetría Directa

La medida de la cantidad de calor emitida por un hombre requiere la construcción de una cámara de tamaño suficiente para que el sujeto pueda alojarse cómodamente en ella durante algún tiempo, y debidamente aislada, a esta cámara se le denomina Calorímetro.

En los calorímetros modernos, tales como los de gradiente, el sujeto está rodeado por una pared conductora del calor. La transferencia de calor a través de dicha pared causa una diferencia de temperatura entre ambos lados de la misma, que puede ser medida con pares termoeléctricas. La respuesta es más rápida que la de las cámaras respiratorias tradicionales y es independiente de la forma en que el calor llega a la pared.

Calorimetría Indirecta

Puesto que la cantidad de calor liberada en la combustión de una sustancia en la bomba calorimétrica es igual a la liberada al ser oxidada en el organismo, siempre que los productos de la oxidación sean los mismos, es posible calcular la cantidad de calor

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producida si conocemos la cantidad de sustancia oxidada y su calor de combustión. del mismo modo, si conocemos la cantidad de oxígeno que se necesita para oxidar una

sustancia y el calor de combustión de ésta, podemos establecer una relación entre la cantidad

de oxígeno consumida y la de calor liberado en la oxidación. Estos hechos son la base de la

calorimetría indirecta.

Metabolismo Basal ( MB )

Se define como la producción calórica de un sujeto en estado de reposo físico y mental, que

se encuentra en un ambiente de temperatura confortable, y medida entre 12 y 16 horas

después de la ingestión de alimento. El MB se expresa habitualmente en términos de

consumo de Oxígeno por minuto o en términos de Kilocalorías por hora o por 24 horas. El

MB está determinado por el tamaño corporal (peso), sexo y la edad el sujeto.

Los factores que ejercen efectos en el MB incluyen los siguientes:

1. Actividad física. El MB se incrementa hasta 40 veces por arriba de lo normal cuando

se llevan a cabo actividades físicas intensas.

Clasificación del trabajo físico

 

Ventilación

Consumo

Metabolismo

Frecuencia

Pulmonar

oxígeno

del pulso

(lmin¨¹ )

(lmin¨¹ )

(lmin¨¹ )

( latidosmin¨¹ )

Muy ligero

<10

<0.5

<2.5

<80

Ligero

10-20

0.5-1.0

2.5-5.0

80 -100

Moderado

20-35

1.0-1.5

5.0-7.5

100-120

Pesado

35-50

1.5-2.0

7.5-10

120-140

Muy pesado

50-65

2.0-2.5

10-12.5

140-160

Agotador

>85

>3.2

>15

>180

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2. Sistema Nervioso.

En casos de sobretensión o estrés, la porción simpática del sistema nervioso autónomo

experimenta estimulación, y los nervios liberan noradrenalina, sustancia que

incrementa e l metabolismo celular hasta en 160 veces, pero sí lo hace durante

algunos minutos.

3. Hormonas.

Además de la noradrenalina, otras dos hormonas ejercen influencia en el MB, la

adrenalina, sintetizada por las suprarrenales y las hormonas tiroideas, que produce la

glándula homónima.

4. Temperatura Corporal.

Por cada grado centígrado de elevación de la temperatura, se aceleran las reacciones

químicas en un 10%.

VALORES CALÓRICOS DE LAS PRINCIPALES SUSTANCIAS QUE COMPONEN LOS ALIMENTOS:

Azúcares:

4 Calorías por gramo

Proteínas:

4 Calorías por gramo

Grasas:

9 Calorías por gramo

Material y equipo:

lápiz.

Calculadora.

báscula

cinta métrica

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DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

1.

Determinación del Metabolismo Basal

1.1

Siguiendo el protocolo de uso de la báscula proceda a:

1.2

Con el tallímetro medir su talla (estatura) en centímetros con la ayuda de un

compañero y anótela en su manual.

1.3 A continuación procede a pesarse en la báscula y anota el valor en tu manual.

1.4 En la siguiente fórmula sustituye los datos obtenidos de peso y talla, agregando

tu edad en ella para que de esta manera obtengas tu Metabolismo Basal. Utiliza la fórmula según corresponda:

MB = 66.4730 + 13.751P + 5.0033 T - 6.7550 E

(para hombres)

MB = 655.0955 + 9.463 P + 1.8496 T - 4.6756 E

(para mujeres)

MB = Metabolismo basal en Kcal/ min-1

P

= Peso en Kg

T

= Talla en cm

E

= Edad en años

2. Determinación del gasto calórico

Con los valores asignados en la siguiente tabla según la actividad, calcula tu gasto calórico de acuerdo a tu género.

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CALCULOS:

RESULTADOS:

TABLA NO.6 REFERENCIA PARA OBTENER Kcal.

ACTIVIDAD

Tiempo

Hombre

Mujer

Hora

Kcal /min-1

Total

Kcal/min-1

Total

Durmiendo

1.1

1.0

Sentado

1.5

1.1

En Pie

2.5

1.5

Andando

3.0

2.5

Otras actividades Total Kcal/día

4.5

3.0

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CONCLUSIÓN:

MECANISMO DE EVALUACIÓN

Elabore un argumento que justifique los valores obtenidos a través de las diferentes actividades.

Discutir la diferencia o similitud de los valores obtenidos para ambos casos de acuerdo a su género.

BIBLIOGRAFÍA: Mathews/Van Holde. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Editorial McGraw-Hill * Interamericana 2000 Lehninger. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Ediciones Omega .S.A. Barcelona 1985 Harper BIOQUÍMICA. 15ª Edición. Editorial Manual Moderno http://www.mediben.com/Nutsem2.htm

M.J.Lynch/S.S. Raphael/L. D. Mellor/P.D. Spare/M.J.H.Inwood. Métodos de Laboratorio Segunda edición/ Tomo I. Editorial Interamericana www.tuotromedico.com

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PROYECTO DE INVESTIGACION EN BIOQUIMICA BASICA

Practica No. 6 Tema teórico al que apoya: Los que incidan según las propuestas de los alumnos.

OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Elaborar un protocolo de investigación relacionado con un tema de Bioquímica.

FUNDAMENTO.

La investigación en el área de Bioquímica básica forma parte integral en el desarrollo de habilidades y conocimientos en el alumno. Esta habilidad es esencial tanto en el desarrollo de sus actividades como estudiante, así como en su futura práctica profesional.

Las habilidades además de las necesarias para el desarrollo de habilidades practicas, involucra otras esferas de conocimiento, actitudes y valores.

Esta sesión se deberá planear con anterioridad de tal manera que durante la sesión práctica se realice el análisis del material bibliográfico y la planeación del desarrollo del mismo.

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El protocolo de investigación deberá contener :

Tema Hipótesis Muestra y Tipo de población Criterios de inclusión Criterios de exclusión Metodología y Apoyo tecnológico Lugar de realización Definiciones de terminología Referencias bibliográficas Discusión de artículos originales Discusión de resultados obtenidos. Conclusiones.

El protocolo deberá ser entregado por escrito y acompañado por el material bibliográfico de apoyo.

RECURSOS NECESARIOS:

En caso de que la investigación sea teorico-práctica

Insumos necesarios

Equipo requerido

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DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

En coordinación con el equipo de trabajo analice y discuta las referencias bibliográficas y la

aplicación a su proyecto de investigación.

Valore y reafirme el tema o plantee otras alternativas de investigación.

Defina el tipo de proyecto que puede ser teórico o teórico experimental.

Al final de la práctica presente las conclusiones de su proyecto.

RESULTADOS

CONCLUSIÓN:

MECANISMOS DE EVALUACIÓN:

Sesión de discusión de resultados

Exposición y Elaboración del proyecto.

Bibliografía utilizada y artículos originales anexos.

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DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS

Práctica No. 7

Tema teórico al que apoya: Triacilglicéridos

OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Explicar como afecta el realizar una determinación de triglicéridos sin tener una ayuno adecuado. Analizar y comparar las concentraciones de los valores de referencia de población adulta de triglicéridos en sangre contra los obtenidos en la práctica. Argumentar la participación de la lipasa pancreática en la digestión de los triglicéridos.

FUNDAMENTO El procedimiento de colesterol involucra reacciones enzimaticas secuenciales. La enzima colesterol enteraza hidroliza los esteres de colesterol a colesterol y acidos grasos. El colesterol producido por esta reacción junto con el colesterol libre presente en la muestra es oxidado por colesterol oxidasa formando colesterol –4 en -3 ona y peroxido de hidrógeno, la oxidación del peroxido de hidrógeno en 4 aminoantipirina se cataliza la peroxidasa. Obteniéndose una quinoenimina.

Los triglicéridos son las grasas más abundantes de la dieta, existen normalmente en los

tejidos animales y vegetales como una mezcla de grasas puras y ácidos grasos libres.

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DE MEDICINA Y PSICOLOGIA MANUAL DE BIOQU ÍMICA BASICA Código: L1M-N3-002 No.de Revisión: 1 Efectividad: 2008-2
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Además de servir como fuente de energía y ser las principales formas de almacenaje de las

células; el análisis de colesterol total es importante en el diagnostico de lipoproteinemia,

artebioesclerosis y enfermedades hepáticas y de la tiroide.

Los triglicéridos son hidrolizados por la lipasa para liberar ácidos grasos y glicerol, ester

último es fosforilado por ATP en presencia de glicerol cinasa. El glicerol resultante es

oxidado por GPO a hidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrógeno. El color es proporcional

a la concentración de triglicéridos.

En esta práctica nos enfocaremos a la determinación de triglicéridos en ayuno, así como

después de haber ingerido una dieta rica en grasas.

RECURSOS NECESARIOS:

Muestra biológica:

Muestra de suero sanguíneo de paciente en ayuno de 12 a 14 hrs.

Material:

Pipetas serológicas.

Micropipetas.

Puntillas de micropipeta.

Bulbos.

Tubos de ensaye

Gradilla

Baño María a 37 ºC

Espectrofotómetro y aditamentos

Calculadora, lápiz y marcador indeleble

Papel absorbente

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Código: L1M-N3-002

No.de Revisión: 1

Efectividad: 2008-2

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Insertos del reactivo.

Reactivos:

Set de Reactivo de Triglicéridos.

Calibrador ó estándar de Triglicéridos.

Sueros control

Agua destilada

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1. Determinación de triglicéridos en suero

1.1 Se toma una muestra de sangre por la mañana en ayunas.(muestra 1)

Enseguida ingerir un alimento rico en grasas, dejar pasar de 30-45 min. y tomar otra

muestra de sangre.(muestra 2)

1.2 En ambas muestras (1 y 2 ) se cuantifican los triglicéridos

1.3 Realice la determinación de las pruebas incluyendo blanco, estándar, control

1.4 Leer las absorbancias en el espectrofotómetro de las muestras a determinar.

1.5 A partir de las absorbancias obtenidas para cada muestra determine la concentración

correspondiente de la manera siguiente:

Triglicéridos mg/dl

=

Abs problema (estándar)

Abs estándar

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Efectividad: 2008-2

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RESULTADOS

VALORES DE REFERENCIA

Esperado:

Límite alto:

Alto:

Muy alto:

menos de 150 mg/dl

150 a 199 mg/dl

200 a 499 mg/dl

500 mg/dl o superior

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN:

MECANISMOS DE EVALUACIÓN:

de

Sesión

de

discusión

resultados

obtenidos

en

los

dos

casos

desarrollados. Elaboración de un argumento que justifique los resultados obtenidos.

BIBLIOGRAFÍA: Mathews/Van Holde. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Editorial McGraw-Hill * Interamericana 2000 Lehninger. BIOQUÍMICA. Segunda edición. Ediciones Omega .S.A. Barcelona 1985 Harper BIOQUÍMICA. 15ª Edición. Editorial Manual Moderno

http://www.mediben.com/Nutsem2.htm

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No.de Revisión: 1

Efectividad: 2008-2

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GLUCONEOGÉNESIS

Práctica No. 8 Tema teórico al que apoya: Gluconeogénesis OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz de:

Explicar la biotransformación de la glucosa conforme ocurre su catabolismo a

través de la gluconeogénesis.

Describir la función de los principales sustratos fisiológicos en el ciclo de cori.

Conocer la importancia que tiene la gluconeogénesis en la regulación enzimática

por la vía del sustrato fisiológico lactato.

FUNDAMENTO

La gluconeogénesis se define como la biosíntesis de hidratos de carbono a partir de

precursores de tres y cuatro carbonos, que generalmente no tienen naturaleza de hidratos de

carbono.