CARACTERIZAÇÃO DE AEROMONAS SPP.

ISOLADAS DE ÁGUAS NÃO TRATADAS PARA
CONSUMO HUMANO




Dissertação de Mestrado em
Biologia Clínica Laboratorial













Maria Ermelinda de Aguiar Ribeiro




Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, 2008




















































Instituição Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Curso Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial
Titulo “Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo
Humano”
Autor Maria Ermelinda Aguiar Ribeiro
Orientadores
Prof.ª Doutora Maria José Félix Saavedra
Prof.º Doutor António José Martínez - Murcia




















































“As Doutrinas espostas no presente trabalho
são da exclusiva responsabilidade do autor”
































Este trabalho foi expressamente elaborado como
dissertação original para o efeito de obtenção do
grau de Mestre em Biologia Clínica Laboratorial.
v

AGRADECIMENTOS
Ao Magnifico Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Professor
Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, a minha especial gratidão pela compreensão e
condições proporcionadas, sem as quais não teria sido possível a realização deste
trabalho.
À Professora Doutora Maria José Saavedra, o meu muito obrigada por se ter
disponibilizado para a orientação científica deste trabalho, pelo apoio imprescindível
que sempre me dispensou, bem como pela amizade e compreensão manifestadas.
Ao Professor António Martínez-Murcia, Director do Laboratório de I&D Molecular
Diagnostic Center (MDC), Alicante, Espanha, o meu profundo reconhecimento por ter
aceite a co-orientação deste trabalho, pela compreensão e incentivo demonstrado em
todos os momentos e disponibilidade para realização da sequenciação dos isolados
bacterianos.
Às colegas de Mestrado, Drª. Anabela Borges e Drª.Carla Dias, pela amizade,
cumplicidade demonstradas no decorrer do trabalho analítico, pelo apoio informático, o
meu mais sincero e reconhecido agradecimento.
Ao Departamento de Ciências Veterinárias, pela disponibilização dos meios necessários
para a realização deste trabalho.
Ao meu marido José João, que nos momentos mais difíceis conseguiu sempre apoiar-me
e incentivar-me mostrando uma total dedicação e disponibilidade, pelo que expresso a
minha mais reconhecida gratidão.
Aos meus filhos, João e Ana Filipa, por todos os momentos que deixei de partilhar com
eles.
A todos, familiares, colegas e amigos, por todo o seu apoio demonstrado na realização
deste trabalho.
vi






FINANCIAMENTOS
A realização deste trabalho foi possível mediante o apoio das seguintes
entidades:
CECAV- Centro de Estudos de Ciência Animal e Veterinária, Universidade de
Trás-os Montes e Alto Douro.











vii







TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE


CONGRESSOS INTERNACIONAIS
Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., and Martínez-Murcia A., 2008. Antimicrobial
resistance patterns of Aeromonas spp. in drinking water from Portugal. Proceedings of the “9
th

I nternational Symposium on Aeromonas and Plesiomonas”, 10
th _
12
th
September, UTAD,
Vila Real.


JORNADAS NACIONAIS
Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., e Martínez-Murcia A., 2008. Perfil de
resistência a antibióticos de Aeromonas spp. isoladas de águas de consumo não tratadas em
Portugal. Livro de resumos das 2
as
J ornadas de Biologia, 7 e 8 de Outubro, UTAD, Vila Real.




viii

RESUMO
____________________________________________________________

O género Aeromonas forma uma unidade monofilética dentro do sub-grupo gama -3 das
Proteobactérias. Bactérias do grupo das Aeromonas surgem em diversos ambientes
aquáticos. Está também comprovada a presença de Aeromonas spp. em águas para
consumo humano, tratadas e não tratadas. Os organismos deste grupo são
frequentemente referidos como “patogénicos emergentes” sendo pesquisados
obrigatóriamente no Canadá, Itália e Holanda. Assim, pretende-se com este estudo,
fazer uma avaliação da presença de organismos do género Aeromonas em águas não
tratadas de fontes, poços e nascentes, para consumo humano em dois concelhos do
Distrito de Vila Real. Pela sua importância, diversidade genética, e o seu nível de
resistência a antibióticos foi o género seleccionado para a elaboração deste trabalho. A
identificação das estirpes foi realizada por sequenciação dos genes 16S rRNA, gyrB,
gyrA e rpoD. Foram obtidos um total de 34 isolados agrupados em sete espécies
distintas – A. hydrophila, A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veroni, A. bestiarum e
A. encheleia – e um grupo distinto dos actualmente identificados, que pela sua distância
filogenética poderá corresponder a uma espécie ainda não descrita. Foi efectuada a
determinação da susceptibilidade para um total de 27 antibióticos sendo utilizados
β-lactâmicos como as penicilinas (aminopenicilinas), cefalosporinas (1ª, 2ª, 3ª e 4
geração), monobactâmicos e carbapenemos. Adicionalmente outros antibióticos foram
testados como: tetraciclinas, quinolonas, aminoglicosídeos, sulfamidas e cloranfenicol.
Dos antibiogramas realizados verificou-se que todas as estirpes apresentaram
multiresistência. Para a amoxicilina e cefalotina obtiveram-se índices de resistência de
100%. Para o carbapenemo testado (imipenemo) 3% das estirpes apresentaram
resistência e 13% foram consideradas intermédias. Todas as estirpes foram sensíveis
para a piperaciclina/tazobactan, aminoglicosídeos, aztreonamo e tetraciclina.


ix

ABSTRACT
____________________________________________________________
The genus Aeromonas forms a monophyletic unit within the gamma-3 subgroup of the
class Proteobacteria. Bacteria of Aeromonas spp. are widely spread in aquatic
environments. They also occur in untreated and treated drinking water. Members of this
genus are considered as “emerging pathogens” and have been the focus of studies in
Canada, Italy and Holland. Thus, it is intended with this study, to evaluate the presence
of organisms of the genus Aeromonas in untreated water sources, wells and springs, for
human consumption in two counties of the District of Vila Real. The reason for the
selection of this genus for study is its clear importance in terms of health, genetic
diversity, and its level of resistance to antibiotics. The identification of strains was
performed by sequencing of 16S rRNA, gyrB, rpoD and gyrA. A total of 34 isolates
were obtained which were clustered into seven distinct species - A. hydrophila,
A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veronii, A. bestiarum and A. encheleia- and a
distinct group not identified, which by their phylogenetic relationship may correspond
to a new species of Aeromonas. The antibiotic susceptibilities of these species were
determined using 27 antibiotics including β-lactams such as penicillins
(aminopenicillins), cephalosporins (1st, 2nd, 3rd and 4 generation), monobactams and
carbapenems. Additionally other classes of antibiotics were also tested e.g.
tetracyclines, quinolones, aminoglycosides, sulphonamides and chloramphenicol. From
antibiograms performed it was found that the strains showed multidrug-resistance. To
amoxicillin and cephalothin rates of resistance were 100%. For the carbapenems tested
(imipenem) 3% of the isolates showed resistance and 13% were considered as having
intermediate resistance. All isolates were sensitive to piperaciclina/tazobactan,
aminoglycosides, tetracycline and aztreonam.


x


ÍNDICE

AGRADECIMENTOS v
FINANCIAMENTOS vi
TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE vii
RESUMO viii
ABSTRACT ix
ÍNDICE x
ÍNDICE DE FIGURAS xiii
ÍNDICE DE QUADROS xiv
ÍNDICE DE TABELAS xv

1. INTRODUÇÃO 1
1.1. A qualidade da água para consumo 2
1.2. O género Aeromonas 6
1.2.1. Ecologia e Patogenicidade 7
1.2.2. Taxonomia e Filogenia 9
1.2.3. Métodos de Identificação 12
1.2.3.1. Métodos microbiológicos convencionais 12
1.2.3.2. Métodos genéticos 13
1.2.3.3. Sequenciação do gene que codifica para o rRNA 16S 14
1.2.3.4. Sequenciação de genes “Housekeeping” 14
1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA 16
1.2.3.4.2. Gene rpoD 18
1.3. Agentes antimicrobianos 18
1.3.1. Principais mecanismos de resistência 19
1.3.2. Antibióticos antiparietais 20
1.3.2.1. β-lactâmicos 21
1.3.3. Inibidores de β-lactâmicos 22
xi

1.3.4. Antibióticos inibidores da síntese proteica 23
1.3.4.1. Aminoglicosídeos 23
1.3.4.2. Tetraciclinas 24
1.3.4.3. Cloranfenicol 24
1.3.4.4. Macrólidos 25
1.3.5. Antibióticos inibidores da síntese dos ácidos nucleicos 25
1.3.5.1. Quinolonas 26
1.3.6. Antibióticos antimetabolitos 26
1.3.6.1. Sulfonamidas/Trimetropim 26
1.3.7. Antibioresistência no género Aeromonas 27

2. OBJECTIVOS 31

3. MATERIAL E MÉTODOS 32
3.1. Origem das amostras 33
3.1.1. Método de recolha das amostras 34
3.1.2. Isolamento pela técnica de filtração por membrana 34
3.1.3. Conservação das estirpes 35
3.2. Caracterização preliminar dos isolados 35
3.2.1. Coloração diferencial de Gram 35
3.2.2. Prova da citromo-oxidase 36
3.2.3. Prova da catalase 36
3.3. Identificação das estirpes bacterianas 37
3.3.1. Extracção de DNA de culturas puras 37
3.3.2. Amplificação de DNA por reacção de PCR 38
3.3.3. Purificação dos produtos de PCR 38
3.3.4. Sequenciação 39
3.3.5. Análise de sequências e construção dos dendogramas 41
3.4. Caracterização bioquímica pelo API 20NE 41
3.5. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos 42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 44
4.1. Estirpes isoladas 45
4.2. Identificação por sequenciação de isolados bacterianos 47
xii

4.2.1. Identificação dos isolados por sequênciação do gene 16S rRNA 47
4.2.1. Identificação dos isolados bacterianos por sequênciação do gene gyrB 48
4.2.2. Identificação dos isolados bacterianos por sequênciação do gene gyrA 52
4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp. 53
4.4. Caracterização fenotípica da estirpe MDC 2464 55
4.4.1. Métodos bioquímicos 55
4.4.2. Sistema de biotipificação numérico API 20NE 55
4.5.Caracterização bioquímica da espécie Aeromonas spp. 57
4.5.1. Sistema de biotipificação numérico API 20NE 57
4.6. Perfil de susceptibilidade a antibióticos 59


5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 66


6. BIBLIOGRAFIA 68

ANEXOS
AnexoI-Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por
16s RNA
Anexo II-Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por gyrB,
gyrA e rpoD




xiii

Í ÍN ND DI IC CE E D DE E F FI IG GU UR RA AS S

Figura 1 - Fotografia de microscopia electrónica de bacilos de Aeromonas hydrophila
colonizando o tecido epitelial de intestino humano 7

Figura 2 - Estrutura da DNA girase. Indicação das subunidades funcionais, GyrA e GyrB 17

Figura 3 - Representação dos locais de actuação dos diferentes grupos de antibióticos 19

Figura 4 - Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a região do gene que foi
amplificada e, em negrito, as posições do primer, e primeiro e último nucleótido amplificado
segundo a numeração de E. coli (Huang, 1996) 49

Figura 5 - Árvore filogenética baseada na sequência do gene gyrB dos isolados obtidos neste
trabalho 50

Figura 6 - Árvore filogenética baseada na sequência do gene rpoD. Está representada nesta
figura a estirpe representativa do grupo Aeromonas spp. 54

Figura 7 - Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE do isolado F9 (MDC 2464)57

Figura 8 - Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE dos isolados F1BCa1 (MDC
2510) e F1BC1a2 58

Figura 9 - Perfil de susceptibilidade a diferentes antibióticos dos isolados de Aeromonas em
estudo 59












xiv

Í ÍN ND DI IC CE E D DE E Q QU UA AD DR RO OS S


Quadro 1 - Estirpes actualmente aceite no género Aeromonas 11
Quadro 2 - Técnica de filtração por membrana 32
Quadro 3 - Procedimento de Coloração pelo método de Gram 35
Quadro 4 - Metodologia de execução da prova da oxidase 35
Quadro 5 - Metodologia de execução da prova da catalase 36
Quadro 6 - Metodologia de extracção do DNA de estirpes bacterianas 37
Quadro 7 - Oligonucleotidos utilizados para reacção de PCR 38
Quadro 8 - Protocolo de Purificação de produtos de PCR 39
Quadro 9 - Oligonucleotidos utilizados em reacção de sequenciação 40
Quadro 10 - Protocolo de precipitação dos produtos de sequenciação 40
Quadro 11 - Procedimento para a realização do sistema API 20 NE 41
Quadro 12 - Técnica de difusão em agar com discos de antibióticos 43





xv

Í ÍN ND DI IC CE E D DA AS S T TA AB BE EL LA AS S


Tabela 1 - Locais de amostragem e número de amostras 33
Tabela 2 - Identificação da amostra, origem, localização e referência atribuída 46
Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene 16s RNA 47
Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene por gyrB 51
Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene por gyrA 53
Tabela 6 – Perfil bioquímico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC2464 56
Tabela 7- Resistência a múltiplos antibióticos das espécies de Aeromonas 63




























1. INTRODUÇÃO
________________________________________________________


Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 2

1.1. Qualidade da água para consumo

Desde a época do Império Romano que se sabe que a água é um potencial
transportador de doenças. O controlo microbiológico das águas de consumo humano
tem sido praticado desde o inicio do século XX. Sendo a água um dos elementos
essenciais para o Homem, é necessário que esta seja utilizada em condições de
potabilidade. Em Portugal, cerca de 1 milhão de pessoas não possui água canalizada,
recorrendo a água de diversas origens, nomeadamente poços, minas, furos e fontes.
Nestes casos, sobretudo no interior do país, a contaminação representa um perigo para a
saúde pública, nomeadamente no que se refere aos perigos microbiológicos (Saavedra,
2000).
De entre os microrganismos presentes na água, destacam-se os de natureza
exógena, como os oriundos de matéria fecal humana e animal, tais como os coliformes
totais, coliformes fecais e enterococos. Os coliformes pertencem à família das
Enterobacteriaceae e incluem vários membros dos géneros Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter e Klebsiella. Existem ainda os de natureza autóctone, que englobam
diversas espécies e fazem parte da microbiota natural da água, entre elas as bactérias
móveis dos géneros Aeromonas e Pseudomonas (Palumo et al., 1996).
A Organização Mundial de Saúde refere a utilização de microrganismos
intestinais como indicadores de poluição fecal, sendo estes microrganismos
universalmente aceites para a monitorização e avaliação da qualidade microbiológica da
água. A existência de enteropatogénicos em amostras de água para consumo humano
indica potencial contaminação, requerendo atenção imediata e alertam-nos para a
necessidade do seu tratamento (OMS, 2003).
Na Europa são várias as directivas relativas a esta análise, nomeadamente a
directiva nº 98/83/CE que refere os critérios e normas de qualidade da água. Em
Portugal, o Decreto-Lei nº 306/2007, de 27 de Agosto, estabelece o regime da qualidade
da água destinada ao consumo humano, tendo por objectivo proteger a saúde humana
dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminação dessa água e assegurar a
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 3

disponibilização tendencialmente universal de água salubre, limpa e desejavelmente
equilibrada na sua composição. A qualidade da água para consumo humano, é
estabelecida por parâmetros microbiológicos e baseada em valores paramétricos de
microrganismos patogénicos indicadores de poluição fecal, fixados nas partes I e II do
decreto-lei. Nos países em vias de desenvolvimento as condições socioeconómicas
favorecem a incidência e prevalência de quadros diarreicos, pelo que a preocupação dos
microbiologistas clínicos, incide essencialmente na identificação dos patogénicos
clássicos como a Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter e
Yersinia (Payment et al., 1991; Lund, 1994; Asmat e Gires, 2002; Castro- Escarpulli et
al., 2003; Schets et al., 2008). Actualmente E. coli é utilizada como sendo a principal
indicadora de monitorização da poluição da água potável (OMS, 2003), sendo mesmo
considerada um indicador superior (Edberg et al., 2000) e está associada a
contaminação fecal recente (APHA, 2005).

Cada vez mais existem estudos em que outros géneros são considerados como
patogénicos emergentes, e possíveis de ser objecto de monitorização (Asmat e Gires,
2002). Nos países industrializados a circulação de muitos patogénicos tem vindo
progressivamente a diminuir nos últimos anos, pelo contrário, infecções causadas por
patogénicos emergentes (i) bacterianos como: Pseudomonas, Legionella, Arcobacter e
Aeromonas; (ii) parasitas como: Cryptosporodium e Giardia; e (iii) vírus: norovírus,
rotavírus, enterovírus, e astrovírus têm vindo a aumentar (Aulicino, et al., 2005;
Sansebastiano et al., 2008; Schets et al., 2008). Alguns autores referem que se deveria
considerar o género Aeromonas como um indicador na monitorização do funcionamento
do sistema de tratamento e potabilização das águas (Szewezyk et al., 2000; Asmat e
Gires, 2002).
Assim, na Holanda, Itália e Canadá as autoridades de sáude pública, na
sequência do aumento do isolamento de Aeromonas spp. estabeleceram o valor máximo
de 200 UFC/100ml em águas para consumo (Carnahan e Josephh, 2005). Em Itália
limites provisórios e cautelar foram estabelecidos em 1997 para águas minerais naturais
na sua origem (10 UFC/100ml) e (100 UFC/100ml) depois de serem engarrafadas.
Contudo o papel da água de consumo nas infecções causadas por Aeromonas spp. ainda
não está claro (Kirov 1997; Edberg et al., 2007). Fuzihara e colaboradores (1995)
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 4

verificaram a ocorrência de Aeromonas spp. em amostras de água tratada e não tratada
concluindo estes autores que o consumo dessas águas representam um risco para a
sáude dos consumidores. Estudos referem que a espécie de Aeromonas hydrophila tem
maior prevalência em águas não poluídas, enquanto Aeromonas caviae está associada a
águas com um elevado grau de poluição (Hanninen et al., 1995). A frequência de outras
fenoespécies deste género parece não estar relacionada com condições ambientais
(Fiorentini et al., 1998).
Em 1998, Borrel e colaboradores, isolaram Aeromonas de diferentes espécies
em águas para consumo onde não foram detectados coliformes mostrando que não
existe uma correlação com estes indicadores. O género Aeromonas foi reconhecido
como um enteropatogénico em humanos, e desde 1970 tem ocorrido um maior interesse
na investigação do mesmo. Desde 1995 que este género foi indicado pela EPA
(Environmental Protection Agency) como organismo “patogénico emergente” (Merino
et al., 1995), e a espécie Aeromonas hydrophila como indicadora desse organismo,
tendo sido proposta a “Candidata à Lista dos Contaminantes” nos Estados Unidos por
esta agência.
A biodiversidade de habitats onde estes agentes patogénicos têm sido isolados,
e o crescente número de infecções associadas a este género nas últimas décadas tem
despertado interesse na comunidade científica de forma a estabelecer o risco que este
género representa para a saúde pública. Em 1954 na Jamaica, é descrito o primeiro caso
de infecção, miosite aguda, em humanos por Aeromonas (Hill et al., 1954),
posteriormente numerosos casos de infecções foram publicadas (Von Graevenitz, 1968).
As doenças infecciosas são um dos principais problemas que os países em vias de
desenvolvimento enfrentam.
Estudos revelam que a água desempenha um importante papel na transmissão
do género Aeromonas para humanos e animais (Joseph e Martin-Carnahan, 2000;
Crivelli et al., 2001; Figueras, 2005). É importante saber que os isolados ambientais são
potenciais patogénicos para o ser humano, havendo subpopulações ou subespécies de
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 5

Aeromonas com maior virulência e que representam um risco para a saúde humana
(Daily et al., 1981; Bin Kingombe et al., 1999; Figueras, 2005).
Em humanos o quadro clínico mais comum está relacionado com
gastroenterites ou com uma condição conhecida como a diarreia do viajante. Infecções
gastrointestinais foram observadas em doentes immunodeprimidos, com doenças
intestinais malignas, doenças hepatobiliares e baixa acidez gástrica após a ingestão de
alimentos e água contaminada (Janda, 1991; Braddour, 1992, Harf-Monteil, 2008).
Numerosos casos têm sido relatados descrevendo o isolamento de Aeromonas spp. em
doentes com diarreia, mas o papel destas bactérias em processos de gastroenterite
continua a ser controverso (Kirov,1993; Janda e Abbott, 1998, Von Gravaenitz, 2007)
mesmo depois de serem isoladas em doentes saudáveis (Janda, 2001; Albert et al.,
2000; Tsai et al., 2006; Figueras, 2005).
Em 1986, Holmberg e colaboradores num estudo que visava avaliarem
aspectos clínicos e epidemiológicos de gastroenterites associadas a Aeromonas spp.
concluíram que o consumo de água não tratada constitui um factor de risco para o
Homem. As três espécies consideradas patogénicas de maior importância para o
Homem são Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii (com 2 biotipos sobria e
veronii), Aeromonas caviae, e constituem assim 85% de todos os isolados clínicos
envolvidos em infecções gastrointestinais como também em infecções extra-intestinais
(Janda, 1991; Braddour, 1992; Abbott, 1998; Janda e Abbott, 1998; Kirov, 2001;
Figueras, 2005; Miñana-Galbis et al., 2007;Von Gravaenitz, 2007). Em contrapartida,
Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei e Aeromonas trota, são consideradas
patogénicos de menor relevância (Sen e Rodgers, 2004; Donohue et al., 2007; Tena et
al., 2008), mas também estão implicadas em doenças nos humanos. Segundo Edberg e
colaboradores (2007) somente três espécies A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biovar
sobria, são clínicamente importantes.
Balotescu e colaboradores (2003) referem uma alta mortalidade por infecções
de estirpes do género Aeromonas nomeadamente de certas fenoespécies (A. hydrophila
e A. veronii) em pacientes imunocomprometidos. Para os microbiologistas “essa alta
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 6

taxa de mortalidade” é provavelmente devida ao pouco conhecimento no que respeita
aos aspectos de antibioresistência em estirpes de Aeromonas, pois tratamentos com
antibióticos para bactérias que apresentam resistência constitutiva levam a resultados
sem sucesso, como também, a crescente tendência de multiresistência que as espécies de
Aeromonas apresentam a alguns grupos de antibióticos (Levy et al., 2005). É
claramente necessário, que intervenções preventivas e programas de monitorização
eficazes, relativamente a águas destinadas ao consumo humano, a actividades
recreativas de lazer e qualidade ambiental, sejam aplicados (Sansebastiano et al., 2008),
de modo a serem conhecidos outros bioindicadores assim como o seu potencial de
resistência.


1.2. O género Aeromonas

O termo Aeromonas, que deriva das palavras gregas “aer” que significa ar ou
gás e “monas” que significa unidade, ou seja unidades produtoras de gás (Martin-
Carnahan e Joseph, 2005). Aeromonas é um género da família Aeromonadaceae.
Actualmente esta família inclui ainda os géneros Oceanimonas, Tolumonas,
Oceanisphaera e Zobellella (Euzéby, 2008). São organismos autóctones do meio
ambiente aquático considerados patogénicos não só para os peixes e anfibios, tendo
actualmente uma importância crescente em humanos.
O género Aeromonas inclui um grupo de bactérias Gram negativo, anaérobias
facultativas, não esporuladas, normalmente oxidade e catalase positiva, capazes de
degradar os nitratos a nitritos, fermentam a D-glucose como fonte principal de carbono
e energia. Estes bacilos não são halofílicos e são resistentes ao agente vibriostático
O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridina) a concentrações de 10 e 150 μg (Martin-
Carnahan e Joseph, 2005). Todas as espécies com excepção de Aeromonas salmonicida
e Aeromonas media são móveis e geralmente movimentam-se por um flagelo polar
(Figura 1). O tamanho varia de 0,3 a 1,0 m de diâmetro e de 1,0 a 3,5 m de longitude.
Podem aparecer como bacilos ou cocobacilos independentes, aos pares ou em cadeias
curtas (Popoff, 1984), a sua temperatura mínima de crescimento é de 4 ºC, a máxima de
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 7

45ºC. O seu crescimento óptimo é a 30 ºC. A sua tolerância ao pH varia entre 4.5 a 9.0.
Estas espécies produzem exoenximas como amilase, fosfolipase, protease e DNAse
(Popoff, 1984; Kirov, 1997; Kirov et al 2004; Carnahan e Joseph, 2005).

Figura 1 – Micrografía electrónica de bacilos de Aeromonas hydrophila colonizando o tejido epitelial intestinal humano
(“Northwest Fisheries science Center, NOAA”).

1.2.1. Ecologia e patogenicidade
Aeromonas spp. são microrganismos de ocorrência amplamente difundida no
ambiente aquático nomeadamente água doce, água potável, águas contaminadas, água
do mar, sistemas de distribuição de água para consumo, águas termais, lagos, rios, mar,
esgotos, e solos (Hazen et al., 1978; Borrel et al., 1998; Saavedra, 2000; Biscardi et
al., 2002; Abbott, 2003; Palú et al., 2006; Libisch et al., 2008; Sepe et al., 2008).
Existem poucos dados relativamente à presença de Aeromonas spp. no solo, contudo
estudos referem que estas podem persistir e mesmo multiplicar-se, mantendo as suas
características de virulência, o que sugere a importância do solo como reservatório deste
microrganismo (Brandi et al., 1996). A incidência de Aeromonas spp. nos sistemas de
distribuição de águas para consumo tem sido alvo de interesse, dada a sua importância
em termos de sáude pública. A concentração destes microrganismos varia com as
estações do ano, e quando a temperatura ambiente é superior a 20 ºC, verifica-se um
aumento, correspondendo à época de maior incidência de quadros diarreicos, o que
apoia a hipótese de considerar que a água e alimentos são os principais veículos de
transmissão deste género (Schubert, 1991; Kirov, 1993; Chopra e Houston, 1999;
Hernould, 2008).
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 8

Estes microrganismos têm também sido isolados numa grande variedade de
alimentos tais como carnes, pescado, mariscos, alimentos preparados, produtos de
pastelaria, leite, derivados lácteos e verduras (Palumo et al., 1989; Knochel e Jeppesen,
1990; Kirov et al., 1993; Hänninen e Siitonen, 1995; Castro - Escarpulli et al., 2003;
Bin Kingombe et al., 2004; Ottaviani et al., 2006). Por este motivo alguns autores
consideram que Aeromonas deveria incluir-se na lista de microrganismos que podem
actuar como causadores de toxoinfecções alimentares (Kirov, 1993). As fontes de
infecção em humanos podem ser agrupadas em duas grandes categorias: a primeira
devida ao complexo ambiente - água - animais; e a outra será mediante a ingestão de
comida contaminada, sendo este género cada vez mais referenciado como o principal
causador de diversas infecções ao nível da clínica humana (Joseph e Martin-Carnahan,
2000; Ko et al., 2000; Hsiu-Tsun et al., 2003; Figueras, 2005).

À medida que a diversidade do género Aeromonas foi sendo descrita aumentou
a sua importância como agente patogénico (Carson et al., 2001). Algumas espécies têm
sido reconhecidas como patogénicas para o Homem causando infecções intestinais e
extraintestinais, incluindo septicémia, feridas, infecções da pele, tecidos moles e no
sangue (Janda 1991; Chang et al., 1997; Krzyminska et al., 2008), como também nos
animais especialmente em peixes, anfíbios e repteis (Martin-Carnahan e Joseph, 2005;
Figueras, 2005; Tena et al., 2007).

Vários estudos referem que as Aeromonas constituem um grupo de
organismos patogénicos primários, sendo a primeira causa de doenças extraintestinais, e
estão fortemente associadas a infecções gastrointestinais em humanos (Janda, 1991;
Braddour, 1992; Subashkumar et al., 2006). O facto de não se conseguir reproduzir em
animais de laboratório os sintomas diarreicos observados no Homem, também não tem
permitido demonstrar a capacidade enteropatogénica desta bactéria (Janda e Abbott,
1998; Von Graevenitz, 2007). Assim o papel de Aeromonas spp. como agente causador
de gastroenterite continua a ser objecto de investigação e mesmo especulação.
Bardhan e colaboradores em 1998 consideraram Aeromonas spp., Escherichia coli e
Klebsiella spp. como os agentes mais importantes de diarreia infantil no Bangladesh.

Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 9

Estudos recentes têm demonstrado que a presença de Aeromonas spp. na água
é um potencial risco para a saúde pública, uma vez que estes microrganismos
produzem uma ampla gama de factores de virulência, deste modo a patogenicidade das
infecções associadas a estes microrganismos é considerada complexa e multifactorial
(Chopra et al., 2000). A presença de factores de virulência nas espécies de Aeromonas
spp. é um facto comprovado, sendo referido tanto componentes estruturais como
produtos extracelulares (Cahill,1990; Thornley et al., 1997; Chacón et al., 2003; Harf-
Monteil et al., 2004a; Ardi, 2005).
Os componentes estruturais mais estudados e que estão estão associados ao
processo de invasão e patogenicidade são flagelos; cápsula; píli; a camada S; os
lipopolissacarideos e as proteínas de membrana externa (Merino et al., 1998; Gavín et
al., 2002; Gavín et al 2003; Kirov et al., 2004). Aeromonas spp. produzem ainda uma
grande variedade de substâncias extracelulares , tais como, enterotoxinas, hemolisinas,
citotoxinas, DNAses, RNAses, elastases, lecitinases, amilases, proteases e lipases,
substâncias envolvidas nos processos de patogenicidade (Nord et al., 1975; Popoff,
1984; Cahill,1990; Kirov, 1997; Schiavano et al., 1998; Chopra e Houston, 1999;
Santos et al., 1999; Fivaz et al., 2001; Asmat e Gires, 2002; González- Serrano et al.,
2002; Kirov et al., 2004; Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Os factores de virulência
referidos no género Aeromonas têm sido descritos quer em estirpes clínicas, estirpes
isoladas em águas e também em alimentos (Bin Kingombe et al., 1999; Martins et al.,
2002; González- Serrano et al., 2002; Sen e Rodgers, 2004).

1.2.2. Taxonomia e Filogenia

A taxonomia do género Aeromonas é um pouco complexa e por vezes confusa,
devido à falta de congruência entre as características fenotípicas e genotípicas das
espécies que constituem este género (Hasan et al., 2006). A caracterização fenotípica é
extremamente difícil e ambígua (Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Ao longo dos
últimos anos, o género Aeromonas foi sujeito a numerosas revisões ao nível da
taxonomia e da nomenclatura. Bacillus punctatus foi o primeiro nome atribuído a um
isolado deste género (Zimmerman, 1890). Na sétima edição do Manual de Bergey‟s
(Snieszko, 1957) este género foi incluído na família Pseudomonadaceae, englobando
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 10

quatro espécies, três espécies mesófilas móveis (A. hydrophila, A. punctata, A.
liquefaciens), e uma psicrófila imóvel (A. salmonicida). Nos finais dos anos sessenta,
Schubert (1969) propôs a classificação do género em três espécies com oito
subespécies: duas espécies móveis, A. hydrophila com as subespécies A. hydrophila
subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. anaerognes e A. hydrophila subsp.
proteolytica, A. punctata com as subespécies A. punctata subsp. punctata e A. punctata
subsp. caviae; e uma espécie imóvel, A. salmonicida com as subespécies A. salmonicida
subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes e A. salmonicida subsp.
mausocida. Esta proposta foi a publicada na oitava edição do Manual de Bergey‟s
(Schubert, 1974), sendo este género incluído na família Vibrionacaeae.
Colwell e colaboradores (1986) através de estudos moleculares de Aeromonas
baseados na análise da sequência do rRNA 5S demonstraram que o género Aeromonas
apresentava uma posição filogenética suficientemente distante das famílias
Enterobacteriaceae e Vibrionaceae constituindo uma familia independente, propondo
elevar este género à categoria de família com o nome taxonómico de Aeromonadaceae.
Em 1994 na edição do Manual de Bacteriologia de Bergey‟s o género
Aeromonas segue ainda incluído na família Vibrionaceae (Holt et al., 1994). Martínez-
Murcia e colaboradores em 1992a realizam o primeiro estudo filogenético baseado na
análise do rRNA 16S em Aeromonas. Neste estudo foi ratificada a proposta de elevar o
género Aeromonas à categoria de família, demonstrando que forma uma linha diferente
dento da sub classe gamma-Proteobacteria. Esta proposta foi aceite, e assim aparece na
nova edição do Manual de Bergey‟s 2001, mantendo-se assim na nova edição deste
manual (Martin-Carnahan e Joseph, 2006). No mesmo trabalho foi também ratificado
que o género Aeromonas engloba um grupo de espécies muito parecidas, com uma
similitude de sequência que varia de 97,8% a 100%, e os resultados deste estudo estão
em concordância com os obtidos com a hibridação DNA-DNA. Este género encontra-se
em constante evolução não somente pela descrição de novas espécies mas também pela
sua reclassificação (Martínez- Murcia et al., 1992b;Yáñez et al., 2003; Miñana-Galbis
et al., 2004, 2007; Huys et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2008).
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 11

Recentemente foi proposta a espécie Aeromonas sharmana, com base num
único isolado obtido de águas termais, GPTSA-6T, (Saha e Chakrabarti, 2006), no
entanto Martínez-Murcia e colaboradores em 2007, esta espécie não foi considerada
como um membro do género Aeromonas. Em 2005 eram 18 as espécies descritas
(Martin- Carnahan e Joseph, 2005; Saavedra et al., 2006) mas em 2009 esse valor
aumentou para 22 (Quadro 1), com a descrição de uma nova espécie, Aeromonas
fluvialis (Alperi et al., 2009).

Quadro 1. Espécies actualmente aceitem no género Aeromonas















Espécie Estirpe tipo Origem
Autores

A. hydrophila ATCC 7966
T
Leite Stainer, 1943
A. bestiarum ATCC 51108
T
Peixe doente Ali et al., 1996
A. salmonicida NCIMB 1102
T
Salmão Griffin et al., 1953
A. caviae ATCC 15468
T
Cobaia Schubert e Hegazi, 1988
A. media ATCC 33907
T
Água de piscicultura Allen et al., 1983
A. eucrenophila NCIMB 74
T
Peixe da água doce Schubert e Hegazi, 1988
A. sobria NCIMB 12065
T
Peixe Popoff et al., 1981
A. veronii ATCC 35624
T
Muco Hickman-Brenner et al., 1987
A. jandaei ATCC 49568
T
Fezes humanas Carnahan et al., 1991a
A. schubertii ATCC 43700
T
Abcesso cutâneo Hickman-Brenner et al., 1988
A. trota ATCC 49657
T
Fezes humanas Carnahan et al., 1991b
A. allosaccharophila CECT 4199
T
Enguia Martínez-Murcia et al., 1992b
A. encheleia CECT 4342
T
Enguia Esteve et al., 1995b
A. popoffii LMG 17541
T
Água potável Huys et al., 1997
A. culicicola MTC 3249
T
Mosquito Pidiyar et al., 2002
A. simiae IBS S6874
T
Fezes de macaco Harf-Monteil et al., 2004
A.molluscorum CECT 5864 Molusco bivalve Miñana-Galagis et al., 2004
A.bivalvium


CECT 7113 Bivalve Miñana-Galagis et al., 2007

A. aquariorium MDC47
T/
DSM 18362
T
Aquário Martínez-Murcia et al., 2008
A. tecta CETC7082
T
MDC91
T
Isolado clínico e ambiental Demarta et al., 2008
A. piscicola
S1.2
T
Peixe
Hidalgo et al., 2008


A. fluvialis
CECT 7401=LMG 24681 Água (Rio)
Alperi et al., 2009

Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 12

No sentido da resolução de algumas ambiguidades, obtidas mediante a
sequênciação de genes 16S rRNA, têm sido pesquisados outros marcadores
filogenéticos que correspondem às sequências dos genes denominados,
“Housekeeping”, aqueles que estão envolvidos em manter as suas funções vitais na
célula. Estudos baseados na sequenciação do gene gyrB e do gene rpoD (Yàñez et al.,
2003, Soler et al., 2004; Martínez-Murcia et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2007)
revelaram uma boa correlação com as metodologias anteriormente utilizadas,
nomeadamente a hibridação DNA-DNA e a sequenciação do gene 16S rRNA, assim
mostrou-se capaz de solucionar, com maior clareza certas ambiguidades existentes
(Martínez- Murcia et al., 2005).

1.2.3. Métodos de Identificação
1.2.3.1. Métodos microbiológicos convencionais
O género Aeromonas em geral é de difícil identificação laboratorial. A elevada
variabilidade de características bioquímicas dos elementos deste género faz com que as
técnicas habitualmente usadas baseadas no fenotípo por vezes aportam resultados
ambíguos e muitas vezes incorrectos. Os métodos convencionais de identificação
baseiam-se nas propriedades fenótipicas dos microrganismos, isto é, um conjunto de
marcadores fenótipicos como fisiológicos, bioquímicos, estruturais, e todas as
características que porpocionam o aspecto global do individuo (Roman-Aravena et al.,
2008). A falta de concordância entre os métodos de identificação bioquímica e genética,
especialmente nos isolados de origem ambiental, baseiam-se no facto dos esquemas de
identificação bioquímica utilizados não distinguirem as espécies de Aeromonas
existentes (Ørmen et al., 2005), como também a descoberta de novas espécies que não
estão contempladas nos esquemas de identificação frequentemente utilizados (Abbout et
al., 2003).
As bases de dados para a identificação de Gram negativo aeróbios ou
anaeróbios facultativos até à pouco tempo incluíam apenas A. hydrophila ou Aeromonas
spp.. Actualmente existem pelo menos 14 sistemas comerciais que contêm na sua base
de dados diversas espécies pertencentes a este género, mas a sua utilidade em
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 13

determinados casos é duvidosa (Joseph e Carnahan, 1994; Vivas et al., 2000). Um
problema geralmente associado a elementos deste género é a confusão com algumas das
espécies do género Vibrio (Vivas et al., 2000; Park et al., 2003). Estudos de Abbott e
seus colaboradores (1998) referem um caso concreto da identificação de duas estirpes
de Aeromonas, identificadas pelo sistema de biotipificação numerica (API 20NE), como
membros do género Vibrio.
Deste modo, o uso sistemas de biotipificação numérica no diagnóstico não são
aconselháveis quando se pretende uma identificação precisa (Valera e Esteve, 2002). O
de metodologias capazes de identificar todas as espécies de Aeromonas é crucial. A sub
identificação dos elementos deste género poderá gerar consequências ao nível da saúde
pública. Por este motivo desde a década de oitenta tem vindo a ser desenvolvidas
diferentes técnicas baseadas na análise de DNA que se têm mostrado mais estáveis e
fiáveis.
1.2.3.2. Métodos genéticos

A porção do genótipo que se expressa em cada estirpe é portanto o fenótipo,
estas propriedades são muito variáveis pela capacidade de adaptação das bactérias a
qualquer ecossistema, e por outro lado apresentam uma interpretação subjectiva e
complicada. A aplicação de métodos genéticos abre novas perspectivas aos
microbiologistas para a identificação ou tipificação de alguns géneros fastidiosos na
determinação da taxonomia e filógenia (Castro-Escarpulli et al., 2003). O
desenvolvimento das técnicas de biologia molecular nos últimos anos tornou possível a
identificação de espécies bacterianas directamente através da análise genética do seu
DNA (métodos genotípicos). O DNA bacteriano contém toda a informação biológica da
célula, quer se expresse ou não e de uma forma geral o genótipo é mais estável durante a
sua evolução. Apesar da introdução de novos métodos de identificação de espécies, não
somente para o género Aeromonas, mas também para outros, o método DNA-DNA
hibridação é considerado por alguns autores como „a gold standard‟ para a identificação
taxonómica de novas espécies (Stackebrandt et al., 2006; Janda e Abbott, 2007).


Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 14

1.2.3.3. Sequênciação do gene que codifica para o 16S rRNA

A sequência nucleotídica do genoma bacteriano é a impressão digital de cada
bactéria. O estudo da sequência do 16S rRNA é um dos métodos mais discriminativos e
precisos para determinar o nível de relação filogenética entre bactérias (Woese, 1987).
A sua utilização permitiu a identificação de quase todas as espécies no entanto quando
se pretende estudar relações filogenéticas próximas, como é o caso de espécies de um
mesmo género, esta técnica apresenta algumas limitações (Martínez-Murcia et al., 1992;
Martínez-Murcia et al., 1999; Janda e Abbott, 2007), visto ser uma molécula
extremamente conservada, verificando-se frequentemente situações em que espécies
distintas apresentam poucas diferenças nucleotídicas (Janda e Abbott, 2007).
A análise do gene 16sRNA (com aproximadamente 1500pb) pode ser
potencialmente aplicada a todas as bactérias. Este gene, o 16S rRNA, que codifica a
unidade de rRNA é altamente conservado, mas ao mesmo tempo possui uma zona
hipervariavel com cerca de 138 pb na região 5‟ terminal que permite a identificação da
maior parte das espécies (Mendes et al., 2003), sendo normalmente usado para a
classificação taxonómica, e é considerado um bom marcador molecular (Woese, 1990;
Amann et al., 1995).
Ainda que, a maioria destes resultados estejam em concordância com os
obtidos com a técnica de hibridação DNA-DNA, também se encontram sequências de
16S rRNA idênticas para espécies que apresentam grupos de hibridação distintos, como
é o caso de A. salmonicida e A. bestiarum que representando duas espécies distintas
deste género ao nível da sequência de rDNA 16S não se verifica nenhuma diferença
nucleotidica (Martínez-Murcia et al., 2005). Por esta razão foi necessário pesquisar
outros métodos eficazes para a identificação das estirpes deste género.

1.2.3.4. Sequenciação de genes “Housekeeping”
A sequenciação é um método simples e preciso que permite a identificação da
maioria das espécies bacterianas, sendo útil quando é impossível obter um resultado
fidedigno pelos métodos fenótipicos convencionais usados habitualmente pelos
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 15

laboratórios de rotina. Nos últimos anos têm aparecido cada vez mais estudos
taxonómicos e filogenéticos baseados em genes “Housekeeping”, genes que codificam
para proteínas de função vital na célula. A utilização de genes alternativos para a
identificação molecular de certas espécies aumenta ainda as potencialidades da
sequenciação. Deste modo estes genes apresentam um conjunto de qualidades que
permitem a sua utilização em filogenia.
Estas vantagens de forma simplificada e objectiva são defenidas em três pontos
principais:
i) São proteínas com uma função vital na célula logo representam uma função
ancestral e encontram-se em todas as células;
ii ) São proteínas sobre as quais já existem estudos científicos que estudaram a
correlação com os estudos de hibridação DNA-DNA e as conclusões
filogenéticas das duas técnicas são semelhantes o que demonstra que na
maioria dos casos não existe transferência horizontal destas proteínas ou que
caso exista é baixa;

iii ) O facto de se tratar de uma sequência que codifica para uma proteína a
percentagem de substituição nucleotídica é superior à encontrada no rDNA
16S, o que se torna útil para o esclarecimento de relações filogenéticas mais
próximas.

A utilização de genes alternativos para a identificação molecular de certas
espécies aumenta ainda as potencialidades da sequenciação. Diferentes genes têm vindo
a ser utilizados para a classificação de bactérias ao nível intra-genérico tais como os
genes recA (Kullen et al., 1997), groEL (Haake et al., 1997), hps 75 (Pai et al., 1997),
tuf (Chavagnat et al., 2002), rpoD (Yamamoto et al., 2000; e gyrB (Kasai et al., 2000;
Yáñez et al., 2003; Soler et al., 2004).
Actualmente existem estudos a demonstrar que estes genes esclarecem de
forma mais objectiva as relações filogenéticas interespécies no género Aeromonas
(Yáñez, 2003; Soler et al., 2004; Kupfer et al., 2006) e caracterização de novas espécies
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 16

(Pidiyar et al., 2002). O estudo das sequências nucleotídicas e de aminoácidos destes
genes tem permitido esclarecer os pontos controversos das árvores filogenéticas
elaboradas com base na sequenciação dos genes ribossómicos (Feng et al., 1997;
Doolitle, 1999).

O gene gyrB e rpoD parecem bons indicadores da evolução do genoma, pelo que
podem ser utilizados como marcadores filogenéticos para a sistemática bacteriana (Kim
et al., 1999; Watanabe et al., 2001). Apenas existe uma cópia do gene e não sofre
transferência horinzontal (Sawada et al., 1999). Estes dois genes housekeeping têm sido
os mais utilizados como uma ferramenta filogenética, dada a sua aplicação já
anteriormente descrita, no género Aeromonas (Soler et al., 2004).
1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA
A DNA girase pertence à família das topoisomerases de tipo II. As DNA
topoisomerases intervêm em processos biológicos tão essenciais como a replicação,
transcrição e recombinação das moléculas de DNA, através do controlo que exercem
sobre o grau de superenrolamento da molécula de DNA numa reacção que não requer
energia (Huang, 1996). Estas enzimas classificam-se atendendo à sua função em tipo I,
tipo II, tipo III ou Tipo IV. A primeira toipomerase do tipo II a ser descoberta foi a
DNA girase em Escherichia coli que é constituída por duas subunidades, GyrA e GyrB
de 97 kDa e 90 kDa respectivamente (Figura 2), e que se integram numa holoenzima de
estequiometria A
2
B
2
(Cove et al., 1997).
A sua funcionalidade está dividida pelos seus domínios. Esta divisão é apoiada
por análises bioquímicas e pela determinação cristalográfica da estrutura da proteína
(Wigley, 1995). A proteína GyrB apresenta o extremo N-terminal, onde ocorre a
hidrólise do ATP (domínio ATPase), necessária ao superenrolamento negativo da
molécula de DNA circular. Este processo é endoenergético, desfavorecido
termodinamicamente, pelo que a energia necessária obtém-se a partir da hidrólise de
uma molécula de ATP. O extremo C-terminal, zona de união à proteína A (GyrA), é a
zona da molécula de enrolamento do DNA (Cabral et al., 1997). O extremo N-terminal
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 17

da proteína GyrA contém o centro activo para a tirosina (Tyr 122) necessária para o
reconhecimento do DNA, é aqui que ocorre a ligação covalente proteína-DNA e se
ligam também as quinolonas. O extremo C-terminal é a zona de enrolamento do DNA
(Huang, 1996; Cove et al., 1997).

Figura 2- Estrutura da DNA girase. Com indicação das subunidades funcionais, gyrA (A‟) e gyrB (B‟)
Apenas existe uma variação de 40 resíduos entre as classes de proteobacterias
gamma e épsilon, a sub unidade A da DNA girase tem 850 aminoácidos em todas as
espécies bacterianas estudadas. A classe epsilon, aparece separada do resto dos grupos
de proteobacterias devido à inserção dos 40 resíduos, sendo que esta diferença de
aminoácidos se localiza no extremo C-terminal da proteína. A subunidade B da DNA
girase em bactérias pode apresentar dois tamanhos diferentes, num grupo representado
pela E. coli, esta enzima tem aproximadamente 800 aminoácidos e todas as
proteobacterias conhecidas pertencem a este grupo.
O outro grupo, representado pelo Bacillus subtilis apresenta cerca de 650
aminoácidos. Os 150 aminoácidos extra das girases do grupo de E. coli formam um
bloco no domínio II da proteína. A ausência desta região nas DNA girases de B. subtilis
sugere que este fragmento não é necessário para a reacção enzimática da
topoisomerização. Deste modo, a inserção destes 150 aminoácidos (450 nucleótidos) é a
que permite separar o grupo de proteobacterias do grupo de Gram positivo. A sequência
nucleotídica do gene gyrB permitiu estudar as relações filogenéticas de géneros como:
Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999); Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000);
Salmonella, Shigella e Escherichia (Fukshima et al., 2002) e Aeromonas (Yanez et al.,
2003). Todos os trabalhos realizados demonstram a fiabilidade e versatilidade da
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 18

utilização deste gene marcador molecular. Yanez e colaboradores em 2003
demonstraram que a sequenciação deste gene em estudos moleculares de elementos do
género Aeromonas era coerente com as outras técnicas antes utilizadas.

1.2.3.4.2. Gene rpoD
O gene rpoD é uma ferramenta útil para o reconhecimento de novas linhas
filogenéticas no género Aeromonas (Alperi et al., 2008). A RNA polimerase é a enzima
responsável pela síntese de RNA dirigida pelo DNA.Todas as células têm RNA
polimerase e nas bactérias uma variedade destas enzimas sintetiza todos os RNAs
celulares, com excepção dos primers utilizados na replicação do DNA. A RNA
polimerase de E. coli é uma proteína de 480 KD composta por quatro subunidades α
2
ββ`Ϭ; duas subunidades α (encoded by the rpoA gene), uma subunidade β (rpoB), uma
subunidade β`(rpoC) e ainda a subunidade Ϭ (Kupfer et al., 2006). A subunidade Ϭ
também chamada de factor Ϭ separa-se do núcleo da enzima após a iniciação da síntese
do DNA e continua isoladamente o processo de polimerização (Ishihama, 2000;
Borukhov e Nudler, 2003). Nas bactérias expressam-se diferentes tipos de factores Ϭ
70
.
O factor Ϭ
70
é responsável por 99% da transcrição celular, é codificado pelo gene rpoD
(Borukhov e Nudler, 2003). Dependendo das necessidades da célula e das condições do
meio são utilizados outros factores de transcrição. A sequência nucleotídica do rpoD foi
utilizada no estudo taxonómico dos géneros Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999);
Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000) e Aeromonas (Soler et al., 2004).

1.3. Agentes antimicrobianos
____________________________________________________________________________________
Cada grupo de antibióticos tem um alvo específico na célula bacteriana
(Figura 3). Dependendo da zona de actuação, e de algumas características dos agentes
antimicrobianos como a estrutura química e o peso molecular a sua actividade será
variável, devendo encarar-se cada antibiótico em particular e não como um todo.
Segundo Sousa (2002) para que as moléculas de antibióticos possam exercer uma
eficiente actividade, sem que existam problemas de toxicidade para com os animais
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 19

(incluído o Homem), são investigadas as diferenças entre a célula bacteriana
(procariotica) e as células dos animais (eucariota).

Figura 3 – Representação dos locais de actuação dos diferentes grupos de antibióticos. Adaptado de
Sousa, 2006.
Um agente antibacteriano poderá eventualmente não actuar sobre um
determinado agente patogénico por causas intrínsecas (por ex. elevado peso molecular
para atravessar as membranas celulares), nestas situações esse agente patogénico
apresenta resistência inata a esse antibiótico não fazendo parte do seu espectro de acção.
Apesar disso, sabe-se que moléculas inicialmente activas contra determinadas espécies
bacterianas hoje já não o são (Lipsitch e Levin, 1997). A resistência bacteriana aos
antibióticos vai evoluindo dada a pressão selectiva exercida pela antibioterapia, gerando
mutações espontâneas ou a transmissão horizontal de genes de resistência por
transferência de outras estirpes. Pois o fluxo de genes de resistência entre o cromossoma
e elementos genéticos móveis, como plasmídeos, transposões ou integrões, leva a que a
ecologia genética de resistência se propague facilmente (Kummerer, 2004).

1.3.1. Principais mecanismos de resistência
A resistência aos antibióticos é um problema global, com implicações em
saúde pública. O uso generalizado de antibióticos permitiu às bactérias sobreviver e
multiplicar-se sob a pressão dos antibióticos devido à sua flexibilidade genética (Cohen,
1997; Kapil, 2005; Levy, 2005). A resistência aos antibióticos pode ser intrínseca ou
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 20

adquirida (Courvalin, 1996; Sousa, 2001; Kapil, 2005; Sousa, 2006). Os mecanismos de
resistência que se podem observar estão relacionados com a forma de acção dos
antibióticos, existindo quatro mecanismos principais (Gilman et al., 1996; Ferreira e
Sousa, 1998; Sousa, 2006). A adopção de determinado mecanismo de resistência por
parte das bactérias está intimamente relacionada com o seu modo de acção e
mecanismos de aquisição de resistência dos antibióticos. As bactérias por vezes
combinam diferentes mecanismos de resistência, o que as torna multiresistêntes.
Pseudomonas aeruginosa apresenta resistência aos carbapenemos e poderá dever-se à
combinação da produção de β-lactamases, aumento das bombas de efluxo e alterações
na parede celular da bactéria (Sousa, 2001).
A emergência da resistência antimicrobiana pode ser uma ameaça para o
ambiente e saúde pública, maior que o aparecimento de novos agentes patogénicos ou o
reaparecimento de antigos. Compreender e reconhecer os problemas da resistência
antimicrobiana e usar os agentes químicos apropriadamente é da maior importância para
a prevenção da sua propagação (Levy, 1990; Cohen, 1997). As bactérias são melhores
engenheiros genéticos que o Homem e vão continuar a escapar ao efeito dos
antibióticos. A melhor solução é usar os antibióticos quando necessários, evitar a
antibioterapia sem conhecimento do agente patogénico em questão e o cumprimento de
regras rígidas com fins profiláticos.

1.3.2. Antibióticos antiparietais
Os antibióticos antiparietais são inibidores na fase de síntese do peptidoglicano
(molécula característica da parede celular bacteriana) e actuam nas diferentes fases da
biossíntese desta macromolécula. Apenas iremos abordar os antibióticos β-lactâmicos, e
fosfomicina. Os β-lactâmicos constituem um grupo muito importante, uma vez que são
amplamente utilizados na clínica, devido á sua baixa toxicidade e boa eficácia
terapêutica (Essack, 2001; Sousa, 2006). Os restantes compostos englobados neste
grupo apenas manifestam acção sobre organismos Gram positivo.

Introdução

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1.3.2.1. β-lactâmicos
Os antibióticos β-lactâmicos englobam na sua totalidade quatro grupos de
antibióticos distintos, como as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactâmicos e os
carbapenemos. As penicilinas foram o primeiro grupo de antibióticos a ser
comercializado, a sua descoberta em 1928 por Alexander Fleming revolucionou a
terapêutica das doenças infecciosas. Os antibióticos β-lactâmicos não são homogéneos
na sua composição, nem nos seus efeitos. Entre si apresentam um anel β-lactâmico
constituído por 3 átomos de carbono e um de nitrogénio com radicais substituintes. Este
anel encontra-se fundido com um anel tiazolidina nas penicilinas enquanto nas
cefalosporinas com um anel dihidrotiazina. Relativamente aos monobactâmicos apenas
temos o anel β-lactâmico, nos carbapenemos observa-se a presença de um C a substituir
o S no anel tiazolidina (Sousa, 2006).
Este grupo de antibióticos inibem irreversivelmente as D-D-
carboxitranspeptidases, conhecidas como PBPs (Penicillin-Binding-Proteins),
impedindo assim o establecimento das pontes interpeptídicas entre as cadeias peptídicas
vizinhas. Estes antibióticos só são activos sobre bactérias em crescimento (Essack,
2001; Sousa, 2005; Sousa, 2006). Existem várias moléculas de características distintas
que foram desenvolvidas para rebater certas limitações destes compostos, como
reacções alérgicas e elevada resistência microbiana (carboxipenicilinas,
ureidopenicilinas, aminopenicilinas (Sousa, 2001; Sousa, 2006)). São exemplos deste
grupo a penicilina, a ampicilina, a carbenicilina, a piperacilina e a amoxicilina.
As cefalosporinas actualmente comercializadas podem ser classificadas em
primeira, segunda, terceira e quarta geração, de acordo com o seu espectro de
actividade. À medida que se avança nas diferenças de gerações, o espectro para as
bactérias Gram negativo amplia-se, perdendo-se actividade contra as Gram positivo. A
ceftazidima, a cefotaxima, a cefoxitina e o cefepime são exemplos de Cefalosporinas
(Sousa, 2001, Sousa, 2006). Têm sido desenvolvidos outros β-lactâmicos não clássicos,
os monobactâmicos e os carbapenemos.
Introdução

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O aztreonamo a única molécula actualmente comercializada no grupo dos
monobactâmicos. Este antibiótico é muito activo para bactérias aeróbias Gram negativo,
e dotado de grande estabilidade para as β-lactamases de largo espectro. Os
carbapenemos dentro dos β-lactâmicos, são o grupo com maior actividade - antibióticos
de largo espectro que resistem à hidrólise de grande parte das β-lactamases existentes
(Sousa, 2001; Sousa, 2006). No mercado nacional existem três moléculas a ser
comercializadas (imipenemo, meropenemo e ertapenemo), porém este grupo está
reservado ao uso hospitalar como último recurso para estirpes multiresistentes. O
mecanismo de resistência mais importante para esta família é a hidrólise enzimática por
β-lactamases. Estas enzimas plasmídicas ou cromóssomicas catalizam a hidrólise do
anel β-lactâmico (ligação CO-N) inactivando o antibiótico (Bonomo, 2003). Em
Pseusomonas aeruginosa a ausência de porinas justifica a sua resistência aos
carbapenemos (Essack, 2001; Sousa, 2006).
Actualmente existem centenas de β-lactamases descritas. As β-lactamases
dependendo da sua especificidade são muitas vezes chamadas penicilases,
cefalosporinases e carbapenemases. Outra forma de classificação é em relação ao centro
activo, as serino-β-lactamases têm a serina no seu centro activo e as metalo-
β-lactamases que têm zinco no centro activo.

1.3.3. Inibidores de β-lactâmicos
Com a finalidade de expandir o espectro destes compostos é usual a sua
associação com compostos inibidores de β-lactamases. As substâncias inibidoras devem
ser estruturalmente semelhantes ao antibiótico. O sulbactam, ácido clavulânico e o
tazobactam, têm estruturas parecidas com o anel β-lactâmico que a enzima o hidrolisa
ficando unida, irreversivelmente, não podendo voltar a actuar sobre outras moléculas
β-lactâmicas (Poole, 2004), ao contrário do que sucede com os antibióticos
convencionais.

Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 23

1.3.4. Antibióticos inibidores da síntese proteica
Os antibióticos inibidores da síntese proteica actuam no complexo ribossomal
70S. Este complexo é formado pela associação das subunidades 30S e 50S). A
subunidade 30S é composta de rRNA 16S (aproximadamente 1.500 nucleótidos) e 21
proteína, enquanto a unidade 50S é constituida por rRNA 5S (aproximadamente 120
nucleótidos), rRNA 23S (aproximadamente 2.900 nucleótidos) e por 31 proteinas. As
mitocondrias presentes nas células eucariotas, possuem ribossomas do tipo bacteriano
70S, assim podem ser vulneráveis aos efeitos destes antibióticos se estivermos perante
moléculas lipófilas (cloranfenicol) que com grande facilidade atravessam as membranas
mitocondriais inibindo a sua síntese proteica. Este grupo de antibióticos inclui os
aminoglicosídeos, as tetraciclinas o cloranfenicol, macrólidos lincosamidas e o ácido
fusídico (Sousa, 2006)
1.3.4.1. Aminoglicosídeos
Os antibióticos aminoglicosídeos juntamente com os β-lactâmicos são
considerados os principais agentes na terapia de infecções severas provocadas por
bacilos Gram negativo e cocos Gram positivo (Sousa, 2006). Os elementos deste grupo
são bastante heterogéneos quanto à sua composição química, propriedades
antibacterianas e propriedades farmacológicas. A gentamicina, a canamicina, a
neomicina, a estreptomicina a tobramicina, a amicacina, e a netilmicina são alguns dos
elementos deste grupo. Estes antibióticos apresentam um anel aminoclitol, derivado do
inositol, unido a açúcares aminados, através de ligações glicosídicas. Têm marcada
actividade contra bacilos Gram negativo aeróbios (Kotra et al., 2000).
As estirpes produtoras de aminoglicosídeos desenvolveram um mecanismo de
auto-defesa, a fim de escaparem ao suicídio produzem metilases para o rRNA 16S,
impedindo a acção dos antibióticos na subunidade 30S. Recentemente no Japão foram
detectados plasmídeos codificadores destas metilases (gene armA e rmtB). Estes genes
têm-se disseminado rapidamente para outras espécies representando já um mecanismo
de relevância neste grupo (Yamane et al., 2004; González-Zorn et al., 2005).
Introdução

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1.3.4.2. Tetraciclinas
As tetraciclinas constituem uma família de antibióticos contendo um núcleo
hidroxinaftaceno, formado por quatro anéis benzónicos fundidos. A tetraciclina é o
protótipo do grupo e os restantes elementos possuem características bastante
semelhantes a esta. Estes antibióticos inibem a síntese proteica, actuando ao nível da
subunidade 30S dos ribossomas. Inibem a ligação dos aminoacil- tRNA(s) aos
ribossomas, impedindo estericamente a ligação codão anticodão ente o tRNA e o local
A dos ribossomas (Chopra et al., 2001). As bombas de efluxo são o principal
mecanismo de resistência bacteriana aos antibióticos desta família. O sistema de efluxo
é especificado por diferentes determinantes genéticos, os genes tet, que codificam as
proteínas TET (Orth et al., 2000).
Estes antibióticos são considerados de largo espectro, activos contra bacilos
Gram positivo e Gram negativo, aeróbios e anaeróbios (Chopra e Roberts, 2002), no
entanto tem se vindo a observar uma elevada prevalência de resistências às tetraciclinas.

1.3.4.3. Cloranfenicol
Trata-se de um antibiótico de largo espectro abrangendo bactérias Gram
positivo e Gram negativo, inibidor da síntese proteica, bacteriostático, actuando na
subunidade 50S, impedindo a actuação da transpeptidase. O cloranfenicol liga-se à
subunidade 50S do ribossoma, impedindo portanto a transpeptidase durante a fase de
alongamento (Sousa, 2006). Dada a sua lipofilia atravessa a dupla membrana
mitocondrial, inibe a síntese proteica em mitocondrias na medula óssea provocando
alterações hemáticas graves (aplasia medular) (Sousa, 2006). O mecanismo de
resistência mais comum é a inactivação enzimática do cloranfenicol por
acetiltransferases bacterianas. O gene cat codifica as O-acetiltransferases bacterianas
que promovem a acetilação da molécula de cloranfenicol em C3 originando derivados
acetoxi, destituídos de propriedades antibióticas (Yoo et al., 2003). Estes genes podem
ter localização plasmídica ou cromossómica.

Introdução

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1.3.4.4. Macrólidos
Os macrólidos têm um espectro bacteriano alargado, sendo activos contra
bactérias Gram positivo. Englobam compostos como a eritromicina, e são inibidores da
síntese proteica. Bactérias Gram negativo são intrinsecamente resistentes à eritromicina
com excepção de Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Campylobacter
spp., Mycoplasma spp., Chlamydia spp. (Sousa, 2006).
Este grupo apresentam uma apetência reversível para as subunidades 50S dos
ribossomas e bloqueiam o local P, prejudicando a transpetidação e/ou a translocação,
exercendo deste modo uma acção bacteriostática. Estas moléculas anfilíticas
moderadamente lipófilas são incompatíveis com os canais de porina (via hidrófila) e
com a superfície predominantemente hidrófila de muitas bactérias Gram negativo. A
difusão através das regiões fosfolipídicas da membrana externa é assim a principal via
de entrada destes compostos.
A mais frequente forma de resistência deste grupo é a resistência cruzada aos
Macrólidos-Lincosamidas-Sptreptogramina B (resistência MLS
B
). Esta resistência deve-
se à N.N‟-dimetilação da adenina na posição 2058 no rRNA 23S, mediada por uma
metilase, produto do gene erm (Schwarz et al., 2002). Estes genes podem ter localização
cromossómica ou plasmídica e podem se exprimir constitutivamente ou por indução. As
bombas de efluxo, geradas por produtos do gene mef, têm também importância na
resistência bacteriana dos macrólidos no entanto, este mecanismo não é eficaz em todas
as moléculas do grupo (Wierzbowski et al., 2005).

1.3.5. Antibióticos inibidores da síntese dos ácidos nucleicos
Fazem parte deste grupo de antibióticos a rifampicina, o metronizadol e as
quinolonas. Actuam sobre a síntese dos ácidos nucleicos provocando a morte celular
(Sousa et al., 1998).

Introdução

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1.3.5.1.Quinolonas
As quinolonas são antibióticos de síntese, derivados do ácido naladíxico sendo
que este foi a primeira quinolona a ser utilizada em 1962 no tratamento da cistite
causada por bactérias Gram negativo (Oliphant e Green 2002; Sousa, 2006).
Actualmente esta família de antimicrobianos tem sofrido grande evolução, pelo que é
classificada, tal como as cefalosporinas, em quatro gerações com base na sua actividade
antimicrobiana. Ao longo das gerações estes antibióticos vão aumentando
sucessivamente o seu espectro de acção. As quinolonas são inibidores directos da
síntese do DNA e actuam mediante a inibição da DNA girase (Topoisomerase II)
codificada pelos genes gyrA e gyrB (principal alvo nas bactérias Gram negativo) e a
toipomerase IV codificada pelos genes parC e parE. Ao actuarem contra as
topoisomerases, as quinolonas interferem com o enrolamento do DNA, impedindo a
replicação e a transcrição do DNA. Assim sendo, a forma de resistência mais comum é
a mutação das enzimas alvo (Topoisomerase II e IV). São exemplos desta família de
antibióticos o ácido naladíxico, a ciprofloxacina, a norfloxacina, a ofloxacina e a
levofloxacina.

1.3.6. Antibióticos antimetabolitos
1.3.6.1. Sulfonamidas / Trimetopim
O ácido para-aminobenzoico (PABA) é um factor indispensável para o
crescimento celular, pois sem ele não há síntese dos ácidos nucleicos. Todas as
moléculas que inibam esta cadeia metabólica, como as sulfamidas, sulfonas, PAS e
Trimethopim são conhecidas como anti-metabolitos ou como inibidores da síntese dos
ácidos nucleicos. As sulfamidas, PAS e sulfonas competem com o PABA impedindo a
sua adição à pteridina, bloqueando assim a síntese de ácido dihidropteroico. O enzima
dihidropteroato sintetase tem mais afinidade para as sulfonamidas do que para o se
substrato natural (PABA). Trimetopim inibe competitivamente a dihidro-folato
redutase, o enzima que reduz dihidrofolato a tetrahidrofolato (também conhecido como
co-factor folato, indispensável à síntese de timidina, purinas e N-formilmetionina).
Introdução

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Trimetopim, um anti-metabolito, siner-geticamente associado a sulfametoxazol, é
largamente utilizado na terapêutica. As sulfamidas inibem portanto a síntese de DNA,
RNA e síntese proteica.Têm efeito bacteriostático

1.3.7. Antibioresistência no género Aeromonas
O aparecimento de resistências é uma estratégia dos procariotas própria da sua
evolução natural, ocorre na natureza, mas “nós” temos acelerado este curso natural com
a sua sobre-pressão selectiva que torna mais rápido o aparecimento de uma grande
variedade de respostas (Levy, 2005). A transferência da resistência ocorre entre
bactérias patogénicas e comensais, mas também nas presentes no solo, água, esgotos,
estrume, efluentes e plantas.
A emergência de isolados clínicos e isolados ambientais resistentes a
antibióticos constitui um sério problema a nível mundial, principalmente a ocorrência
de bactérias resistentes a antibióticos provenientes de ambientes naturais, dado que estes
microrganismos não são expostos directamente aos antibióticos (Blasco et al., 2008).
Considerando as crescentes evidências de que a resistência clínica está intimamente
associada à ambiental (Prabhul et al., 2007; Abriouel et al., 2008), a presença de
resistência a diferentes grupos de antibióticos em microrganismos não “patogénicos”,
isolados de ambientes aparentemente inócuos como é o caso das águas de consumo, é
um procedimento promissor e emergente, relativamente à disseminação dos genes
responsáveis por este tipo de resistência, às quais a investigação deve responder (Sayah
et al., 2005).
No âmbito de determinar o perfil de susceptibilidade aos agentes
antimicrobianos comercializados actualmente, vários estudos têm sido efectuados com
isolados de Aeromonas. Apesar disso, a maioria dos trabalhos que estudam a
sensibilidade in vitro a antimicrobianos incide apenas sobre as espécies fenotípicas
“A. hydrophila“, “A. caviae” e “A. sobria”, porque a identificação habitual das estirpes
é realizada mediante testes bioquímicos, que segundo o anteriormente descrito, não
Introdução

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identificam com exactidão os elementos deste género ao nível de espécie. As estirpes de
Aeromonas hydrophila isoladas de ambientes aquáticos no Bengladehs por McNicol e
colaboradores em 1980 revelaram sensibilidade à gentamicina, canamicina e ácido
naladíxico, contudo apresentaram um fénótipo de resistência múltiplo à estreptomicina e
tetraciclina.
Num trabalho realizado por Kampfer e colaboradores (1999) testou a
sensibilidade de 217 estirpes, representativas das 14 espécies descritas até aquele
momento, a 69 agentes antimicrobianos. Estes autores verificaram que não existiam
diferenças significativas entre as espécies. No entanto, o trabalho de Overman e Janda
(1999) em que foi testado o efeito de 18 antibióticos em 56 estirpes, compara a
susceptibilidade de estirpes pertencentes às espécies: A. jandaei, A. schubertii, A. trota e
A. veronii, tendo verificado que A. jandaei era a espécie que apresentava maior nível de
resistência aos antibióticos testados e A. trota seria a espécie mais susceptível.
De uma forma geral admite-se que os indivíduos deste género são resistentes
à penicilina, ampicilina e carbenicilina (β-lactâmicos - penicilinas). Em vários trabalhos
é referido que estas estirpes são intrinsecamente resistentes à ampicilina de tal forma
que, para o seu isolamento foi generalizada a adição deste antibiótico ao meio de cultivo
(Ceylana et al., 2003; Vila et al., 2003; Vivekanandhana et al., 2005). Estudos
descrevem que 100% dos isolados apresentam resistência à ampicilina (Vila et al.,
2002).
Contudo, outros estudos têm vindo a descrever estirpes com sensibilidade a
este antibiótico (Goñi-Urriza et al., 2000a; Saavedra et al., 2004). Num trabalho de
Saavedra e seus colaboradores (2004), realizado com estirpes de Aeromonas isoladas de
trutas de aquacultura, concluiu-se que 35% das estirpes testadas apresentaram
susceptibilidade à ampicilina, referindo que o facto de se considerar estas estirpes
intrinsecamente resistentes à ampicilina foi baseado em estirpes clínicas, nas estirpes
ambientais, em que a pressão selectiva é significativamente diferente, os resultados
podem ser diferentes.
Introdução

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 29

Relativamente ao perfil de susceptibilidade em estirpes de origem alimentar
existem também diferentes estudos (Radu et al., 2003; Vivekanandhan et al., 2005; Palú
et al., 2006; Akinbowale et al., 2007). Em 2006, Palú e colaboradores verificaram que
todas as estirpes de Aeromonas spp.de origem alimentar (alfaces), eram sensíveis à
cefotaxima, ceftazidima, imipenemo, amicacina, gentamicina, tobramicina,
ciprofloxacina, cloranfenicol e trimetropim- sulfametoxazol. No entanto há estudos em
que para o trimetropim- sulfametoxazol os valores de resistência variam entre os 18,8%
em Aeromonas isoladas de trutas e os 100% em estirpes obtidas de tilapia e pacu
(Belém-Costa e Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2007)
No tratamento de infecções por Aeromonas, aconselha-se, como primeira
escolha, as fluoroquinolonas, e como alternativa o trimetropim-sulfametoxazole,
aminoglicosídeos, carbapenemos, cefalosporinas de segunda e terceira geração, e as
tetraciclinas (Overman e Janda, 1999,Vila et al., 2003; Otaviani et al., 2006).
Diferenças no perfil de susceptibilidade a antibióticos em estirpes de origem
ambiental estão associadas a zonas de elevado impacto humano (Ko et al., 1996; Goñi-
Urriza et al., 2000a). Assim, podemos inferir pelos diferentes trabalhos que o perfil de
susceptibilidade para este género pode ser bastante diversificado e continua por
clarificar.



















2. OBJECTIVOS
____________________________________________________________
Objectivos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 31


Este trabalho tem como objectivo avaliar a presença, as espécies e a incidência
de membros do género Aeromonas em águas para consumo humano, tratadas e não
tratadas. Contribuirá também para aumentar o conhecimento sobre a ecología deste
grupo de microorganismos e no futuro poder contribuir para evitar processos
infecciosos em humanos e em animais.
Para a concretização deste estudo estabeleceram-se objectivos específicos:
 Obter de uma colecção de estirpes bacterianas do género Aeromonas;
 Determinar o perfil de susceptibilidade a diferentes grupos de
antibióticos dos isolados de Aeromonas;
 Caracterizar, os isolados obtidos, por métodos genéticos e identificá-los
filogeneticamente, recorrendo à análise de genes “housekeeping”. Estes
métodos serão usados para uma identificação inequívoca à especie.


Pretende-se, assim, com os resultados deste trabalho, alertar para a presença de
resistência a diferentes grupos de antibióticos em microrganismos não patogénicos,
isolados de ambientes aparentemente inócuos como é o caso das águas de consumo, que
é não só preocupante, como coloca questões importantes, relativamente à disseminação
dos genes responsáveis por este tipo de resistência, às quais a investigação deve
responder.















3. MATERIAL E MÉTODOS
___________________________________________________________________________________


Material e Métodos
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3.1. Origem das amostras
____________________________________________________________________________________
Neste estudo foram analisadas amostras de águas não tratadas, provenientes de
fontes, poços e nascentes, localizadas em dois Concelhos do Distrito de Vila Real de
acordo com a tabela 1.
Tabela 1 - Locais de amostragem e número de amostras
Concelho Localização Nº de Amostras
Vila Real Agarêz 3
Vila Real Constantim 2
Vila Real Escariz 1
Vila Real Estação 1
Vila Real Fonteita 2
Vila Real Guiães 3
Vila Real Nascente do Hospital 1
Vila Real Nascente do Marão 1
Vila Real S. Mamede 1
Vila Real S. Cibrão 2
Vila Real Lordelo 3
Vila Real Parada de Cunhos 3
Vila Real F. Piscinas 1
Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar 1
Vila Pouca de Aguiar Capelos 1
Vila Pouca de Aguiar Soutelo de Aguiar 1
Vila Pouca de Aguiar Cerdeira de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Vreia de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Campo de Jales 2
Vila Pouca de Aguiar Alfarela de Jales 1
Vila Pouca de Aguiar Jales 2
Total 34

As amostras foram analisadas na Universidade de Trás-os-Montes e Alto
Douro no Departamento de Ciências Veterinárias nos laboratórios de Microbiologia
Alimentar e Microbiologia Médica. O estudo filogenético ocorreu nas instalações do
laboratório Molecular Diagnostics Center (MDC) com sede em Orihuela (Alicante –
Espanha).


Material e Métodos
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3.1.2. Método de recolha das amostras

As amostras de água foram recolhidas para frascos de polipropileno estéreis e o
tempo máximo decorrido entre a colheita da amostra de água e a sua análise
laboratorial. A recolha foi realizada seguindo as regras estabelecidas pela ISO 5667-2
(1991) aprovada como Norma Portuguesa NP EN 25 667-1 (1997), que se reporta à
norma europeia EN 25 667 (1993).

3.1.3. Isolamento pela técnica de filtração por membrana

O método de isolamento utilizado foi o método de filtração por membrana
(ISO 9308-1,1990) que permite determinar o número de microrganismos presentes na
água, quando se filtra um determinado volume de amostra de água através de uma
membrana de nitrocelulose com uma porosidade de 0.45μm de diâmetro (Quadro 2).

Quadro 2- Técnica de filtração por membrana
1. De cada amostra de água, depois de homogeneizada, passar 100 ml, por uma membrana de nitrocelulose
(Gelman) de 0.45μm de porosidade;
2. Retirar com a ajuda de uma pinça estéril a membrana de filtração, e colocar à superfície do meio de
GSP, (Meio 1- Anexo I);
3. Incubar a 30ºC, durante 24horas.


Dado este estudo incidir apenas sobre o género Aeromonas, o meio de cultura
utilizado foi o G. S. P. (Glutamato Amido Vermelho de Fenol) – MERCK 10230 – que
segundo especificação da empresa fabricante é selectivo e diferencial para
Pseudomonas spp. e Aeromonas spp..
A cultura pura das colónias presuntivas de Aeromonas, colónias amarelas, foi
obtida por expansão clonal, seguida de diversas provas morfofisiológicas, bioquímicas e
identificação por métodos fenotípicos e genotipicos.

Material e Métodos
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3. 1. 3. 1. Conservação das estirpes
De colónias isoladas, procedeu-se à inoculação da cultura em meio líquido de
B.H.I-Oxoid CM 0225- e foi a incubar a 30 ºC, durante 24 horas. Foram conservadas
alíquotas de B.H.I. com glicerol a 15% a -70 º C.


3.2. Caracterização preliminar dos isolados
____________________________________________________________________________________
3.2.1. Coloração diferencial de GRAM
A coloração de Gram é um dos primeiros passos para a caracterização
morfofisiológica dos isolados, o género Aeromonas são Gram negativo. O procedimento
para a realização desta coloração encontra-se no quadro 3.
Quadro 3 – Coloração pelo método de Gram
1.

Esfregaço;
 Laminas microscópicas limpas e desengorduradas;
 Ansa esterilizada;
 Deixa-se arrefecer;


Espalha-se em camada muito fina;
Secar ao ar ou suavemente à chama.
2.
Fixação;
 Coloca-se a lâmina acima da chama, a uma altura que a mão possa suportar o calor;
 Passa-se duas a três vezes a lâmina pela chama;
 Deixa-se arrefecer
3. Corante inicial – Violeta de metilo (1minuto);
4. Mordente- Lugol (30 segundos);
5. Diferenciação- alcool/acetona até se tornar incolor;
6. 2ª Lavagem- água;
7. Corante de contraste- Vermelho neutro (1

a 2 minutos),
8. 3ª Lavagem- água;
9. Secagem- entre duas folhas de papel de filtro;
10. Observação- objectiva de X 100 (com óleo de emersão).








Material e Métodos
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3.2.2. Prova da citromo-oxidase

A prova da oxidase utiliza-se na identificação de bactérias aeróbias Gram
negativo, apesar de muitas bactérias Gram positivo apresentarem um sistema citocromo
dectetável.
O sistema de citocromos possui hemoproteínas que contêm ferro que
transferem electrões ou hidrogénio até ao oxigénio com a formação de água. As
bactérias com reacção positiva possuem um sistema citocromo oxidase de transporte de
electrões, as negativas não possuem este sistema, embora estas possam ter outros
citocromos.
As reacções lentas ou mesmo negativas estão relacionadas com níveis baixos
de citocromo oxidase. O género Aeromonas geralmente é oxidase positivo.
Para a realização desta prova foi preparada uma solução de tetrametil p-fenileno de
amina. As colónias suspeitas foram inoculadas com umas gotas deste reagente seguindo
a metodologia descrita no quadro 4.

Quadro 4 – Prova da Oxidase
1.
Colocar uma tira de papel de filtro sobre uma tampa de uma placa de petri, colocando duas a três gotas
do reagente oxidase sobre a tira;
2.
Com uma pipeta de Pasteur retira-se uma pequena porção de colónia e coloca-se sobre a tira de papel
de filtro;
3.
Se houver mudança de cor. (Azul púrpura junto à zona em que se colocou a porção de colónia) a
reacção é positiva.


3.2.3. Prova da catalase

A catalase é uma enzima hemoproteica que contém ferro, decompõe o peróxido
de hidrogénio (H
2
O
2
) em água e oxigénio. A actividade da catalase manifesta-se na
maior parte das bactérias aeróbias, mas apenas em algumas anaeróbias. O género
Aeromonas é catalase positivo. Esta prova realiza-se inoculando uma porção de cultura
da estirpe em estudo em peróxido de hidrogénio, a metodologia utilizada encontra-se
descrita no quadro 5.
Material e Métodos
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Quadro 5 - Prova da catalase
1. Numa lâmina desengordurada e passada previamente ao bico de Busen, colocar uma gota de água
oxigenada;
2. De um meio sem sangue, recolher um de uma colónia sobre a gota de água oxigenada;
3. Ao verificar efervescência diz-se que a reacção é positiva, ou seja, revela-se a produção de catalase.



3.3. Identificação das estirpes bacterianas
____________________________________________________________________________________

A identificação dos isolados foi realizada através da sequenciação do gene
gyrB que codifica para a subunidade β da DNA girase, através da metodologia validada
por Yáñez e colaboradores (2003). Em ocasiões que o justifica-se, foi sequenciado o
16S rRNA, gyrA e o rpoD gene que codifica para o factor Ϭ
70
da RNA polimerase.

3.3.1. Extracção de DNA
Antes de proceder à sequenciação dos genes é necessário efectuar a extracção
do DNA a partir de cultura pura. A metodologia seguida está descrita no quadro 6.

Quadro 6 – Metodologia de extracção do DNA de estirpes bacterianas
1. Suspender num tubo de 1,5 ml contendo 100 µl de TE, uma colónia de cultura recente.
2.

Adicionar 200 µl de chelex, previamente preparado na concentração de 20% (Bio-Rad).
3. Agitar no vortex durante cerca de 1 minuto.
4.
Submeter a mistura a uma sucessão de três ciclos de choques térmicos, alterando 10 minutos de
aquecimento a 95 ºC com um período de 10 minutos de congelação a -20 ºC.
5. Agitar novamente o tubo no vortex.
6. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 r.p.m.
7. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e armazenar a -20 ºC.


Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 38

3.3.2. Amplificação de DNA por reacção de PCR

Para a amplificação dos genes 16S rRNA, gyrB, rpoD e gyrA utilizaram-se os
oligonucleótidos descritos no quadro 7.

Quadro 7 – Oligonucleótidos utilizados em reacção de PCR
Posição Sequência (5`--- 3`) Referência
gyrB 3F 334/354 TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yáñez et al., 2003
gyrB 14R 1464/1444 TTG TCC GGG TTG TAC TCG TC Yáñez et al., 2003
rpoD 70F 280/302 ACG ACT GAC CCG GTA CGC ATG TA Yamammoto et al., 2000
rpoD 70R 1139/1117 ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Yamammoto et al., 2000
gyrA “MLPA analysis of the genus Aeromonas” Martínez-Murcia et al. (MS submitted)
16S 0F 8/27 AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martínez-Murcia et al., 1999
16S 15R 1492/1510 GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martínez-Murcia et al., 1999
Nota: * posição segundo numeração de E. coli (Huang, 1996).

A mistura da PCR foi realizada para um volume final de 50 µl, contendo
75mM de Tris HCl (pH 9.0), 2mM de MgCl
2
, 50mM de KCl, 20mM de (NH
4
)
2
SO
4
, 1
µl de DNA genómico, 2,5mM de cada dNTP, 10 pmol de cada oligonucleótido e 1 U
Taq polimerase (BIOTOOLS).
As condições de amplificação a que se submeteram as misturas, foram
diferentes conforme os genes a amplificar. Para a amplificação dos genes gyrB e rpoD
foram utilizadas as seguintes condições: desnaturação inicial durante 5 minutos à
temperatura de 94ºC, 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 94ºc durante 15
segundos, hibridação a 55ºC durante 30 segundos e extensão a 72ºc durante 45
segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extensão final a 72ºC por
um período de 5 minutos.

Para a amplificação do 16S rRNA a mistura foi submetida inicialmente a um
período de 5 minutos à temperatura de 94 ºC para a desnaturação, de seguida foi
submetida a 35 ciclos de amplificação (desnaturação a 94 ºC durante 15 segundos,
hibridação a 55 ºC durante 30 segundos e extensão a 72 ºC durante 1 minuto e 30
Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 39

segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extensão final a 72 ºC por
um período de 5 minutos.
Para amplificação do gene gyrA foram utilizadas a seguintes condições:
desnaturação inicial durante 5 minutos à temperatura de 94 ºC, 35 ciclos de
amplificação (desnaturação a 94 ºC durante 15 segundos, hibridação a 55 ºC durante 30
segundos e extensão a 72 ºC durante 45 segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura
a um ciclo de extensão final a 72 ºC por um período de 5 minutos.

3.3.3. Purificação dos produtos de PCR

A purificação dos produtos de PCR foi realizada com o “Kit” QIAquick PCR
Purification Kit (Qiagen), seguindo o procedimento aconselhado pelo fabricante, cujos
passos estão indicados no quadro 8.

Quadro 8 – Protocolo de purificação dos produtos de PCR
1. Colocar 250 µl de Buffer PB num tubo de 1,5 ml e adicionar o produto da PCR (50 µl).
2. Colocar a mistura numa coluna QIAquick.
3. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
4. Rejeitar o que passa para o tubo colector.
5. Adicionar 750 µl de Buffer PE à coluna, para lavar.
6. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
7. Rejeitar e centrifugar novamente durante 1 minuto a 13000 r.p.m.
8. Colocar a coluna num tubo de 1,5 ml.
9. Adicionar 30 µl de H
2
O M.Q. para eluir o DNA.
10. Centrifugar novamente.
11 Guardar a -20 ºC.


3.3.4. Sequenciação

Os produtos de amplificação purificados foram preparados com o Kit Big
Dye®

Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), segundo recomendações do
fabricante, sendo a reacção de sequenciação preparada para um volume final de 10 µl,
Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 40

adicionando-se 4 µl da solução “Premix”; 4 µl de DNA genómico e 2 µl de primer a 2
µM. Os oligonucleótidos utilizados estão descritos no quadro 10. A mistura foi
submetida a uma sucessão de 25 ciclos. As condições para cada ciclo foram:
desnaturação a 96 ºC durante 10 segundos, hibridação a 50 ºC durante 5 segundos e
extensão a 60 ºC durante 4 minutos.

Quadro 9 – Oligonucleótidos utilizados nas reacções de sequenciação
Posição Sequência (5`--- 3`) Referência
gyrB 3F 334/354* TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT Yáñez et al., 2003
gyrB 7F 792/812* GGG GTC TAC TCG TTC ACC AA Yáñez et al., 2003
rpoD 8F 740/757# GT CAA TTC CGC CTG ATG C Soler et al., 2004
rpoD 9R 800/782# ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT Soler et al., 2004
gyrA “MLPA analysis of the genus Aeromonas” Martínez-Murcia et al. (MS submitted)
16S 0F 8/27҂ AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG Martínez-Murcia et al., 1999
16S 9R 926/908 CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT Martínez-Murcia et al., 1999
16S15R 1492/1510҂ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Martínez-Murcia et al., 1999

Nota: * posição segundo numeração de E. coli (Huang, 1996).
# posição segundo numeração de E. coli
҂ posição segundo numeração de E. coli (Stern et al., 1988).

Os produtos da reacção de sequenciação foram precipitados conforme a
metodologia descrita no quadro 10.

Quadro 10 – Protocolo de precipitação dos produtos de sequenciação
1. Colocar num tubo de 1,5 ml: 2,5 µl de EDTA (125 mM) e 30 µl de Etanol a 100%.
2.

Adicionar os 10 µl da reacção de sequenciação e misturar por inversão, deixando à temperatura
ambiente durante 15 minutos.
3. Centrifugar durante 20 minutos a 14000 r.p.m. à temperatura de 4 ºC.
4. Eliminar a solução de etanol e EDTA
5. Adicionar 100 µl de etanol a 70%.
6. Centrifugar durante 2 minutos a 14000 r.p.m a 4 ºC e eliminar na totalidade a solução de etanol.
7. Secar o pellet (10 minutos no Concentrator-Vacufuge Eppendorf).
8. Armazenar o pellet seco a -20 ºC.

Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 41

Para a ressuspensão do pellet, adiciona-se 20 µl de formamida desionizada e
deixa-se repousar 5 a 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifuga-se brevemente
durante alguns minutos. Por fim, carrega-se a placa do sequenciador automático ABI
3100 Avant Genetic Analiser (Applied Biosystems).

3.3.5. Análise de sequências e construção de dendogramas

As sequências nucleotídicas obtidas foram analisadas pelo programa Chromas
lite versão 2.0. O alinhamento foi realizado com o programa Clustal X, versão 1.8
(Tompson et al., 1997). As árvores evolutivas construíram-se pelo método de
Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com o programa MEGA – Molecular
Evolutionary Genetics Analysis - versão 2.1 (Kumar et al., 2001).


3.4. Caracterização bioquímica pelo API 20NE
____________________________________________________________________________________
As provas bioquímicas convencionais e o sistema de biotipificação numérico
são métodos de identificação que se baseiam nas características fenótipicas dos
microrganismos isto é, os caracteres fisiológicos, bioquímicos e estruturais que o
microrganismo apresenta. O sistema de identificação utilizado foi o sistema de
biotipificação númerico API 20NE, que é um sistema padronizado para identificação de
bacilos Gram negativos não enterobacterias e não fastidiosos como Pseudomonas,
Acinectobacter, Vibrio e Aeromonas. Este sistema é composto por 8 testes
convencionais, 12 testes de assimilação e uma base de dados. Para a realização do
sistema da bioMerieux API 20NE foi seguida a metodologia fornecida pelo fabricante,
cujos passos estão indicados no quadro 11.
Quadro 11 – Procedimento para a realização do sistema API 20NE

1. Preparar a câmara de incubação, colocando aproximadamente 5ml de água destilada nos alvéolos para
criar uma atmosfera húmida. Após retirar a galeria do invólucro hermético, coloca-la na câmara;

2. Preparação do inóculo – abrir uma ampola de meio de auxiliar (API 20/NE Médium).
Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 42

3.Preparar uma suspensão com opacidade superior a 4 da escala de McFarland. Transferir 1 ml desta
suspensão para o meio auxiliar;

4. Homogeneizar; e distribuir o meio nas galerias enchendo até à cúpula;
5. Vedar com parafina líquida;
6 Inocular a 30 ºC durante 48 h;
7. Observar os resultados às 24 e 48h.


3.5. Perfil de Susceptibilidade a agentes antibacterianos
____________________________________________________________________________________

O perfil de resistência aos agentes antibacterianos foi efectuado pelo método de difusão
em disco em Agar Muller-Hinton seguindo o procedimento do quadro 12. Foram
testados vinte e sete antibióticos (Oxoid) pertencendo a diferentes grupos:

β-lactâmicos: (i) Penicilinas- Amoxicilina (AML
10
); Amoxicilina / ácido Clavulânico
(AMC
30
); Piperacilina (PRL
100
); Piperacilina / Tazobactan (TZP
110
); Ticarcilina (TIC
75
);
Ticarcilina / ácido Clavulânico (TIM
85
); (ii) Cefalosporinas - Cefalotina (KF
30
);
Cefoxitina (FOX
30
); Cefoperazona (CFP
30
); Ceftazidime (CAZ
30
); Cefepime (FEP
30
);
Cefotaxime (CTX
30
); Ceftriaxona (CRO
30
); (iii) Monobactâmicos- Aztreonamo
(ATM
30
); (iv) Carbapenemos (IMP
10
);
Aminoglicosídeos- Gentamicina (CN
10
;) Canamicina (K
30
); Tobramicina (TOB10);
Amicacina (AK30); Estreptomicina (S)
Quinolonas- Ciprofloxacina (CIP
5
); Ácido nalidixico (NA)
Macrólidos- Eritromicina (E
15
);
Cloranfenicol (C30);
Tetraciclina (TE
30
);
Sulfamidas- Co –trimoxazol (SxT
25
);
Fosfomicina (FOS).
Material e Métodos
Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 43

Quadro 12 – Protocolo da técnica de difusão em agar com discos de antibióticos

1. Preparar uma suspensão bacteriana de cada estirpe em estudo a partir de 3 – 4 colónias em soro fisiológico
estéril. A suspensão deve ter uma turvação equivalente a metade do grau 1 da escala de McFarland;
2. Mergulhar uma zaragatoa na suspensão bacteriana retirando o excesso e semear em placas de agar Mueller-
Hinton;
3. Aplicar os discos dos antibióticos sobre a superfície do meio de cultura, após a secagem do inoculo e vai
incubar a 37 ºC, durante 18 horas;
4. Com uma craveira medir os diâmetros dos halos de inibição de crescimento para cada antibiótico.


Os resultados foram analisados segundo as normas do “Clinical and
Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2007) que segundo o diâmetro do halo formado
pela acção dos antibióticos classifica as estirpes em sensível, resistente ou intermédio.
























4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
___________________________________________________________










Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 45

4.1. Estirpes isoladas
____________________________________________________________________________________
Para a obtenção das estirpes necessárias à elaboração deste trabalho, foram
realizadas 34 amostras de água para consumo humano não tratadas, provenientes de
dois Concelhos do Distrito de Vila Real, nomeadamente o Concelho de Vila Real e
Vila Pouca de Aguiar, já referidas no capítulo de Material e Métodos. A sementeira
realizou-se em meio de G.S.P (Glutamato Amido Vermelho Fenol) - MERCK 10230-
que segundo especificação do fabricante é selectivo e diferencial para Pseudomonas
spp. e Aeromonas spp.
Das 34 amostras de água não tratadas para consumo humano, utilizadas neste
estudo com origem em fontes, poços e nascentes. No total foram obtidos 87 isolados,
sendo que 43 destes revelaram oxidase e catalase positiva. Os restantes isolados (n=44),
referem-se a bactérias com oxidase e catalase negativa, que não foram objecto de estudo
neste trabalho.
Às estirpes isoladas foi atribuída uma codificação constituída por uma letra e
um número. A letra faz referência à origem da amostra (F- Fonte, P- Poço e N -
Nascente), e o número corresponde à colónia isolada.
As estirpes foram depositadas na colecção de Aeromonas da Universidade de
Trás-os-Montes e Alto Douro, no Departamento de Ciências Veterinárias e as amostras
que foram seleccionadas para sequenciação, nas instalações do Molecular Diagnóstics
Center (MDC), foi atribuída uma referência dessa colecção.
Na tabela 2 encontram-se os isolados (n=43), obtidos por amostra como
também a sua origem. Pela análise desta tabela verifica-se que o número de isolados
obtidos nas fontes é superior ao obtido nos poços. Este facto não significa
obrigatoriamente que exista maior incidência de isolados do género Aeromonas nas
fontes.



Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 46

Tabela 2- Identificação da amostra, origem, localização e referência atribuída.


Amostra Origem Localização Referência dos Isolados
F1 Fonte Centro Povo Guiães F1 AL; F1b
F1B Fonte do Senhor Guiães F1BC 1a 1(MDC 2510); F1BC 1a2; F1BC2;
F1BA1; F1BA2.1; F1BA2.2;F1BA3


F2 Fonte do Corgo Piscinas F2.1; F2. 2a2;
F4 Fonte da Estrada Escariz F4A
F5B Fonte da Aldeia Parada de Cunhos F5.B1; F5.B2
F7 Fonte do Mouco V. Pouca de Aguiar F7A; F7 R
F8 Fonte Capelos F8
F9 Fonte do Largo Soutelo de Aguiar F9 (MDC2464) ; F9Ap
F10 Fonte da Cerdeira Cerdeira de Jales F10AA
F11 Fonte da Igreja Vreia de Jales F11 B; F11 R
F12 Fonte Nova Campo de Jales F12
F13 Fonte de Reguenga Alfarela de Jales F13
F24 Fonte do Cruzeiro Andrães F24. 2
F25 Fonte Central S. Cibrão F25. 1; F25. 2.1; F25. 3
F27 Fonte do Paço Torneiros Arroios F27. 1a; F27. 1b; F27. 2
F28 Fonte Constantim F28 1a; F28 1b
P1 Poço Lordelo P1. a1
P2 Poço Jales P2. 1a; P2.1b
P3 Poço Fonteita P3. 1a; P3. 1aa; P3.1b1
P4 Poço Jales P4. 2
P5 Poço Estação P5. 1.1;
P6 Poço Constantim P6
Nascente
1
N. do Hospital Lordelo N1.1
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 47

4.2. Identificação por sequênciação de isolados bacterianos
____________________________________________________________________________________
4.2.1. Identificação de isolados por sequênciação do gene 16S rRNA
A sequenciação por 16S rRNA permite determinar as relações filogenéticas
entre bactérias, sendo que este método é considerado o mais correcto na identificação
dos microrganismos.
Nove isolados foram seleccionados por apresentarem características
morfológicas distintas; (i) colónias rosa ou laranja em GSP; (ii) Gram negativo; (iii)
oxidase positiva; (iv) catalase positiva - presuntivas de Pseudomonas/ Plesiomonas.
De referir ainda que no estudo do perfil de susceptibilidade, quatro dos
isolados apresentaram resistência ao imipenemo. Os resultados da identificação por
sequenciação do gene 16sRNA para os nove isolados encontram-se na tabela 3.

Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene 16S rRNA










Pela análise desta tabela verifica-se que todos os isolados foram obtidos de
fontes. Os quatro isolados seleccionados (F281a, F281b, F1AL e F10AA) apresentavam
Referência dos isolados Identificação das estirpes
F1AL Chryseobacterium spp.
F1b Pseudomonas costantinii
F10AA Chryseobacterium spp.
F11Bp Pseudomonas brenneri
F11R Pseudomonas brenneri
F12 Pseudomonas savastanoi
F13 Pseudomonas veronii
F281a Pseudomonas fluorescens
F281b Pseudomonas fluorescens
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 48

um fenótipo de resistência ao imipenemo, contudo em GSP a morfologia das colónias
era diferente entre eles, tendo os isolados (F281a, F281b) cor rosa e os isolados (F1AL,
F10AA) cor laranja. Com estas características fenótipicas e após a sequenciação do
gene 16sRNA dois dos isolados foram identificados como Pseudomonas fluorescens e
os outros dois como pertencentes ao género Cryseobacterium spp.. De referir que os
isolados (F1AL, F10AA) revelaram perfis de susceptibilidade diferentes aos
antibioticos testados (Anexo I).
O imipememo é um carbapenemo de uso hospitalar e é referido em vários
estudos (Chin-Chen Lai et al., 2007) como último recurso para estirpes multiresistentes
nosocomiais. Relativamente à amostra F11 os isolados obtidos (F11Bp e F11R)
apresentavam características morfológicas distintas, e perfil de susceptibilidade
idêntico, no entanto a identificação dos isolados bacterianos foi a mesma (Pseudomonas
brenneri). Este facto reforça a necessidade da utilização de métodos genótipicos para a
correcta identificação.
Da tabela análise da tabela 3 observa-se que as sequências obtidas pertencem a
5 espécies do género Pseudomonas - P. costantinni, P. brenneri, P. savastonoi,
P.veronni e P. fluorescens. Algumas espécies de Pseudomonas são patógenicas para os
animais, incluindo o Homem. A espécie Pseudomonas aeruginosa é considerada um
importante patogénico nosocomial em doentes com fibrose quistica (Spilker et al.,
2004), e em queimaduras e feridas (Muller et al., 2009).

4.2.1. Identificação de isolados bacterianos por sequenciação do gene
gyrB
Algumas espécies de bactérias não podem ser diferenciadas entre si apenas
pela sequenciação do gene 16S rRNA. A utilização de genes alternativos para a
identificação molecular de certas espécies aumenta as potencialidades da sequenciação.
A identificação da espécie a que pertencem as 34 estirpes foi realizada por
sequenciação de genes housekeeping. Amplificou-se e determinou-se a sequência
nucleotídica do gene gyrB em 29 isolados presuntivos de Aeromonas: i) colónias
amarelas em GSP, ii) Gram negativo, iii) oxidase e catalase positivam.
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 49

O fragmento de gyrB amplificado foi de 1100 nucleotidos (Figura 4), dos
quais se sequenciaram entre 989 e 1100 pares de bases. Este fragmento representa
aproximadamente 40% da sequência completa (seguindo como referência a sequência
de gyrB da E. coli, que apresenta 2415 nucleótidos; Huang, 1996) e contém 70% dos
nucleótidos correspondentes ao domínio ATPase da proteína.
Foi comparado um fragmento contínuo de 989 pares debases, desde a posição
393 até à posição1389. O número de posições variáveis no fragmento de, gyrB
analisado foi de 241 pb que corresponde a 24,4% do total comparado, ou seja, o número
de posições conservadas (isto é, com idêntica composição) corresponde a 75% dos
nucleótidos sequenciados.



Figura 4 – Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a região do gene que foi amplificada, as setas
indicam a localização dos primers utilizados e em negrito encontram-se as posições do primeiro e último nucleótido
amplificado seguindo a numeração de E. coli (Huang, 1996).

Estas sequências foram comparadas com as da base de dados do MDC para
poder inferir acerca de quais as espécies representadas. A árvore filogenética obtida
dessa análise encontra-se na figura 4.
Desta análise observa-se que as sequências obtidas pertencem a 6 espécies do
género Aeromonas - Aeromonas hydrophila, Aeromonas bestiarum, Aeromonas
eucrenophila, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii e Aeromonas encheleia. Verifica-se
ainda, a formação um cluster filogenético independente dos grupos pertencentes a todas
as espécies actualmente reconhecidas neste género, pelo que poderá representar uma
espécie ainda não descrita. A estirpe deste grupo será denominada de Aeromonas spp.
gyrB14R
gyrB3F
5’ 3’ 334 1464
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 50


Figura 5- Àrvore filogenética obtida com a sequênciação do gene gyrB das estirpes isoladas neste estudo
Aeromonas spp.
A. hydrophila
A. aquariorum
A. trota
A. jandaei
A. caviae
A.schubertii
A. bivalvium
A. eucrenophila
A. tecta
A. encheleia
A. salmonicida
A. bestiarum
A. popoffii
A. media
A. allosacharophila
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
75
38
84
99
45
23
40
54
59
99
37
86
43
43
13
99
51
86
81
73
96
37
61
66
81
30
42
40
53
32
55
18
38
25
31
26
9
20
50
42
50
55
87
53
32
58
63
82
36
29
30
30
25
0.02
A. veronii /culicicola
A. sobria
A. simiae
A. molluscorum
Aeromonas spp.
A. hydrophila
A. aquariorum
A. trota
A. jandaei
A. caviae
A.schubertii
A. bivalvium
A. eucrenophila
A. tecta
A. encheleia
A. salmonicida
A. bestiarum
A. popoffii
A. media
A. allosacharophila
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
MDC181
P5 1.1
MDC57
MDC41
MDC260
MDC39T
MDC28T
MDC100
MDC561
MDC1TA
MDC12
MDC45
MDC99
MDC17T
MDC105
MDC103
MDC104
MDC10T
MDC219
MDC241
MDC250
MDC273
MDC149T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
F27.1b
F27.1a
MDC165
MDC162
P6
N1.1
F5B1
MDC34
MDC11T
MDC4
MDC26
MDC19T
MDC148
MDC25
MDC44
MDC5
MDC24
MDC64
MDC16T-A.HG11
MDC63
MDC37T
MDC14
MDC93
F9=MDC2464
MDC91T
MDC92
MDC94
MDC95
MDC20T
MDC74
MDC72
MDC73
MDC43
F1BC1a1
F7R
MDC256
P2.1b
F7A
MDC147
P2.1a
MDC32T
MDC21
MDC146
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
F8
MDC87T
MDC88
MDC574
MDC575
MDC2T
MDC18-A.G501
MDC2374
MDC54T
MDC55
MDC51
MDC52
MDC33
MDC40T
MDC49
MDC48
MDC2475
F4A
MDC240
P3.1b1
MDC27
F25.2.1
MDC231
P4.2
MDC35T
MDC13T
MDC578
MDC582
MDC580
MDC579
MDC581
MDC38T
MDC36
MDC90
MDC89
MDC576
MDC577
MDC317
MDC573
MDC442
MDC259
MDC2406
MDC310
MDC47
MDC318
100
100
47
52
100
92
99
99
81
52
99
99
99
67
83
99
41
25
98
98
52
32
68
60
32
99
47
55
70
27
99
24
29
52
98
67
55
39
52
55
58
67
38
37
96
55
36
45
46
36
54
23
5
51
72
63
53
75
38
84
99
45
23
40
54
59
99
37
86
43
43
13
99
51
86
81
73
96
37
61
66
81
30
42
40
53
32
55
18
38
25
31
26
9
20
50
42
50
55
87
53
32
58
63
82
36
29
30
30
25
0.02
A. veronii /culicicola
A. sobria
A. simiae
A. molluscorum
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 51

Na tabela 4 estão representadas as espécies de Aeromonas identificadas por
sequenciação do gene gyrB, bem como a referência dos isolados.

Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene gyrB


















Neste estudo e de acordo com a tabela 4 e 5 a espécie com maior incidência foi
a espécie Aeromonas hydrophila (n=10), com uma percentagem de 29,4%. Estes
Referência dos isolados Identificação das espécies por gyrB
F1BC1a1 (MDC2510); F1BC1a2; F1BC2;
F1BA1; F1BA3
Aeromonas spp.
F1BA2.1; F1BA2.1 Aeromonas encheleia
F9 (MDC2464); F9Ap Aeromonas tecta
P5. 1.1 Aeromonas veronii
F4A
Aeromonas hydrophila




P3. 1b1 Aeromonas hydrophila
P4. 2 Aeromonas hydrophila
F25. 1; F25. 2.1; F25. 3; F24. 2 Aeromonas hydrophila
F7R Aeromonas eucrenophila
F7A Aeromonas eucrenophila
F8 Aeromonas eucrenophila
P2. 1a Aeromonas eucrenophila
P2. 1b Aeromonas eucrenophila
P6 Aeromonas bestiarum
F5.B1; F5.B2 Aeromonas bestiarum
F27. 1a; F27. 2 Aeromonas bestiarum
F27. 1b Aeromonas bestiarum
N1.1 Aeromonas bestiarum
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 52

resultados são semelhantes aos obtidos por Villari e colaboradores em 2003 num estudo
realizado a partir de águas naturais minerais.
No México, Castro-Escarpulli e colaboradores (2003), a partir de águas de
diferentes origens referem percentagens semelhantes para a espécie de Aeromonas
hydrophila, e os mesmos resultados foram referenciados por Tequianes-Bravo et al.,
2005 em amostras de água potável. Para estes autores a alta frequência de Aeromonas
hydrophila sugere que águas contaminadas por estes microrganismos apresentam um
potencial risco de infecções ao Homem, dado que algumas estirpes de Aeromonas
possuem um vasto conjunto de factores de virulência como enterotoxinas, citotoxinas e
aerolisinas (Nzeako et al., 1991; González-Serrano et al., 2002). Num trabalho de Kosal
e colaboradores (2007) a prevalência desta espécie foi de 46%, no entanto num estudo
efectuado por Razzolini e colaboradores (2008) com o intuito de detectar Aeromonas e
suas toxinas em águas de reservatórios e fontanários os valores obtidos foram de 15,7%.
Neste trabalho e relativamente às espécies Aeromonas bestiarum, Aeromonas
eucrenophila e Aeromonas caviae (n=2), a percentagem obtida foi de 21%, 15% e 6%
respectivamente. De Aeromonas encheleia, Aeromonas veronii, Aeromonas tecta apenas
foi isolada 1 estirpe pertentente a cada uma das espécies.
Uma particularidade dos resultados deste estudo reside no facto de todas as
espécies consideradas patogénicas para o Homem (Aeromonas hydrophila, Aeromonas
veronii biotype sobria e Aeromonas caviae), foram por nós identificadas o que é de
extrema importância quando se considera a sua ampla distribuição ambiental, tendo
como origem poços. Clínicamente estas espécies são as mais importantes (Figueras,
2005; Edberg et al., 2007

4.2.2. Identificação de isolados bacterianos por sequênciação do gene
gyrA
A sequenciação nucleotídica do gene gyrA (Martínez-Murcia et al. (MS
submitted) foi realizada a 5 estirpes bacterianas presuntivas de Aeromonas e os
resultados da sequenciação estão representadas na tabela 5.
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 53

Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciação do gene gyrA




Da análise da tabela 5 podemos referir que a espécie Aeromonas hydrophila foi
isolada tanto em Fontes como em Poços, o que é bem demonstrativo da sua ubiquidade.
A espécie Aeromonas caviae foi também por nós identificada. É de salientar que ambas
as espécies A. hydrophila e A. caviae pertencem a uma das três espécies consideradas
clinicamente patogénicas para o Homem (Borchardt et al., 2003; Tsai et al., 2006),
sendo que A. hydrophila está intimamente associada a septicémia em doentes
queimados (Chin-Cheng Lai et al., 2007).


4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp.
________________________________________________________

Os resultados da análise filogenética pela sequenciação do gene gyrB
revelaram a presença de um grupo de estirpes distinta de todos os grupos filogenéticos
que representam as espécies de Aeromonas descritas e/ou dos grupos de homologia
DNA-DNA formados dentro deste género.
Como forma de confirmar a formação desse grupo independente constituido
pelos isolados de Aeromonas spp., foi realizada a sequenciação do gene rpoD para a
estirpe MDC 2510. O fragmento de rpoD amplificado foi de 859 pb, dos quais foram
sequenciados entre 722 a 850 nucleótidos, o que representa cerca de 45% da proteína
não englobando o centro activo da proteína.
Quando se realizou o alinhamento desta estirpe com as sequências da base de
dados do MDC foi comparado um fragmento contínuo de 683 pb, este apresenta 252
posições variáveis, o que corresponde a 36,9% da sequência total comparada.
A árvore filogenética obtida dessa análise encontra-se na figura 6.
Referência dos isolados Identificação das estirpes gyrA
F2.1 Aeromonas hydrophila
F2.2a2 Aeromonas hydrophila
P1.a1 Aeromonas hydrophila
P3.1a Aeromonas caviae
P3.1aa Aeromonas caviae
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 54


Figura 6. Arvore filogenética baseada na sequência do gene rpoD.
A. bivalbium
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC24-HG11
MDC63-encheleia-HG11
MDC16-HG11
MDC37T
MDC14
MDC64
MDC94
MDC95
MDC92
MDC91T
MDC93
F1BC1a1
MDC147
MDC256
MDC146
MDC32T
MDC21
MDC87
MDC88
MDC72
MDC74
MDC73
MDC20T
MDC43
MDC55
MDC54T
MDC2374
MDC18-HG13
MDC574
MDC575
MDC2T
70
100
45
100
100
97
60
63
100
100
100
53
76
81
100
74
36
99
78
46
61
100
100
76
57
39
38
100
66
68
93
89
100
98
85
34
46
57
28
36
100
55
34
39
100
100
34
56
100
100
100
100
99
100
62
45
63
100
98
34
60
100
34
24
100
40
39
97
100
43
53
91
100
46
81
100
79
55
55
32
52
22
58
48
42
65
71
48
14
100
39
42
17
24
19
45
0.02
A. popoffii
A. jandaei
A. bestiarum
A. salmonicida
A. hydrophila
A. aquariorum
A. sobria
A. media
A. trota
A. allosaccharophila
A. culicicola/ A. veronii
A. caviae
A. encheleia
A. simiae
A. tecta
A. molluscorum
A. schubertii
Aeromonas sp. (HG11)
A. eucrenophila
Aeromonas sp.
A. bivalbium
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC30
MDC9
MDC23
MDC15
MDC149T
MDC165
MDC34
MDC4
MDC11T
MDC162
MDC26
MDC148
MDC25
MDC44
MDC19T
MDC5
MDC27
MDC240
MDC48
MDC231
MDC35T
MDC2475
MDC317
MDC259
MDC318
MDC573
MDC310
MDC47T
MDC442
MDC2406
MDC105
MDC104
MDC17T
MDC103
MDC-579
MDC581
MDC13T
MDC580
MDC578
MDC582
MDC577
MDC8
MDC90
MDC38T
MDC576
MDC3
MDC1T
MDC99
MDC45
MDC100
MDC12
MDC561
MDC28T
MDC181
MDC41T
MDC57
MDC39T
MDC260
MDC51
MDC52
MDC33
MDC49
MDC40T
MDC250
MDC273
MDC241
MDC219
MDC10T
MDC24-HG11
MDC63-encheleia-HG11
MDC16-HG11
MDC37T
MDC14
MDC64
MDC94
MDC95
MDC92
MDC91T
MDC93
F1BC1a1
MDC147
MDC256
MDC146
MDC32T
MDC21
MDC87
MDC88
MDC72
MDC74
MDC73
MDC20T
MDC43
MDC55
MDC54T
MDC2374
MDC18-HG13
MDC574
MDC575
MDC2T
70
100
45
100
100
97
60
63
100
100
100
53
76
81
100
74
36
99
78
46
61
100
100
76
57
39
38
100
66
68
93
89
100
98
85
34
46
57
28
36
100
55
34
39
100
100
34
56
100
100
100
100
99
100
62
45
63
100
98
34
60
100
34
24
100
40
39
97
100
43
53
91
100
46
81
100
79
55
55
32
52
22
58
48
42
65
71
48
14
100
39
42
17
24
19
45
0.02
A. popoffii
A. jandaei
A. bestiarum
A. salmonicida
A. hydrophila
A. aquariorum
A. sobria
A. media
A. trota
A. allosaccharophila
A. culicicola/ A. veronii
A. caviae
A. encheleia
A. simiae
A. tecta
A. molluscorum
A. schubertii
Aeromonas sp. (HG11)
A. eucrenophila
Aeromonas sp.
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 55

Os resultados obtidos indicam que os isolados de Aeromonas spp. representam
linhas fiógenéticas independentes das descritas até ao momento. A utilização de
diversos genes que codificam funções essenciais (housekeeping) como gyrB, gyrA e
rpoD, graças a sua maior variabilidade intra e interespecífica, têm demonstrado ser
ferramentas úteis para a diferenciação da taxonomia do género Aeromonas (Martínez-
Murcia, 2008). As espécies de Aeromonas mais relacionadas com este novo grupo
formado são Aeromonas tecta e Aeromonas eucrenophila.


4.4. Caracterização fenotípica da estirpe MDC 2464

4.4.1 Métodos bioquímicos
Procedeu-se à caracterização fenótipica da estirpe com a referência MDC 2464
por métodos bioquímicos, por se tratar de uma espécie ainda não descrita em isolados
ambientais ao contrário do descrito por Demarta e colaboradores (2008) a espécie
Aeromonas tecta foi descrita em isolados clínicos, mediante utilização de genes
housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia. Os perfis bioquímicos foram
comparados com a espécie tipo F518
T
(MDC 91)

obtida de amostras de fezes de criança
com diarreia em 1992,

e outras estirpes de Aeromonas (MDC92, MDC93, MDC94,
MDC95).
Os resultados da caracterização fenotípica estão representados na tabela 6. O
isolado F9Ap que corresponde à estirpe com a referência MCD 2464 é oxidase e
catalase positiva, resistente ao agente vibriostático O/129 (150μg), apresenta
crescimento nas concentrações de 0 e 3% de NaCl. Fermenta a glucose com produção
de ácido e gás, e outros carboidratos como a maltose, manose e trealose. É negativa para
a lactose, sacarose, xilose celobiose e rafinose. Para as provas bioquímicas
complementares será de referir, que a estirpe analizada reduz os nitratos a nitritos, não
degrada o aminoácido triptofano, e revelou reacção negativa para a urease e Voges-
Proskaeur. Constata-se também a hidrólise da gelatina, esculina (48 horas), e lisina
descarboxilase (LDC). Relativamente ao teste da ornitina descarboxilase (ODC)
obtivemos um resultado positivo na estirpe tipo (MDC 91), como também para o
isolado deste estudo (MDC 2464). O resultado desta prova difere do descrito por
Demarta e colaboradores (2008) que referem poder ser variável. Todas as provas
bioquímicas não apresentaram diferenças.
Resultados e Discussão

Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano Página 56

Tabela 6. Perfil bioquímico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC 2464

Legenda: ODC (Ornitina descarboxilase); LDC (Lisina descarboxilase); TSI (Triple Iron Sugar); + =
positivo; - = negativo
Nota: K/A- Acidez da Glucose e alcalinização da Lactose e Sacarose
Estirpes
Provas




MDC91 MDC92 MDC93 MDC94 MDC95 MCD2464

Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás Ferm/Gás
Glucose + / + + / + + / - + / + + / + + / +
Lactose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Manose + / + + / - + / - + / + + / + + / +
Maltose + / + + / + + / - + / + + / + + / +
Sacarose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Xilose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Celobiose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Trealose + / + + / - + / - + / + + / + + / +
Rafinose - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Inositol - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Sorbitol - / - - / - - / - - / - - / - - / -
Manitol + / + + / - + / - + / - + / + + / -
Esculina - + + - - -
(+ 48h)

ODC + + + + + +
LDC + + + + + +
Indol - - - - - -
Metil Red + + + + + +
Voges-Proskaeur


- - - - - -
Urease - - - - - -
Nitratos + + + + + +
Gelatina + + + + + +
Citrato + + + + + +
TSI K/A K/A K/A K/A K/A K/A
Resultados e Discussão

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4.4.2. Sistema de biotipificação numérico API 20NE
Procedeu-se também à caracterização bioquímica do isolado MDC 2464,
recorrendo-se à utilização de um sistema miniaturizado sob a forma de kit, o API 20NE
(bioMerieux) (figura 7). A metodologia está descrita no quadro 11 (Material e
Métodos). Este procedimento justifica-se por se tratar de uma espécie ainda não descrita
em isolados ambientais ao contrário do descrito por Demarta e colaboradores (2008),
em que a espécie Aeromonas tecta foi descrita em isolados clínicos, mediante utilização
de genes housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia.

Figura 7- Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE do isolado MDC 2464

Pela figura 7 acima referida, é possível observar que o isolado de Aeromonas
tecta caracterizado bioquimicamente por API 20NE, revela pelo perfil de resultados a
ocorrência da degradação do aminoácido triptofano, ao contrário do verificado quando
se caracterizou fenotipicamente esta estirpe, o que é bem demonstrativo da contradição
dos resultados obtidos e da ambiguidade da identificação de espécies por métodos
fenotípicos. Para as restantes provas, os resultados obtidos foram similares aos estudos
realizados com o intuito de caracterizar bioquímicamente a estirpe por métodos
bioquímicos convencionais.

4.5. Caracterização bioquímica da espécie de Aeromonas spp.
4.5.1. Sistema de biotipificação numérica API 20NE
A espécie identificada como Aeromonas spp. refere-se aos isolados (F1BC1a1- MDC
2510 e F1BC1a2. Esta caracterização bioquímica efectuou-se por se tratar de uma
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espécie ainda não descrita no género Aeromonas. Na figura 8 está representado o perfil
numérico dos isolados anteriormente referidos.

Figura 8- Perfil do sistema de biotipificação numérico API 20NE dos isolados FBC1a1- MDC 2510 - e
FBC1a2

Pela figura 8 é possível observar que os resultados dos isolados de Aeromonas
spp., apresentam perfil bioquímico idêntico, com excepção da arginina dihidrolase que
para o isolado FBC1a (MDC 2510) deu resultado positivo, ao contrário do verificado
para o isolado FBC1a2) com reacção negativa às 24 horas, mas às 48 horas o resultado
desta prova foi positivo. Em ambos os isolados ocorreu a redução dos nitratos, indol e
urease positiva, hidrólise da esculina e gelatina, fermentação da glucose. De salientar
que o perfil numérico obtido para os isolados da espécie A. tecta (F9 e F9Ap) e
Aeromonas spp. (F1BC1a1 e F1BC1a2), com leitura às 24 horas não foi possível obter
qualquer identificação pela consulta no livro índex do sistema de biotipificação
respectivo. Este facto corrobora a necessidade de se fazer a identificação por métodos
genéticos como referido (Figueras et al., 2000; Castro-Escarpulli et al., 2003; Martínez-
Murcia et al., 2007; Hidalgo et al., 2008).
A caracterização bioquímica apresenta problemas ao nível das bactérias do
género Aeromonas, dado que o método de biotipificação numérica utilizado tem como
base de dados, resultados de ensaios em estirpes clínicas. Assim e de acordo com Díaz e
colaboradores (2006) é referido que num laboratório de análises microbiológicas de
águas, Aeromonas hydrophila é a espécie mais frequentemente identificada (62,5%),
Aeromonas caviae (20,3%), Aeromonas veronii biovar sobria (9,3%), e Aeromonas spp.
(7,8%). Tal como referido por vários autores sabe-se que os sistemas comerciais para
identificação bioquímica das espécies de Aeromonas são erróneos, existindo mesmo
sistemas que apenas incluem nas suas bases de dados a espécie Aeromonas hydrophila
(Vivas et al., 2000). No nosso trabalho essa dificuldade foi constatada, em ambas as
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espécies (Aeromonas tecta e Aeromonas spp.). A escassa coincidência entre os métodos
de identificação fenotípica e genética é evidenciada pela falta de provas fenotípicas
claras e concisas para diferenciar entre espécies de Aeromonas. Diferenças entre a
identificação fenotipica/genética foram reportadas em estudos anteriores (Abbott et al.,
1998; Vivas et al., 2000; Park et al., 2003; Díaz et al., 2006), e está de acordo com os
nossos resultados. Hidalgo e colaboradores (2008) referem que 73,5% dos isolados
identificados fenotipicamente como A. hydrophila, mediante identificação genética
resultaram em A. hydrophila (22,4%), A. sobria (28,6%) e A. bestiarum (22,5%).

4.6. Perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos
_______________________________________________________________________________
Foi realizado o perfil de susceptibilidade, pelo método de difusão em disco
(Quadro 12, Material e Métodos) a 27 antibioticos de vários grupos em 34 estirpes. As
tabelas com os perfis individuais das estirpes em estudo encontram-se no anexo II. Os
resultados globais do perfil de susceptibilidade dos isolados obtidos apresentam-se na
figura 9.


Figura 9. Perfil de susceptibilidade a diferentes antibióticos dos isolados de Aeromonas em estudo
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
AML
AMC
TIC
TIM
PRL
TZP
ATM
IPM
KF
FOX
CAZ
CTX
CRO
CFP
FEP
FOS
NA
CIP
AK
CN
TOB
K
S
E
C
STX
TE
Resistente Sensível Intermédio
Resultados e Discussão

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Ao longo dos vários anos, estudos relativos ao perfil de susceptibilidade a
diferentes antibióticos têm sido efectuados com estirpes Aeromonas de origem clínica e
ambiental (Overman e Janda, 1999; Huddleston et al., 2006; Palú et al., 2006). Pela
análise da figura 9 podemos verificar que as estirpes estudadas apresentaram uma
percentagem elevada de resistência à amoxicilina assim, os índices obtidos foram de
100%. Estudos anteriores (Vila et al., 2002; Radu et al., 2003) referem 100% de
resistência a estes antibióticos, referindo que as estirpes do género Aeromonas são
intrinsecamente resistentes à penicilina (Hatha et al., 2005). No entanto, nos trabalhos
de Saavedra e colaboradores (2004) apresentam-se valores de 35% de sensibilidade a
estes antibióticos. Em relação à cefalotina, cefalosporina de primeira geração, todas as
estirpes foram resistentes a este antibiótico, resultados obtidos também por Bizani e
Brandelli (2001).
Verificámos ainda que 85% das estirpes testadas eram resistentes à ticarcilina,
estando estes resultados em concordância com os obtidos por Blasco e seus
colaboradores em 2008, num estudo onde foi comparada a multiresistência de
patogénicos (Aeromonas spp., Pseudomonas spp. e Legionella spp.) isolados em água
de reservatórios, água engarrafada e sistemas de refrigeração.
Podemos constatar que as estirpes de Aeromonas estudadas apresentaram uma
elevada percentagem de sensibilidade à ureidopenicelina (piperaciclina). Á semelhança
do referido por Vila et al., (2002) e Fosse et al., (2003) verificamos que as
ureidopenicelinas se revelaram mais activas do que as carboxipenicelinas contra as
estirpes testadas, como se pode observar na figura 16, a percentagem de estirpes
sensível à piperaciclina é de 100%, enquanto a percentagem de estirpes sensível à
ticarcilina é de 5%.
Relativamente às cefalosporinas testadas verificamos que a percentagem de
estirpes resistentes à cefalotina (100%), a única cefalosporina de 1ª geração testada,
estava de acordo com os valores obtidos noutros trabalhos (Bizani e Brandelli, 2001).
No que se refere à cefalosporina de 2ª geração testada, a cefoxitina, 9% das estirpes
analisadas eram resistentes. No estudo de Costa e colaboradores em 2002 com estirpes
obtidas num matadouro de frangos e no estudo de Palú e colaboradores em 2006 com
estirpes obtidas de alfaces foram obtidos valores de resistência à cefoxitina (32%)
superiores aos obtidos no nosso estudo. Para as cepalosporinas de 3ª e 4ª geração
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obtivemos valores de 100% de sensibilidade revelando-se assim efectivas contra
Aeromonas spp.. Estes resultados semelhantes aos obtidos em vários estudos, (Kãmpfer
et al., 1999; Bizanni e Brandelli, 2001; Fosse et al., 2003; Sader e Jones, 2005), em que
todas as estirpes analisadas querem de origem ambiental, quer de origem clínica eram
susceptíveis a este subgrupo de antibióticos. Por outro lado os resultados por nós
obtidos de isolados de Aeromonas spp., em águas não tratadas para consumo humano,
estão de acordo com os de Ottaviani e colaboradores (2006) num estudo que visou
pesquisar a presença deste género em melhixões no mar Adriático.
Constatamos ainda, que da associação do inibidor de β-lactamases, o ácido
clavulânico com a aminopenicilina, amoxicilina, permitiu reduzir a resistência deste
antibiótico de 100% para 56% o que revela a sua eficiência. Este inibidor quando
associado à carboxipenicilina, ticarcilina, essa diminuição não foi tão significativa pois
passou de 85% para 68%, o que corresponde a uma redução de 17%. Estes resultados
estão de acordo com os obtidos noutros estudos (Vila et al., 2002; Saavedra et al.,
2004). Relativamente ao tazobactam, constatamos que da sua associação à
ureidopenicelina (piperaciclina) não houve qualquer eficiência, pois todas as estirpes
eram sensíveis.
Os nossos resultados revelaram que 100% das estirpes estudadas eram
sensíveis ao aztreonamo o que está de acordo com outros estudos publicados (Ko et al.,
1996; Kãmpfer et al., 1999; Sader e Jones, 2005). No entanto, no estudo de Koksal e
colaboradores (2007), com estirpes isoladas de água para consumo em Istambul-
Turquia, para este antibiótico foram obtidos índices de sensibilidade de 89% e no
trabalho de Díaz e colaboradores (2006), com estirpes isoladas de água apenas 58% das
estirpes eram sensíveis ao aztreonamo.
Para o carbapenemo testado, imipenemo, 3% das estirpes apresentaram resistência, 12%
foram consideradas intermédias e as restantes 84% sensíveis. Estes resultados são de
realçar pelo facto de este antibiótico ser de último recurso em estirpes nosocomiais
multiresistentes, nomeadamente Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni
como é referido em vários trabalhos (Hughes et al., 2002; Hsueh et al., 2005; Poirel e
Nordmann (2006); John e McGowan (2006). Em estudos anteriores obtiveram-se, no
que se refere ao imipenemo, estirpes de origem clínica e ambiental com resistência a
este carbapenemo (Hughes et al., 2002; Obi et al., 2007; Koksal et al., 2007). De referir
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que no nosso estudo a estirpe Aeromonas eucrenophila foi a que apresentou resistência
a este agente antibacteriano.
No presente trabalho verificou-se que para as quinolonas testadas todas as
estirpes de Aeromonas eram sensíveis à ciprofloxacina (Penders e Stobberingh, 2008),
enquanto a sensibilidade revelada ao ácido naladíxico foi de 91%. Castro-Escarpulli e
colaboradores (2003) reportam que 58,5% das estirpes de peixe congelado para
consumo, que analisaram, eram resistentes à ciprofloxacina, Koksal e colaboradores
(2007) referem para ambos os antibióticos valores de 1% e 2% respectivamente.
Em vários estudos é referida a susceptibilidade das estirpes de Aeromonas, aos
aminoglicosídeos testados com diferentes origens, (Kãmpfer et al., 1999; Vila et al.,
2002; Palú et al., 2006). Neste estudo, a estreptomicina revelou ser o menos efectivo,
com 44% das estirpes analisadas a apresentarem-se resistentes. Em 2007 Akinbowale e
colaboradores obtiveram valores de resistência semelhantes (33%) em estirpes isoladas
de trutas na Austrália. Em contrapartida, outros autores, referiram valores de resistência
para este antibiótico superiores, 65% em estirpes isoladas de água de dois rios Europeus
(Goñi-Urriza et al., 2000), e 75% em estirpes isoladas de peixe congelado para
consumo, no México (Castro-Escarpulli et al., 2003). Para os restantes
aminoglicosídeos verificamos que 100% das estirpes estudadas eram sensíveis à
amicacina, canamicina, gentamicina, e tobramicina, valores comparáveis aos obtidos em
outros estudos (Overman e Janda, 1999; Castro-Escarpulli et al., 2003).
No nosso estudo detectamos um elevado número de estirpes resistentes à
eritromicina (89%) à semelhança do reportado noutros trabalhos (Kãmpfer et al., 1999;
Blasco et al., 2008), Koksal e colaboradores (2007) obtiveram 48%. Verificamos ainda
que 11% das estirpes revelaram sensibilidade a este antibiótico. Alguns autores referem
a existência de uma resistência intrínsica do género Aeromonas à eritromicina (Kãmpfer
et al., 1999). Relativamente ao sulfametoxazol-trimetoprim, 97% das estirpes eram
sensíveis a este antibiótico. Nos estudos de Palú e colaboradores (2006) as estirpes
analisadas de origem alimentar eram todas sensíveis, mas segundo Castro-Escarpulli e
colaboradores em 2003 obtiveram valores de resistência de 49%, valores muito
superiores aos obtidos por nós (3%). No que se refere ao cloranfenicol e à tetraciclina
verificou-se que todas as estirpes analisadas, eram sensíveis a estes antibióticos o que
está de acordo com (Penders e Stobberingh, 2008). De referir no entanto que Costa e
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colaboradores (2002) descrevem que 75% das estirpes obtidas em diferentes pontos da
linha de abate de aves, eram resistentes à tetraciclina enquanto Koksal e colaboradores
(2007) num estudo efectuado em águas para consumo obtiveram valores de resistência
de 12% para este antibiótico.
A existência de multiresistência tem sido referida em estudos anteriores
(Morita et al., 1994; Radu et al., 2003; Ottaviani et al., 2006) e está de acordo com os
nossos resultados. Neste trabalho todas as estirpes estudadas apresentaram resistência a
três ou mais antibióticos.
Tabela 7- Resistência a múltiplos antibióticos das espécies de Aeromonas
Fénotipo de Resistência Isolados
AML, KF; E F8; F5B2; F27.2
AML; AMC; KF F7R
AML; TIC; KF; E P6
AML; AMC; KF; S F7A
AML; TIC; TIM; KF; E F2.1; F1BA2.1; F1BA2.2
AML; AMC; TIC; TIM; KF F2.2a2
AML; AMC; TIC; KF; E F5B1
AML; TIC; KF; S; E F27.1b; F1BC1a1; F1BC1a2
AML; AMC; TIC; TIM; KF; E P2.1a; F4A; F24.2; F25.1; F25.2.1; F25.3; N1.1; P31b1
AML; TIC; TIM; KF; S; E; F1BC2; F1BA1; F1BA3
AML; AMC; TIC; TIM; KF; S P5.1.1
AML; TIC; KF; S; E; SXT F27.1a
AML; AMC; TIC; TIM; KF; S; E F9; F9Ap; P4.2
AML; TIC; TIM; KF; FOX; NA; E P1a1
AML; AMC; TIC; TIM; IMP; KF; S; E P2.1b
AML; AMC; TIC; TIM; KF; FOX; NA; S; E P3.1a; P3.1aa


Huddleston e colaboradores (2006) referem no entanto a inexistência de
estirpes multiresistentes. Dos 34 isolados submetidos ao teste de sensibilidade a
antimicrobianos, 38% apresentaram resistência a seis antibióticos e 11,7% a sete, em
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combinações diferentes. É de referir que em 6% das estirpes analizadas se detectou
multiresistência a nove antibióticos, sendo que a combinação dos antimicrobianos
verificada é a mesma. Estas estirpes foram identificadas como Aeromonas caviae, dados
estes que corroboram com os obtidos para a mesma espécie por Costa e colaboradores
(2003). Apesar da espécie A. caviae ser considerada de menor patogenicidade, quando
comparada à A. hydrophila a presença de estirpes dessa espécie, resistente a um amplo
espectro de antimicrobianos, deve ser motivo de preocupação.
A estirpe onde se detectou a ocorrência de resistência a oito antibióticos, entre
os quais imipenemo, foi a espécie Aeromonas eucrenophila. A multiresistência à
amoxicilina, cefalotina e eritromicina foi detectada em 9% das estirpes analisadas,
verificando-se a presença de resistência à amoxicilina e cefalotina em 100% das
estirpes.


























5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
____________________________________________________________________________________








Considerações Finais

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As amostras de água não tratada para consumo humano, utilizadas neste
trabalho são provenientes de fontes, poços e nascentes, cujo controlo e frequência na
monitorização da qualidade microbiológica destas águas deverá ser de acordo com o
Decreto-lei 306/2007, sendo esta no entanto escassa ou nula. Pois estas águas não são
distribuídas pelas entidades gestoras responsáveis por essa distribuição, logo não existe
obrigatoriedade da realização desta análise. Desta forma o risco de transmissão de
bactérias patogénicas ou comensais é elevado.
O isolamento e a identificação de diferentes espécies de Aeromonas nas águas
não tratadas nesta região, sugerem uma elevada prevalência destas espécies, e reforça a
afirmação dos riscos que estas águas representam para a saúde pública pelo seu
consumo directo ou como veículo de contaminação de alimentos.

A sequenciação dos genes gyrB, gyrA e rpoD utilizados na metodologia para
identificação dos 34 isolados obtidos neste estudo mostraram ser bastante eficazes, o
que possiblitou a identificação de sete espécies distintas – Aeromonas hydrophila,
Aeromonas eucrenophila, Aeromonas caviae, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii,
Aeromonas bestiarum e Aeromonas encheleia. É de referir que a espécie Aeromonas
tecta ainda não tinha sido descrita em isolados ambientais, tendo sido possível a sua
detecção neste trabalho pelas ferramentas utilizadas.

A análise filogenética demonstrou a existência de um grupo de estirpes que,
com base na sua relação com as restantes espécies do género Aeromonas poderá
representar uma espécie não descrita deste género.

No que se refere aos perfis de susceptibilidade aos antibióticos testados
conclui-se que a piperaciclina, o aztreonamo, as cepalosporinas de 3ª e 4ª geração e a
ciprofloxacina apresentavam boa actividade contra Aeromonas spp.
Detectou-se multiresistência em todos os isolados, sendo de salientar que em
6% das estirpes analisadas foi observada multiresistência a nove antibióticos.
Os resultados alertam para o facto de que isolados da mesma espécie podem
apresentar comportamentos de susceptibilidade diferente aos grupos de antibióticos.














6. BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________






Bibliografia

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ANEXOS
_______________________________________________________


















Anexo I
Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por 16s RNA



Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano





AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
F1AA R R
10
R R
10
R
11
S R R R R
13
R
14
R R R
10
S R S S R
14
I
14
R R R I
18
S S S
F1b R R R R S S S S R R S S R
10
S S S S S S S S S S R I16 S S
F10AA R R R R R
17
R
17
R R
11
R S S R R
12
R
15
R R S S R
14
R
9
R R
10
R
10
R
8
R
12
S R
9

F11B R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R
10
S S
F11R R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R S S
F12 R R R R S S R S

R R S R
10
R S S S S S S S S S I
14
R I
16
S S
F13 R R R R S S R S R R S R R S S S S S S S S S S R R
10
S S
F281a R R R R S S S R
11
R R S R
12
I
15
I
19
S R I
14
S S S S S S R R
11
S S
F281b R R R R S S S R
11
R R S R
11
I
17
I
18
S R I
17
S S S S S S R R
12
S S










Anexo II
Perfil de susceptibilidade a antibióticos dos isolados identificados por gyrB, gyrA e
rpoD






Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano
ND-Não determinado


AML AMC TIC

TIM

PRL TZP ATM IPM KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
F2.1 R S R R
10
S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F2. 2a2 R R R R S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
P3. 1a R R
13
R
10
R
10
S S S S R
10
R S S S S S S R S S S S S R
11
R
12
S S S
P3. 1aa R R
13
R
9
R
11
S S S S R
12
R S S S S S S R S S S S S R
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R
11
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11
R
9
R
10
S
19
S S S R I
16
S S S S S S S S S S S S I
14
R
14
S S S
F4A R R
13
R R
12
S S S S

R S S S S S ND S S S S S S S S R S S S
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10
S

S S S S S R S S S S S S S S S S S S S I
13
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I
16
S S S S S R S S S S S S S S S S S S S R
11
S S S S
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7
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S S S S S S S S S S S S S R
11
R
14
S S S
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S S S S S S S S S S S S S R
11
R
14
S S S
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R R
9
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15
R S S S S S S S S S S S S S R
11
S S S S
P2.1b R R
10
R
13
R
12
S S S R
13
R S S S S S S S S S S S S S R R S S S
P4.2 R R
10
R
13
R
12
S S S I
15
R S S S S S S S S S S S S S R
10
R S S S
P1.a1 R I
15
R
10
R
12
S S S S R R S S S S S S R S S S S S S
15
R
16
S S S
N1.1 R R R R S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S


Caracterização de Aeromonas spp. isoladas de águas não tratadas para consumo humano
AML AMC TIC TIM PRL TZP ATM IMP KF FOX CAZ CTX CRO CFP FEP FOS NA CIP AK CN TOB K S E C SXT TE
F8 R
10
S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S
16
R
11
S S S
F5B1 R R
13
R S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R
11
S S S
F5B2 R I
16
I
18
S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F24.2 R R R R S S S S

R S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F25.1 R R R R S S S S R
14
S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F25.2.1 R R R R S S S S R
10
S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F25.3 R R R R S S S S R
8
S S S S S S S S S S S S S S R S S S
F27.1a R I
15
R I
16
S S S S R S S S S S S S S S S S S S R
11
R
12
S R S
F27.1b R S
20
R
12
S S S S S R S S S S S S S S S S S S S R
11
R
12
S S S
F27.2 R I
16
I
16
I
18
S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R
15
S S S
P2.1a R R
10
R
13
R
12
S S S I
15
R S S S S S S S S S S S S S I
12
R
13
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P6 R I
15
R
12
S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S R S S S
1BA3 R I
15
R R
10
S
22
S S S R S S S S S S S S S S S S S R
10
R
16
S S S
1BA2.1 R I
16
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11
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24
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15
R
15
S S S
1BA2.2 R S
18
R R
13
S
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