You are on page 1of 31

1 Test per tube

Product catalog No: 25244­00
ReaPan 3 4 G

                                                                     

   Manufactured by  

                                                                            
ReaPan 3 4 G Reagent
1. INTENDED USE

The ReaPan 3 4 G reagent is a two color immunofluorescence staining reagent for 
the   enumeration   of   absolute   counts   of   total   T­lymphocytes   (CD3+)   and 
helper/inducer (CD4+) T­Cells.  This reagent is intended for flow cytometry based 
analysis   in   lyzed   human   whole   blood   samples,   preferably   on   the   Guava   PCA 
System1. Please get in touch with ReaMetrix before running the reagents on other 
Flow Cytometer systems. 

2. BACKGROUND

The ReaPan 3 4 G reagent contains fluorescently labeled antibodies that bind to CD3 
and CD4 antigens found on the surface of circulating leukocytes in peripheral blood 
samples. 
2
The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as the T­
cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent binds to the 20kDa ε 
chain of this complex. 

The CD4 antigen is a 59kDa protein. It interacts with class II molecules of the major 
histocompatibility   complex   and   is   the   primary   receptor   for   the   Human 
Immunodeficiency Virus (HIV).
Cells   that   are   CD3+   &   CD4+   are   identified   as   helper/inducer   lymphocytes. 
Decreased   CD4+CD3+   cell   counts   have   been   associated   with   some   forms   of 
immunodeficiency. 

3. REAGENT

The ReaPan 3 4 G reagent is formulated in buffered saline with sodium azide and 
stabilizers.  It contains R­Phycoerythrin (PE)– labeled anti­CD4 monoclonal antibody, 
clone RPA­T4; R­Phycoerythrin (PE)­Dyomics 649 – labeled anti­CD3 monoclonal 
antibody, clone UCHT1; The monoclonal antibodies used in the ReaPan 3 4 G were 
assigned these specificities at the 8th International Workshop on Human Leukocyte 
Differentiation   Antigens.     The   ReaPan   3   4   G   reagent   enables   a   single­platform 

3
enumeration   of   absolute   CD4+   (and   CD3+)   and   total   CD3+   T­cell   counts.     The 
ReaPan 3 4 G reagent is provided in dried­down format and dispensed in Guava Flow 
Cytometer compatible sample tubes with each tube containing one ready­to­use test.

Precautions

1) Warning: The ReaPan 3 4 G reagent contains Sodium azide. Sodium azide is 
harmful   if   swallowed.   Wear   suitable   protective   clothing.   If   swallowed,   seek 
medical advice immediately. Contact with acids liberates toxic gas. Azides should 
be flushed with large amounts of water during disposal to avoid deposits in lead or 
copper plumbing.

2)Warning: All blood specimens are considered biohazards. Handle them as if they 
are capable of transmitting infection and dispose off with proper precautions and 
accordance with governmental regulations.

3) The addition of the precise volume of blood is critical to obtain correct results. 
Use a calibrated pipette and operate according to the manufacturer’s instructions.

Storage and Handling

4
1) Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent 
after the expiry date on the label.

2) Do not freeze the Four Color reagent.

3) The ReaPan 3 4 G reagent is light sensitive. Do not expose to direct light either 
during storage or when mixed with blood.

5
4. INSTRUMENT

The   ReaPan   3   4   G   reagent   has   been   tested   on   the   Guava   PCA™   systems 
manufactured   by   Guava   Technologies,   Inc.1.   ReaMetrix   recommends   running   this 
reagent   on   this   instrument.   Instruments   should   be   calibrated   for   setting 
photomultiplier tube voltages, fluorescence compensation, and checking instrument 
sensitivity according to the manufacturer’s guidelines.

 It is the responsibility of the user to optimize the performance of the reagent for use 
in flow cytometers other than that mentioned above. The flow cytometers used along 
with this reagent should be equipped with one excitation lasers Green laser 532nm 
and two fluorescence detection channels yellow/orange ~580nm to 583nm , red ~675 
to 680 nm and Forward scatter1.

6
5. SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube containing 
K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the   minimum 
volume of blood to be collected.

The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 25°C) and 
should be stained and analyzed ideally within 24 hours of draw.  

Refrigerated, hemolyzed, and previously fixed blood specimens can yield erroneous 
results and should be rejected.

6. PROCEDURE

6.1 Reagent Provided

1. ReaPan 3 4 G in a dried format.

2. ReaLyse Lysing Solution (ReaMetrix Catalog No.25237­00) or similar blood 
fix/lyse solution

7
6.2 Reagents and materials required but not provided

1) Blood collection tube containing K3EDTA
2) Calibrated pipettes

3) Vortex mixer

4) Guava® Check Beads Kit­For verifying the performance of the Guava systems 
6.3 Assay Protocol

1) Mix blood sample (invert blood tube at least 10 times) and pipette 50µL of 
blood   into the correctly labeled tube that contains the dry down reagent.

2) Vortex each tube vigorously for 30 seconds. Incubate for 30 minutes at 
room temperature. Protect the tube from direct light.

3) Add 450µL of 1X ReaLyse Lysing solution (a 10X solution is typically 
supplied with the kit) to each tube and vortex for 20 seconds. Return tubes to 
the dark for at least 15 minutes.
8
4)Vortex  sample tube thoroughly (at  low speed)  and load  onto cytometer  for 
analysis.

6.4 Flow Cytometer Acquisition and Analysis
This protocol assumes that the flow cytometer has been setup according to the 
manufacturer’s   instructions   (For   example,   In   the   case   of   Guava   PCA™,   the 
instrument should be setup and calibrated using Guava®  Check Kit and Easy 
CD4   Cytosoft   2.2   software     Guava   check™   software).   Open   the   Easy   CD4 
Cytosoft 2.2 software and connect to the cytometer. 

1)DETERMINING THE ABSOLUTE CD4 CONCENTRATION:

2) Click Guava EasyCD4 from the main menu. Allow the Guava PCA to 
warm up for 15 minutes before acquiring specimens.

3)Select EasyCD4 from the Reagent Type menu.

4) Enter the reagent kit lot # and expiration date. This information can be 
found on the ReaPan 3 4 G Reagent pouch.

9
5) Click New Data Set. Select the folder where you want to save the file, 
and enter a file name for this session. Click Save. The same file name you enter 
for the FCS file will also be used for the spreadsheet (.csv) file. If you wish, you 
may select an existing data file and either overwrite it or append it with the data 
from this session.

6)Select the reagent type.

7)Mix the normal control specimen and load it on the Guava PCA.

Click Settings.

a) To adjust instrument settings, click Adjust Settings.

b) To   retrieve   instrument   settings,   click  Retrieve   Settings.   Select   a 


settings file and click  Open. The settings are automatically downloaded to the 
Guava PCA.

c) A   message   appears   prompting   you   to   load   the   control   specimen. 


Ensure the tube is loaded and click OK.

10
d)Enter a file name for this data set and click Save. The Adjust Settings screen 
appears.   The   system   automatically   sets   the   threshold   to   exclude   background 
fluorescence.

e) To fine tune the settings, you can make the following adjustments  once 
events start to appear on the screen:

f) Set the Refresh Rate to the number of events you want to display. The default is 
2000 events appearing on the display at any time. To view fewer events, select 
100.To view all events, select Cumulative.

g) Set the Flow Rate. The recommended flow rate is Medium (0.5 µL/s). You 
may also select Low (0.2 µL/s).

h) Use the FSC Gain settings to reduce or amplify the FSC signal so that the 
white blood cell (WBC) population is positioned between 10e2 and 10e3.

i) To adjust the FSC threshold, click and drag the threshold marker up or down the 
FSC axis of the FSC vs CD3­PE­Dyomics 649 (PM2) dot plot until the desired 

11
amount of debris is eliminated below the threshold. Set the threshold 2 to 3 mm 
to the left of the CD3+ cells.

j) Adjust the PM2 voltage (using the slider or the arrow keys on the keyboard) to 
optimize the separation between CD3– and CD3+ cells. Make sure the negative 
population   is   positioned   below   10e1   on   the   CD4­PE   (PM1)   vs.   CD3­PE 
Dyomics649 (PM2) plot.

k) Adjust the PM1 voltage so that the negative population is positioned below 
10e1 on the CD4­PE (PM1) vs. CD3­PE­Dyomics  649 (PM2) plot. Drag to 
adjust FSC threshold.

l) Adjust   the   CD3  gate  on  the   FSC  vs.  CD3­  PE­Dyomics   649  (PM2)   plot  to 
include all CD3+ cells. The CD3 gate is used as a counting gate. Events that are 
included in the gate are counted toward the number of Events to Acquire. For 
example, if the Events to Acquire is set to 2000, acquisition is complete when 
2000 events have passed through the CD3 gate. Set the CD4 gate on the CD4­
PE (PM1) vs CD3­PE­Dyomics 649 (PM2) plot. 

7) When you are finished adjusting settings, click Next Step to advance to the data 
acquisition screen.
12
8)Open the Specimen Information control panel and enter the number of events to 
acquire and dilution factor. The default number of events to acquire is 2000. The 
default dilution factor is 20. If you set a CD3 gate to include CD3+ cells only, as 
many events will be acquired as is necessary to satisfy 2000 CD3+ events.

9) If   you   want   to   identify   individual   specimens   or   sets   of   specimens,   enter   an 


optional ID in the Specimen ID field.

10) The specimen ID may be any text up to 40 characters long, such as the 
name of the specimen you are testing. 

11) Mix the first specimen and load it on the Guava PCA. Click  Acquire 


Next Specimen. The system acquires the specimen and automatically displays the 
results. Click to automatically start acquisition when a tube is loaded.

8. ACQUISITION NOTES

If you select  Autostart Acquisition, acquisition automatically starts when you load 
each tube. You do not need to click Acquire Next Specimen. Autostart Acquisition is 
automatically disabled if you click any of the following: Settings (followed by Adjust  

13
or Retrieve), Quick Clean, or Backflush. You must recheck the box to continue using 
the feature.

If the acquisition rate appears to slow dramatically, the fluid pathway may be blocked. 
Click Abort, load a tube of 20% bleach, then click Backflush. When the backflush is 
complete, load a tube of DI water and click Quick Clean.

Reload the specimen and click Acquire Next Specimen.

The progress bar provides an estimate of the target event count during the acquisition 
period, which times out after 4 minutes.

You may set or fine tune the gates immediately after acquisition from the Acquisition 
screen. 

Click Save and Close Current Specimen.

You   may   still   enter   or   change   the   Specimen   ID   for   the   current   specimen   before 
clicking Save and Close Current Specimen.

14
When you are finished, load a tube of Guava ICF and click Quick Clean. Follow with 
a second Quick Clean running deionized water to rinse.

9. ANALYSIS

Use the Analysis screen to analyze specimens, print results, log comments, or view 
the event log from a data set that was saved previously. You can also export data to 
FCS 2.0 format  or a spreadsheet  file. You can  save changes  made to the gate or 
markers within Analysis by overwriting the existing file or saving a new file. Guava 
does not recommend overwriting files.

If you access the Analysis screen during data acquisition you can view or print data 
for any specimens already acquired. You may also log comments or view the event 
log.   However,   you   cannot   change   analysis   settings   (gates   and   markers)   from   the 
analysis screen during acquisition. Any analysis settings you wish to change during 
acquisition should be done from the Acquisition screen.

Click Guava EasyCD4TM icon from the main menu.

Click Go to Analysis from the Acquisition screen.

15
Click Open Data Set. Select an FCS file for analysis and click Open.

The data and results for the first specimen in the data set appear. The marker settings 
appear as they were when the specimen was acquired. To see a list of all specimens in 
the data set, click the title bar of the Analysis Specimen List control panel.

CD3 GATE

The CD3 gate is used as a counting gate. Events that are included in the gate are 
counted   toward   the   number   of   Events   to   Acquire.   To   set   a   gate   on   the   CD3 
population, position the cursor over the upper­left handle. Click and drag the handle to 
a new location. Make sure the left side of the rectangle does not eliminate any CD3+ 
cells. Repeat with the lower­right handle. Position the bottom of the gate between the 
CD3–and CD3+ cells. Be sure to include all CD3+ cells. Excluding CD3+ cells from 
the CD3 gate will affect results. Events that fall within the center rectangle and appear 
in red are included in the gate. You may also set the gate by entering the coordinates 
in the Marker Position fields and clicking Set

CD4 GATE:

16
You can set rectangular markers or quadrant markers. You can choose to view all the 
events acquired or only the CD3+ gated events by clicking the appropriate option 
under CD3/CD4 Plot. When All Events is selected, all of the events to the right of the 
FSC threshold are displayed in the CD3/CD4 Dot Plot. When CD3+ Gated Events is 
selected,only those events within the CD3+ gate are displayed. Guava recommends 
selecting All Events when setting the CD4 gate.

RECTANGULAR MARKER:

To set a gate on the CD4 T­cell population, click and drag the handles so that all of 
the CD3+/CD4+ cells are within the gate. You may also set the gate by entering the 
coordinates   in   the   Marker   Position   fields   and   clicking  Set.   Gate   set   on   CD3+   T 
lymphocytes.Click and drag handles to manually set gate. A pop­up label displays 
handle’s   current   x   and   y   coordinates.   Enter   coordinates   to   set   gate.   Rectangular 
markers   selecting   CD4+   T   cells   (pink)   and   excluding   all   other   cell   populations 
(black).Enter coordinates to set gate. Click and drag handles to manually set gate. A 
pop­up label displays handle’s current x and y coordinates. Select data to view. Select 
type of markers.

QUADRANT MARKERS:

17
 To set quadrant markers, position the cursor over the handle at the intersection, then 
click and drag to the desired location. You may also set the markers by entering the 
coordinates in the Marker Position fields and clicking Set. If necessary, you can adjust 
the angle of the markers ±44° from their original location.

Click and drag the handle (Solid Square) towards the end of the marker and tilt the 
marker to the desired angle. You may also angle the markers by entering the degrees 
in the Marker Position Angle fields and clicking Set.

Click  Next  under   Specimen   List   Navigation   in   the   Specimen   Information   control 
panel or Unit Control panel. You can also click on the next specimen in the list, or use 
the keyboard arrow keys to select specimens.

Select data to view.Enter coordinates to set gate. Click and drag handles to manually 
set gate. A pop­up label displays handle’s current x and y coordinates.Select type of 
markers.

Select   data   to   view.   Enter   coordinates   and   angle   to   set   markers.   Click   and   drag 
intersection to set markers. A label displays markers’ x and y coordinates and angles. 
Click   and   drag   handle   to   set   marker   angle.   A   label   displays   markers’   x   and   y 
coordinates and angles. Select type of markers.

18
You can apply gate and/or marker settings from one specimen to another specimen(s), 
whether   you   have   made   changes   or   the   specimens   were   acquired   with   different 
settings.   Select   the   specimens   to   which   you   want   to   apply   the   settings   from   the 
Analysis Specimen List. Be sure the original specimen, whose setting you wish to use, 
is also selected. Then, click  Apply Current Settings  to Selected Specimens. Hold 
down the Shift key while clicking and dragging to select groups of specimens. Or, 
hold down the Ctrl key while clicking to select multiple specimens.

When you have finished analyzing the specimens in the current file, you can save any 
analysis changes you made by exiting Analysis or clicking Open Data Set. A dialog 
box appears prompting you to save the changes. Click  Yes  and either overwrite the 
existing file or save the file with a new name. Results are automatically exported to a 
CSV file that is given the same name as the FCS files.

If   you   wish   to   view   the   event   log,   click  View   Event   Log.   You   can   also   enter 
comments related to the assay and save these comments to the event log. Click Log 
Comment and type in the information. Then, click Save Comments to Log.

10. RESULTS:

19
You can view all the events or CD3+ gated events only, by selecting either All Events 
or CD3+ Gated Events under CD3/CD4 Plot (or CD3/CD8 Plot) to the left of the dot 
plot. Guava recommends selecting All Events when viewing the results for CD4 (or 
CD8) T cells.

 The CD3 gate is used to determine the concentration of CD3 T cells. 

  CD3+ cells  x           dilution factor                    =      CD3 T cell concentration  

                        Volume of specimen acquired

 The CD4 gate is used to determine the concentration of CD4 T cells.

CD3+CD4+ cells x             dilution factor                  =      CD4 T cell concentration  

                               Volume of specimen acquired

 The summary of each quadrant is outlined in the table below:

20
                                                                            CD4

Quadrant Staining Population Color


lower left CD4–, CD3– PMN   cells,   B   cells,   NK  black
lower right CD4+, CD3– monocytes black
upper right  CD4+, CD3+ helper/inducer   T  pink
upper left  CD4–, CD3+ suppressor/cytotoxic   T  black

Figure 1. Gating CD3 and CD4 cell population with Cytosoft (version 2.2)

21
                  FIGURE 1A        FIGURE 1B

22
11.PERFORMANCE CHARACTERISTICS

The performance  data for ReaPan 3 4 G Reagent  were  generated  by performing 


clinical validation against the predicate Guava Reagents on the same Guava PCA 
platform

Accuracy

The absolute counts for CD4+ and CD3+ T­Cells determined using ReaPan 3 4 G 
reagent   were   compared   with   Guava   Easy   CD4   Reagent   using   Guava   PCA 
Instrument. The absolute counts for CD3+ determined by the ReaPan 3 4 G were 
compared with a Guava Easy CD3 Reagent. Excellent correlation is seen for a 100 
sample comparison for CD3 counts (R2 > 0.97, R > 0.98) as well as for CD4 counts 
(R2 > 0.97, R > 0.97).  This is comparable and is some cases better than correlations 
23
determined across reagents in literature2,4.

CD3 Counts:

24
Guava Reagents on PCA - 6000
y =1.027x +15.844
5000 2
R =0.9718
CD3 Counts

4000

3000

2000

1000

0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
RMX Reagents on PCA - CD3 Count

25
CD4 Counts:

1600
Guava Reagents on PCA -

1400 y =1.0364x +8.1047


2
1200 R =0.9745
CD4 Count

1000
800
600
400
200
0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

RMX Reagents on PCA - CD4 Count

26
Precision

The   precision   on   a   set   of   dispensed   reagents   was   tested   using   Immunotrol   Cells3 
(Beckman Coulter, US) stained with three tubes of dried reagents. The precision on CD4 
counts was seen to be within 2.5% and that on CD3 counts was seen to be within 1.4%. 

12.LIMITATIONS

1. The   ReaPan   3   4   G   reagent   has   only   been   validated   with 


K3EDTA treated whole blood.
27
2. Laboratories should establish their own reference ranges for the 
absolute counts obtained using the ReaPan 3 4 G reagent. 

3. The reagents must only be used with the ReaLyse Lysis Solution

13.WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated on the 
label at the time of delivery to the customer. There are no warranties, expressed or 
implied, that extend beyond the description on the label of the product. ReaMetrix’s 
sole liability is limited to replacement of the product. ReaMetrix is not liable for 
property damage, personal injury, or economic loss caused by the product. 

Note: Guava Check kit, Guava PCA, Easy CD4, Cytosoft 2.2 are all registered trade 
names of Guava Technologies. 

28
14. REFERENCES

1.Guava   Technologies   Website,  The   Guava   Personal   Cell   Analysis   (PCA)  


Platform, http://guavatechnologies.com/

2.A.   J.   Kandathil,   R.   Kannangai,   S.   David,   G.   Nithyanandam,   S.   Solomon,   P. 


Balakrishnan, O. C. Abraham,  S. Subramanian, P. Rupali, V. P. Verghese, S. 
Pulimood,   and   G.   Sridharan,  Comparison   of   Microcapillary   Cytometry 
Technology and  Flow Cytometry  for CD4+ and  CD8+ T­Cell Estimation, 
Clin Diagn Lab Immunol. 2005 August; 12(8): 1006–1009.

3.Immunotrol   Cell   Controls   from   Beckman   Coulter, 


http://www.beckmancoulter.com. Part Number 6607077.

4.Kovit Pattanapanyasat, Yuwadee Phuang­Ngern, Surada Lerdwana, Punneeporn 
Wasinrapee,   Natthaga   Sakulploy,   Egarit   Noulsri,   Charin   Thepthai,   Janet   M. 
McNicholl, Evaluation of a single­platform microcapillary flow cytometer for 
enumeration of absolute CD4+ T­lymphocyte counts in HIV­1 infected Thai 

29
patients, Volume 72B, Issue 5, Pages 387­39.

Manufactured by ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 

30
www.reametrix.com
Rev No. 2.0,  28­Apr­09

31