You are on page 1of 27

1 Test per tube

Product catalog No: 25332­00
ReaPan 3 8 G

Manufactured by  
                                                                            

1
ReaPan 3 8 G Reagent

1. INTENDED USE

The ReaPan 3 8 G reagent is a two color immunofluorescence staining reagent for 
the enumeration of absolute counts of total T­lymphocytes (CD3+) and Suppressor/
cytotoxic   (CD8+)   T­Cells.     This   reagent   is   intended   for   flow   cytometry   based 
analysis   in   lyzed   human   whole   blood   samples,   preferably   on   the   Guava   PCA 
System1. 

2.  BACKGROUND

The  ReaPan 3 8 G reagent contains fluorescently labeled antibodies that bind to 
CD3 and CD8 antigens found on the surface of circulating leukocytes in peripheral 

2
blood samples. 

The CD3 antigen is a complex of at least six proteins known collectively as the T­
cell receptor (TCR) complex. The antibody used in this reagent binds to the 20kDa 
ε chain of this complex. 

The CD8 antigen is a complex consisting of two disulfide linked subunits. The 
antibody used in this reagent binds to the 32KDa  ά  subunit of the complex.CD8  
interacts with class I major histocompatibity complex molecules.

Cells   that   are   CD3+   and   CD8+   are   identified   as   suppressor/cytotoxic   T 


lymphocytes. Decreased CD8+CD3+ cell counts have been associated with some 
forms of immunodeficiency. 

3. REAGENT

The ReaPan 3 8 G reagent is formulated in buffered saline with sodium azide and 
stabilizers.     It   contains   R­Phycoerythrin   (PE)–   labeled   anti­CD8   monoclonal 
antibody,   clone   LT8;   R­Phycoerythrin   (PE)­Dyomics   649   –   labeled   anti­CD3 
monoclonal   antibody,   clone   UCHT1;   The   monoclonal   antibodies   used   in   the 

3
ReaPan 3 8 G were assigned these specificities at the 8th International Workshop 
on Human Leukocyte Differentiation Antigens.  The ReaPan 3 8 G reagent enables 
a single­platform enumeration of absolute CD8+ (and CD3+) and total CD3+ T­
cell counts.   The ReaPan 3 8 G reagent  is provided in dried­down format and 
dispensed   in   Guava   Flow   Cytometer   compatible   sample   tubes   with   each   tube 
containing one ready­to­use test.

Precautions

1) Warning: The ReaPan 3 8 G reagent contains Sodium azide. Sodium 
azide is harmful if swallowed. Wear suitable protective clothing. If swallowed, 
seek medical advice immediately. Contact with acids liberates toxic gas. Azides 
should be flushed with large amounts of water during disposal to avoid deposits 
in lead or copper plumbing.

2)Warning: All blood specimens are considered biohazards. Handle them as if they 
are capable of transmitting infection and dispose off with proper precautions and 
accordance with governmental regulations.

4
3) The addition of the precise volume of blood is critical to obtain correct 
results.   Use   a   calibrated   pipette   and   operate   according   to   the   manufacturer’s 
instructions.

Storage and Handling

1) Store the reagent at room temperature in a dry place. Do not use the reagent 
after the expiry date on the label.

2) Do not freeze the Four Color reagent.
3) The ReaPan 3 8 G reagent is light sensitive. Do not expose to direct light either 
during storage or when mixed with blood.

4. INSTRUMENT

The   ReaPan   3   8   G   reagent   has   been   tested   on   the   Guava   PCA™   systems 
manufactured  by Guava Technologies, Inc.1. ReaMetrix recommends  running this 
reagent   on   this   instrument.   Instruments   should   be   calibrated   for   setting 
photomultiplier tube voltages, fluorescence compensation, and checking instrument 
5
sensitivity according to the manufacturer’s guidelines.

It is the responsibility of the user to optimize the performance of the reagent for use 
in flow cytometers other than that mentioned above. The flow cytometers used along 
with this reagent should be equipped with one excitation lasers Green laser 532nm 
and two fluorescence detection channels yellow/orange ~580nm to 583nm , red ~675 
to 680 nm and Forward scatter1.

5. SPECIMEN COLLECTION

The blood sample should be collected in a sterile blood collection tube containing 
K3EDTA.   Follow   the   collection   tube   manufacturer’s   guidelines   for   the   minimum 
volume of blood to be collected.
The anti­coagulated blood must be stored at room temperature (20°C ­ 25°C) and 
should be stained and analyzed ideally within 24 hours of draw.  
Refrigerated, hemolyzed, and previously fixed blood specimens can yield erroneous 

6
results and should be rejected.

6. PROCEDURE

6.1 Reagent Provided
ReaPan 3 8 G in a dried format.

6.2 Reagents and materials required but not provided
1) Blood collection tube containing K3EDTA
2) Calibrated pipettes
3) Vortex mixer
4) ReaLyse Lysing Solution (ReaMetrix Catalog No.25237­00) or similar blood 
fix/lyse solution
5) Guava® Check Beads Kit­For verifying the performance of the Guava systems 

6.3 Assay Protocol

1) Mix blood sample (invert blood tube at least 10 times) and pipette 50µL of 
blood   into the correctly labeled tube that contains the dry down reagent.

7
2) Vortex each tube vigorously for 30 seconds. Incubate  for 30 minutes  at 
room temperature. Protect the tube from direct light.

3) Add 450µL of 1X ReaLyse Lysing solution (a 10X solution is typically 
supplied with the kit) to each tube and vortex for 20 seconds. Return tubes to 
the dark for at least 15 minutes.

4)Vortex sample tube thoroughly (at  low speed) and load onto cytometer  for 


analysis.

6.4 Flow Cytometer Acquisition and Analysis

This protocol assumes that the flow cytometer has been setup according to the 
manufacturer’s   instructions   (For   example,   In   the   case   of   Guava   PCA™,   the 
instrument should be setup and calibrated using Guava® Check Kit and Easy CD8 
Cytosoft 2.2 Software   Guava check™ software). Open the Easy CD8 Cytosoft 
2.2 software and connect to the cytometer. 

8
g. DETERMINING THE ABSOLUTE CD8 CONCENTRATION:

1) Click Guava EasyCD8 from the main menu. Allow the Guava PCA to warm 
up for 15 minutes before acquiring specimens.
2) Select EasyCD8 from the Reagent Type menu.
3) Enter the reagent kit lot # and expiration date. This information can be found on 
the ReaPan 3 8 G Reagent pouch.
4) Click New Data Set. Select the folder where you want to save the file, and enter a 
file name for this session. Click Save. The same file name you enter for the FCS 
file will also be used for the spreadsheet (.csv) file. If you wish, you may select 
an existing data file and either overwrite it or append it with the data from this 
session.
5) Select the reagent type.
6) Mix the normal control specimen and load it on the Guava PCA.
Click Settings.
a) To adjust instrument settings, click Adjust Settings.
b) To   retrieve   instrument   settings,   click  Retrieve   Settings.   Select   a 
settings file and click  Open. The settings are automatically downloaded to 
the Guava PCA.
9
c) A message appears prompting you to load the control specimen. Ensure 
the tube is loaded and click OK.
d)Enter a file name for this data set and click Save. The Adjust Settings screen 
appears. The system automatically sets the threshold to exclude background 
fluorescence.
e) To fine tune the settings, you can make the following adjustments 
once events start to appear on the screen.
f) Set  the  Refresh  Rate  to the  number of  events  you want  to display.  The 
default is 2000 events appearing on the display at any time. To view fewer 
events, select 100.To view all events, select Cumulative.
g) Set   the  Flow   Rate.  The   recommended   flow   rate   is   Medium   (0.5 
µL/s). You may also select Low (0.2 µL/s).
h) Use the  FSC Gain  settings to reduce or amplify the FSC signal so 
that the white blood cell (WBC) population is positioned between 10e2 and 
10e3.
i) To adjust the FSC threshold, click and drag the threshold marker up or down 
the FSC axis of the FSC vs CD3­PE­Dyomics 649 (PM2) dot plot until the 
desired amount of debris is eliminated below the threshold. Set the threshold 
2 to 3 mm to the left of the CD3+ cells.

10
j) Adjust the PM2 voltage (using the slider or the arrow keys on the keyboard) 
to optimize the separation between CD3– and CD3+ cells. Make sure the 
negative   population   is   positioned   below   10e1   on   the   CD8­PE   (PM1)   vs. 
CD3­PE Dyomics649 (PM2) plot.
k) Adjust the PM1 voltage so that the negative population is positioned 
below 10e1 on the CD8­PE (PM1) vs. CD3­PE­Dyomics 649 (PM2) plot. 
Drag to adjust FSC threshold.
l) Adjust the CD3 gate on the FSC vs. CD3­ PE­Dyomics 649 (PM2) plot to 
include all CD3+ cells. The CD3 gate is used as a counting gate. Events that 
are included in the gate are counted toward the number of Events to Acquire. 
For example, if the Events to Acquire is set to 2000, acquisition is complete 
when 2000 events have passed through the CD3 gate. Set the CD8 gate on 
the CD8­PE (PM1) vs CD3­PE­Dyomics 649 (PM2) plot. 
7) When you are finished adjusting settings, click Next Step to advance to the data 
acquisition screen.
8) Open the Specimen Information control panel and enter the number of events to 
acquire and dilution factor. The default number of events to acquire is 2000. 
The default dilution factor is 20. If you set a CD3 gate to include CD3+ cells 
only, as many events will be acquired as is necessary to satisfy 2000 CD3+ 
events.
11
9)If   you   want   to   identify   individual   specimens   or   sets   of   specimens,   enter   an 
optional ID in the Specimen ID field.
10) The specimen ID may be any text up to 40 characters long, such as the name 
of the specimen you are testing. 
11) Mix the first specimen and load it on the Guava PCA. Click  Acquire Next 
Specimen.  The system acquires the specimen and automatically displays the 
results. Click to automatically start acquisition when a tube is loaded.

8. ACQUISITION NOTES

If you select Autostart Acquisition, acquisition automatically starts when you load 
each tube. You do not need to click Acquire Next Specimen. Autostart Acquisition is 
automatically   disabled   if   you   click   any   of   the   following:  Settings  (followed   by 
Adjust  or  Retrieve),  Quick   Clean,   or  Backflush.  You   must   recheck   the   box   to 
continue using the feature.

If   the   acquisition   rate   appears   to   slow   dramatically,   the   fluid   pathway   may   be 
blocked. Click  Abort, load a tube of 20% bleach, then click  Backflush. When the 
backflush is complete, load a tube of DI water and click Quick Clean.
Reload the specimen and click Acquire Next Specimen.
12
The progress bar provides an estimate of the target event count during the acquisition 
period, which times out after 4 minutes.
You   may   set   or   fine   tune   the   gates   immediately   after   acquisition   from   the 
Acquisition screen. 

Click Save and Close Current Specimen.
You may still  enter or change  the Specimen  ID for the current  specimen  before 
clicking Save and Close Current Specimen.

When you are finished, load a tube of Guava ICF and click  Quick Clean. Follow 
with a second Quick Clean running deionized water to rinse.

9. ANALYSIS
Use the Analysis screen to analyze specimens, print results, log comments, or view 
the event log from a data set that was saved previously. You can also export data to 
FCS 2.0 format or a spreadsheet  file. You can save changes made to the gate or 
markers within Analysis by overwriting the existing file or saving a new file. Guava 
does not recommend overwriting files.

13
If you access the Analysis screen during data acquisition you can view or print data 
for any specimens already acquired. You may also log comments or view the event 
log. However,  you cannot  change  analysis settings  (gates  and markers)  from  the 
analysis screen during acquisition. Any analysis settings you wish to change during 
acquisition should be done from the Acquisition screen.

Click Guava EasyCD8TM icon from the main menu.
Click Go to Analysis from the Acquisition screen.

Click Open Data Set. Select an FCS file for analysis and click Open.

The data and results for the first specimen in the data set appear. The marker settings 
appear as they were when the specimen was acquired. To see a list of all specimens 
in the data set, click the title bar of the Analysis Specimen List control panel.

CD3 GATE
The CD3 gate is used as a counting gate. Events that are included in the gate are 
counted   toward   the   number   of   Events   to   Acquire.   To   set   a   gate   on   the   CD3 
population, position the cursor over the upper­left handle. Click and drag the handle 

14
to a new location. Make sure the left side of the rectangle does not eliminate any 
CD3+ cells. Repeat  with the lower­right  handle.  Position the bottom  of the gate 
between the CD3–and CD3+ cells. Be sure to include all CD3+ cells. Excluding 
CD3+ cells from the CD3 gate will affect results. Events that fall within the center 
rectangle and appear in red are included in the gate. You may also set the gate by 
entering the coordinates in the Marker Position fields and clicking Set

CD8 GATE:
You can set rectangular markers or quadrant markers. You can choose to view all the 
events acquired or only the CD3+ gated events by clicking the appropriate option 
under CD3/CD8 Plot. When All Events is selected, all of the events to the right of 
the   FSC   threshold   are   displayed   in   the   CD3/CD8   Dot   Plot.   When   CD3+   Gated 
Events is selected, only those events within the CD3+ gate are displayed. Guava 
recommends selecting All Events when setting the CD8 gate.

RECTANGULAR MARKER:
To set a gate on the CD8 T­cell population, click and drag the handles so that all of 
the CD3+/CD8+ cells are within the gate. You may also set the gate by entering the 
coordinates  in the Marker  Position fields  and clicking  Set. Gate  set  on CD3+  T 
lymphocytes.Click and drag handles to manually set gate. A pop­up label displays 

15
handle’s   current   x   and   y   coordinates.   Enter   coordinates   to   set   gate.   Rectangular 
markers   selecting   CD8+   T   cells   (pink)   and   excluding   all   other   cell   populations 
(black).Enter coordinates to set gate. Click and drag handles to manually set gate. A 
pop­up  label   displays   handle’s  current   x  and  y  coordinates.  Select   data   to  view. 
Select type of markers.

QUADRANT MARKERS:
 To set quadrant markers, position the cursor over the handle at the intersection, then 
click and drag to the desired location. You may also set the markers by entering the 
coordinates  in the Marker Position fields  and clicking  Set. If necessary,  you can 
adjust the angle of the markers ±44° from their original location.
Click and drag the handle (Solid Square) towards the end of the marker and tilt the 
marker to the desired angle. You may also angle the markers by entering the degrees 
in the Marker Position Angle fields and clicking Set.

Click  Next  under Specimen List Navigation in the Specimen Information control 


panel or Unit Control panel. You can also click on the next specimen in the list, or 
use the keyboard arrow keys to select specimens.

16
Select data to view. Enter coordinates to set gate. Click and drag handles to manually 
set gate. A pop­up label displays handle’s current x and y coordinates. Select type of 
markers.

Select  data   to  view.  Enter   coordinates  and  angle  to  set  markers.  Click  and   drag 
intersection to set markers. A label displays markers’ x and y coordinates and angles. 
Click   and   drag   handle   to   set   marker   angle.   A   label   displays   markers’   x   and   y 
coordinates and angles. Select type of markers.

You   can   apply   gate   and/or   marker   settings   from   one   specimen   to   another 
specimen(s), whether you have made changes or the specimens were acquired with 
different settings. Select the specimens to which you want to apply the settings from 
the Analysis Specimen List. Be sure the original specimen, whose setting you wish 
to use, is also selected. Then, click Apply Current Settings to Selected Specimens. 
Hold down the Shift key while clicking and dragging to select groups of specimens. 
Or, hold down the Ctrl key while clicking to select multiple specimens.

When you have finished analyzing the specimens in the current file, you can save 
any analysis change you made by exiting Analysis or clicking  Open Data Set. A 
dialog   box   appears   prompting   you   to   save   the   changes.   Click  Yes  and   either 

17
overwrite the existing file or save the file with a new name. Results are automatically 
exported to a CSV file that is given the same name as the FCS files.

If   you   wish   to   view   the   event   log,   click  View   Event   Log.   You   can   also   enter 
comments related to the assay and save these comments to the event log. Click Log 
Comment and type in the information. Then, click Save Comments to Log.

10. RESULTS:

You can view all the events or CD3+ gated events only, by selecting either All 
Events or CD3+ Gated Events under CD3/CD8 Plot (or CD3/CD4 Plot) to the left 
of the dot plot. Guava recommends selecting All Events when viewing the results 
for CD8 (or CD4) T cells.

The CD3 gate is used to determine the concentration of CD3 T cells. 
  CD3+ cells    x           dilution factor                    =      CD3 T cell concentration  
                         Volume of specimen acquired

18
 The CD8 gate is used to determine the concentration of CD8 T cells.
CD3+CD8+ cells x             dilution factor                  =      CD8 T cell concentration  
                               Volume of specimen acquired
 

The summary of each quadrant is outlined in the table below:
                                                                            CD8
Quadrant Staining Population Color
lower left CD8–, CD3– PMN cells, B cells, monocytes black
lower right CD8+, CD3– Natural Killer Cells (NK cells) black
upper right  CD8+, CD3+ suppressor/cytotoxic T pink
upper left  helper/inducer T lymphocytes
CD8–, CD3+ black
lymphocytes

Figure 1. Gating CD3 and CD8 cell population with Cytosoft (version 2.2)

19
 
 FIGURE 1A        FIGURE 1B

11. PERFORMANCE CHARACTERISTICS

The performance data for ReaPan 3 8 G Reagent were generated by performing 
clinical validation against the predicate Guava Reagents on the same Guava PCA 
platform
Accuracy

20
The absolute counts for CD8+ and CD3+ T­Cells determined using ReaPan 3 8 G 
reagent   were   compared   with   Guava   Easy   CD8   Reagent   using   Guava   PCA 
Instrument. The absolute counts for CD3+ determined by the ReaPan 3 8 G were 
compared with a Guava Easy CD3 Reagent. Excellent correlation is seen for a 100 
sample comparison for CD3 counts (R2 > 0.97, R > 0.99) as well as for CD8 counts 
Guava Easy CD8 Reagent- CD8 Count

(R2 > 0.96, R > 0.98).  This is comparable and is some cases better than correlations 
determined across reagents in literature2,4.

CD8:
3500
R2 = 0.9634
3000
R = 0.98
2500

2000

1500

1000

500

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

RMX ReaPan 3 8 G Reagent- CD8 Count

21
R = 0.98

Guava Easy CD8 Reagent -CD3 Count


CD3: 

4000
R2 = 0.9713
3500
R = 0.99
3000

2500

2000

1500

1000

500

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

RMX ReaPan 3 8 G Reahent- CD3 Count

22
12. LIMITATIONS

1. The   ReaPan   3   8   G   reagent   has   only   been   validated   with   K3EDTA 


treated whole blood.

2. Laboratories   should   establish   their   own   reference   ranges   for   the 


absolute counts obtained using the ReaPan 3 8 G reagent. 

3. The reagents must only be used with the ReaLyse Lysis Solution

13.WARRANTY

This product is warranted only to conform to the quantity and contents stated on the 
label at the time of delivery to the customer. There are no warranties, expressed or 
implied, that extend beyond the description on the label of the product. ReaMetrix’s 
sole liability is limited to replacement of the product. ReaMetrix is not liable for 
property damage, personal injury, or economic loss caused by the product. 
Note: Guava Check kit, Guava PCA,  Easy CD8, Cytosoft 2.2  are all registered  
23
trade names of Guava Technologies. 

24
14. REFERENCES

1. Guava   Technologies   Website,  The   Guava   Personal   Cell   Analysis  


(PCA) Platform, http://guavatechnologies.com

2. A.   J.   Kandathil,   R.   Kannangai,   S.   David,   G.   Nithyanandam,   S. 


Solomon, P. Balakrishnan, O. C. Abraham, S. Subramanian, P. Rupali, V. P. 
Verghese,   S.   Pulimood,   and   G.   Sridharan,  Comparison   of   Microcapillary 
Cytometry  Technology and Flow Cytometry  for CD4+ and CD8+ T­Cell 
Estimation, Clin Diagn Lab Immunol. 2005 August; 12(8): 1006–1009.

3. Immunotrol   Cell   Controls   from   Beckman   Coulter, 


http://www.beckmancoulter.com. Part Number 6607077.

4. Kovit   Pattanapanyasat,   Yuwadee   Phuang­Ngern,   Surada   Lerdwana, 


Punneeporn Wasinrapee, Natthaga Sakulploy, Egarit Noulsri, Charin Thepthai, 
Janet   M.   McNicholl,  Evaluation   of   a   single­platform   microcapillary   flow 
cytometer for enumeration of absolute CD4+ T­lymphocyte counts in HIV­
1 infected Thai patients, Volume 72B, Issue 5, Pages 387­39.
25
Manufactured by 
ReaMetrix India Pvt. Ltd.
Manufacturing License Number: KTK25/519/2006
50­B, II Phase, Peenya Industrial Area
Peenya, Bangalore 560058, India

26
Ph: +91­80­28378693/5, Fax: +91­80­41172451
E­mail: info@reametrix.com, 
www.reametrix.com
Rev No. 1.0, 28­Apr­09

27