Reporte Practica No.

8 Determinacion de la
concentracion de proteinas
Materia: Laboratorio de
Biotecnología Molecular


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Unidad Profesional Interdisiplinaria de Ingenieria Campus Guanajuato





Ingeniería Biotecnológica
Laboratorio de Biotecnología Molecular
Practica 8.- Determinación de la concentración de proteinas
5BV1
27/04/2014
Hugo Ramírez Rodríguez 2011660475
Juan Cristóbal García García 2012660213
José Gilberto Savi Tejeda 2012660319
Ricardo Rafael Marín Mosqueda 2010660234
Erick Noé Soto Martínez 2011660270


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Resultados
Para estimar la concentración de proteínas presentes en una muestra problema
mediante el ensayo Bradford, se realizaron diluciones de un stock de albúmina de
suero bovino (BSA) de 1mg/mL, estas diluciones se utilizaron para la construcción
de una curva estándar, leyendo las diluciones y la muestra problema a una
absorbancia de 595 nm.

Tabla 1. Lectura de Absorbancia para la curva de calibración para la concentración de
albumina
Concentración de albumina (mg/mL) Absorbancia a 595nm
0.3157 -0.152
0.5 -0.057
1 0.306
Se realizó una regresión lineal con el software estadístico minitab 17® para la
construcción de una curva estándar.

Figura 1. Curva de calibración para la concentración de Albumina BSA
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Si se despeja la ecuación de la recta obtenida es posible realizar una estimación
de una muestra problema.
Ecuación 1

La muestra problema se midió por triplicado en un espectrofotómetro UV a una
absorbancia de 595 nm, obteniendo los siguientes resultados.

Tabla 2. Lectura de absorbancia de la concentración de la muestra probema
Muestra Problema Absorbancia a 595 nm por triplicado.
Lectura 1 0.435
Lectura 2 0.423
Lectura 3 0.458
Promedio 0.4387
Desviación Estándar 0.0178

Discusión de Resultados


Tabla 3. Cuadro comparativo entre diversas técnicas para la cuantificación de proteínas
Método Ventajas Inconvenientes
Métodos de
absorción
No se pierden las muestras Interfieren muchos compuestos que absorben
en el UV



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Método Ventajas Inconvenientes
Métodos derivados Colorimétricos
Biuret Bastante específico para
proteínas.
Muestra con pocas
Interferencias.
Método económico.

Tiene poca sensibilidad.
Lowry Muy sensible
Menos afectado por la
turbidez.
Método relativamente simple
se puede completar en 1 a
1.5 horas.

No todas las proteínas reaccionan igual.
La muestra puede tener interferencias con
varios compuestos como detergentes no
iónicos, sulfato de amonio etc.

Bradford Método muy sensible a bajas
concentraciones de proteína.

La muestra puede tener interferencias con
detergentes y soluciones básicas.
BCA Es el método mas sensible.
Es el que presenta menos
interferencias con la
muestra.
El color no es estable con el tiempo.
Los azúcares reductores interfieren con la
reacción.
La respuesta en la absorbancia no es lineal

Métodos derivados Fluorimétricos
o-ftalaldehido Muy sensible Interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual


(Fernandez, 2002)
1


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El ensayo de Bradford es un método de determinación de proteína que consiste en
la unión del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 a las proteínas.
(Bradford, 1976)
2

El colorante existe en tres formas: catiónico ( rojo) , neutro ( verde ), y aniónico
(azul). En un medio ácido, el colorante es predominantemente en forma catiónica
roja doblemente protonado (Amax = 470nm) .
(Compton y Jones 1985)
3

Sin embargo , cuando el colorante se une a la proteína, esta se convierte en una
forma no protonada azul estable ( Amax = 595 nm )
(Reisner et al.1975 , Fazekes de St. Groth et al . 1963 , Sedmack y Grossberg 1977)
4,5,7


Esta forma de proteína - colorante azul es la que se detecta a 595 nm en el
ensayo utilizando un espectrofotómetro.

Spector (1978) encontró que el coeficiente de extinción de una solución del
complejo del colorante con albúmina BSA fue constante en una gama de
concentración de 1 µg/mL hasta 15µg/mL de albúmina BSA. Por lo tanto, la ley de
Beer se puede aplicar para la cuantificación exacta de la proteína mediante la
selección de una relación adecuada de volumen de colorante para la
concentración de la muestra. (Spector,1978)
8

Ciertos interacciones químicas con el colorante pueden interferir con el ensayo. La
interferencia de compuestos no proteínicos se debe a su capacidad de cambiar los
niveles de equilibrio del colorante entre las tres especies de colores. Las fuentes
conocidas de interferencia, tales como algunos detergentes, flavonoides, y
tampones básicos de proteínas, estabilizan el colorante neutro verde ya sea por la
unión directa con el colorante o por un cambio en el pH impidiendo la reacción de
coloración.
(Compton y Jones 1985, Fanger 1987)
3,4

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Figura 2.- Curva de calibración para un ensayo Bradford donde se muestra la región de
concentración que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer.
Los valores de concentración para realizar la curva de calibración y de la muestra
problema no se encuentran dentro de la región que mejor se comporta de acuerdo
a la Ley de Lambert Beer, por lo que es necesario un ajuste estadístico que mejor
se adapte a los resultados, por otro lado los resultados obtenidos para las
primeras dos mediciones de la curva de calibración son valores negativos lo cual
indica un error.
Con lo mencionado, el presunto motivo por el cual se obtuvieron lecturas erróneas
fue por la presencia de restos de detergentes en los materiales usados durante la
sesión, pudiendo estar principalmente contaminados los tubos de ensaye y
probablemente las celdas donde se colocaron las muestras para ser analizadas o
bien estas se encontraban en malas condiciones.
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En el caso particular de los resultados obtenidos en las mediciones de la muestra
problema, se puede observar que se encuentran dentro del rango de sensibilidad
que cita Fernandez (2002), por lo cual se descartan posibles problemas de
contaminación con detergentes que pudieran interferir en las lecturas de la
muestra problema.

Se realizó una estimación de una curva estándar ideal utilizando una relación
proporcional tomando como referencia el valor positivo (0.306) de absorbancia a
595nm obtenido para una concentración de 1 (mg/mL) de albumina.

Figura 3. Curva de calibración ficticia basada en la lectura positiva obtenida
experimentalmente

Se realizo un despeje de la ecuación obtenida para poder estimar la concentración
de la muestra problema a partir de la absorbancia.
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Ecuación 2
El análisis de regresión lineal es una técnica estadística utilizada para estudiar la
relación entre variables.
Cabe destacar que la estimación realizada no tiene validez estadística, debido a
que no se puede realizar una regresión lineal asumiendo una relación proporcional
y=mx+b con un solo valor como variable de respuesta.
Se compararon nuestros resultados con los obtenidos del estudio “Plasmid vectors
for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus
niger” donde realizan un ensayo Bradford debido a la dificultad para medir la
densidad óptica del hongo, ya que crece en estructuras complejas, son pesados y
unicelulares. Por lo tanto optaron por la medición de extractos de proteínas del
hongo.
Para el ensayo de Bradford realizaron una serie de diluciones estándar con
concentraciones conocidas de albúmina de suero bovino (BSA) se realizaron con
el fin de determinar las concentraciones de las proteínas.
(Storm, 2005)
9

Tabla 4. Tabla de concentraciones de la curva de calibración del estudio “Plasmid Vectors
for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger”
Standard µL standard µL dH
2
O Concentration
Std 1 300 µL stock 1200µL 2 mg/ml
Std 2 200 µL stock 1000µL 1,67mg/ml
Std 3 700 µL Std 1 700µL 1 mg/ml
Std 4 700 µL Std 2 700µL 0 mg/ml
Std 5 700 µL Std 3 700µL 0,5 mg/ml
Std 6 700 µL Std 4 700µL 0 mg/ml
Std 7 700 µL Std 5 700µL 0.25mg/ml
Std 8 700 µL Std 7 700µL 0,125mg/ml
Std 9 - 700µL 0 mg/ml
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Figura 4. Curva de calibración del estudio “Plasmid Vectors for protein production, gene
expression and molecular manipulations in Aspergilus niger”

Donde la ecuación despejada para conocer la concentración utilizando la
absorbancia de una muestra problema es la siguiente.


Ecuación 3



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Tabla 5. Comparación de los resultados obtenidos en el laboratorio con los obtenidos del
estudio “Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular
manipulations in Aspergilus niger”


Origen de la curva
estándar
Ecuación Obtenida Concentración
estimada de la
muestra problema
en mg/mL.
(Valor Promedio)
Curva obtenida en
el laboratorio.



R
2
=0.991
1.20
Curva ficticia
construida con el
valor de
absorbancia
positivo.


R
2
=1
1.433
Curva del
trabajo “Plasmid
vectors for protein
production, gene
expression and
molecular
manipulations in
Aspergillus niger”

R
2
=0.996

1.071
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Conclusiones

No es posible realizar una estimación correcta de la muestra problema con el
ajuste de la curva estándar obtenida, debido a que se obtuvieron valores de
absorbancia negativos y el numero de diluciones es muy reducida como para
realizar una curva estándar con validez estadística, sin embargo al hacer uso de la
curva estándar de (Storm, 2005)
9
, se logró estimar que la concentración de la
muestra problema es de 1.071 mg/mL.
Cuestionario

1. Menciona que rango de concentración de proteínas puedes detectar en el método
de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm.

El método de Lowry posee diversos grados de sensibilidad dependiendo de la
longitud de onda a la cual se analice la muestra (Badui, 1999).
A una longitud de onda de 550 nm el método presenta una baja sensibilidad
permitiendo así detectar únicamente concentraciones de proteínas elevadas
(Storch, 2000), el rango va de 100-2000 mg/mL o en su defecto, de 25 a 100 mg
de proteína (M. Walker, 2002)
A una longitud de onda de 750 nm el método presenta una alta sensibilidad por lo
que es posible detectar bajas concentraciones de proteína (Storch, 2000), para un
rango de concentraciones menores a 500 mg/mL o en su defecto, de 1 a 2 mg de
proteína
(M. Walker, 2002)
A una longitud de onda de 660 nm el método presenta su máximo de absorbancia
y por ende es la longitud de onda más empleada, pues pues incrementa el rango
de identificación de las proteínas (Hall, 1996), sin embargo, al no presentar la
misma sensibilidad que a 750 nm diversos compuestos no proteicos pueden
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interferir en la lectura. A esta longitud se puede detectar proteínas en un rango de
2 a 30 mg (Universidad del Quindio, 2010).

2. Menciona ventajas y desventajas en el uso del método de Lowry.

Ventajas
 Es más sensible que muchos métodos como el de Biuret (50-100
veces) o absorción de rayos UV a 280 nm (10-20 veces).
 Es más específico.
 Relativamente simple debido a que se puede llevar a cabo en un
tiempo corto.
 Es menos afectado por la turbiedad de la muestra

Desventajas
 El color varía con diferentes proteínas.
 El color no necesariamente es proporcional a la concentración de
proteínas.
 Puede tener interferencia con varios compuestos como lo son
azúcares reductores (Nielsen,2010).

3. Escribe el fundamento de los métodos de Bradford y el ácido bicinconínico (BCA)
utilizados en la determinación de la concentración de proteínas.

El método de Bradford se basa en la unión no covalente de la forma aniónica del
colorante Azul de Coomassie G-250 con la proteína. El colorante reacciona
principalmente con los residuos de Arginina, los cuales poseen una cadena
cargada positivamente, y tiene pequeñas interacciones con otros residuos básicos
(Histidina y Lisina) y residuos aromáticos (Tirosina, Triptófano y Fenilalanina). En
ausencia de proteína el colorante es de color rojo pálido y, una vez se une a la
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proteína, se forma una coloración azul con una absorbancia máxima a 590 nm a la
cual se realiza la lectura en el espectrofotómetro.

Figura 5. Estructura del azul de coomassie
(Mikkelsen & Cortón, 2004)

El método del ácido bicinconínico (BCA) es también conocido como el método de
Smith y se basa en el uso de este reactivo. El BCA en la forma de una sal de sodio
es soluble en agua, estable y altamente específico y un reactivo sensible a a iones
de

en solución alcalina. Es similar al método de Lowry en el sentido de que en
solución alcalina, , los enlaces peptídicos y los residuos de principalmente
Cisteína, Cistina, Triptófano y Tirosina reaccionan con los iones de

y los
reducen a

(Reacción de Biuret). Entonces el

forma un complejo con 2
moléculas de BCA para producir un color púrpura el cual es soluble en agua y
tiene una fuerte absorbancia a 562 nm.

Figura 6. Reacción del método del BCA
(Hall, 1996)

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4. Menciona que compuestos pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el ensayo
de Bradford.

Existen varios compuestos que pueden causar interferencia dependiendo de su
concentración y su efecto sobre el reactivo que ayuda en la cuantificación, sin
embargo, solo se han caracterizado algunos de ellos , por lo que solo se
mencionarán algunos de ellos.
Bradford;
 Detergentes iónicos y no iónicos (Triton y SDS) (Nielsen,2010).
 Tris
 Glicina
 Acetato de Sodio
 Bicarbonato de Sodio
 Glucosa
 Urea
 Azida de Sodio
 EDTA
 2-Mercaptoetanol
 Acido Ascórbico
 Acetona
 Etanol
 Metanol (Sigma,2012)
Lowry;
 Glucosa
 Sacarosa
 Sulfato de Amonio
 Tris
 Fosfato de Sodio
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 Glicina
 Urea
 Cloruro de Sodio
 Azida de Sodio
 Ácido clorhídrico
 Hidróxido de Sodio
 EDTA (Hall,1996)

Referencias

1. Fernández, E. (2002). Métodos para la cuantificación de proteínas.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de
Rabanales. España

2. Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,
Anal Biochem, 72, 248–254

3. Compton SJ and Jones CG (1985), Mechanism of dye response and
interference in the Bradford protein assay, Anal Biochem 151, 369–374

4. Fanger B (1987), Adaptation of the Bradford protein assay to membrane-
bound proteins by solubilizing in glucopyranoside detergents, Anal Biochem
162, 11–17

5. Fazekas St. Groth S et al. (1963), Two new staining procedures for
quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips, Biochim Biophys
Acta 71, 377–391

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6. Reisner AH et al. (1975), The use of Coomassie Brilliant Blue G-250
perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric
focusing on polyacrylamide gels, Anal Biochem 64, 509–516

7. Sedmak JJ and Grossberg SE (1977), A rapid, sensitive and versatile assay
for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 79, 544–
552

8. Spector T, (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein
quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or
equal to 0.5 to 50 micrograms of protein, Anal Biochem 86, 142–146

9. Storm R, et al. (2005), Plasmid vectors for protein production, gene
expression and molecular manipulations in Aspergillus niger, El Sevier,
Plasmid 53, 191–204

Referencias Cuestionario

1. Badui, S. (1999). Química de los Alimentos. México: Pearson Educación.
2. Hall, G. (1996). Methods of Testing Protein Functionality. Great Britain:
Chapman and Hall.

3. Fernández, E. (2002). Métodos para la cuantificación de proteínas.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de
Rabanales. España
4. M. Walker, J. (2002). The Protein Protocols Handbook. New Jersey:
Humana Press.

5. Mikkelsen, S., & Cortón, E. (2004). Bioanalytical Chemistry. New Jersey:
John Wiley & Sons.
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6. Nielsen, S. (2010). Food Analysis, 4th Edition. Indiana, USA: Springer.
7. Sigma. (s.f.). Bradford Reagent Technical Bulletin. Recuperado el 25 de
Abril de 2014, de
http://www.chem.uky.edu/courses/che554/1_Photometry/SigmaBulletin_b69
16bul.pdf
8. Storch, W. (2000). Inmunofluorescence in clinical inmunology: a primer and
atlas. Boston: Birkhauser.

9. Universidad del Quindio. (2010). Laboratorio de Bioquímica: una visión
práctica. Colombia: Universidad del Quindio.

10. Zor, T., & Selinger, Z. (1995). Linearization of the Bradford Protein Assay
Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies. Analytical
Biochemestry .