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Reporte Practica No.

8 Determinacion de la
concentracion de proteinas
Materia: Laboratorio de
Biotecnologa Molecular


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Unidad Profesional Interdisiplinaria de Ingenieria Campus Guanajuato





Ingeniera Biotecnolgica
Laboratorio de Biotecnologa Molecular
Practica 8.- Determinacin de la concentracin de proteinas
5BV1
27/04/2014
Hugo Ramrez Rodrguez 2011660475
Juan Cristbal Garca Garca 2012660213
Jos Gilberto Savi Tejeda 2012660319
Ricardo Rafael Marn Mosqueda 2010660234
Erick No Soto Martnez 2011660270


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concentracion de proteinas
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Resultados
Para estimar la concentracin de protenas presentes en una muestra problema
mediante el ensayo Bradford, se realizaron diluciones de un stock de albmina de
suero bovino (BSA) de 1mg/mL, estas diluciones se utilizaron para la construccin
de una curva estndar, leyendo las diluciones y la muestra problema a una
absorbancia de 595 nm.

Tabla 1. Lectura de Absorbancia para la curva de calibracin para la concentracin de
albumina
Concentracin de albumina (mg/mL) Absorbancia a 595nm
0.3157 -0.152
0.5 -0.057
1 0.306
Se realiz una regresin lineal con el software estadstico minitab 17 para la
construccin de una curva estndar.

Figura 1. Curva de calibracin para la concentracin de Albumina BSA
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Si se despeja la ecuacin de la recta obtenida es posible realizar una estimacin
de una muestra problema.
Ecuacin 1

La muestra problema se midi por triplicado en un espectrofotmetro UV a una
absorbancia de 595 nm, obteniendo los siguientes resultados.

Tabla 2. Lectura de absorbancia de la concentracin de la muestra probema
Muestra Problema Absorbancia a 595 nm por triplicado.
Lectura 1 0.435
Lectura 2 0.423
Lectura 3 0.458
Promedio 0.4387
Desviacin Estndar 0.0178

Discusin de Resultados


Tabla 3. Cuadro comparativo entre diversas tcnicas para la cuantificacin de protenas
Mtodo Ventajas Inconvenientes
Mtodos de
absorcin
No se pierden las muestras Interfieren muchos compuestos que absorben
en el UV



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Mtodo Ventajas Inconvenientes
Mtodos derivados Colorimtricos
Biuret Bastante especfico para
protenas.
Muestra con pocas
Interferencias.
Mtodo econmico.

Tiene poca sensibilidad.
Lowry Muy sensible
Menos afectado por la
turbidez.
Mtodo relativamente simple
se puede completar en 1 a
1.5 horas.

No todas las protenas reaccionan igual.
La muestra puede tener interferencias con
varios compuestos como detergentes no
inicos, sulfato de amonio etc.

Bradford Mtodo muy sensible a bajas
concentraciones de protena.

La muestra puede tener interferencias con
detergentes y soluciones bsicas.
BCA Es el mtodo mas sensible.
Es el que presenta menos
interferencias con la
muestra.
El color no es estable con el tiempo.
Los azcares reductores interfieren con la
reaccin.
La respuesta en la absorbancia no es lineal

Mtodos derivados Fluorimtricos
o-ftalaldehido Muy sensible Interferencia de aminas contaminantes en
la muestra
No todas las muestras reaccionan igual


(Fernandez, 2002)
1


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El ensayo de Bradford es un mtodo de determinacin de protena que consiste en
la unin del colorante Coomassie Brilliant Blue G- 250 a las protenas.
(Bradford, 1976)
2

El colorante existe en tres formas: catinico ( rojo) , neutro ( verde ), y aninico
(azul). En un medio cido, el colorante es predominantemente en forma catinica
roja doblemente protonado (Amax = 470nm) .
(Compton y Jones 1985)
3

Sin embargo , cuando el colorante se une a la protena, esta se convierte en una
forma no protonada azul estable ( Amax = 595 nm )
(Reisner et al.1975 , Fazekes de St. Groth et al . 1963 , Sedmack y Grossberg 1977)
4,5,7


Esta forma de protena - colorante azul es la que se detecta a 595 nm en el
ensayo utilizando un espectrofotmetro.

Spector (1978) encontr que el coeficiente de extincin de una solucin del
complejo del colorante con albmina BSA fue constante en una gama de
concentracin de 1 g/mL hasta 15g/mL de albmina BSA. Por lo tanto, la ley de
Beer se puede aplicar para la cuantificacin exacta de la protena mediante la
seleccin de una relacin adecuada de volumen de colorante para la
concentracin de la muestra. (Spector,1978)
8

Ciertos interacciones qumicas con el colorante pueden interferir con el ensayo. La
interferencia de compuestos no protenicos se debe a su capacidad de cambiar los
niveles de equilibrio del colorante entre las tres especies de colores. Las fuentes
conocidas de interferencia, tales como algunos detergentes, flavonoides, y
tampones bsicos de protenas, estabilizan el colorante neutro verde ya sea por la
unin directa con el colorante o por un cambio en el pH impidiendo la reaccin de
coloracin.
(Compton y Jones 1985, Fanger 1987)
3,4

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Figura 2.- Curva de calibracin para un ensayo Bradford donde se muestra la regin de
concentracin que mejor se comporta de acuerdo a la Ley de Lambert Beer.
Los valores de concentracin para realizar la curva de calibracin y de la muestra
problema no se encuentran dentro de la regin que mejor se comporta de acuerdo
a la Ley de Lambert Beer, por lo que es necesario un ajuste estadstico que mejor
se adapte a los resultados, por otro lado los resultados obtenidos para las
primeras dos mediciones de la curva de calibracin son valores negativos lo cual
indica un error.
Con lo mencionado, el presunto motivo por el cual se obtuvieron lecturas errneas
fue por la presencia de restos de detergentes en los materiales usados durante la
sesin, pudiendo estar principalmente contaminados los tubos de ensaye y
probablemente las celdas donde se colocaron las muestras para ser analizadas o
bien estas se encontraban en malas condiciones.
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En el caso particular de los resultados obtenidos en las mediciones de la muestra
problema, se puede observar que se encuentran dentro del rango de sensibilidad
que cita Fernandez (2002), por lo cual se descartan posibles problemas de
contaminacin con detergentes que pudieran interferir en las lecturas de la
muestra problema.

Se realiz una estimacin de una curva estndar ideal utilizando una relacin
proporcional tomando como referencia el valor positivo (0.306) de absorbancia a
595nm obtenido para una concentracin de 1 (mg/mL) de albumina.

Figura 3. Curva de calibracin ficticia basada en la lectura positiva obtenida
experimentalmente

Se realizo un despeje de la ecuacin obtenida para poder estimar la concentracin
de la muestra problema a partir de la absorbancia.
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Ecuacin 2
El anlisis de regresin lineal es una tcnica estadstica utilizada para estudiar la
relacin entre variables.
Cabe destacar que la estimacin realizada no tiene validez estadstica, debido a
que no se puede realizar una regresin lineal asumiendo una relacin proporcional
y=mx+b con un solo valor como variable de respuesta.
Se compararon nuestros resultados con los obtenidos del estudio Plasmid vectors
for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergillus
niger donde realizan un ensayo Bradford debido a la dificultad para medir la
densidad ptica del hongo, ya que crece en estructuras complejas, son pesados y
unicelulares. Por lo tanto optaron por la medicin de extractos de protenas del
hongo.
Para el ensayo de Bradford realizaron una serie de diluciones estndar con
concentraciones conocidas de albmina de suero bovino (BSA) se realizaron con
el fin de determinar las concentraciones de las protenas.
(Storm, 2005)
9

Tabla 4. Tabla de concentraciones de la curva de calibracin del estudio Plasmid Vectors
for protein production, gene expression and molecular manipulations in Aspergilus niger
Standard L standard L dH
2
O Concentration
Std 1 300 L stock 1200L 2 mg/ml
Std 2 200 L stock 1000L 1,67mg/ml
Std 3 700 L Std 1 700L 1 mg/ml
Std 4 700 L Std 2 700L 0 mg/ml
Std 5 700 L Std 3 700L 0,5 mg/ml
Std 6 700 L Std 4 700L 0 mg/ml
Std 7 700 L Std 5 700L 0.25mg/ml
Std 8 700 L Std 7 700L 0,125mg/ml
Std 9 - 700L 0 mg/ml
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Figura 4. Curva de calibracin del estudio Plasmid Vectors for protein production, gene
expression and molecular manipulations in Aspergilus niger

Donde la ecuacin despejada para conocer la concentracin utilizando la
absorbancia de una muestra problema es la siguiente.


Ecuacin 3



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Tabla 5. Comparacin de los resultados obtenidos en el laboratorio con los obtenidos del
estudio Plasmid Vectors for protein production, gene expression and molecular
manipulations in Aspergilus niger


Origen de la curva
estndar
Ecuacin Obtenida Concentracin
estimada de la
muestra problema
en mg/mL.
(Valor Promedio)
Curva obtenida en
el laboratorio.



R
2
=0.991
1.20
Curva ficticia
construida con el
valor de
absorbancia
positivo.


R
2
=1
1.433
Curva del
trabajo Plasmid
vectors for protein
production, gene
expression and
molecular
manipulations in
Aspergillus niger

R
2
=0.996

1.071
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Conclusiones

No es posible realizar una estimacin correcta de la muestra problema con el
ajuste de la curva estndar obtenida, debido a que se obtuvieron valores de
absorbancia negativos y el numero de diluciones es muy reducida como para
realizar una curva estndar con validez estadstica, sin embargo al hacer uso de la
curva estndar de (Storm, 2005)
9
, se logr estimar que la concentracin de la
muestra problema es de 1.071 mg/mL.
Cuestionario

1. Menciona que rango de concentracin de protenas puedes detectar en el mtodo
de Lowry, si la muestra se lee a una longitud de onda de 500, 660 y 750 nm.

El mtodo de Lowry posee diversos grados de sensibilidad dependiendo de la
longitud de onda a la cual se analice la muestra (Badui, 1999).
A una longitud de onda de 550 nm el mtodo presenta una baja sensibilidad
permitiendo as detectar nicamente concentraciones de protenas elevadas
(Storch, 2000), el rango va de 100-2000 mg/mL o en su defecto, de 25 a 100 mg
de protena (M. Walker, 2002)
A una longitud de onda de 750 nm el mtodo presenta una alta sensibilidad por lo
que es posible detectar bajas concentraciones de protena (Storch, 2000), para un
rango de concentraciones menores a 500 mg/mL o en su defecto, de 1 a 2 mg de
protena
(M. Walker, 2002)
A una longitud de onda de 660 nm el mtodo presenta su mximo de absorbancia
y por ende es la longitud de onda ms empleada, pues pues incrementa el rango
de identificacin de las protenas (Hall, 1996), sin embargo, al no presentar la
misma sensibilidad que a 750 nm diversos compuestos no proteicos pueden
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interferir en la lectura. A esta longitud se puede detectar protenas en un rango de
2 a 30 mg (Universidad del Quindio, 2010).

2. Menciona ventajas y desventajas en el uso del mtodo de Lowry.

Ventajas
Es ms sensible que muchos mtodos como el de Biuret (50-100
veces) o absorcin de rayos UV a 280 nm (10-20 veces).
Es ms especfico.
Relativamente simple debido a que se puede llevar a cabo en un
tiempo corto.
Es menos afectado por la turbiedad de la muestra

Desventajas
El color vara con diferentes protenas.
El color no necesariamente es proporcional a la concentracin de
protenas.
Puede tener interferencia con varios compuestos como lo son
azcares reductores (Nielsen,2010).

3. Escribe el fundamento de los mtodos de Bradford y el cido bicinconnico (BCA)
utilizados en la determinacin de la concentracin de protenas.

El mtodo de Bradford se basa en la unin no covalente de la forma aninica del
colorante Azul de Coomassie G-250 con la protena. El colorante reacciona
principalmente con los residuos de Arginina, los cuales poseen una cadena
cargada positivamente, y tiene pequeas interacciones con otros residuos bsicos
(Histidina y Lisina) y residuos aromticos (Tirosina, Triptfano y Fenilalanina). En
ausencia de protena el colorante es de color rojo plido y, una vez se une a la
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protena, se forma una coloracin azul con una absorbancia mxima a 590 nm a la
cual se realiza la lectura en el espectrofotmetro.

Figura 5. Estructura del azul de coomassie
(Mikkelsen & Cortn, 2004)

El mtodo del cido bicinconnico (BCA) es tambin conocido como el mtodo de
Smith y se basa en el uso de este reactivo. El BCA en la forma de una sal de sodio
es soluble en agua, estable y altamente especfico y un reactivo sensible a a iones
de

en solucin alcalina. Es similar al mtodo de Lowry en el sentido de que en


solucin alcalina, , los enlaces peptdicos y los residuos de principalmente
Cistena, Cistina, Triptfano y Tirosina reaccionan con los iones de

y los
reducen a

(Reaccin de Biuret). Entonces el

forma un complejo con 2


molculas de BCA para producir un color prpura el cual es soluble en agua y
tiene una fuerte absorbancia a 562 nm.

Figura 6. Reaccin del mtodo del BCA
(Hall, 1996)

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4. Menciona que compuestos pueden interferir en el ensayo de Lowry y en el ensayo
de Bradford.

Existen varios compuestos que pueden causar interferencia dependiendo de su
concentracin y su efecto sobre el reactivo que ayuda en la cuantificacin, sin
embargo, solo se han caracterizado algunos de ellos , por lo que solo se
mencionarn algunos de ellos.
Bradford;
Detergentes inicos y no inicos (Triton y SDS) (Nielsen,2010).
Tris
Glicina
Acetato de Sodio
Bicarbonato de Sodio
Glucosa
Urea
Azida de Sodio
EDTA
2-Mercaptoetanol
Acido Ascrbico
Acetona
Etanol
Metanol (Sigma,2012)
Lowry;
Glucosa
Sacarosa
Sulfato de Amonio
Tris
Fosfato de Sodio
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Glicina
Urea
Cloruro de Sodio
Azida de Sodio
cido clorhdrico
Hidrxido de Sodio
EDTA (Hall,1996)

Referencias

1. Fernndez, E. (2002). Mtodos para la cuantificacin de protenas.
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de
Rabanales. Espaa

2. Bradford MM (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding,
Anal Biochem, 72, 248254

3. Compton SJ and Jones CG (1985), Mechanism of dye response and
interference in the Bradford protein assay, Anal Biochem 151, 369374

4. Fanger B (1987), Adaptation of the Bradford protein assay to membrane-
bound proteins by solubilizing in glucopyranoside detergents, Anal Biochem
162, 1117

5. Fazekas St. Groth S et al. (1963), Two new staining procedures for
quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips, Biochim Biophys
Acta 71, 377391

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6. Reisner AH et al. (1975), The use of Coomassie Brilliant Blue G-250
perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric
focusing on polyacrylamide gels, Anal Biochem 64, 509516

7. Sedmak JJ and Grossberg SE (1977), A rapid, sensitive and versatile assay
for protein using Coomassie Brilliant Blue G-250, Anal Biochem 79, 544
552

8. Spector T, (1978) Refinement of the Coomassie blue method of protein
quantitation. A simple and linear spectrophotometric assay for less than or
equal to 0.5 to 50 micrograms of protein, Anal Biochem 86, 142146

9. Storm R, et al. (2005), Plasmid vectors for protein production, gene
expression and molecular manipulations in Aspergillus niger, El Sevier,
Plasmid 53, 191204

Referencias Cuestionario

1. Badui, S. (1999). Qumica de los Alimentos. Mxico: Pearson Educacin.
2. Hall, G. (1996). Methods of Testing Protein Functionality. Great Britain:
Chapman and Hall.

3. Fernndez, E. (2002). Mtodos para la cuantificacin de protenas.
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de
Rabanales. Espaa
4. M. Walker, J. (2002). The Protein Protocols Handbook. New Jersey:
Humana Press.

5. Mikkelsen, S., & Cortn, E. (2004). Bioanalytical Chemistry. New Jersey:
John Wiley & Sons.
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6. Nielsen, S. (2010). Food Analysis, 4th Edition. Indiana, USA: Springer.
7. Sigma. (s.f.). Bradford Reagent Technical Bulletin. Recuperado el 25 de
Abril de 2014, de
http://www.chem.uky.edu/courses/che554/1_Photometry/SigmaBulletin_b69
16bul.pdf
8. Storch, W. (2000). Inmunofluorescence in clinical inmunology: a primer and
atlas. Boston: Birkhauser.

9. Universidad del Quindio. (2010). Laboratorio de Bioqumica: una visin
prctica. Colombia: Universidad del Quindio.

10. Zor, T., & Selinger, Z. (1995). Linearization of the Bradford Protein Assay
Increases Its Sensitivity: Theoretical and Experimental Studies. Analytical
Biochemestry .

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