ApostilaNectEssencial Rev 03

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Essencial

Autores
M. Sc. Fernanda Raquel Sartor
M. Sc. Rafael Fonsca Zanotti

Viosa-MG 2012

Essencial

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Mdulo 1
1. Organizao de um laboratrio de Cultura de Tecidos e
Biofbrica
1.1 Distribuio e identificao das salas
1.2 Armazenamento dos reagentes
1.3 Organizao das vidrarias
2. Uso e importncia dos principais equipamentos na Cultura de
Tecidos
2.1 Autoclave
2.2 Destilador
2.3 Desionizador
2.4 Cmara ou capela de fluxo
2.5 Balana
2.6 pHmetro
2.7 Capela exausto
3. Boas prticas no laboratrio de cultura de tecidos
3.1 Assepsia
3.2 EPI
3.3 Manipulao do material vegetal no fluxo

Mdulo 2
1. Principais riscos e dificuldades na cultura de tecidos
1.1 Declnio de Vigor
1.2 Contaminao
1.3 Oxidao Fenlica
1.4 Variao Somaclonal
1.5 Hiperhidricade
1.6 Temperatura e Iluminao

Mdulo 3

1. Identificao dos reagentes
2. Princpios SI (Sistema internacional de unidades)
3. Qumica para cultura de tecidos- Preparo das solues estoque
3.1. Preparo das solues de NaOH e HCl
3.2. Soluo de micronutrientes, macronutrientes, vitaminas, Fe-
EDTA, dos meios de cultura JADS, MS e WPM.
3.3 Auxina
3.4 Citocinina
4. Preparo dos meios de cultura MS, WPM e JADS
5. Reguladores de crescimento
5.1. Importncia das auxinas
5.2. Importncia das citocininas

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Histrico da Cultura de Tecidos Vegetais

Um histrico sucinto, visando oferecer uma idia das bases e da evoluo
da cultura de tecidos vegetais.
Em 1838, Schleiden e Schwann levantaram a hiptese de que toda
clula tinha capacidade de gerar um indivduo
Em 1892, Sachs definiu que as plantas sintetizam substncias
capazes deformar rgos e que apresentam distribuio de forma
polar
Em 1902, Haberdandt tentou demonstrar a totipotencialidade das
clulas das plantas, a partir de material maduro, e obteve pouca
expanso, porm no conseguiu diviso celular. O
desconhecimento dos reguladores de crescimento contribuiu para
este insucesso
Em 1904, Hanning foi o primeiro a cultivar embries imaturos de
crucferas in vitro com sucesso
Em 1922, Robbins e Kotte mantiveram, com sucesso, razes de
gramneas em meio de cultura
Em 1925, Laibach aplicou o cultivo de embries a cruzamentos
interespecficos de Linum.
Os progressos na cultura de tecidos s foram possveis a partir da dcada
de 30.
Em 1934, White manteve o crescimento de pices de razes de
tomate, em meio lquido, por um perodo ilimitado. Neste mesmo
ano, Kogh et al. identificaram o primeiro fitohormnio, a auxina,
cido indolilactico
Em 1939 Gautheret e Nocourt estabeleceram um protocolo para a
manuteno de cultura de calo de cenoura. Neste mesmo ano,
White conseguiu manter calo de fumo em meio contendo AIA
Outros mritos no avano das tcnicas de cultivo in vitro so
devidos s observaes de Van Overbeek et al. (1941) que
promoveram a diferenciao e o crescimento de calo a partir de
embries de Datura stramonium, pela incluso deleite de coco no
meio de cultivo
Em 1946, Ball regenerou plantas de Lupinus e Tropaelum, a partir
de pices caulinares
Em 1948, Skoog e Tsui demonstraram a regulao qumica da
formao da parte area e raiz, em calo de fumo
Em 1952, Sussex e Steve, trabalhando com primrdio foliar,
observaram que este originava uma planta. Neste mesmo ano, a
suplementao do meio de cultura com auxina e leite de coco
permitiu que Steward e Caplin (1952) obtivessem formao de
calo em diversas espcies de plantas
Tambm em 1952, Morel e Martin recuperaram plantas de dlia
livres de Vrus do Mosaico pela cultura de pices caulinares
Em 1953, Tulecke obteve calo haplide a partir do cultivo de
plen de Gingko biloba
No perodo de 1953 a 1954, Muir observou que clulas colocadas
em meio de cultura continuavam se multiplicando

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Em 1954, Muir et al. obtiveram a primeira planta, a partir de uma
clula isolada
Com a descoberta da cinetina (primeira citocinina) por Miller et
al. (1955), foi possvel demonstrar-se que a diferenciao da parte
area, raiz ou ambos, em calo de fumo, era regulada pelo balano
hormonal auxina/citocinina. A partir desta descoberta houve
grandes avanos no estudo da cultura de tecidos vegetais
Em 1958, Wickson e Thimann observaram que quando se
aplicava cinetina a uma gema terminal ou lateral dormente, esta
saa da dormncia
No mesmo ano, Reinert e Steward et al. (1958) obtiveram
formao de embries somticos a partir de calo de cenoura, e
Maheswari e Rangaswamy estudaram a cultura de ncelos e a
regenerao de embries somticos em Citrus
Em 1959, Melchers e Bergmann constataram uma variao na
ploidia com o avano do tempo em que o explante permanecia no
meio de cultura
Em 1960, Morel recuperou cultivares de orqudeas livres de vrus,
mediante cultura de meristemas, trabalhando com pice caulinar
(meristema + primrdio foliar + poro inferior ao primrdio
foliar) demonstrando a potencialidade das aplicaes comerciais
da micropropagao
O mtodo de isolamento de protoplastos de plantas com enzima
de degradao da parede celular foi desenvolvido por Cocking
(1960)
Murashige e Skoog elaboraram, em 1962, o meio de cultura
conhecido universalmente, denominado meio MS
Tambm em 1962 Kanta et al. Obtiveram sucesso na polinizao
in vitro de Papaver somniferum. vulos isolados eram colocados
em cultura e, em seguida, gros de plen eram depositados sobre
os mesmos, ocorrendo o desenvolvimento do tubo polnico, a
fecundao, a formao do embrio e, posteriormente, a obteno
de sementes
J em 1965, Aghion-Prat induziu a florao in vitro em tecidos de
fumo
Em 1966, Guha e Maheswari foram os pioneiros na induo de
andrognese in vitro em Datura, a partir de gros de plen,
mediante cultura de anteras
Smith e Murashige obtiveram, em 1970, a formao de plantas
pela cultura de meristemas propriamente dito (poro distal ao
mais novo primrdio foliar)
O mtodo de excluso de viroses e virides em plantas de Citrus
foi desenvolvido por Murashige et al. (1972) e consistia na
garfagem de pices caulinares (meristemas com dois primrdios
foliares) em porta-enxerto in vitro
Neste mesmo ano, Carlson et al. (1972) comunicaram a primeira
fuso de protoplastos, obtida em Nicotiana
Em 1974, Reinhard iniciou estudos sobre a biotransformao de
tecidos vegetais e Zaenen et al. descobriram que o plasmdio Ti
o princpio indutor de tumores de Agrobacterium, uma bactria

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de grande importncia na transformao gentica em protoplastos
vegetais
Em 1978, Melchers et al. conseguiram hbridos somticos entre
batata e tomate
Em 1982, Krens et al. alcanaram a incorporao de DNA isolado
por protoplastos, tornando possvel a transformao de clulas
vegetais a partir de um DNA isolado
Neste mesmo ano, Zimmermann obteve a fuso de protoplastos,
atravs de estmulo eltrico
Em 1985, Horsch et al. obtiveram a infeco e a transformao
gentica de disco foliar de tabaco com Agrobacterium, bem como
a regenerao das plantas transformadas
No Brasil, os trabalhos pioneiros com cultura de tecidos foram
desenvolvidos no Instituto Biolgico, na dcada de 1950
A primeira equipe de cultura de tecidos foi formada em 1971, na
ESALQ, em Piracicaba, SP
Entre 1975 e 1980 foram criados os laboratrios da Universidade
de Campinas, do Instituto Agronmico de Campinas e da
EMBRAPA
Atualmente, a maioria das instituies tem laboratrio nesta rea,
trabalhando com diferentes metodologias de manipulao de
plantas in vitro.

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Mdulo 1

1. Organizao de um laboratrio de Cultura de Tecidos e
Biofbrica

Um laboratrio de cultura de tecidos no deve ser localizado em
ambientes sujeitos a poeira e a corrente de ar nem prximo a fontes
potenciais de microrganismos ou contaminao qumica, j que o cultivo
in vitro de clulas, tecidos ou rgos vegetais se caracteriza por se
realizar em condies asspticas. O interior do recipiente de cultivo deve
estar livre de qualquer organismo capaz de proliferar e afetar o
desenvolvimento do material vegetal, da a importncia de se manter o
ambiente estril durante o processo.
Em um laboratrio de cultura de tecidos, todas as atividades realizadas
devem ser realizadas assepticamente, com temperatura e iluminao
controladas, esses fatores so essenciais para que se obtenha sucesso em
qualquer trabalho ligado a produo in vitro. A padronizao das
condies ambientais em um laboratrio proporciona confiabilidade nos
resultados e menor porcentagem de perda de material, j que estes fatores
podem ser regulados para que se obtenha uma condio tima para o
desenvolvimento do material vegetal.
Este tipo de laboratrio tem algumas particularidades que o
distinguem dos demais. A implantao e organizao dependem de sua
finalidade e do nmero de pessoas que nele vo trabalhar; assim, um
laboratrio destinado exclusivamente micropropagao com base em
protocolos estabelecidos, tende a ser maior, porm mais simples em
instalaes e equipamentos que um laboratrio destinado pesquisa com
diferentes sistemas ou, ainda, com aspectos bioqumicos, genticos e
estruturais, entre outros; pode ser pequeno, porm, mais especializado.
Um laboratrio de pesquisa pode, tambm, ter finalidade didtica.

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1.1 Distribuio e identificao das salas

Um laboratrio deve ser compartimentado, pois desta forma evita
contaminao do ambiente e do material. Atividades que lidam com
material contaminado e sujo devem ser separadas das atividades com
materiais esterilizados e que necessitam de ambiente assptico. As
instalaes no laboratrio devem seguir ruma seqncia natural, de tal
forma que procedimentos sucessivos sejam realizados lado a lado. Isso
certamente economizar tempo e trabalho, resultado tambm em
economia financeira.
As atividades dentro de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais
devem ser distribudas em salas, sempre na ordem em que forem
realizadas. Desta forma, sugere-se um laboratrio com as seguintes
composies (Figura 1).

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Figura 1: exemplo de planta baixa de um laboratrio de cultura de
tecidos.

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Sala de limpeza: o local para descarte de meios de cultura, lavagem de
vidraria, utenslios diversos e autoclavagem de gua. Deve conter
bancada, armrios e prateleiras para estocagem de material, pias fundas,
autoclave, destilador, desionizador, lavador de pipetas, forno de micro-
ondas, estufa de secagem de vidrarias, escorredor de vidrarias e
eletricidade para 110 e 220 volts. A assepsia desta sala baixa, devido s
suas atividades, por isso ela deve ficar distante da sala de transferncia.

Sala de preparo: local para preparo de meios de cultura e de solues. a
sala de maior circulao de pessoal. Deve ser equipada com armrios,
estante para estocagem de vidraria, pia, geladeira, freezer, balana,
pHmetro, agitador magntico e eletricidade para 110 e 220 volts.

Sala de transferncia ou inoculao: local onde se manipula
assepticamente o material vegetal, sendo exclusiva para a capela de fluxo
e estantes que auxiliam na estocagem temporria dos meios de cultura e
outros materiais j autoclavados, destinados ao uso imediato. A
circulao de pessoas deve ser restrita; uma pequena janela de vidro na
porta interessante para que o seu interior possa ser visualizado; deve-se
evitar ao mximo a abertura freqente enquanto o manipulador estiver
trabalhando.

Sala de cultura ou de crescimento: local destinado ao crescimento in vitro
do material inoculado. Necessita de estantes com prateleiras, cada
prateleira deve ser iluminada individualmente com no mnimo 2 fileiras
de lmpadas fluorescentes. Um armrio ou um pano preto so teis para
as culturas que precisam se desenvolver no escuro.

Instalaes de apoio: a ltima etapa na cultura de tecidos vegetais a
aclimatao das plantas, corresponde etapa na qual as plantas tm de se
adaptar ao ambiente externo. Para isso, necessria uma rea externa,
como cmara de nebulizao ou telado onde as plantas tero um
ambiente controlado e que pode ser modificado, para que o material
vegetal se adapte vagarosamente ao ambiente natural.

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1.2 Armazenamento dos reagentes
O armazenamento de substncias qumicas deve ser organizado de
forma a se obter uma disposio adequada dos reagentes para no gerar
acidentes e evitar compras desnecessrias.
O grande nmero de problemas de estocagem em laboratrio
qumico deve-se diversidade de reagentes que devem ser armazenados.
A estocagem sem as especificaes de produtos qumicos associadas com
a falta de planejamento e controle propicia acidentes pessoais e danos
materiais (GOBBI, 2006).
Diferentemente do estoque de qualquer material, critrios rgidos
devem ser seguidos para a armazenagem de produtos qumicos (Figura
2). Este tipo de armazenamento deve-se levar em considerao o tipo de
produto a ser armazenado: volteis, corrosivos, txicos inflamveis,
explosivos e peroxidveis, assim como a incompatibilidade qumica
(OLIVEIRA et al., 2007).

Figura 2: armazenamento de reagentes.

Os reagentes no podem ser guardados de uma forma aleatria ou
por ordem alfabtica, pois, nesse caso, estaro sendo desrespeitadas
incompatibilidades. Abaixo alguns itens que devem ser tratados com
muita ateno:

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Precisa existir um almoxarifado para o armazenamento de
estoques de reagentes. Este ambiente deve ser projetado
com interruptores e lmpadas que no provoquem fascas, o
piso tambm deve ser adequado antiderrapante.
Transportes de reagentes sempre feito por meio de
carrinhos.
No laboratrio os reagentes so guardados em armrios
adequados, com prateleiras ajustveis e quando necessrio
revestidas.
Os frascos dos reagentes devem estar dispostos de modo a
facilitar o acesso queles usado com maior freqncia.
Frascos pesado no so guardados em prateleiras altas.
Solventes volteis e inflamveis so guardados em armrios
refrigerados ou com exausto adequada.
Preferencialmente os armrios devem possuir uma altura
que dispense o uso de escadas.
Os frascos devem sempre ser fechados hermeticamente ao
serem guardados.
Sempre deve ser retirado o lacre o frasco, para evitar
acmulo de umidade.
Observar sempre no rtulo da embalagem a temperatura
ideal para o armazenamento do reagente.
Temperatura ambiente = balco
Observar sempre se h necessrio guardar na geladeira ou
freezer.
DI CA: numere os frascos dos reagentes e faa uma lista de consulta,
assim muito mais fcil encontr-lo!!

1.3 Organizao das vidrarias

Alm de equipamentos e infra-estrutura, outros utenslios como
vidrarias e materiais so muito utilizados dentro de um laboratrio de
cultura de tecidos.

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Os frascos para o cultivo in vitro so essenciais para a manuteno das
condies asspticas do ambiente. Esses frascos tm que ser
transparentes e autoclavveis, de vidro ou plstico. Podem ser utilizados
desde tubos de ensaio e frascos prprios para cultura de tecidos at
frascos de alimentos e conserva, reutilizados, de tamanhos e formatos
variados. importante que os frascos possuam tampas que permitam
trocas gasosas entre o ambiente interno e o externo ao tubo ou frasco.
Mas importante verificar que as tampas no permitam a contaminao
de meio nutritivo (Figura 3).

Para o preparo das solues, so utilizados bqueres, erlenmeyers,
provetas, pipetas, placas de Petri, bastes de vidro, bales volumtricos
entre outros.
Aconselha-se dispor de bqueres e erlenmeyers com capacidade
variando entre 25 a 2000 mL e provetas de 10 a 2000 mL (Figura 4).

Figura 3: frascos para cultivo.

Figura 4: vidrarias

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O acondicionamento das vidrarias deve ser feito de modo que
facilite o acesso.
Sempre guardar vidrarias de maior volume no fundo dos
balces, para que na hora de peg-las no esbarre e quebre as
da frente.
Todas as vidrarias devem ser guardadas com a boca tampada,
com plstico PVC ou papel alumnio.
Vidrarias de plstico so to teis e eficientes quanto as de
vidro.
Bales volumtricos, provetas e pipetas no podem ser secas
em estufa.

2. Uso e importncia dos principais equipamentos na
Cultura de Tecidos

Os equipamentos so utilizados para reunir dados, aferio,
calibrao e tambm como ferramenta por fazer parte da metodologia
ou ambiente do trabalho. Antes de ligar um equipamento e tentar
manuse-lo indispensvel leitura do manual de instrues.

2.1 Autoclave
Para que serve? Utilizada para esterilizao de meios de cultura,
vidraria, gua e outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco
ou calor mido, que mais eficiente para a esterilizao. A temperatura
ideal de trabalho fica em 121C. Pode ser horizontal ou vertical (Figura
5).
Como funciona? O processo de autoclavagem consiste em manter o
material contaminado em contato cm o vapor de gua em temperatura
elevada, por um perodo de tempo suficiente para matar todos os
microorganismos. A autoclave formada por um cilindro metlico
resistente, vertical ou horizontal, onde geralmente fica a resistncia que
aquecer a gua. Possui uma tampa que permite fech-la hermeticamente.
Em cima da tampa esto as vlvulas ou botes de segurana e de ar.
Apresenta tambm uma chave de comando para controlar a temperatura e
um registro indicador de temperatura e presso.

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I MPORTANTE: Todo material deve estar rigorosamente limpo para que
depois seja acondicionado em pacotes e levados autoclave. Esses
pacotes devem ser feitos de material que permita a passagem do vapor.
CUI DADOS!!
1. No utilizar recipientes fechados;
2. Pode danificar itens de plstico e borracha;
3. Pode corroer itens metlicos e no inoxidveis;
4. O equipamento requer limpeza, manuteno e testes biolgicos
peridicos.

2.2 Destilador
Para que serve? utilizado para eliminao de sais mineiras da
gua (Figura 6). Para uma maior pureza da gua, recomenda-se sua
utilizao juntamente com o desionizador.
Como funciona? Quando a gua atinge a temperatura de 100C,
bactrias vrus e outros organismos que possam estar presentes so
mortos. A gua fervente se converte em vapor, eliminando todos os
slidos dissolvidos, toxinas qumicas, metais pesados e outros
contaminantes. O vapor sobe pela serpentina de condensao, aps ser
resfriada pelo ventilador de ar, a gua condensa em gotas de pura gua
destilada. A gua destilada, depois passa pelo filtro de carvo ativado
eliminando assim traos de sabor e odor. A gua pura coletada e

Figura 5: Modelos
de autoclaves

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acondicionada geralmente em barriletes plsticos. Este processo retira a
gua das impurezas e no as impurezas da gua.

2.3 Desionizador
Para que serve? Deve ser instalado logo aps o destilador. Auxilia
na eliminao de ons (Figura 7).
Como funciona? Depois de destilada a gua passa por colunas de
resinas, uma aninica e outra catinica, as quais removem todos os ons.
O Desionizador remove os sais minerais produzindo gua quimicamente
pura com condutividade equivalente da gua bi-destilada.

2.4 Cmara ou capela de fluxo
Para que serve? Utilizada para realizar trabalhos de manipulao
assptica.
Como funciona? Funciona forando a passagem de ar por meio de
um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril no
interior da capela. No deve ser colocada em frente a porta, ventilador ou
Figura 6: destilador de
gua e barrilete.

Figura 7: desionizador

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aparelho ar condicionado, para evitar entrada de ar contaminado durante
o uso. As capelas possuem lmpadas ultravioleta que, ligadas cerca de 20
minutos antes de se iniciar o trabalho, esterilizam o ambiente (Figura 8).

ATENO!!!
Lmpadas ultravioleta causam graves queimaduras!
Nunca utilize a capela com a UV ligada!
Ao ligar a lmpada, coloque um aviso da porta para que ningum
se exponha acidentalmente!

2.5 Balana
Imprescindvel para a pesagem de reagentes, no preparo de solues
e dos meios de cultura. Para quantidades menores, h a necessidade de
uma balana de preciso. Um laboratrio de cultura de tecidos vegetais,
mesmo que pequeno, necessita de uma balana de preciso (Figura 9).

2.6 tro

Figura 8: Cmara ou
capela de fluxo.

Figura 9: Balanas de
preciso.

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2.6 pHmetro
Para que serva? Utiliza-se para medir a quantidade de pH em
amostras, substncias ou solues (Figura 10).
Como funciona? um eletrodo acoplado a um potencimetro
(medido de diferena de potencial). Ao ser submerso na amostra, o
eletrodo do pHmetro gera milivolts, que por meio do milivolmetro, so
transformados em uma escala de pH.

2.7 Capela exausto
Capela de exausto de gases um gabinete ventilado, que elimina
vapores txicos e odores durante a manipulao de reagentes em um
laboratrio (Figura 11). A capela de exausto de gases um equipamento
de segurana para o operador e tambm para o meio ambiente.

3 Boas prticas no laboratrio de cultura de tecidos

3.1 Assepsia
Para que se tenha sucesso em qualquer procedimento na cultura de
tecidos, se faz necessrio:
Manipulao correta do material vegetal

Figura 10: pHmetro

Figura 11: capela de
exausto

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Assepsia de todos os materiais e instrumentos utilizados
Limpeza da sala de inoculao
Limpeza da cmara de fluxo
Jaleco limpo
Unhas cortadas e limpas
Cabelo curto, preso ou uso de toucas

Na limpeza das salas usa-se soluo de hipoclorito de sdio, a
assepsia das mos feita com lcool 70%.

Tambm entendido como assepsia ou esterilizao, a limpeza que
se faz nos materiais utilizados (vegetal e manipulao). Esta entendida
como um conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de
microrganismos (bactrias, fungos filamentosos, leveduras etc). A
respeito de como evitar microrganismos que possam contaminar o
explante, inevitvel o uso de antisspticos, sejam estes bacteriostticos
ou germicidas. Esses antisspticos podem ser antibiticos ou de outra
natureza, como lcoois (lcool etlico); halognios (hipoclorito de sdio);
sais de metais pesados (bicloreto de mercrio), fungicidas orgnicos etc.
Em relao vidraria e aos meios de cultura, estes devem ser
esterilizados para que se destruam todos os microrganismos, por calor
seco (forno, ar quente) ou mido (autoclave). Pinas bisturis e demais
utenslios metlicos para a manipulao do tecido podem ser esterilizados
por flambagem direta, como por exemplo: lamparina com lcool ou bico
de Bunsen na cmara de fluxo, ambiente este axnico (livre de germes)
portanto, adequado para o trabalho in vitro.

3.2 EPI
Todo e qualquer trabalho a ser desenvolvido dentro de um
laboratrio apresenta riscos, seja por produtos qumicos, chama,
eletricidade ou imprudncia do prprio usurio, que pode resultar em
danos materiais ou acidentes pessoais, que podem acontece quando
menos se espera.

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Prevenir acidentes dever de cada um, portanto trabalhe com calma,
cautela, dedicao e bom senso, seguindo sempre as recomendaes aqui
descritas, desta forma prevenindo e/ou minimizando os efeitos nefastos
resultantes dos possveis acidentes. Fique atento :

Armazenamento apropriado de reagentes e resduos
laboratoriais;
Formas adequadas de descarte de resduos laboratoriais;
Formas de preveno de acidentes;
Utilizao correta de equipamentos, como microscpios e
balanas;
Utilizao de extintores;
Procedimentos gerais recomendados em casos de acidentes.

Regras gerais que nunca devem ser esquecidas:

1. Apenas permitida a entrada de pessoas autorizadas no laboratrio ou
salas de preparo;
2. Nunca trabalhar sozinho no laboratrio. conveniente faz-lo durante
o perodo em que h fluxo de pessoas;
3. Usar o jaleco de algodo e preferivelmente com mangas compridas,
sempre que estiver dentro de um laboratrio, mesmo que no esteja
trabalhando;
4. Utilizar os equipamentos de proteo individual (luvas, touca,
mscara, etc) de acordo com a necessidade;
5. No permitido beber, comer, fumar ou aplicar cosmticos dentro do
laboratrio, em decorrncia do alto risco de contaminao;
6. Utilizar roupas e calados adequados que proporcionem maior
segurana, tais como: calas compridas e sapatos fechados;
7. Tomar os devidos cuidados com os cabelos, mantendo-os presos e/ou
uso de touca;
8. Manter sempre limpo o local de trabalho, evitando obstculos que
possam dificultar os procedimentos;

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9. No trabalhar com material imperfeito, principalmente vidros que
tenham arestas cortantes. Todo material quebrado deve ser
desprezado;
10. No deixar sobre a bancada, vidros quentes e frascos abertos;
11. Quando deixar algum equipamento quente na bancada colocar aviso;
12. Utilizar culos de segurana quando se fizer necessrio;
13. Usar luvas apropriadas durante a manipulao de objetos quentes e de
substncias que possam ser absorvidas pela pele (corrosivas, irritantes,
cancergenas, txicas ou nocivas);
14. Caso voc tenha alguma ferida exposta, esta deve estar devidamente
protegida.

Primeiros socorros em laboratrio

muito importante que sejam conhecidos os procedimentos de
segurana que devem ser usados quando ocorrem determinados
acidentes. Por esse motivo enumeraremos aqui os acidentes que podem
ocorrer com maior freqncia em laboratrios e quais as providncias
que devem ser tomadas imediatamente.
de vital importncia conhecer a localizao das pessoas e
equipamentos necessrios quando o acidente exigir assistncia
especializada.
Nmeros de telefones, como os de ambulncia, bombeiros, posto
mdico, hospital e mdico mais prximos, devem estar visveis e
facilmente acessveis ao responsvel pelo laboratrio.

Queimaduras
Pessoas com queimaduras profundas podem correr srio risco de
vida. Quanto maior a extenso, maiores os perigos para a vtima. Existem
diferentes graus de leso. Leve em conta que uma pessoa pode
apresentar, ao mesmo tempo, queimaduras de terceiro, segundo e
primeiro graus - e cada tipo de leso pede um socorro especfico.
proibido passar gelo, manteiga ou qualquer coisa que no seja gua fria

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no local, em qualquer caso. Tambm no se deve estourar bolhas ou
tentar retirar a roupa colada pele queimada.

Ferimentos com materiais perfuro cortantes e fraturas
Se a hemorragia decorrente de um ferimento qualquer intensa,
deve ser interrompida imediatamente. O estancamento de hemorragia
pode ser feito aplicando-se uma compressa ao ferimento com presso
direta. Se for possvel, o local afetado deve ser elevado at que se
controle a hemorragia.
Tratando-se de corte leve, a hemorragia no grande. Nestes
casos, deve-se remover todo material estranho que se encontre no
ferimento, lavando-se cuidadosamente a regio com sabo e gua
corrente e limpa. A seguir, deve ser aplicado anti-sptico em todas as
partes do ferimento at aproximadamente 2 cm da pele ao redor do corte.
No se deve nunca remover materiais estranhos que estejam muito
profundos nos ferimentos.
Em casos de ferimentos por perfurao a vtima deve ser enviada
a um hospital, pois h perigo da existncia de materiais estranhos no
corte e a impossibilidade de se alcanar o fundo do ferimento com anti-
spticos.
Sintomas como dor, inchao e deformao so tpicos em casos
de fraturas. A vtima no deve ser removida do local do acidente a menos
que vapores, fumaa ou fogo assim o determinem.

I ntoxicao por gases ou vapores
O socorrista deve tomar todas as precaues, como o uso dos
devidos equipamentos de proteo individual, para entrar na rea
do acidente;
Remover o acidentado do local do acidente para local arejado e
afrouxar as vestes, principalmente prximas ao pescoo;
Manter o acidentado deitado e moderadamente aquecido;
Praticar respirao artificial boca-a-boca, a no ser que se trate de
sustncias do tipo gs cloro, SO
2
, inalado para os pulmes.

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I ngesto oral de agentes qumicos
Normalmente, quando certas solues so ingeridas deve-se
induzir o vmito. A melhor maneira para provoc-los a excitao
mecnica da garganta. Em alguns casos, o vmito no deve ser
provocado, como nas intoxicaes em conseqncia da ingesto de
substncias custicas e derivados de petrleo.

Produtos de risco
A definio inclui:
Produtos txicos: por ao txica imediata ou mais lenta sobre o
organismo e o meio ambiente;
Produtos inflamveis: materiais que podem pegar fogo e manter a
combusto;
Corrosivos: substncias cidas ou bsicas que provocam
queimaduras;
Reativos: materiais que explodem ou reagem de forma violenta;
Outros materiais, como os gases comprimidos (nitrognio,
oxignio, entre outros) e o nitrognio lquido.

3.3 Manipulao do material vegetal no fluxo

A capela deve ser limpa com lcool 70%, sempre com a
ventilao ligada;
Aps a limpeza, a lmpada germicida deve ser acesa, o tempo
indicado para deix-la ligada de 15 a 20 minutos;
No perodo em que a lmpada UV estiver ligada, NO ENTRAR
NA SALA DE CULTIVO;
Desligar a lmpada UV;
Ligar a lmpada de iluminao; a ventilao permanece ligada;
Novamente limpar a capela com lcool 70%;
Utilizar lcool 70% nas mos, toda vez que julgar necessria
assepsia;
Flambar pinas e bisturis toda vez que julgar necessrio;

23
Essencial
Nunca utilizar as ferramentas acima citadas enquanto
estiverem quentes, elas podem colocar em risco o posterior
desenvolvimento da plntula;
4 Bibliografia consultada

ANDRADE, S.R.M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Documentos 58, Embrapa. Planaltina DF,
2002.

CARVALHO, J.M.F.C.; ROCHA, R.W.C. Curso de cultivos de tecidos vegetais. Documentos 157,
Embrapa. Campina Grande PB, 2006.

CARVALHO, J.M.F.C.; VIDAL, M.F. Noes de cultivo de tecidos vegetais. Documentos 116, Embrapa.
Campina Grande PB, 2003.

CARVALHO, J.M.F.C. Procedimentos para implantao de um laboratrio de um cultivo de tecidos.
Circular Tcnica, Embrapa. Campina Grande PB, dez. 2002.

GOBBI,M. Estocagem e Manuseio. Manual de Segurana para usurios de produtos qumicos perigosos,
7-18.
OLIVEIRA,C.M.A. MANCILHA, J.C. ROCHA, L.M.S. SASSA,L.H. MELLO, M.A. SANVIDO, M.C.
BERGAMO, M.E. REY, M.D. OLIVEIRA, P.C.A. LOPES, W.A.C. 2007. Guia de Laboratrio para o
Ensino de Qumica: Instalao, montagem e operao. Conselho Regional de Qumica IV Regio, 20-21.
2006.

JUNGHANS, T.G.; SOUZA, A.S. Aspectos prticos da micropropagao de plantas. Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical, Cruz das Almas BA. 385p. 2009.

PAIVA, R.; PAIVA, P.D.O. Cultura de tecidos. UFLA/FAEPE, Lavras MS, 2003.

24
Essencial
Mdulo 2

1. Principais riscos e dificuldades na cultura de tecidos

O cultivo in vitro como qualquer outro processo sensvel a alguns
problemas de ordem ambiental ou biolgico que afetam diretamente o
desenvolvimento das culturas

1.1 Declnio de vigor
As plantas desenvolvem o metabolismo de acordo com os estmulos
recebidos, e, portanto, quando ocorrem problemas determinantes
refletido diretamente na fisiologia vegetal do explante. A baixa taxa de
desenvolvimento chamada de declnio do vigor e est associado com a
produo de substncias fenlicas ou a outros fatores como vitrescncia,
habituao ou maturidade dos explante.
A perda de vigor pode ser tambm afetada por erros no balano
nutricional do meio de cultura, utilizao de fitorreguladores inadequados
ou falta de repicagem do material vegetal.

1.2 Contaminao
Em principio existiriam trs alternativas para contornar a
contaminao. A primeira o uso de meristemas. Mas este procedimento
laborioso demais e no muito pratico. A segunda, usar compostos
qumicos (hipoclorito de sdio, antibitico, fungicida etc) e a terceira
simplesmente usar plantas estreis, quando por exemplo, coletamos
ramos do campo e depois de uma assepsia externa, os galhos (sem folhas)
os fazemos brotar dentro de uma cmara mida, e a partir disso,
extramos os explantes: folhas ou gemas, mesmos assim, uma assepsia
convencional requerida como j mencionado anteriormente.
A contaminao bacteriana tem sido abundantemente relatada em
trabalhos de fitopatologia de plantas. Em funo desta constatao que
o uso de antibiticos, como estratgia teraputica, na cultura de tecidos
de planta e no mbito agronmico ainda persistente, apesar de que,
existe um olhar de desconfiana em torno a seu uso pela questo da

25
Essencial
induo de resistncia plasmidial. Os antibiticos na sua definio
clssica so substncias produzidas por microorganismos que inibem ou
matam outros microrganismos. A contaminao bacteriana normalmente
aparece nas placas como uma mancha redonda, lisa, brilhante de cor
branco ou bege, podendo emergir da periferia do explante ou, em
qualquer lugar do meio, quando por conseqncia inadequada
manipulao na cmara de fluxo laminar (Figura 1).

Em cultura de tecidos o uso de explantes provenientes do campo,
creia grandes problemas de contaminao, mesmo, realizando uma
assepsia previa inoculao. Razes, sementes, gemas ou folhas de
plantas deste origem , normalmente esto pesadamente contaminados por
fungos.
Um fungicida uma substncia que mata fungos, sendo que,
dependendo de sua especificidade o mecanismo de ao alguns matam
mais que outros. Deste ponto de vista, os fungicidas esto destinados a
proteger s plantas. Esta proteo pode ser realizada de duas maneiras.
Uma delas a destruio do inoculo antes que se espalhe e forme miclio
pela planta generalizando a doena (preveno). A outra forma,
bloquear a doena quando j instalada na planta, seja local ou sistmica
(terapia o cura).
Em geral, poderamos classificar os fungicidas como no
sistmicos e sistmicos. Como j mencionado, em geral os explantes
provenientes do campo, j possuem o contaminante no interior do tecido,
mesmo que, o explante no apresente sintomas visveis. o que se
desprende depois de observar a contaminao do explante no meio
nutritivo, a pesar de que, foi realizada a assepsia de praxe (uso de
hipoclorito de sdio) (Figura 2).

Figura 1: contaminao
por microrganismos.

26
Essencial

1.3 Oxidao Fenlica
A oxidao a reao do oxignio com ons metlicos (+) dos outros
compostos do meio de cultivo. Os explantes ao serem inoculados no meio
de cultura podem liberar exsudatos que tornam o meio de cultivo escuro
(Figura 3). Este tipo de escurecimento conseqncia da liberao de
fenis dos ferimentos ocasionados no processo de extrao dos explantes
(Santos, 2001).

Figura 3: oxidao fenlica em meio de cultura.

Compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP, cido ascrbico e
cido ctrico tm sido adicionados ao meio de cultura com o objetivo de
controlar o processo de oxidao.
Carvo ativado adicionado ao meio de cultura em
concentraes que variam de 0,3 a 2,0%, cuja ao adsorver
fenis do meio de cultura, alm de atuar induzindo os
processos de morfognese e rizognese.
A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os
compostos fenlicos evitando que estes oxidem e

Figura 2: contaminao
por microrganismos.

27
Essencial
polimerizem. Esta substncia geralmente adicionada ao
meio de cultura em concentraes que variam de 0,01- 4,0 %.
Composio dos meios de cultura com variaes na
concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou diminuio
em concentrao de ferro e cobre, uso de reguladores de
crescimento (variaes em tipo e concentraes) alm da
adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para
controle da oxidao.
O cido ctrico atua como agente quelante de metais, mas no
muito eficiente em retirar ferro da soluo.
O cido ascrbico normalmente acrescido ao meio de
cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade
metablica dos tecidos.
A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita
minimizando os danos causados ao explante, removendo os compostos
fenlicos produzidos ou atravs da alterao da composio do meio de
cultura e a concentrao ou tipo de reguladores de crescimento
empregados.
A remoo dos compostos pode ser feita ainda pela utilizao de
meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes agentes
de solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro.

1.4 Variao Somaclonal
O ambiente da cultura in vitro pode induzir variabilidade nas culturas
este fenmeno foi denominado de variao somaclonal. Isto ocorre
devido aos sucessivos subcultivos do mesmo material vegetal.
O mais comum que se pode observar so plantas que param de se
desenvolver, cessa a multiplicao e a colorao da planta muda,
geralmente ficando mais clara.

1.5 Hiperhidricade
A hiperhidricidade definida como o estado fisiolgico que a planta
apresenta elevado teor de gua no interior das clulas e tecidos com
aspecto translcido (Figura 4). As alteraes na estrutura das plantas

28
Essencial
cultivadas in vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa
sndrome de caractersticas anormais.

O fenmeno pode ser revertido, desde que seja realizada a
transferncia de meio de cultivo e adequar o ambiente, dando ateno
especial para a temperatura, irradincia, fotoperodo e concentraes dos
elementos do meio de cultivo.

Ocorrncia
A hiperhidricidade pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em
regenerao de brotos a partir de calos, em todas as espcies. mais
freqente em massa de calos de plantas lenhosas, mas tambm ocorre em
plantas herbceas, pode ser conseqncia da difuso passiva da gua
dentro dos tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no
processo metablico da planta.

Fatores que influenciam a hiperhidricidade
Culturas que desenvolvem-se rapidamente so menos propensas.
Quando se busca melhores condies de cultivo para cada espcie,
diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a hiperhidricidade.
A hiperhidricidade tende a ser promovida por altas temperaturas,
baixa irradincia luminosa ou em culturas mantidas no escuro.
Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta
umidade relativa apresentam maior suscetibilidade hiperhidricidade,
pois este provavelmente o ambiente mais favorvel para ocasion-la.
Culturas mantidas em meio lquido, incluindo aquelas realizadas
com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem mais facilmente
do que aquelas que so cultivadas em meio slido.

Figura 4: Hiperhidricidade

29
Essencial
Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio
slido ficam totalmente vitrificadas quando so transferidas para um
meio de cultivo lquido.
Os brotos apresentam sintomas mais freqentes quando se utiliza
concentraes de BAP acima de 2,0 mg.L
-1
, suplementado com sacarose
e baixas concentraes de sorbitol.
Culturas em meios com altas concentraes de BAP sofrem
imensamente a induo de hiperidricidade. Isto pode ser evitado
transferindo a cultura para um meio que no possua BAP. As auxinas
podem s vezes induzir a hiperhidricidade entretanto, a adio de auxinas
no meio contendo citocininas, freqentemente aumenta a proporo de
vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste
problema.

Diminuindo a hiperhidricidade
Existem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da
vitrificao, dentre estes pode-se destacar:
Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no
meio de cultura;
Aumento da concentrao de geleificante no meio semi-slido;
Controle da concentrao de sacarose;
Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro;
Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos
explantes (ponte de papel);
Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o
citrato, succinato ou malato para auxiliara assimilao do NH
4+
;
Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo;
Utilizao de alta de luminosidade;
Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria;
Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina
para a espcie estudada;
Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo;
Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de
fitorreguladores;

30
Essencial
Diminuio do uso de citocininas ou restrio do uso do BAP.
Pode-se tambm aumentar o nmero de subcultivos;
Substituio da sacarose por frutose ou galactose;
Ajuste correio do pH do meio de cultivo.

1.6 Temperatura e luminosidade
O sucesso da cultura de tecidos em grande parte dependente
desses dois fatores. Cada cultura tem necessidades especiais de
temperatura e perodos de luz, por isso se faz necessrio que antes do
cultivo in vitro faa-se buscas de informaes sobre a espcie que ser
trabalhada.
A maioria das espcies se adaptam em temperaturas de 25C com
variao de 2C para mais ou para menos e fotoperodo de 16 horas de
luz.

2. Bibliografia consultada
ANDRADE, S.R.M. Princpios da cultura de tecidos vegetais. Documentos 58, Embrapa. Planaltina
DF, 2002.

CARVALHO, J.M.F.C.; ROCHA, R.W.C. Curso de cultivos de tecidos vegetais. Documentos 157,

CARVALHO, J.M.F.C.; VIDAL, M.F. Noes de cultivo de tecidos vegetais. Documentos 116,

CARVALHO, J.M.F.C. Procedimentos para implantao de um laboratrio de um cultivo de
tecidos. Circular Tcnica, Embrapa. Campina Grande PB, dez. 2002.

31
Essencial
Mdulo 3

1. Identificao dos reagentes

Para otimizar os procedimentos no laboratrio necessrio que todos
os reagentes estejam enumerados e identificados em uma planilha. Alm
disso, os reagentes enumerados devem ficar dispostos em ordem para
facilitar sua localizao. Os reagentes podem ficar na bancada ou em
armrios, na geladeira (4-8
o
C) ou no freezer (-10
o
C), sendo que estas
informaes esto nos rtulos dos reagentes.
Para facilitar a compra dos mesmos reagentes necessrio anotar alm
do nome o cdigo que o produto tambm apresenta isto evitar comprar
produtos que no so especficos para cultura de tecidos vegetais.

2. Princpios SI (Sistema internacional de unidades)

No SI distinguem-se duas classes de unidades:
- Unidades de base (principais);
- Unidades derivadas.

A Conferncia Geral, levando em considerao as vantagens de se
adotar um sistema prtico nico para ser utilizado mundialmente nas
relaes internacionais, no ensino e no trabalho cientfico, decidiu
basear o Sistema Internacional em sete unidades perfeitamente
definidas, consideradas como independentes sob o ponto de vista
dimensional.
Unidade de comprimento- metro (m)
Unidade de massa - quilograma (kg)
Unidade de tempo- segundo (s)
Unidade de corrente eltrica - ampre (A)
Unidade de termodinmica - kelvin (k)
Unidade de quantidade de matria (mol)
Unidade de intensidade luminosa - candela (cd)

32
Essencial
Quadro 1 - Exemplos de unidades SI derivadas, expressas a partir das
unidades de base

Quadro 2- Mltiplos e submltiplos decimais das unidades SI

3. Qumica para cultura de tecidos- Preparo das solues
estoque

Importncia dos meios de cultura

Meios de cultivo so combinaes de sais minerais
(macronutrientes e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e
reguladores de crescimento. Podem ser semi-slidos (adicionando-se gar
ou outro agente para geleificao) ou lquidos, de acordo com o protocolo

33
Essencial
para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para as culturas
fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e
controlam, em grande parte, o padro do desenvolvimento in vitro
(Torres, 1998). A constituio do meio baseada nas exigncias das
plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para
atender as necessidades especficas. Um dos primeiros meios de cultura
desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apresenta baixo nvel de
nitrognio e de potssio, restringindo o seu uso para muitas clulas. O
meio MS (Murashige e Skoog, 1962) foi baseada no White sendo uma
das primeiras formulaes melhoradas usadas em cultura de tecidos de
plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e amnio.

3. Composio do meio de cultura

Os meios nutritivos so formados por mltiplos componentes,
sendo bastante variveis em funo da espcie vegetal e da origem do
explante. constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os
essenciais compreendem a gua, os sais inorgnicos, a fonte de carbono e
energia, vitaminas e substncias reguladoras de crescimento. Entre os
componentes adicionais esto includos os aminocidos, amidas e cidos
orgnicos. Os principais componentes de uso mais frequente nos meios
de cultura so:

gua: o componente em maior quantidade do meio de cultura. A
qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos
vegetais. Pode ser uma fonte potencial de impurezas quando no
tratada. Para melhor controle deve-se usar gua destilada,
bidestilada e desionizada. A utilizao de gua de torneira pode
comprometer o desenvolvimento da cultura, pelo excesso de sais
e cloro presente nesta gua, alm de formas de resistncia de
inmeros microrganismos.

34
Essencial
Nutrio mineral
Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmos
estabelecidos para a nutrio mineral bsica das plantas no campo e em
hidroponia. Dentre eles podemos destacar:

Nitrognio: Acrescentado aos meios na forma orgnica (prontamente
disponvel as culturas) ou na forma inorgnica. Pode estar
disponvel como amnio (NH
4
+
) (ction) ou nitrato (NO
3
-
)
(nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo
do material em cultura (George, 1993). constituinte de
aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia na
sntese protica. A toxidez do amnio s clulas diminui ou
desaparece quando ele usado como nica fonte de nitrognio na
forma de sal de um cido orgnico, de preferncia um cido
tricarboxlico (ciclo de Krebs), como cido ctrico ou cido alfa-
cetoglutarico (Torres, 1998). A glutamina (precursora de vrios
aminocidos) a mais utilizada como fonte de nitrognio
orgnico. Meios enriquecidos com nitrognio so fundamentais
para a embriognese somtica, bem como diferenciao de parte
area (Amirato, et. al. 1983).

Fsforo: Adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio
monobsico (KH
2
PO
4
), pois a forma que absorvida (George,
1993). Algumas fontes orgnicas podem ser utilizadas quando
existem restries aos fosfatos minerais (Torres, 1998). Atua no
metabolismo energtico, na regulao de processos enzimticos e
na ativao de enzimas (Santiago, 2001). constituinte dos
cidos nuclicos (DNA e RNA), fosfolipdios e acares-fosfato;
coenzimas (NADP) e especialmente do ATP (composto rico em
energia que participa de vrios processos metablicos, tais como:
sntese e degradao de carboidratos, sntese de protenas e de
cidos graxos). Na organognese est envolvido na diferenciao
da parte area, pois reverte o efeito das auxinas.

35
Essencial
Potssio: utilizado com nitrato (KNO
3
), fosfato (KH
2
PO
4
) ou cloreto
(KCl). Ativador de vrias enzimas do metabolismo de
carboidratos e protenas. Como enzimas envolvidas nos processos
de gliclise e respirao (Santiago, 2001). necessrio para a
embriognese somtica (Ammirato, 1983). A deficincia de
potssio pode conduzir a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de
absoro de fosfato. Atua como ativador enzimtico em vrios
processos metablicos, tais como: respirao, sntese de
carboidratos e protenas e reaes de fosforilao.

Enxofre: Utilizado na forma de sulfato (SO
4
-2
) ou na forma de
aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no
metabolismo energtico na formao do fosfosulfato de
adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua
absoro relacionada assimilao do nitrognio e,
independentemente, do pH (Santiago, 2001).

Clcio: Utilizado na forma de nitrato - Ca(NO
3
)
2
- ou cloreto- CaCl
2
-.
Est envolvido na diviso celular, uma vez que um dos
componentes da lamela mdia o pectato de clcio. Mantm a
integridade da membrana celular e importante para a
germinao de gros de plen (George, 1993). um agente
quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico. Altas
concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle
da necrose do pice caulinar. importante para manuteno da
integridade funcional de membranas e neutralizao de cidos
orgnicos (quelao), evitando sua toxicidade.

Magnsio: Usado na forma de sulfato de magnsio- MgSO
4
7H
2
O-. um
dos componentes da clorofila, co-fator importante para vrias
reaes enzimticas que atuam sobre substratos fosforilados,
necessrio para a absoro de fsforo e atua como ativador
enzimtico em vrios processos com metabolismo de cidos
nuclicos.

36
Essencial

Ferro: Est numa faixa intermediria entre os macros e micronutrientes.
adicionado ao meio na forma quelado Fe-EDTA. Envolvido nas
reaes de oxi-reduo nos organismos vivos e essencial para a
sntese da clorofila.

Molibdnio: adicionado na forma de molibidato de sdio (Na
2
MoO
4
),
Co-fator da redutase do nitrato sendo desta maneira importante
para a absoro no nitrognio.

Cobre: usado como sulfato de cobre- CuSO
4
5H
2
O-. um ction que
em doses acima do normal fitotxico s culturas. Constituinte da
enzima plastocianina que importante componente do transporte
de eltrons.

Cloro: essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao
de Hill, porm em altas concentraes txico.

Zinco: Adicionado ao meio atravs do Sulfato de zinco- ZnSO
4
7H
2
O-.
Importante nas reaes de oxi-reduo das plantas. Co-fator de
enzimas anidrase carbnica.

Mangans: Adicionado ao meio atravs do Sulfato de mangans-
MnSO
4
H
2
O -. Essencial no metabolismo para a reao de Hill na
fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo
eltrons e oxignio.

Cobalto: usado como cloreto de cobalto- CoCl
2
6H
2
O- e est
envolvido na expanso foliar.

Boro: Embora a precisa funo do boro no metabolismo no esteja clara,
evidncias sugerem que ele executa papis importantes no
alongamento da clula, na sntese de cidos nuclicos, nas

37
Essencial
respostas a hormnios e na integridade estrutural da parede
celular.

Constituintes orgnicos
Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos,
substncias reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e
amidas, certas purinas e pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos.

Carboidratos: As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no
encontram condies adequadas de iluminao e concentrao de
CO
2
e, s vezes, no apresentam teores de clorofila suficientes para
realizar fotossntese (Torres, 1998). Muitas vezes, acares que no
so efetivos na manuteno do crescimento do calo, sustentam a
iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica. Os
carboidratos mais usados nos meios de cultura so a sacarose, a
glicose e a frutose nos nveis de 2% a 5% (p/p) (George, 1993). A
concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacarose entre
6% a 12% podem ser usadas em cultura de embries, frutos e anteras,
enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura de protoplastos.
Pode ocorrer a caramelizao do acar quando exceder o tempo de
autoclavagem e a sua degradao pode ocorrer formao de
hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-metilfurano, 2,5-
dimetilfuranoe maltol (Ammirato et. al. 1983). Estes compostos
formam meladoidinas que so compostos de colorao amarronzada,
de alto peso molecular, podendo inibir o crescimento celular. O
acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e pode
conter alto nvel de zinco que txico para o tecido. Glicose e frutose
devem ser esterilizadas a frio.
Aminocidos e amidas: A suplementao pode ser realizada pela
incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito
benfico pode ser avaliado pela substituio desta protena por uma
mistura de aminocidos e amidas. Os aminocidos e amidas tm
importncia na amplificao das respostas morfogenticas,
proporcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no

38
Essencial
sentido da regenerao. As formas "L" dos aminocidos so de
ocorrncia natural. A tirosina apresenta influncia na iniciao de
parte area em cultura de calos, L-arginina no enraizamento e L-
serina na obteno de embries haplides mediante o cultivo de
micrsporo. As amidas L-glutamina e L-aspagarina so benficas na
obteno de embries somticos, e a cistena includa, s vezes,
como agente redutor.

Vitaminas: Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas
concentraes, desempenham funes reguladoras catalticas no
metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura
de tecidos a tiamina (B1). A tiamina solvel em gua. Outras
vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B3) e piridoxina (B6).
Riboflavina (Vitamina B2): componente da coenzima FMN (Flavina
mononucleotdeo) e o FAD (Flavinaadenina-dinucleotdeo) que atuam
em oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do transporte de
eltrons (George, 1996).
Tiamina (Vitamina B1): atua no metabolismo celular devido funo
como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e
cetoglutarato (George, 1996).
cido pantotnico: um dos componentes da coenzima A e exerce
papel importante no metabolismo de lipdios.
cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B3): um componente das
coenzimas NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio.
Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vitamnico B6):
Fazem parte de coenzima metablicas de aminocidos. Estas vitaminas
tm papel importante nas reaes de transaminao e descarboxilao
(George, 1996).
Biotina: atua no metabolismo do cido asprtico, e nas reaes do ciclo
de Krebs que levam formao deste cido (Ammirato, 1983).
cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao
fotossinttica devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente (Santiago,
2001).

39
Essencial
4. Reguladores do crescimento vegetais
Para ocorrer o desenvolvimento ou a entrada de atividade de um
determinado processo necessrio a sinalizao especfica por
reguladores de crescimento. O controle qumico da diferenciao da parte
area foi primeiramente observado em cultura de calo de tabaco. Foi
observada inibio na formao de gemas por auxinas, e reverso deste
efeito estimulando brotaes utilizando-se adenina bem como o fosfato
inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo de organognese in
vitro controlado por substncias hormonais sendo que o
desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano
entre auxinas e citocininas. O balano de auxinas/citocininas em
alto/baixo favorecem o enraizamento e o balano inverso promove a
formao de parte area. Concentraes iguais promovem a produo de
calos.
Auxina: As auxinas mais usadas so AIA (cido indol-3-actico),
AIB (cido indol-3-butirico), ANA (cido naftalenoactico), 2,4-D,
2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a
induo de calos e tem o efeito de inibir a morfognese. As auxinas 2,4-
D e ANA so sintticas e tm efeitos semelhantes s auxinas de
ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao. A auxina 2,4,5-
triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a formao de calos
em monocotiledneas (Ammirato, 1983). As auxinas so termoestveis,
no decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a
menos estvel. A dissoluo das auxinas feita em NaOH 2 M.

Citocinina: so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um
papel fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria
das espcies (Santiago, 2001). Induzem a diviso celular, proliferao e
morfognese da parte area. As citocininas mais usadas em cultura de
tecidos so a benzilaminopurina (BAP), cinetina (CIN), benziladenina
(BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ).

cido giberlico (GA
3
): usado, algumas vezes, em cultura de
meristemas, na recuperao de plantas livres de vrus. Alm de ser

40
Essencial
importante na superao da dormncia de sementes de algumas espcies.
O GA
3
deve ser dissolvido em gua com pH ajustado a 5,7 ou em base
(NaOH 2M). As solues de GA
3
devem ser esterilizadas em filtro
bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe por
autoclavagem. As solues estoques devem ser preparadas na hora.

pH
O pH dos meios nutritivos em culturas de clulas vegetais
normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os
componentes para um valor ligeiramente cido, entre 5 e 6 (normalmente
entre 5,7 - 5,8)(Torres, 1998). Recomenda-se este valor para formulaes
lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve ser ajustado em 5,7,
pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que em
pH 6,0 - 6,2 verifica-se a precipitao de sais (George, 1996). O pH varia
durante o perodo de cultura.

Preparo dos meios e cultura
O preparo de solues estoque tem por objetivo facilitar o preparo
final dos meios de cultivo e preciso na dosagem dos componentes. As
pores so mantidas em geladeira e por um perodo no superior a uma
semana para a maioria das solues estoques, principalmente aquelas que
apresentam precipitao. Solues estoques de vitaminas devem ser
mantidas em geladeira ou em congeladores. Recomenda-se montar
estoques de sais minerais (conjuntos de macronutrientes e
micronutrientes), Fe-EDTA, misturas orgnicas e reguladores de
crescimento. A sacarose e o agente gelificante so pesados e preparados
no momento do preparo do meio.
Para o preparo das solues estoque necessrio pesar os
reagentes e colocar em gua destilada no balo volumtrico. O volume
estar aferido se o menisco se encontrar na marca do balo volumtrico.

41
Essencial

Figura1. Balo volumtrico com soluo.
Obs. O menisco a volta que o lquido apresenta por causa da
coeso do lquido e a adeso da parede do recipiente.

5.1 Preparo soluo de HCl, NaOH e Fe-EDTA

Para preparar 1000 mL da soluo de HCl 1 M.
Lembrete: Adicionar o cido na gua.
O menisco da sua soluo
deve estar aqui.
O que uma soluo estoque?
A soluo estoque uma soluo com a concentrao do reagente
muitas vezes maior do que ns usaremos no meio de cultura.
Ex. Quando voc faz uma soluo de micronutrientes 1000 X
quer dizer que com 1000 mL desta soluo eu posso fazer 1000 mL
de meio de cultura. Por causa disso, ns devemos tomar muitos
cuidados com as solues estoque tanto no seu preparo quanto na
sua identificao correta. Sempre colocando a sua concentrao.

42
Essencial
Dica: Deve-se colocar o Bquer em isopor com gelo, pois a reao do
cido com a gua libera muito energia (exotrmica) e esquenta a vidro.

Os dados abaixo esto na embalagem do reagente
d= 1,19 g/mL ou 1,19g/cm
3
P.M.= 36,5 g
Soluo de HCl 36,5% p/p
Clculo 1
1,19 g ------- 1 mL
36,5 g --------x
x= 30,67 ml

Clculo 2
30,67 mL ----- 36,5%
y --------------- 100%
y= 84 mL de soluo de HCl 36,5%
Na capela exaustora, devemos colocar 84 mL de HCl 36,5% em 800 mL
de gua destilada no Bquer. Depois que resfriar a soluo deve-se verter
a soluo no balo volumtrico e completar o volume para 1000 mL.

Para preparar 1000 mL da soluo de NaOH 2 M
Os dados abaixo esto na embalagem do reagente
P.M.= 40g
Dissolver 80g de NaOH no Bquer com 800 mL de gua destilada.
Depois que resfriar a soluo deve-se verter a soluo no balo
volumtrico e completar o volume para 1000 mL

Para preparar 1000 mL da soluo de Fe-EDTA (100x)
- Dissolver 5,56 g de sulfato de ferro (FeSO
4
7H
2
O) em 400ml de gua
quente;
- Dissolver 7,45 g de sdio-EDTA (Na
2
-EDTA) em 400ml de gua
quente;
- Misturar as duas solues quentes, vertendo-se a soluo de Na
2
-EDTA
sobre a soluo de FeSO
4
7H
2
O;

43
Essencial
- Completar o volume para 1000 mL de soluo fria, com gua destilada,
esta soluo dever ter colorao verde claro.
- Armazenar em vidro escuro e coberto com papel alumnio, colocando-o
em geladeira.

Tabela 1. Soluo estoque do meio MS (Murashige; Skoog, 1962 )
Componentes
Meio MS
Conc. estoque p/ 1000 mL Estoque
Macronutrientes
NH
4
NO
3
10 X 16,5 g Macro MS
KNO
3
10 X 19 g Macro MS
CaCl
2
2H
2
O 10 X 4,4 g Macro MS
MgSO
4
7H
2
O 10 X 3,7 g Macro MS
KH
2
PO
4
10 X 1,7 g Macro MS
Micronutrientes
MnSO
4
H
2
O 1000 X 16,90 g Micro MS
H
3
BO
3
1000 X 6,2 g Micro MS
ZnSO
4
7H
2
KI 1000 X 0,83 g Micro MS
NaMoO
4
2H
2
CuSO
4
5H
2
CoCl
2
6H
2
EDTA 100 X 7,45 g Fe-EDTA
FeSO
4
7H
2
O 100 X 5,56 g Fe-EDTA
Vitaminas
Tiamina HCl 500 X 0,05 g Vit. MS
Piridoxina HCl 500 X 0,25 g Vit. MS
cido nicotnico 500 X 0,25 g Vit. MS
Glicina 500 X 1,0 g Vit. MS
Mio-inositol 500 X 50 g Vit. MS

Tabela 2. Soluo estoque do meio WPM (Lloyd; McCown, 1986))

44
Essencial
Componentes
Meio WPM
Conc. estoque p/ 1000 mL Estoque
Macronutrientes
NH
4
NO
3
50 X 20 g Sol. A WPM
CaCl
2
2H
2
O 50 X 4,8 g Sol. A WPM
MgSO
4
7H
2
O 50 X 18,5 g Sol. A WPM
KH
2
PO
4
50 X 8,5 g Sol. A WPM
Ca (NO
3
)
2
50 X 27,8 g Sol. B WPM
K
2
SO
4
50 X 49,5 g Sol. C WPM
Micronutrientes
MnSO
4
H
2
O 100 X 2,23 g Micro WPM
H
3
BO
3
100 X 0,62 g Micro WPM
ZnSO
4
7H
2
NaMoO
4
2H
2
CuSO
4
5H
2
FeSO
4
7H
2
Vitaminas
Tiamina HCl 500 X 0,05 g Vit. WPM
Piridoxina HCl 500 X 0,25 g Vit. WPM
cido nicotnico 500 X 0,25 g Vit. WPM
Glicina 500 X 1,0 g Vit. WPM
Mio-inositol 500 X 50 g Vit. WPM

Tabela 3. Soluo estoque do meio WPM (Correia, 1996)

45
Essencial
Componentes
Meio JADS
Conc. estoque p/1000 mL Estoque
Macronutrientes
NH
4
NO
3
100 X 32,4 g Macro JADS
KNO
3
MgSO
4
7H
2
O 100 X 73,95 g Macro JADS
KH
2
PO
4
Ca (NO
3
)
2
100 X 118,1 g Ca(NO
3
)
2

JADS
Micronutrientes
MnSO
4
H
2
O 100 X 1690 mg Micro JADS
H
3
BO
3
100 X 310 mg Micro JADS
ZnSO
4
7H
2
NaMoO
4
2H
2
CuSO
4
5H
2
CoCl
2
6H
2
FeSO
4
7H
2
Vitaminas
Tiamina HCl 100 X 50 mg Vit. JADS
Piridoxina HCl 100 X 50 mg Vit. JADS
cido nicotnico 100 X 50 mg Vit. JADS
Glicina 100 X 200 mg Vit. JADS
L- Arginina 100 X 700 mg Vit. JADS
L- Glutamina 100 X 14,6 g Vit. JADS
L- Cisteina 100 X 250 mg Vit. JADS
Pantotenato de
clcio
100 X 250 mg Vit. JADS
Mio-inositol
1
- 100 mg -
1
Para o meio JADS, no precisar ser feita soluo, acrescenta o inositol
em p.

46
Essencial
Soluo estoque dos reguladores de crescimento
Auxinas
cido Indolactico-AIA 1mM
AIA 250mL 100mL 50mL
43,798mg 17,519mg 8,7595mg
Obs.Solvente em NaOH 2M ( 3gotas) No recomendado o armazenamento

cido Indolbutrico-AIB 1mM

AIB
250mL 100mL 50mL
50,8mg 20,32mg 10,16mg
Obs.Solvente em NaOH 2M( 3gotas) Armazenamento 0
o
C

Citocininas

2,4-D 1mM

2,4-D
500mL 250mL 100mL
110,5mg 55,25mg 22,1mg
Obs.Solvente em NaOH 2M( 3gotas) Armazenamento 0
o
C
cido Naftalenoactico-ANA 1mM

ANA
1000mL 500mL 250mL 100mL
1,862g 0,931g 0,4655g 0,01862g
Obs.Solvente em NaOH 2M ( 3gotas) Armazenamento 0
o
C
6-Benzilaminopurina-BAP 1mM

BAP
500mL 250mL 100mL
112,65mg 56,325mg 22,53mg
Obs.Solvente em NaOH 1N ( 3gotas) Armazenamento 0
o
C

47
Essencial

6. Preparo dos meios de cultura MS, WPM e JADS

Depois de feita as solues estoque como demonstrado no item 5,
deve-se o utilizar o volume da soluo estoque indicado nas explicaes
abaixo para fazer 1000 mL de dos meio de cultura.
---------------------------------------------------------------------------------------
Meio MS (para fazer 1000 mL de meio de cultura)
Macronutrientes = 100 mL
Micronutrientes = 1 mL
Fe-EDTA = 5 mL
Vitamina MS = 2 mL
Sacarose = 30 g
gar = 6 g
---------------------------------------------------------------------------------------
Meio WPM (para fazer 1000 ml de meio de cultura)
Sol. A WPM = 20 mL
Sol. B WPM = 20 mL
Sol. C WPM = 20 mL
Micro WPM = 1 mL
Fe-EDTA = 5 mL
Vitamina WPM = 2 mL
Sacarose = 30 g
gar = 6g
---------------------------------------------------------------------------------------
Meio JADS (para fazer 1000 mL de meio de cultura)
Macro JADS = 10 mL
Ca(NO
3
)
2
JADS = 10 mL
Micro JADS = 10 mL
Vitamina JADS = 10 mL
Fe-EDTA = 10 mL
Mio-Inositol = 100 mg
Sacarose = 30 g
gar = 6 g
---------------------------------------------------------------------------------------
OBS
1
: O pH do meio de cultura, varia de acordo com a espcie a ser
trabalhada, porm, na maioria das vezes o ideal est entre 5,7- 5,8.
OBS
2
: A concentrao de sacarose varia de acordo com a espcie a ser
trabalhada, porm, a maioria delas exige 30g L
-1
de sacarose.
OBS
3
: O Meio de cultura WPM muito indicado para espcies lenhosas
que no obtiveram bons resultados com meio MS.
Cinetina-KIN 1mM

Cinetina
500mL 250mL 100mL
107,6mg 53,8mg 21,52mg
Obs.Solvente em NaOH 1N ( 3gotas) Armazenamento 0
o
C

48
Essencial
OBS
4
: Os reguladores de crescimento e suas concentraes variam de
acordo com a espcie, indica-se fazer testes com no mnimo de
concentraes (baixa, mdia e alta) para depois ajustar conforme a
resposta da planta.
OBS
5
: A presena e a quantidade de gar varia em relao do meio ser
lquido( sem gar) ou da consistncia do meio (para algumas culturas o
meio necessita ser mais rgido, para outras mais fluida). Alm existe a
variao do grau de pureza entre as marcas fazendo com que utilize mais
ou menos meio.
6. Bibliografia Consultada
AMMIRATO, P. G. V. 1993. Embryogenesis, in: Evans, D. A.; Sharp, W. R.; Ammirato, P. G. V.; Yamada,
Y.Handbook of plant cell culture. New York: MacMilam Publischer Company, v.1, 123p.

CALDAS, L.S., HARIDASAN, P.; FERREIRA, M.E. Meios nutritivos. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.;
BUSO, J.A.(eds.). Tcnicas e aplicaes da cultura de tecidos de plantas. Braslia: ABCTP/EMBRAPA, 1998.
p. 87-132.

GEORGE, E. F. 1996. The derivation, preparation, and use of culture media, In: Plant propagation by tissue
culture. Exegetics, Edington. X, p. 344-419.

GEORGE, E. F. 1996. Embryogenesis: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. VII, p. 612-
623.

GEORGE, E. F. 1996. Plant grow regulators: Plant propagation by tissue culture. Exegetics, Edington. XI,
p.420-479.

GEORGE, E. F. 1996. Plant propagation and micropropagation: Plant propagation by tissue culture.Exegetics,
Edington. II, p. 37-66.

GEORGE, E. F. 1996. Plant tissue culture techniques: Plant propagation by tissue culture. Exegetics,
Edington. I, p. 3-36.

INMETRO. http://www.inmetro.gov.br/infotec/publicacoes/Si.pdf acessado em 20/02/2012

LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia
latifolia, by use of shoot -tip culture . Proceedings International Plant Propagators Society, Ashville,
v.30, p.421-427, 1986.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth
and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagem, v.15, p.473-479,
1962.

SANTIAGO, E. J. A.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O.; SANTANA, J. R. F.; GOMES, G. A. C. 2001; Meios de
cultura: Cultura de tecidos. Paiva e Paiva, UFLA, Lavras, MG. 3:22-35.

SKOOG, F. & MILLER, C.O. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues
cultured In vitro. Symp. Soc. for Exp. Biol., 11:118-31.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR (UFC)-
http://www.fisiologiavegetal.ufc.br/APOSTILA/NUTRICAO_MINERAL.pdf - Acessado em 07/02/2012

WHITE, P.R. Plant tissue culture. Annu.Rev.Biochem., 11:615-628,1942.

49
Essencial

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