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Broamtología 2007

ANALISIS DE LECHE Y PRODUCTOS LACTEOS
Preparación de la muestra
Llevar la muestra de leche a aproximadamente 20°C y mezclar por trasvase a otro
recipiente limpio, repitiendo la operación hasta asegurar una muestra homogénea. Si no
se han dispersado los grumos de crema, entiiar la leche en un a!o de agua a aprox.
"#°C y mezclar hasta homogeneidad. $n%riar a 20°C antes de medir un volumen para
analizar &'('C )*020, )+#,-.
Caracteres oranol!pticos "#$$%&' olor, color, saor, aspecto, presencia de
sedimento.
La leche %resca otenida en circunstancias normales, es de color lanco intenso,
completamente opaca, de olor déil y saor suave, pastoso y déilmente azucarado.
Control Tam(o Entera Descremada
(lor .éil
Color /lanco intenso
Saor Suave, pastoso
y déilmente
azucarado
'specto (paca
0resencia de
sedimento
1o
Determinación de la densidad "#$$%&
Se puede determinar con picnómetro, alanza hidrost2tica o lactodens3metro, a
)4.*°C &'('C )*02), )+#,-.
$l lactodens3metro est2 calirado a )4°C. ' temperaturas di%erentes &)4°C 5 4°C-
se puede hacer una corrección sumando o restando 0.0002 a la densidad le3da, por cada
grado de temperatura respectivamente mayor o menor a )4°C.
Determinación de la composición
)ateria rasa ")!todo de *er(er& "#$$%&
Nota' el método de 6erer se utiliza para leche con contenido graso entre ) a #7 y para
leche 2cida.
+undamento8 se trata la %racción proteica de la leche en el denominado utirómetro con
2cido sul%9rico en caliente, separ2ndose por centri%ugación la grasa lierada. La adición
del 2cido am3lico %acilita la separación de %ases, de manera :ue, luego de centri%ugar, el
contenido de grasa se lee directamente en la escala del instrumento.
Procedimiento8 ;edir con pipeta )0 ml de S(,<2 6erer &densidad ).#)" = ).#)> a
20°C, aprox. +07- e introducirlos en un utirómetro para leche, cuidando de no mo?ar las
paredes internas del cuello. 'gregar con rapidez )) ml de leche medidos con pipeta de
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dole a%oro, de manera :ue %orme una capa sore el 2cido sin mezclarse con éste.
'gregar inmediatamente ) ml de alcohol am3lico y tapar con el tapón correspondiente.
'gitar suavemente pero en %orma e%ectiva, teniendo la precaución de tomar el utirómetro
con un repasador, y su?etando el tapón con el pulgar. @eri%icar :ue est2 ien tapado y
colocarlo en un a!o de agua a *4=>0°C durante 4=)0 min con el tapón hacia aa?o.
Aetirarlo del a!o, secarlo por a%uera y centri%ugar durante "=4 min en la centr3%uga
especial con los tapones hacia a%uera. Llevar nuevamente al a!o de agua ,=4 min y leer
inmediatamente el espesor de la capa de grasa en la parte superior graduada del
utirómetro. 0or a?uste adecuado del tapón de cierre se puede hacer coincidir la ase de
la capa de grasa con el cero de la escala. La lectura del menisco da directamente el
porcenta?e de grasa de la leche.
E,tracto seco total "#$$%&
Procedimiento- Barar un cristalizador ien limpio y seco de di2metro no menor de 4 cm
con )0=)4 g de arena calcinada. 'gregar 4 ml de leche con pipeta a%orada, calentar a
a!o ;ar3a )0=)4 min. Llevar luego a estu%a a +#=)00°C hasta peso constante &aprox. "
h-. $n%riar en desecador, pesar r2pidamente y expresar el resultado como 7 de sólidos
totales &pCv-. &'('C )*0"2, )+#,, modi%icado-.
E,tracto seco no raso
Se otiene por di%erencia entre el valor de extracto seco total y el valor de materia
grasa.
Determinación de prote.nas
Se pueden emplear el método de D?eldahl &1 x %actor *."#- o el método de
/rad%ord sore las prote3nas precipitadas con 2cido tricloroacético &BC' )27- y
neutralizadas y dilu3das en solución alcalina. (tra alternativa es emplear el método de
1itrógeno 2lcali l2il descrito a continuación8
Determinación de prote.nas en lec/e por destilación directa- )!todo de 0o1ran2i o
del Nitróeno 3lcali l3(il- &)+40. ;ilchEissenscha%ts, 4)=4, @ol. 2-.
+undamento- $s un método r2pido asado en la lieración de amon3aco cuando la leche
es calentada a eullición en solución alcalina. La mayor parte del amon3aco lierado
proviene de la r2pida hidrólisis de glutamina y asparagina.
Procedimiento- Colocar en un alón D?eldahl )0 ml de leche, 20 ml de /aCl2 )0 7 &usar
propipeta- y >0 ml de 1a(< "2 7. .estilar durante * min &exactamente medidos a partir
del inicio de la eullición-, recogiendo sore )00 ml de /("<" 2 7. Bitular el destilado con
S(,<2 0.)1, usando como indicador * a # gotas de una solución 0.0)* 7 de ro?o de
metilo y 0.0#" 7 de verde de romocresol en alcohol. Calcular el porcenta?e de prote3na
&pCp- utilizando una curva de caliración :ue relaciona el 7 prote3nas con los ml de S(,<2
0.)1 gastados.
Curva de caliración8 se otiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras
de leche con contenidos de prote3na conocidos. 0ara otener las distintas muestras de
leche se parte de una leche entera a la :ue se le midió el 7 de prote3nas por el método
de D?eldhalF con esta leche se hacen diluciones o se agrega case3na para otener las
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concentraciones proteicas deseadas. $l contenido de prote3nas :ue cura el rango de la
curva de caliración, dee ser de ) a , 7 &pCv-.
1(B'8 'ctualmente los an2lisis en leche se realizan siguiendo la metodolog3a
especi%icada en las normas G.H, de la Hederación Gnternacional de Lecher3a &HGL-. 0ara la
determinación del contenido de prote3nas se utiliza el método de D?eldhal, utilizando 2cido
órico para recoger el destilado.
Determinación de Lactosa "#$$%&
La determinación de lactosa seg9n la '('C tamién se puede realizar por método
espectro%otométricos &)*04), '('C, )+#,- o enzim2ticos &)*04+, '('C, )+#,-.
Procedimiento- Colocar en un matraz de )00 ml, )0 ml de leche exactamente medidos,
diluir con *0=#0 ml de agua destilada, agregar 4 ml del reactivo de Courtonne &suacetato
de plomo al "0 7-, agitar enérgicamente y llevar a )00 ml con agua destiladaF
homogeneizar y %iltrar por papel. @alorar la lactosa en el l3:uido %iltrado utilizando el
método de Hehling=Causse=/onnans.
@aloración por el método de Hehling=Causse=/onnans modi%icado &'('C )+*4, p. ,+4- a-
@aloración del reactivo8 $n un erlenmeyer de 240 ml de capacidad se colocan exactamente
)0 ml de reactivo HC/, "0 ml de agua destilada y 2 o " trozos de porcelana porosa y se
calienta a eullición. Ina vez alcanzada ésta, se comienza a agregar desde la ureta la
solución patrón de az9car a una velocidad de goteo controlada &medirla- evitando
interrumpir la eullición. Cuando la coloración azul del reactivo disminuye de intensidad o
alcanza un tono celeste verdoso, se agregan " gotas de la solución acuosa de azul de
metileno y se contin9a con el agregado de solución patrón, gota a gota, hasta decoloración.
La primera gota :ue torna a amarillo oro parte de la solución indica el punto %inal. Se dee
realizar esta valoración por duplicado.
.een gastarse alrededor de 4=* ml de la solución patrón para decolorar )0 ml de
reactivo de HC/. Si el volumen gastado cae %uera de estos valores hay :ue modi%icar la
velocidad de adición hasta lograr el valor indicado. La velocidad de goteo encontrada como
óptima ser2 la empleada al valorar las soluciones prolema.
- @aloración de gl9cidos solules reductores8 Se titulan )0 ml de reactivo HC/ seg9n el
procedimiento seguido en a- pero esta vez cargando la ureta con la solución de az9cares
solules otenida a partir de la muestra &%iltrado-. $l gasto de esta valoración dee estar
comprendido entre " y # ml, si no es as3 hay :ue modi%icar la concentración de la solución
de az9cares.
1ota )8 $s conveniente :ue el agregado de solución de az9cares &patrón y prolema- se
haga al principio a razón de ) gotaCseg y después del agregado de azul de metileno, a )
gotaC" seg.
1ota 28 Se dee tener sumo cuidado en la oservación del punto %inal de la titulación, pues
la coloración amarilla camia r2pidamente a parda.
c- 6l9cidos solules reductores previa hidrólisis 2cida8 $n vaso de precipitado de capacidad
conveniente, se colocan 40 ml del %iltrado preparado para determinar gl9cidos directamente
reductores &punto -, se agregan )=2 ml de <Cl puro &δ8),)+-, se lleva a a!o ;ar3a por
espacio de "0 min, se neutraliza con solución de 1a(< o con 1a<C(" sólido y se lleva al
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volumen inicial &40 ml- con agua destilada. Hiltrar y en el l3:uido %iltrado valorar los az9cares
reductores mediante la técnica descripta en -.
C2lculo8 Los gl9cidos directamente reductores se expresan com9nmente en porcenta?e de
glucosa y los no reductores &calculados a partir de la di%erencia c=- son expresados en
porcenta?e del disac2rido mayoritario, multiplicando por el %actor correspondiente.
Considerar las siguientes e:uivalencias al e%ectuar los c2lculos8
40 mg glucosa J ** mg lactosa anhidra J *+.4 mg lactosa hidratada
Control del estado de conser4ación
Determinación del pH "#$$%&
Procedimiento- 0oner un volumen adecuado en un vaso precipitado y medir el p< en un
p<metro previamente calirado.
Esta(ilidad 1rente al areado de alco/ol
Procedimiento- Colocar 2 cm
"
de leche en un tuo de ensayos y agregar igual volumen
de etanol >07. 'gitar y oservar si coagula.
Acide5 "#$$%&
Procedimiento- ;edir exactamente 20 ml de muestra o pesar con exactitud alrededor de
20 g. Colocar en un erlenmeyer de 240 ml. .iluir con aproximadamente 2 veces su
volumen con agua destilada lire de C(2 &para eliminar el C(2 hervirla 4 min y en%riarla
evitando la incorporación de aire-. 'gregar 2 ml de %eno%tale3na al )7 &solución de
%eno%tale3na )7 en etanol de +47 vCv-, y titular con 1a(< 0.) 1 hasta color rosa déil
pero persistente. $xpresar los resultados en 7 en 2cido l2ctico pCp &'('C )*02", )+#,-.
1(B'8 La acidez de la leche puede expresarse tamién en grados .ornic &ver 0rolema
) de la gu3a de Seminarios de L$C<$-.
Ensa2o del a5ul de metileno- Reductasimetr.a "#$$%&
Procedimiento- Braa?ar en condiciones de esterilidad y evitar la exposición a la luz
solar. Colocar en un tuo de ensayo ancho &aprox. "=, cm de di2metro- ,0 ml de leche
cuidando de no mo?ar un costado de la pared interior del tuo. 'gregar ) ml de solución
de azul de metileno sin :ue la punta de la pipeta entre en contacto con la leche. Bapar el
tuo con un tapón de algodón y colocarlo en un a!o de agua a ">="#°C. $l nivel de
agua en el a!o dee exceder al de la leche en el tuo. ;edir el tiempo en :ue se
produce decoloración total o hasta 4 mm de la super%icie.
La leche se clasi%icar2 seg9n la siguiente tala8
6-7 )u2 mala' se decolora antes de los 20 min.
#-7 )ala' se decolora entre 20 min y 2 h.
8-7 )ediocre' se decolora entre las 2 h y 4 h.
9-7 :uena' conserva el color por m2s de 4 h.
1(B'8 La solución de azul de metileno se prepara disolviendo azul de metileno en
alcohol de +*° hasta saturación, y diluyendo 4 ml de esta solución con )+4 ml de agua
destilada estéril. .escartar después de 2 meses. 1o exponer a la luz..
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Ensa2o de la 1os1atasa alcalina
Procedimiento- $l ensayo consiste en incuar la muestra con un sustrato de la enzima
en condiciones de temperatura y p< adecuados para la reacción enzim2tica. $l producto
%inal se detecta por una reacción colorimétrica. .ee hacerse un ensayo en lanco en las
mismas condiciones pero con la misma leche previamente hervida y en%riada.
$l ensayo se llevar2 a cao con un Kit de Liener La, seg9n se indica en el
siguiente protocolo8
Sustrato, %enil%os%ato de sodio. Cada comprimido contiene 2, moles de sustrato y se 
disuelve en *.4 ml de u%%er C("
M
CC("<
=
.
Aeactivo diazo, na%talen=),4 disul%onato de la sal de diazonio del 4=nitro=2=amino anisol.
Cada comprimido contiene ,.4 mg de reactivo y se disuelve en ,.4 ml de agua destilada.
/IHH$A8 ,*.+ g de C("1a2, ">.2 g C("<1a y agua destilada, cantidad su%iciente para )
litro.

;uestra /lanco
Leche 2 ml ==
Leche calentada ) min a #0=+0°C == 2 ml
.e?ar )0 min a ">=,,°C
Sustrato 2 ml 2 ml
tapar el tuo y agitar por inversión varias veces. .e?ar )0 min a ">=,,°C. <ervir y en%riar.
Aeactivo diazo ) ml ) ml
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PREPARACION DE PRODUCTOS LACTEOS
6-7 COA*ULACION EN;I)ATICA DE LA LECHE
a- )edida de la acti4idad coaulante
Recuerde que la actividad es una medida de velocidad, estará dada por la acción
catalítica de la enzima sobre un sustrato, en este caso estamos viendo el efecto de
la renina sobre la kapa-caseína.
La mezcla de incuación se prepara con 2.0 ml de leche, 0.2 ml de Cl 2Ca 0.) ;,
en el momento de agregar la solución de enzima &0."ml- dee contailizar el tiempo.
La temperatura de traa?o ser2 de ">°C.
Se mide el tiempo necesario para :ue comience la coagulación, :ue se detecta
por agitación de la mezcla de incuación con una varilla de vidrio, inclinando el tuo. Se
eleva la varilla sore el nivel del l3:uido, rozando la pared del tuo y se oserva en el
l3:uido :ue cae sore la pared, la aparición de pe:ue!os co2gulos.
;ezcla de reacción8 2.0 ml Leche
0.2 ml Cl2Ca 0.) ;
0." ml $nzima
En este caso particular, usted no detendrá la acción de la enzima, simplemente
definirá el tiempo en que ha comenzado la coagulación.
a medida de actividad coagulante de la leche será e!presada directamente como
el tiempo de coagulación requerido para los "ml de leche ensa#ados.
(- E1ecto de la 4ariación de la concentración de en5ima en el tiempo de
coaulación-
Tiempo de coaulación con di1erente concentración de coaulante
Recuerde que al ser el tiempo de coagulación una medida indirecta de la actividad
de la enzima, mas específicamente podemos decir que es inversamente
proporcional, podemos observar cual será el efecto de la concentración de la
enzima en los tiempos de coagulación. $omo se esta traba%ando a concentración
de sustrato saturante # se fi%a el tiempo en que aparece el coagulo, se puede decir
que la variación en el tiempo esta relacionado con la variación en la concentración
de enzima.
Procedimiento- Braa?ara con cuatro mezclas de reacción a ">°C, colocando en cada
tuo un volumen di%erente de solución enzim2tica &coagulante-, hasta un volumen
m2ximo de 0." ml. La mezcla de reacción es e:uivalente a la del punto a., con un
volumen %inal de 2.40 ml. $l volumen se completa con DCl 0.)4 ;. La solución enzim2tica
&coagulante- se agrega en 9ltimo término e inmediatamente se incuan los tuos y se
contailiza el tiempo. ' continuación tiene una tala donde se resumen las , mezclas de
reacción.
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)e5cla 6 )e5cla # )e5cla 8 )e5cla 9
Lec/e "ml& 2.00 2.00 2.00 2.00
Cl#Ca $-6 ) 0.20 0.20 0.20 0.20
0Cl $-6< ) "ml& 0."0 0.20 0.)0 0.00
En5ima "ml& 0.00 0.)0 0.20 0."0
Se miden los tiempos de coagulación para cada mezcla de reacción, :ue deer2n
estar en el rango de ) a "0 min. Si no %uera as3, se deer2 repetir la serie, modi%icando
las cantidades de solución coagulante.
6ra%icar el tiempo de coagulación en %unción de la cantidad de solución de enzima.
<aga una interpretación de estos resultados.
c- O(ser4ación de las dos etapas del proceso de coaulación
Recuerde que se ha propuesto un mecanismo en dos etapas para que ocurra la
coagulación, en este caso deberá interpretar los protocolos # analizar los resultados.
0reparara mezclas de reacción, con concentraciones di%erentes de enzima, con
temperaturas de incuación di%erentes y con agregado de CaCl2 en momentos di%erentes.
$n todos los casos se medir2n los tiempos de coagulación de cada tuo.
Las mezclas ) y 2 ser2n los controles :ue utilizara para el estudio. Las mezclas "
y , le permitir2n estudiar la inactivación de la enzima por e%ecto de la a?a temperatura,
ya :ue deer2 incuar amas mezclas a 0
o
C durante 2 horas y posteriormente llevar a
">
o
C. Las mezclas 4 y * le permitir2n estudiar el e%ecto del agregado de calcio, ya :ue
deer2 incuar amas mezclas en ausencia de cloruro de calcio durante "0 minutos y a
partir del agregado del mismo contailizara el tiempo de coagulación.
8%
o
C $
o
C "#/& = 8%
o
C 8%
o
C
)e5cla 6 )e5cla # )e5cla 8 )e5cla 9 )e5cla < )e5cla >
Lec/e "ml& 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
Cl#Ca $-6 ) 0.20 0.20 0.20 0.20 "0min 0.2ml "0min 0.2ml
0Cl $-6< ) "ml& 0.20 0.00 0.20 0.00 0.2 0.0
En5ima "ml& 0.)0 0."0 0.)0 0."0 0.) 0."
&aga un análisis de los resultados obtenidos para los pares de mezclas de
reacción, identificando con ellos el mecanismo propuesto para el proceso de
coagulación.
#-7 COA*ULACION ACIDA DE LA LECHE- CINETICA DE ACIDI+ICACION
DE LA LECHE POR ACCION :ACTERIANA-
Procedimiento- 0reparar una mezcla de incuación con )00 ml de leche y 4 ml de
inóculo. Hraccionar la mezcla en # tuos estériles, poniendo 4 ml exactos en cada tuo.
Gncuar a ,2°C. Cada "0 min sacar un tuo y valorar la acidez con 1a(< 0.)1.
1(B'8 $l inóculo acteriano dee ser un cultivo %resco en %ase estacionaria temprana,
con )0
#
IHCCml. $l %ermento para yogur dee tener una proporción )8) de Streptococcus
termophilus y Lactobacillus bulgaricus.