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PATOLOGÍA MOLECULAR
PATOLOGÍA MOLECULAR
CAPÍTULO 3
CAPÍTULO 3
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CONTENIDO
CONTENIDO
Introducción.
Introducción.
Estructura genética.
Estructura genética.
ase de !a tecno!og"a de! ADN
ase de !a tecno!og"a de! ADN
reco#$inante.
reco#$inante.
Ais!a#iento % o$tención de! ADN de
Ais!a#iento % o$tención de! ADN de
te&idos.
te&idos.
PCR o reacción en cadena de !a
PCR o reacción en cadena de !a
'o!i#erasa.
'o!i#erasa.
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CONTENIDO
CONTENIDO
PCR (in situ).
PCR (in situ).
PCR **CP.
PCR **CP.
Otros #étodos 'ara detectar
Otros #étodos 'ara detectar
#utaciones.
#utaciones.
Técnicas de +i$ridación.
Técnicas de +i$ridación.
Técnicas 'ara 'rote"nas.
Técnicas 'ara 'rote"nas.
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CONTENIDO
CONTENIDO
A'!icaciones de !a $io!og"a #o!ecu!ar en
A'!icaciones de !a $io!og"a #o!ecu!ar en
'ato!og"a.
'ato!og"a.
Diagnóstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
Diagnóstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
tu#ora!.
tu#ora!.
Diagnóstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
Diagnóstico #o!ecu!ar en 'ato!og"a
in,ecciosa.
in,ecciosa.
Otras a'!icaciones de !a 'ato!og"a
Otras a'!icaciones de !a 'ato!og"a
#o!ecu!ar.
#o!ecu!ar.
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CONTENIDO
CONTENIDO
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
Southern blot y Northern blot.
Southern blot y Northern blot.
Hibridación “in situ.
Hibridación “in situ.
!"SH #t$cnica de hibridación “in situ
!"SH #t$cnica de hibridación “in situ
con %luorescencia.
con %luorescencia.
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CONTENIDO
CONTENIDO
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA TUMORAL
PATOLOGÍA TUMORAL
An&lisis cito'en$tico.
An&lisis cito'en$tico.
T$cnicas (oleculares es)ec*%icas.
T$cnicas (oleculares es)ec*%icas.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

La información genética radica en dos
hebras de polinucleótidos que constituyen
el ADN.

El ADN consta de dos largas cadenas de
nucleótidos enrolladas entre s! con un
código de 4 bases"

Las bases p#ricas  Adenina y guanina.

Las bases pirimid!nicas  citosinas y timina.

Dichas bases est$n ligadas a una pentosa
%deso&irribosa' y a un grupo fosfato.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA
+structura del A,N
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

En la s!ntesis de ADN tienen que separarse
ambas hebras del mismo y cada una de
ellas sir(e de molde para que la nue(a
cadena de ADN sea complementaria de la
anterior.

En el n#cleo las moléculas de ADN est$n
pegadas y compactas constituyendo los
cromosomas.

La totalidad de la secuencias del ADN y
cromosomas se denomina )enoma.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

La unidad funcional del ADN es el gen que
es la parte de ADN que (a a dar origen a una
prote!na.

El primer paso es la transcripción o s!ntesis
de A*N.

La molécula de A*N consta de la base
uracilo en lugar de timina y de la a+#car
ribosa en (e+ de deso&irribosa.

El siguiente paso es la traducción o s!ntesis
de las proteinas a ni(el de los ribosomas.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

El lengua,e molecular con toda la
información genética se reduce a un código
donde cada amino$cido est$ representado
por tres bases de A*N que se llama codón.

Los amino$cidos que est$n en el citoplasma
son guiados hasta los ribosomas por el
llamado A*N de transferencia que tiene una
secuencia de nucleótidos complementaria
%anticodón' a la de los codones del A*Nm.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

E&isten dos secuencias en el ADN que
controlan el inicio de la transcripción y son"

Los promotores.

Los facilitadores o -enhancers..

Los promotores son secuencias del ADN
adyacentes al gen que se (a a transcribir y es
donde se unen las en+imas responsables de la
s!ntesis del A*N la A*N polimera+a y otros
cofactores.

Los facilitadores son secuencias del ADN
situadas a distancia del gen a transcribir y que
pueden regular la e&presión de dicho gen.
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA
Transcri)ción y traducción
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E*TRUCTURA GEN-TICA
E*TRUCTURA GEN-TICA

/e distingue un ADN"

0odificante  consta de e&ones.

No codificante o silente  consta de
intrones y largas secuencias repetiti(as.
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A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE

0on la tecnolog!a del ADN recombinante se
puede manipular genes y obtener grandes
cantidades de ADN.

La base de dicha tecnolog!a fue el
descubrimiento de en+imas bacterianas
llamadas en+imas de restricción que rompe
el ADN en sitios espec!ficos produciendo 
fragmentos de restricción.
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0ada en+ima reconoce una secuencia #nica
de nucleótidos y corta la cadena del ADN de
forma simétrica o de forma asimétrica.

La tecnolog!a del ADN recombinante
permite ligar ADN en pl$smidos y cósmidos
donde tras romper el ADN con las mismas
en+imas se puede integrar la secuencia
génica en los mismos.
A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE
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A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
A*E DE LA TECNOLOGÍA DEL
ADN RECOMINANTE
ADN RECOMINANTE
+s-ue(a de la tecnolo'*a del A,N reco(binante
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La técnica resumida es as!"

*eali+ar (arias secciones de parafina en el
microtomo.

Desparafinación en &ilol.

La(ar las secciones con alcohol de 123 se
secan y luego se incuban con proteinasa 4 en un
tampón con un detergente.

5osteriormente se separa el ADN por e&tracción
org$nica con fenol y croroformo que separa las
prote!nas del ADN y se precipita en ADN en
etanol.
AI*LAMIENTO 0 OTENCI/N
AI*LAMIENTO 0 OTENCI/N
DEL ADN DE TE1IDO*
DEL ADN DE TE1IDO*
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5ara que se produ+ca la s!ntesis de ADN es
necesario que se separe primero las hebras del
mismo lo que se consigue calentando las
muestras a 1260.

/e a7ade un cebador o secuencia génica
complementaria al ADN hibridación que se
produce a temperatura espec!fica %28 9 :860'.

La ADN polimerasa tiene que ir a7adiendo
nucleótidos de forma complementaria a las
hebras de ADN separadas.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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T$cnica de PC.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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La técnica de 50* se puede usar para"

Detectar inserciones génicas.

Delecciones.

;raslocaciones.

<utaciones puntuales.

/e puede reali+ar a partir de te,ido fresco o
incluido en parafina.

La principal (enta,a y des(enta,a de la 50*
es su e&tremada sensibilidad.
PCR O REACCI/N EN CADENA
PCR O REACCI/N EN CADENA
DE LA POLIMERA*A
DE LA POLIMERA*A
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/e parte de secciones de congelación o
parafina y tras la preparación tisular
adecuada se procede a reali+ar los pasos
de amplificación en cadena de la
polimerasa a7adiendo los cebadores los
nucleótidos y la ADN polimerasa a los
portas.
PCR (in situ)
PCR (in situ)
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Este método se basa en que las cadenas
sencillas de ADN con mutaciones puntuales
tienen diferente mo(ilidad electroforética en
geles de poliacridamida no
desnaturali+antes.

Las des(enta,as de este método son los
falsos negati(o
PCR **CP
PCR **CP
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+s-ue(a de la t$cnica de SSCP
PCR **CP
PCR **CP
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;enemos"

;écnica D))E %Electroforesis en gel de gradiente
desnaturali+ante.

Electroforesis en gel de poliacridamida para
heteroduple&.

A/= %Allele>/pecif oligonucleotide hybridi+ation'.

5olimorfismo de longitud de fragmentos de
restricción.

50*>alelo>espec!fico %<is><atch'.
OTRO* M-TODO* PARA
OTRO* M-TODO* PARA
DETECTAR MUTACIONE*
DETECTAR MUTACIONE*
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SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT
SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT

Ambas técnicas se usan en el an$lisis del
ADN o de A*N mediante separación de los
mismos por electroforesis y posterior
hibridación con sondas espec!ficas.

En el />? el ADN genómico se corta con
en+imas de restricción en (arios fragmentos
y luego se separa en electroforesis en gel de
agarosa.
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT
SOUTH+.N /LOT 0 NO.TH+.N1/LOT

En en N>? el A*N celular se aisla y se
separa seg#n el tama7o por electroforesis
en gel los $cidos nucleicos son
transferidos desde el gel a un filtro de papel
de nailon o nitrocelulosa al que se quedan
fi,amente unido posteriormente el filtro de
papel se hibrida con las sondas espec!ficas
para el ADN o A*N.
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T$cnica de Southern1/lottin'
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
H"/.",AC"2N “in situ
H"/.",AC"2N “in situ

;écnica histoqu!mica que permite (isuali+ar
al microscópio fragmentos de ADN o A*N.

;iene dos grandes (enta,as"

La positi(idad se detecta en secciones
tisulares.

La técnica se puede reali+ar a partir de
secciones de hasta 2 micras.
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T$cnica de hibridación “in situ
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
!"SH
!"SH

/e basa en la utili+ación de sondas
espec!ficas para determiandos cromosomas
o secuencias de los mismos.

5ermite estudiar alteraciones genéticas
concomitantemente con la (isuali+ación de
las células y en el conte&to tisular de las
lesión.
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T-CNICA* DE .IRIDACI/N
T-CNICA* DE .IRIDACI/N
!"SH
!"SH

/e puede utili+ar en cromosomas en
metafase como en interfase.

La técnica consiste en desnaturali+ar el ADN
con calor incubar las células con
formamida y tampón salino y
posteriormente hibridarlas con las sondas
espec!ficas.
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Entre los métodos utili+ados en patolog!a
tenemos"

0itometr!a de flu,o  para el estudio de
marcadores linfoides de ant!genos de
diferenciación.

@estern>blot o inmunoblot  en el cual las
muestras tisulares se aislan de las prote!nas y se
corren en un gel de poliacrilamida
desnaturali+ante y se hace una transferencia de
las mismas a un papel donde se reali+an la
detención mediante anticuerpos espec!ficos.
T-CNICA* PARA PROTEÍNA*
T-CNICA* PARA PROTEÍNA*
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T$cnica de 3estern /lot
T-CNICA* PARA PROTEÍNA*
T-CNICA* PARA PROTEÍNA*
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/e pueden aplicar en"

*eordenamiento genético en procesos
linfoproliferati(os.

Estudios de alteraciones oncogénicas.

Adentificación de agentes infecciosos.

Estudio de alteraciones genéticas
hereditarias.

Adentificación de muestra.

Estudio de metabolopat!as.
APLICACIONE* DE LA
APLICACIONE* DE LA
IOLOGÍA MOLECULAR
IOLOGÍA MOLECULAR
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DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA TUMORAL
PATOLOGÍA TUMORAL
AN4L"S"S C"TO5+N6T"CO
AN4L"S"S C"TO5+N6T"CO

Los incon(enientes que tiene esta técnica
en el estudio de tumores son"

Dificultad de culti(ar células de tumores
sólidos.

/olo detecta las alteraciones genéticas que
conlle(en a cambios morfológicos de los
cromosomas.
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An&lisis cito'en$tico y (olecular de c$lulas tu(orales
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA TUMORAL
PATOLOGÍA TUMORAL
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DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA TUMORAL
PATOLOGÍA TUMORAL
T6CN"CAS 7OL+CULA.+S +SP+CÍ!"CAS
T6CN"CAS 7OL+CULA.+S +SP+CÍ!"CAS

/outhern ?lot.

50*.

Estudio de predisposición genética del
c$ncer.
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En la (aloración de las técnicas de biolog!a
molecular en patolog!a infecciosa hay dos
puntos importantes"

La posibilidad de falsos positi(os.

/e detecta al agente infeccioso pero no
puede concluirse que esté causando la
enfermedad.
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA IN2ECCIO*A
PATOLOGÍA IN2ECCIO*A
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En patolog!a molecular tanto en las biopsias
como en las autopsias se pueden utili+ar
para detectar microorganismos las técnicas
de"

Bibridación de $cidos nucleicos.

Amplificación en cadena de la polimerasa
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
DIAGN/*TICO MOLECULAR EN
PATOLOGÍA IN2ECCIO*A
PATOLOGÍA IN2ECCIO*A
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E&isten di(ersas técnicas que se utili+an en los
siguientes grupos de enfermedades"

Las enfermedades neurodegenerati(as.

Enfermedades cardio(asculares.

Enfermedades metabólicas.
OTRA* APLICACIONE* DE LA
OTRA* APLICACIONE* DE LA
PATOLOGÍA MOLECULAR
PATOLOGÍA MOLECULAR