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e-ciência, v.1, n.1, out.

2013


AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E MODULATÓRIA DE
EXTRATOS METANÓLICO E HEXÂNICO DA CASCA DE Sideroxylon obtusifolium


Lívia Maria Garcia Leandro
1
; Pedro Everson Alexandre de Aquino; Rakel Olinda Macedo;
Fabíola Fernandes Galvão Rodrigues; Tassia Thaís de Alencar Martins Guedes; Alisson Dias
Frutuoso; Henrique Douglas Melo Coutinho
2
; João Marcelo Alvarenga Braga
3
; Tatianne
Régia Gomes Ribeiro
4;
Edinardo Fagner Ferreira Matias
5































1
Graduandos de Biomedicina Faculdade de Ciências Aplicadas Doutor Leão Sampaio
2
Professor Doutor da Universidade Regional do Cariri
3
Professor Doutor da Universidade do Estado do Rio de Janeiro
4
Professora Mestra da Universidade Federal do Ceará
5
Professor Mestre da Faculdade de Ciências Aplicadas Doutor Leão Sampaio

e-ciência, v.1, n.1, out. 2013
RESUMO
Sideroxylon obtusifolium, conhecida popularmente na região cearense como quixabeira, é
bastante utilizada de maneira etnofarmacológica para o combate de diversas infecções como:
dores no trato gastrointestinal, inflamações crônicas, lesões nas genitais, inflamações nos
ovários, cólicas, problemas renais, problemas cardíacos e diabetes. Este trabalho tem como
principal fundamento avaliar a atividade antimicrobiana e modulatória de extratos metanólico
e hexânico da casca de Sideroxylon obtusifolium frente a cepas de bactérias padrões e
multirresistentes. O extrato metanólico e hexânico da casca de S. obtusifolium foi analisado
para a atividade antibacteriana por meio de teste de microdiluição para determinação de
concentração inibitória mínima (CIM) e modulação de aminoglicosídeos (neomicina,
gentamicina e amicacina). Na avaliação da CIM foram obtidos resultados ≥ 1024µg/mL com
as bactérias (Escherichia coli; Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa) tanto para
o extrato metanólico, quanto para o extrato hexânico. O extrato metanólico não apresentou
grau de modulação clinicamente relevante perante cepas de bactérias multirresistentes S.
aureus e E. coli. Em relação a P. aeruginosa, o extrato metanólico mostrou atividade
sinérgica quando combinado com amicacina. O extrato hexânico mostrou atividade sinérgica
para SA 358 quando combinado com gentamicina e amicacina; para EC 27 quando
combinado com amicacina e neomicina; e para PA 03 quando combinado com amicacina.
Novas e aprofundadas pesquisas são necessárias para uma possível utilização desses produtos
naturais combinados aos antimicrobianos testados (aminoglicosídeos) frente às linhagens
patogênicas. Através dos resultados sugere-se que os produtos naturais representam fontes
promissoras no combate à resistência bacteriana.
Palavras-chave:.Escherichia coli. Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa.
fitoterápicos.



























e-ciência, v.1, n.1, out. 2013
ABSTRACT
Sideroxylon obtusifolium, popularly known in the Ceará region as Quixabeira, is widely used
in the ethnopharmacological way to fight various infections of the gastrointestinal tract such
as pain, chronic inflammations, genital lesions, inflammation of the ovaries, cramps, kidney
problems, heart problems and diabetes. This work has as main basis to evaluate the
antimicrobial activity and modulatory methanol and hexane extracts of bark Sideroxylon
obtusifolium against strains of multiresistant bacteria and patterns. The methanol and hexane
extract of the bark of S. obtusifolium was analyzed for antibacterial activity by microdilution
test for determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and modulation of
aminoglycosides (neomycin, gentamicin and amikacin). In the evaluation of MIC ≥
1024μg/mL results were obtained with bacteria (Escherichia coli, Staphylococcus aureus and
Pseudomonas aeruginosa) for both the methanol extract, and for the hexane extract. The
methanol extract showed no clinically relevant degree of modulation against multiresistant
bacterial strains S. aureus and E. coli. About the P. aeruginosa, the methanol extract showed
synergistic activity when combined with amikacin. The hexane extract showed synergistic
activity for SA 358 when combined with gentamicin and amikacin, for EC 27 when combined
with amikacin and neomycin, and PA 03 when combined with amikacin. New and in-depth
research is needed for a possible use of these natural products combined to antimicrobials
(aminoglycosides) against the pathogenic strains. Through the results, it is suggested that
natural products represent promising sources to combat bacterial resistance.
Keywords: Escherichia coli. Staphylococcus aureus. Pseudomonas aeruginosa. herbal.





















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1 INTRODUÇÃO

O uso de produtos naturais vem contribuindo para resultados relevantes em
tratamentos terapêuticos (FIGUEREDO et al., 2013). Uma das formas mais conhecidas de
aproveitamento da biodiversidade é o preparo tradicional de fitoterápicos. A utilização de
plantas em medicina tradicional deriva da cultura intrínseca e do folclore de cada sociedade.
Com o desenvolvimento de novas tecnologias foi possível o estudo mais aprofundado dessas
plantas, isolando substâncias responsáveis pelo seu efeito farmacológico e assim criando
drogas com o princípio ativo purificado e melhorado (SCHENKEL; GOSMANN;
PETROVICK, 2001).
Sapotaceae é uma família que compreende 11 gêneros e cerca de 450 espécies
neotropicais com representantes desde a região sul dos Estados Unidos, até Paraguai, Uruguai
e Chile. São componentes importantes em florestas úmidas, mas ocorrem também em savanas
e em zonas semiáridas. No bioma cerrado, ocorrem pelo menos sete gêneros e cerca de 20
espécies (GAMA; BARBOSA; OLIVEIRA, 2011). As sapotáceas são árvores que possuem
látex, geralmente branco, em todas as partes da planta (RIBEIRO, 1999).
O gênero Sideroxylon possui 69 espécies de regiões subtropicais e tropicais
(TRESSENS, 1996). Sideroxylon obtusifolium (Humb. ex Roem. E Schult) T.D. Penn.,
conhecida como “Quixabeira”, “Quixaba” ou “Rompe-gibão”, é uma espécie que ocorre no
Bioma da Caatinga na região do Nordeste, no terreno arenoso da costa litorânea do Ceará e do
Rio Grande do Sul, no Pantanal Mato-Grossense, sendo muito frequente no Vale do São
Francisco (ARAUJO NETO et al., 2010). É característica das várzeas úmidas e da beira de
rios da Caatinga arbórea, das restingas litorâneas e da mata chaquenha do Pantanal Mato-
Grossense (GARRIDO et al., 2007).
S. obtusifolium é muito utilizada na medicina popular, a sua casca é usada para dores
no trato gastrointestinal, inflamações crônicas, lesões nas genitais, inflamações nos ovários,
cólicas, problemas renais, problemas cardíacos e diabetes (BELTRÃO et al., 2008). A folha e
o fruto também são utilizados para os mesmos fins medicinais (ALBURQUERQUE et al.,
2011).
Muitas plantas têm demonstrado grande potencial de forma direta como
antimicrobianos, como também apresentam substâncias capazes de modular a ação dos
antibióticos. Assim, as companhias farmacêuticas, como também os herboristas, dependem,
em grande parte, da natureza para a produção de drogas com fins comerciais (MATIAS et al.,
2010a).

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As linhagens patogênicas de Escherichia coli têm sido identificadas nos humanos
como causa primária de infecções no trato urinário, meningite neonatal, septicemia
nosocomial e enterites. Staphylococcus aureus é uma bactéria esférica, Gram-positivo, do
grupo dos cocos. É a espécie de maior interesse clínico, principalmente em ambiente
nosocomial. Está frequentemente relacionado com diversas infecções em seres humanos.
Pseudomonas aeruginosa pode causar infecções nosocomiais graves, com elevada letalidade.
Atualmente, se posiciona entre as principais bactérias causadoras de infecções hospitalares.
Outra característica marcante e preocupante desta espécie é a resistência cruzada aos
antimicrobianos, que resulta da co-resistência, ou seja, da presença de múltiplos mecanismos
de resistência num único hospedeiro levando à resistência a múltiplos fármacos
(FIGUEREDO et al., 2007; SANTOS et al., 2007; VON BAUM; MARRE, 2005).
A resistência bacteriana representa um alvo relevante das mais atuais publicações
sobre antimicrobianos. É uma das principais causas de emergência das doenças infecciosas e
do aumento da mobilidade, mortalidade e custos em saúde, decorrentes da redução das opções
terapêuticas eficazes contra os micro-organismos resistentes. Tal aumento de resistência dos
microrganismos aos antibióticos comumente usados é, atualmente, uma preocupação da saúde
pública tanto nos países desenvolvidos como nos subdesenvolvidos (SILVA, 2009).
Portanto, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana e
modulatória de extratos metanólico e hexânico da casca de Sideroxylon obtusifolium frente a
cepas de bactérias padrões e multirresistentes, como também avaliar o espectro de ação e o
grau de inibição dos extratos obtidos a partir da mesma, determinando a Concentração
Inibitória Mínima (CIM) dos extratos mais efetivos, verificando a eficácia dos mesmos na
modulação da resistência bacteriana à aminoglicosídios.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Material vegetal

Cascas de Sideroxylon obtusifolium foram coletadas no município de Palestina, Ceará,
Brasil. O material vegetal foi identificado e uma exsicata da espécie foi depositada no
Herbário RB na coleção do Instituto de Pesquisa Jardim Botânico.

2.2 Material bacteriano


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Os micro-organismos utilizados nos testes foram obtidos através do Laboratório de
Microbiologia e Biologia Molecular (LMBM) da Universidade Regional do Cariri (URCA).
Foram utilizadas linhagens padrão de bactérias Escherichia coli ATCC 10536;
Staphylococcus aureus ATCC 25923; Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 e
multirresistentes da espécie Escherichia coli 27, Staphylococcus aureus 358 e Pseudomonas
aeruginosa 03. Antes dos ensaios, as linhagens foram cultivadas a 35ºC por 24 horas em
Brain Heart Infusionbroth – BHI (Difco Laboratories Ltda).

2.3 Preparação dos extratos metanólico e hexânico

Para preparação dos extratos foram coletadas cascas que permaneceram submersas em
metanol e hexano separadamente por 72h. Após esse período, o eluente foi filtrado em papel
filtro para separação dos resíduos sólidos e concentrado em condensador rotativo a vácuo e
banho-maria (model Q-214M2 – Quimis, Brazil) (BRASILEIRO et al., 2006), obtendo-se
rendimentos dos extratos brutos apresentados. Para os testes foram utilizadas soluções
preparadas a partir dos extratos sob uma concentração de 10 mg/mL, dissolvidos em DMSO
(dimetil sulfóxido), em seguida diluídos com água destilada para uma concentração de 1024
μg/mL.

2.4 Teste de atividade antibacteriana

A CIM (concentração inibitória mínima) foi determinada em ensaio de microdiluição
em caldo (NCCLS, 2003) utilizando-se um inóculo de 100 μL de cada linhagem, suspensas
em caldo BHI que apresentava uma concentração de 10
5
UFC/mL em placas de microtitulação
com 96 poços, com diluições em série ½. Em cada poço foi adicionado 100μL de solução de
cada extrato. As concentrações finais dos extratos variaram entre 512 – 8 μg/mL. Para os
controles foram utilizados os antibióticos padrões amicacina, gentamicina e neomicina
(Sigma) cujas concentrações finais variaram entre 512 μg/mL – 8,0 μg/mL. As CIMs foram
registradas como as menores concentrações para a inibição do crescimento. Para evidenciá-
las, preparou-se uma solução indicadora de resazurina sódica (Sigma) em água destilada
estéril na concentração de 0,01% (p/v). Após a incubação, 20 µL da solução indicadora serão
adicionados em cada cavidade e as placas passarão por um período de incubação de 1 hora em
temperatura ambiente. A mudança de coloração azul para rosa, devido à redução da
resazurina, indica o crescimento bacteriano (JAVADPOUR et al., 1998), auxiliando a

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visualização da CIM, definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento
microbiano, evidenciado pela cor azul inalterada. O ensaio antibacteriano foi realizado em
duplicata e os resultados foram expressos como média das repetições.

2.5 Execução e Leitura dos Ensaios

Os extratos foram misturados em caldo BHI 10% em concentrações subinibitórias,
obtidos e determinados após a realização de teste de avaliação da CIM, sendo que para o teste
de modulação a concentração da solução de extrato foi reduzida 8 (oito) vezes(CIM/8). A
preparação das soluções de antibióticos foi realizada com a adição de água destilada estéril
em concentração dobrada (1024µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes
de 100µL diluídos seriadamente 1:1 em caldo BHI 10%. Em cada cavidade com 100µL do
meio de cultura continha a suspensão bacteriana diluída (1:10). Os mesmos controles
utilizados na avaliação da CIM para os extratos foram utilizados durante a modulação
(COUTINHO et al., 2008). As placas preenchidas foram incubadas a 35ºC por 24 horas e
após esse período a leitura foi evidenciada pelo uso de resazurina como citado anteriormente
no teste de determinação da CIM.

3 RESULTADOS

Após a realização do teste de Concentração Inibitória Mínima (CIM) com bactérias
(Escherichia coli; Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa) foram obtidos
resultados ≥ 1024µg/mL tanto para o extrato metanólico, quanto para o extrato hexânico
(Tabela 1).
Tabela 1.Concentração inibitória mínima(CIM) (μg/mL) dos extratos metanólico e hexânico de Sideroxylon
obtusifolium
Extratos EC 27 EC-
ATCC
10536
SA 358 SA-
ATCC
25923
PA 03 PA-
ATCC
15442
EMSO ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024
EHSO ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024 ≥1024
EMSO – Extrato Metanólico de Sideroxylon obtusifolium; EHSO – Extrato Hexânico de Sideroxylon
obtusifolium; EC – Escherichia coli, SA – Staphylococcus aureus, PA- Pseudomonas aeruginosa.



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O extrato metanólico não apresentou grau de modulação clinicamente relevante
perante cepas de bactérias multirresistentes S. aureus e E. coli. Em relação a P. aeruginosa, o
extrato metanólico mostrou atividade sinérgica quando combinado com amicacina. O extrato
hexânico mostrou atividade sinérgica para S. aureus 358, quando combinado com
gentamicina e amicacina, para E. coli 27, quando combinado com amicacina e neomicina,e
para P. aeruginosa 03, quando combinado com amicacina ( Tabela 2).
Tabela 2.Concentração inibitória mínima (μg/mL) de aminoglicosídeos na ausência e presença do EMSO e
EHSO Escherichia coli27, Staphylococcus aureus 358 e Pseudomonas aeruginosa 03
Escherichia coli EC27
EMSO EHSO Controle
Amicacina(µg/mL)
Neomicina(µg/mL)
Gentamicina(µg/mL)
312,50
156,25
78,12
78,12
39,06
78,12
312,50
156,25
78,12
Staphylococcus aureus - SA358
EMSO EHSO Controle
Amicacina(µg/mL)
Neomicina(µg/mL)
Gentamicina(µg/mL)
625,00
39,06
78,12
156,25
39,06
4,88
625,00
39,06
78,12
Pseudomonas aeruginosa- PA03
EMSO EHSO Controle
Amicacina(µg/mL)
Neomicina(µg/mL)
Gentamicina(µg/mL)
156,25
312,50
78,12
78,12
312,50
78,12
625,00
312,50
78,12
EMSO – Extrato Metanólico de Sideroxylon obtusifolium; EHSO – Extrato Hexânico de Sideroxylon
obtusifolium;EC – Escherichia coli, SA – Staphylococcus aureus, PA- Pseudomonas aeruginosa.

4 DISCUSSÃO

Testes fitoquímicos realizados por Silva (2008), onde se analisou através de
cromatografia em camada delgada (placas de gel de sílica Merck - Alemanha, Art.105554)
com o emprego de diversas fases móveis e reveladores específicos (HARBORNE, 1998;
METZ, 1961; NEU, 1956; WAGNER; BLADT, 1996), compostos em Sideroxylon
obtusifolium, como flavonóides, mono e sesquiterpenos, proantocianidinas condensadas e
leucoantocianidinas, triterpenos, esteróides e açúcares. As partes analisadas apresentaram-se
semelhantes quanto à presença desses metabólitos, porém, o caule das plantas adultas

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apresentou uma variedade maior de proantocianidinas condensadas, leucoantocianidinas e
açúcares.
Os flavonóides são sintetizados por plantas em resposta à infecção microbiana. A
atividade antibacteriana é devido à capacidade de formar complexos com proteínas solúveis
extracelulares que se ligam na parede celular da bactéria. Mono e sesquiterpenos são os
principais componentes dos óleos essenciais, e como as proantocianidinas e
leucoantocianidinas também são ativos contra bactérias (AHAMD et al.,1993).
Foi observado um efeito sinérgico do extrato hexânico da Sideroxylon obtusifolium
quando combinado aos antibióticos reduzindo o CIM dos mesmos contra as linhagens
bacterianas utilizadas, semelhante a outros resultados de estudos com produtos naturais de
origem vegetal, como o estudo feito por Matias et al., (2010b) que avaliou a atividade
antibacteriana da Croton campestris A., Ocimum gratissimun L. e Cordia verbenaceae DC
mostrando uma melhor atividade antibacteriana do extrato hexânico. Este resultado pode ser
devido à presença de compostos com reconhecida atividade antibacteriana, tais como taninos,
flavonóides e terpenos, extraídos principalmente por solventes apolares como o hexano. O
extrato metanólico também apresentou sinergismo contra as cepas da Pseudomonas
aeruginosa em associação com a amicacina.
Muitos estudos demonstraram que extratos e óleos essenciais de plantas podem
modificar a atividade de antimicrobianos e assim melhorar seu desempenho diminuindo a
concentração necessária para que haja inibição do crescimento. Fato constatado com o estudo
das plantas Turner aulmifolia, Momordica charantia, Mentha arvensis, Cordia verbenaceae.
A capacidade dos produtos naturais em modificar a ação de antimicrobianos pode ser vista a
partir de estudos que demonstram que a associação de drogas sintéticas e extratos de plantas
podem atuar revertendo a resistência microbiana eliminando plasmídios e inibindo a bomba
de efluxo. (COUTINHO et al., 2009; COUTINHO et al., 2010; MATIAS et al., 2010b).

5 CONCLUSÃO

O estudo demonstrou que os extratos metanólico e hexânico de Sideroxylon
obtusifolium não apresentaram atividade relevante frente às cepas bacterianas testadas. Em
contrapartida, os testes com a modulação do extrato hexânico reduziram a CIM das cepas
bacterianas multirresistentes utilizadas, diferente do extrato metanólico que mostrou efeito
modulatório com amicacina apenas contra as cepas da Pseudomonas aeruginosa, já que
possuem compostos com reconhecida atividade antibacteriana.

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Novas e aprofundadas pesquisas são necessárias para uma possível utilização desses
produtos naturais combinados aos antimicrobianos testados (aminoglicosídeos) frente às
linhagens patogênicas. Os resultados obtidos no presente estudo são promissores e poderão
estimular futuras pesquisas sobre o uso de produtos naturais a fim de favorecer a sua
viabilização na utilização no combate à resistência microbiana.

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