SOAL

:
1. Pengikatan biomolekul terhadap substrat padat pada berbagai deteksi dapat melalui
berbagai jalur diantaranya:
1. Pengikatan covalent antara polysterene microplate pada ELISA/poly-l-lysin
glass slide pada imunohistokimia dengan antibodi/antigen yang diuji.
2. Direct ionic binding
3. Perantaraan avidin biotin complex
Jelaskan perbedaan ketiga jalur diatas dengan menitikberatkan pada skema interaksi yang
terjadi, kelebihan, dan kelemahan masing-masing!
2. Bagaimana pelabelan antibody dan enzim dapat dilakukan? Jelaskan jawaban
saudara serta berikan contoh teknik pelabelan antibody dan enzim yang saudara
ketahui.

JAWABAN :
1. a) Pengikatan covalent antara polysterene microplate pada ELISA/poly-l-lysin glass slide
pada imunohistokimia dengan antibodi/antigen yang diuji.
Imunohistokimia merupakan metode visualisasi/pewarnaan sel dan jaringan dalam
penelitian yang digunakan dengan dasar ikatan reaksi antigen – antibody. Salah satu
metodenya ialah ELISA. Antibodi atau antigen pada ELISA agar tidak bergerak atau
berpindah maka diletakkan pada bahan padat. Bahan padat yang dipakai dalam ELISA
terbuat dari selulosa, dextran cross linked, poliacrilamide, polistiren dan polipropilen.
Bahan padat tersebut dapat berupa butiran, lempeng(microplate) atau tabung. Microplate
yang sering digunakan yaitu yang terbuat dari polysterene atau poliolefin. Microplate dari
bahan tersebut mampu mengikat biomolekul seperti antigen atau antibody. Interaksi antara
antigen atau antibodi membentuk ikatan kovalen mengikat dengan bahan padat seperti
adanya protein target yang telah berikatan dengan microplate akan membuat ikatan
dengan antibodi spesifik yang ditambahakan ke dalam microplate. Selanjutnya kompleks
protein yang telah berikatan dengan antibodi spesifiknya tersebut akan dapat berikatan
dengan antibodi lain yang telah dilabel (antibodi sekunder). setelah antibodi sekunder
sudah terikat pada bahan padat maka untuk menghasilkan perubahan warna perlu
ditambahkan subsrat
Kelebihan : dapat digunakan untuk banyak sampel
Kekurangan : waktu yang dibutuhkan lama
b) Direct ionic binding
Ikatan ion didefinisikan sebagai kekuatan elektro statik antara gugusan bermuatan positif
dan terjadi didalam dan diantara biomolekul. Sebagaian besar gugusan fungsional dari
biomolekul merupakan asam atau basa Bronsted-Lowry dan terionisasi pada pH fisiologis.
Proses ikatan ionik langsung terjadi ketika inti atom yang bermuatan positif secara
dominan melebihi muatan positif inti atom lainnya, sehingga secara efektif menyebabkan
satu atom mentransfer elektronnya ke atom yang lain. Hal ini menyebabkan satu atom
bermuatan positif dan yang lainnya bermuatan negatif secara keseluruhan. Ikatan ionik
terjadi antara gugusan bermuatan positif dan negatif dalam molekul protein yang sangat
berpengaruh dalam menentukan bentuk dan fungsi. Interaksi biologis terjadi antara
makromolekul( protein: antigen/antibodi) dengan enzim.
Kelebihan : bagus untuk senyawa yang cenderung berikatan ion
Kekurangan : hasil dipengaruhi konsentrasi ion larutan substrat dan pH
c) Avidin-biotin kompleks
Biotin, juga dikenal sebagai vitamin H, adalah molekul kecil (BM 244,3) yang terdapat
dalam jumlah kecil dalam semua sel mahkluk hidup dan sangat penting untuk sejumlah
proses biologis. Sisi rantai asam valeric dari molekul biotin dapat diderivatisasi untuk
menggabungkan pada berbagai kelompok reaktif yang digunakan untuk mengikatkan
biotin dengan molekul lain. Dalam konteks Imunohistokimia, biotin adalah konjugasi
antibodi atau enzim yang digunakan untuk mendeteksi antigen target.
Avidin memiliki Afinitas yang tinggi untuk membentuk komplek avidin biotin. Yang
memungkinkan biotin yang mengandung molekul dalam campuran kompleks untuk secara
khusus terikat untuk avidin. Avidin adalah glikoprotein ditemukan dalam putih telur dan
jaringan burung, reptil dan amfibi. Ini berisi empat subunit identik. Setiap subunit terdiri
dari 128 asam amino dan mengikat satu molekul biotin, dengan demikian, total empat
molekul biotin dapat mengikat molekul avidin tunggal. Luasnya glikosilasi pada avidin
sangat tinggi; karbohidrat mencapai sekitar 10% dari massa total tetramer tersebut. Avidin
memiliki titik isoelektrik dasar (PI) 10 sampai 10,5 dan stabil melalui berbagai pH dan
suhu. Modifikasi kimia yang luas memiliki sedikit efek pada aktivitas avidin, sehingga
sangat berguna untuk pemurnian protein. Namun, karena kandungan karbohidrat dan pi
dasar, avidin akan cenderung membentuk ikatan nonspesifik.
Kompleks avidin-biotin dikenal sebagai interaksi antara protein dan ligan secara non
kovalen yang terkuat. Pembentukan ikatan antara biotin dan avidin sangat cepat, dan
apabila telah terbentuk tidak akan terpengaruh oleh pH ekstrem, suhu, pelarut organik dan
agen denaturing lainnya. Avidin memiliki kemampuan mendeteksi atau memurnikan
protein berlabel biotin atau molekul lain sangat berguna untuk sejumlah aplikasi biomedis.
proses terbentuknya avidin dan biotin ialah Antibodi primer diinkubasi dengan sampel
jaringan untuk memungkinkan mengikat antigen target. Lalu diinkubasi selama 1 jam
pada suhu ruang atau selama 24 jam pada suhu 4
o
C. Lalu Sebuah antibodi sekunder
terbiotinilasi, dengan spesifisitas terhadap antibodi primer, diinkubasi dengan sampel
jaringan untuk memungkinkan mengikat antibodi primer. Lalu di inkubasi selama 1 jam
pada suhu kamr. Sebuah enzim terbiotinilasi (HRP atau AP) prainkubasi dengan avidin
bebas untuk membentuk avidin-biotin-enzim kompleks. Biasanya, avidin dan enzim
terbiotinilasi dicampur bersama dalam rasio tertentu untuk mencegah kejenuhan avidin dan
diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar untuk membentuk kompleks.
Sebuah alikuot larutan ini kemudian ditambahkan ke dalam sampel jaringan, dan seluruh
situs biotin-binding di avidin mengikat untuk biotinylated antibodi yang sudah terikat
untuk jaringan . Hasilnya adalah terbentuknya enzim dengan konsentrasi yang besar
(molekul enzim 3-1 molekul avidin) di lokasi antigen dan karena itu terjadi peningkatan
intensitas sinyal dan sensitivitas ketika ditambahkan penambahan substrat. Perubahan
warna akan terjadi apabila ditambahkan streptavidin sebagai substrat.
Kelebihan : Sangat sensitive karena tempat ikatan substrat lebih banyak dan afininitas
kompleks avidin-biotin tinggi maka lebih stabil. Ikatan yang terbentuk sangat kuat tidak
terpengaruh oleh pH ekstrem, temperatur, pelarut organik dan agen denaturing yang lain.
 Kekurangan : Membutuhkan waktu yang cukup lama, avidin dapat menempel
pada bahan padat sehingga apabila ditambahkan substart akan terjadi perubahan
warna.
Bagaimana Pelabelan antibodi dan enzim dilakukan? Jelaskan jawaban saudara serta
berikan contoh pelabelan antibodi dan enzim yang diketahui
2. Pelabelan Antibody dan Enzim
Struktur molekul antibodi pada daerah konstan akan memungkinkan untuk berikatan secara
kovalen dengan berbagai jenis label. Ikatan ini tidak akan mempengaruhi ikatan antigen-
antibodi yang terjadi pada daerah variabel. Pelabelan antibodi pada umumnya
menggunakan enzim( enzim imunoasay). Enzyme immunoassay(EIA) adalah tes untuk
mendeteksi antigen atau antibodi dengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa
substrat sehingga terjadi perubahan warna. Metode enzim imunoassy menggunakan sifat
katisa dari enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Enzim dan
substratnya berfungsi mendeteksi jumlah antigen atau antibodi yang terdapat pada sampel.
Enzim yang berlabel yang sering digunakan ialah alkaline phosphatase, Glocose-6-
phosphatase dehydrogenase dan β-galactosidase.
Pelabelan antigen dengan enzim menggunakan prinsip konjugasi untuk menghasilkan
ikatan kovalen. Pelabelan antibody menghasilkan deteksi direct dan indirect dari antigen.
Pada deteksi direct, label berikatan kovalen dengan antibodi primer. Sedangkan pada
deteksi indirect label berikatan kovalen dengan antibodi sekunder. Bahan kimia yang
dipakai untuk label antibody ada empat yaitu NHS ester (berupa tinta fluorosense), reagen
heterobifunctional (berupa molekul protein seperti HRP, fosfatase alkali, atau
phycoerythrin) , carbodiimides dan sodium periodate
Langkah dari enzim imunoassay ialah sebuah plat plastik dilapisi dengan antigen . Antigen
bereaksi dengan antibodi pada serum sampel. plat kemudian diinkubasi dengan sebuah
gabungan enzim-antibodi berlabel. Jika terdapat antibodi,gabungan tersebut bereaksi
dengan kompleks antigen-antibodi pada plate.Aktivitas enzim diukur dengan
spektrofotometer setelah penambahan substratkromogenik spesifik. Misalnya, peroksidase
mengkatalisa substratnya,o-dianisidine,menyebabkan perubahan warna. Pada beberapa kit ,
tes EIA dapat dibaca secara langsung(visual).
Enzim imunoasay terbagi menjadi dua jenis yaitu heterogen dan homogen. Enzim
imunoasay yang heterogen aktifitas label enzim tidak dipengaruhi oleh reaksi antigen dan
antibodi dan diperlukan pemisahan fraksi terikat dan tidak terikat hal ini dikarenakan Pada
sistim heterogen, sifat label sebelum dan sesudah reaksi tetap sama, jadi perlu pemisahan
komponen reaktan yang berlebih dengan kompleks Ag-Ab yang terbentuk, sebab kuantitas
kompleks ini yang akan dihitung.Sedangkan pada enzim imunoasay homogen aktivitas
enzim sebagai label bergantung pada reaksi antigen-antibodi sehingga tidak diperlukan
pemisahan karena sifat label sebelum dan sesudah reaksi sangat berbeda, jadi tidak perlu
lagi pemisahan komponen reaktan secara fisis.
1. Teknik ELISA kompetitif
Teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat
antibodi-enzim.
2. Teknik ELISA nonkompetitif / ELISA Sandwich
Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi (primer dan
sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan
dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA
nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
3. ELISA Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik ini seringkali
digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada sampel. ELISA
direct menggunakan suatu antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendeteksi keberadaan
antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji.
4. ELISA Indirect
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik
(monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi
keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Contoh dari pelabelan antibodi menggunakan enzim:
 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Elisa adalah tehnik imunoassay yang menggunakan enzim sebagai label untuk amplifikasi
dan visualisasi reaksi primer ikatan antigen-antibodi. Pelabelan dapat dilakukan baik pada
antigen atau antibodi. Antibodi yang digunakan dalam ELISA dapat berupa antibodi
poliklonal atau antibodimonoklonal. ELISA pada umumnya menggunakan solid phase dan
untuk reaksi kompetitif.
 IEMA (immunoenzymetric assay)
Berdasarkan teknik sandwich untuk reaksi non-kompetitif.
Tujuan dari tehnik ini mendeteksi antibodi dalam serum (berbeda dengan model
sebelumnya). Antigen yang digunakan biasanya berlebih dan terikat pada matrix tertentu,
serum yang akan dideteksi jenis antibodinya (antibodi primer) biasanya merupakan
antibodi poliklonal direaksikan dengan antigen tersebut. Reaksi ini memerlukan suatu anti-
antibodi (antibodi sekunder) terhadap antibodi yang akan dideteksi tadi. Antibodi sekunder
inilah yang biasanya dilabel dan dapat bereaksi dengan bagian Fc dari molekul antibodi
primer, sehingga kandungan antibodi dalam serum dapat ditentukan..
 EMIT (enzyme-multiplied immunoassay technique)
Metode tanpa pemisahan dengan menggunakan label enzim terkonjugasi pada hapten
disertai reaksi deteksi menggunakan perubahan substrat membentuk produk reaksi
enzimatik.