You are on page 1of 7

http://www.flandersfood.

com/artikel/2009/04/02/immobilisatie-van-%C3%9F-
alactosidase
!mmobilisatie van de en#$men op de Ca-alinaat-#etmeel-beads ed%rende 2 maanden
#ort voor &'% beho%d van de activiteit van de en#$men. ()F eimmobiliseerde
en#$men hebben na & weken al een verlies van 3'% van de activiteit van de en#$men.
Immobilisatie van enzymen
Beatriz M. Brena and Francisco Batista-Viera
!n dit deel van de literat%%rst%die worden de verschillende methodes besproken die *e
kan %itvoeren om en#$men te immobiliseren en het n%t van het immobiliseren.
!nleidin
!mmobilisatie van een en#$m is een manier om de stabiliteit van het en#$m te
verbeteren. )ierbi* worden en#$men f$siek beperkt of elokaliseerd op een bepaald
vaste draer of matri+ #odat men h%n activiteit optimaal kan ebr%iken.
,oor het en#$m te immobiliseren wordt de levensd%%r van het en#$m aan#ienli*k
verlend en is het beter beschermd teen veranderende condities in de reactor #oals
p)- temperat%%r- concentratie van het reaens-... . .ri*e en#$men #i*n immers minder
eschikt als #e in minder optimale omstandiheden van de s%bstraatcondities eplaatst
worden omdat #e dab heel snel onstabiel worden.
/a een reactie is het %iterst moeili*k om de#e vri*e en#$men ter% te verwi*deren van de
reactor en #i*n prod%cten- wat betekent dat men de en#$men niet kan herebr%iken.
0n#$men #i*n helemaal niet oedkoop d%s is het belanri*k om #%ini met de proteinen
om te aan en #e te herebr%iken- #eker in ind%striele processen waar men op rote
schaal met hen werkt. ,e ind%strie wilt de prod%ctie kosten van h%n afewerkte
eindprod%cten #olaa moeli*k ho%den- daarom is er al veel onder#oek edaan naar het
immobiliseren van en#$men om #e te stabiliseren en herebr%iken in processen.
,e en#$men k%nnen reacties katal$seren onder mildere condities met een hoe
na%wke%riheid op vlak van s%bstraat specificiteit waardoor er ook minder onewenste
bi* prod%cten worden eprod%ceerd. Chemische bindinen in levende s$stemen of
molec%len worden etransformeerd door de en#$men #odat %iteindeli*k de
eienschappen van molec%len verandert. 1ol%celen bevatten d%i#enden af#onderli*k
atomen die eoraniseerd #i*n in een bepaalde str%ct%%r en volorde en hebben
afhankeli*k van de#e str%ct%%r elk h%n eien f%nctie in bioloische of chemische
processen. )et #i*n de en#$men die de#e str%ct%%r k%nnen veranderen door de volorde
te veranderen #odat de f%nctie/eienschappen van de molec%len verandert.
2i* het immobiliseren #i*n er 3 hoofd factoren die het %iteindeli*ke het rendement van het
e3mobiliseerd en#$me k%nnen be3nvloeden: het en#$me #elf- de matri+ en de methode
van bindin. 45.1. 6%isan7
De matrix
,e draer is #eer belanri*k voor het bepalen in welk soort reactor het en#$m kan
werken. !n een stirrin reactor moet de draer nat%%rli*k bestand #i*n teen impact en
compressie- bi* een kolomreactor moet de draer liefst pore%s #i*n voor een optimale
werkin t%ssen en#$m en reaens 4#o root moeli*k oppervlak7.
8lemeen is een pore%#e matri+ #eer ideaal voor het optimaal ebr%ik van de en#$men
doordat een roter oppervlak van de matri+ #ort voor meer capaciteit bi* het binden van
de en#$men en eeft teeli*kerti*d beschermin teen de omevinsfactoren.
0en niet-pore%#e matri+ heeft een elimiteerde capaciteit en een lae diff%sie rote
doorheen de draer waardoor het reaens ook minder snel of in mindere hoeveelheden
met de en#$men kan reaeren. ,e ind%striele 2iochemie is voorstander van een
pore%#e matri+ van oranische materie aane#ien de#e es$nthetiseerd kan worden
waarbi* de eienschappen naar ke%#e k%nnen worden aanepast.
8arose is een veelv%ldi ebr%ikte matri+ door #i*n hoe porositeit- h$drofiel karakter-
afwe#iheid van eladen roepen die niet-speciefieke absorptie van s%bstraat en
prod%cten belet en nat%%rli*k de commerci9le beschikbaarheid voor het ebr%ik op
ind%strieel vlak.
0nkele voorbeelden van draer materiaal voor e3mmobiliseerde en#$emn
:ranisch:
/at%%rli*ke pol$meren
;ol$sacchariden: cell%lose- de+trose- aar- aarose- chitine- alinaat
;roteinen: collaeen- alb%mine
<oolsto
=$nthetische pol$meren:
;ol$st$reen
8ndere pol$meren: pol$acr$laat- pol$methacr$laten- pol$acr$lamide- pol$amides- vin$l
en all$l-pol$meren
!noranisch:
/at%%rli*ke mineralen: bentonite- silici%m
6eprod%ceerde materialen: las 4niet-pore%s of econtroleerd pore%s7- metalen- metaal
o+iden
Binding
)et immobiliseren kan onderverdeeld worden in 2 hoofd caterorie9n- de reversibele en
irreversibele methode waarbi* het en#$m ener#i*ds kan erec%pereerd worden van #i*n
draer #onder het te beschadien en ander#i*ds #eker beschadid wordt bi* het
verwi*deren van #i*n matri+. ,e sterkte van de bindin is loischer wi*#e een factor die de
e3mmobiliseerde en#$men in de#e caterorien in deelt.
irreversible enzyme immobilisatie
,e bekendste technieken bi* het irreversible immobiliseren #i*n de covalente bindin-
omsl%itin- micro-encaps%llerin.
8dsorptie van en#$men op een vaste stof is waarschi*nli*k de makkeli*kste manier om
en#$men te immobiliseren. )et is ebaseerd op niet speciefiek interactie t%ssen de
matri+ en het en#$m wanneer men de#e met elkaar ment. ,e bindin bestaat
voornameli*k %it waterstofbr%en- meerdere #o%tbr%en and van der waals krachten
waarbi* een minim%m aan activatie stappen nodi is. ,aarom is dit de meest eenvo%di
%it te voeren en oedkoopste immobilisatie techniek. 8ls evol van de #wakkere
bindinen is desorptie door sterke veranderinen in p)- temperat%%r-... veel
voorkomend.
41.<. 6oel- '9947
:msl%itin in een epol$meriseerde el of een tralie netwerk is een andere methode van
immobiliseren. ,e belanri*kste factor bi* de#e methode is de porie rootte- #odat
ewenste molec%le rootte k%nnen diff%nderen doorheen de pori9n. 1en ment een
h$drofiele matri+ in een waterie oplossin met het en#$m #odat de en#$men worden
opevanen in het tralie werk. 0en root voordeel is dat de proteinen niet ebonden #i*n
aan het pol$meer #odat in theorie de en#$m molec%len niet verstoord worden en h%n
eienschappen beho%den. 0en nadeel #i*n de vri*e radicalen die k%nnen onstaan ti*dens
het pol$merisatie proces van het pol$meer en de activiteit van de en#$men neatief
k%nnen be3nvloeden. :msl%itin is enkel eschikt voor kleine proteine molec%len d%s
onbr%ikbaar voor en#$men die op macromolec%laire s%bstraten werken #oals de+trase-
tr$psine-... . 4Fi%%r d7
41.<. 6oel- '9947
Cross-linkin wordt ekenmerkt door de meerdere covalente bindinen t%ssen het
proteine en #i*n matri+. ,it ebe%rt door bindin met de f%nctionele roepen van
molec%len of een onoplosbare draer. 1en heeft 2 soorten cross-linkin- eente met een
matri+ en een #onder de matri+.
2i* cross-linkin #onder een matri+ #%llen de en#$men aan elkaar ehecht worden
waardoor er een en#$m areatie onstaat enaamd >C?08> 4cross linked en#$m
areate7. ,e en#$men #i*n stabiel- makkeli*k rec$cleerbaar door h%n evormde cl%ster
en hebben een hoe activiteit afhankeli*k van h%n manier van bindin. 0en nadeel van
de#e methode is dat de en#$men #ich k%nnen aan edraen als een draen
res%lterend in een verlaade en#$matische activiteit. 1eestal wordt de#e methode
ebr%ikt in combinatie met een ander methode.
41.<. 6oel- '9947
,e Covalente bindin t%ssen het en#$m en de matri+ #ort voor een #eer stabiele
samenhan #odat de#e niet makkeli*k van elkaar escheiden k%nnen worden. ,e#e
methode wordt voornameli*k ebr%ikt als het %iterst nodi is om het en#$m escheiden
te ho%den van het evormde prod%ct. ,e reactie moet ebe%ren onder milde
omstandiheden #odat het en#$m niet edeactiveerd wordt. )et actieve deel van het
en#$m ma ook niet aanetast worden anders verliest het #i*n activiteit volledi. ,e
koppelin kan in 2 klassen opedeeld worden- eent*e waarbi* de matri+ eactiveerd
wordt door het toevoeen van een reactieve f%nctie aan een pol$meer en een andere
waarbi* de r%enraat van het pol$meer aanepast wordt #odat er een actieve roep
ontstaat. ,e#e activatie processen #i*n nodi om electrofiele ro%pen te cre9ren die dan
sterk reaeren met de n%cleofiele ro%pen van de proteinen. ,e f%nctionele roepen
amides- ether- thio roepen of carbo+$l roepen #oren voor een een estabiliseerde
bindin. ,e covalente bindin is een van de meest ebr%ikte technieken maar ook een
van de d%%rdere en inewikkeldste. )et res%ltaat ma er wel #i*n aane#ien het en#$m
%iterst stabiel is- makkeli*k te herebr%iken en er minder kans is dat het en#$m #ich
ment met de verkreen prod%cten in vereli*kin met adsorptie. 4Fi%%r b7
41.<. 6oel- '9947 42rena en 2atista-.iera- 200&7
,e entrapment methode maakt ebr%ik van een pol$meer netwerk dat het en#$m
omsl%it waarbi* het s%bstraat en het prod%ct k%nnen penetreren maar de caps%le
impermeabel is voor het en#$me. ,e#e methode is moeli*k door elimiteerd massa
transport doorheen het membraan of el. 4Fi%%r c7
reversible enzyme immobilisatie
,e#e methode ebr%ikt men voornameli*k voor economische redenen aane#ien de
matri+ escheiden kan worden van #i*n h%idi en#$m en later ter% kan eladen worden
met verse en#$men. 0en d%%r#aam ebr%ik van de draer kan kosten bi* ind%strieel
processsen flink doen dalen maar met moet wel oppassen voor en#$men lekken bi* de
procd%cten als de bindinen relatief #wak #i*n.
Adsorptie met niet covalente interacties
/iet-specifieke adsorptie: ,e simpelste techniek bi* de#e methode is f$sieke adsorptie
waarbi* de en#$men met de matri+ verbonden #i*n via waterstofbr%en- van der @aals
krachten- h$drofobe interacties of de ionische bindin t%ssen molec%len. ,e krachten die
betrokken #i*n bi* de sterkte van het niet-covalent immobiliseren van en#$men worden
bepaald door de condities #oals p)- temperat%%r- polariteit van het solvent en de
ionische sterkte. 8dsorptie is een techniek die de activiteit van het en#$m oed bewaard
ti*dens het immobiliseren en is economisch aantrekkeli*k. )et kan wel voor problemen
#oren als er en#$men lekken in de prod%cten door te #wakke interacties t%ssen matri+
en en#$m.
!onische bindin: ,e#e methode is ebaseerd op het proteine-liand interactie met
principes ebr%ikt in de chromatoraph$- een voorbeeld is het ebr%ik van ion-
e+chaners. 0en liand is een ion of molec%le dat aan een centraal metaal atoom bind
om een ecoArdineerd comple+ te vormen. 1aar het is moeili*k om condities te vinden
waar de ion-e+chaners teeli*kerti*d een sterke bindin vormt en de activiteit van het
en#$m optimaal realiseert. ,e pol$meer-ionische lianden #oren wel voor een
optimaliserin van eienschappen van de prod%cten.
)$drofobe adsorptie: ,e interactie is niet ebaseerd op de chemische bindin maar op
de entropische edreven interactie d%s ebaseerd op de wanorde van het s$steem. ,e
sterkte van de bindin is afhankeli*k van de h$drofobische aspect van de matri+ en het
proteine. ,e h$drofobiciteit van de draer is reelbaar via de raad van s%bstit%tie van
de matri+ en de rootte van de h$drofobe liand molec%le. 1en kan via 2eta-am$lase en
am$lol%cosidase de immobilisatie makkeli*ke omkeren en het en#$m af#onderen van
#i*n draer.
8ffiniteit bindin: ,e#e methode is opmerkeli*k in #i*n selectiviteit bi* de interactie t%ssen
matri+ en en#$men. 1aar de proced%re heeft meestal nood aan covalente bindin van
een kosteli*ke affiniteit liand 4 lectine of antibod$7 aan de matri+ #odat de#e methode op
ind%strieel vlak niet al te interessant is.
Metaal binding of chelatietherapie
!mmobilisatie via metalen ebe%rt via overansmetaal#o%ten of h$dro+ides die op de
oranische matri+en eplaatst #i*n en via n%cleofiele ro%pen verbonden #i*n met de
matri+. .ia verwarmin of ne%tralisatie slaan de metaal#o%ten of h$dro+ides neer op de
matri+ 4#oals cell%lose- chitine- alinaat#%%r en silici%m ebaseerd draers7.
=terische factoren #oren ervoor dat het onmoeli*k is dat alle posities van het metaal
reaeren met de matri+. )ierdoor is er no plaats voor en#$men om met de metalen te
reaeren en wordt de immobilisatie specifieke activiteit relatief hoo 430-B0%7. 1aar de
operationele stabiliteit #i*n #eer variable bi* de#e methode en is daarom moeili*k om te
reprod%ceren. ,it kan moeli*k komen door het bestaan van niet-%niforme adsorptie
plaatsen of door het lekken van metaalionen. 1en kan de vormin van adsorptie sites
controleren door chelator liands te immobiliseren op de vaste matri+ via covalente
bindinen. Co #i*n de metaal ionen stabiel en ecoArdineerd ebonden en #oren #e
voor beho%d van het proteine.
Disulfide bindingen
)et maken van dis%lfide bindinen bi* het immobiliseren is #eer %niek aane#ien de
stabiele covalente bindinen t%ssen matri+ en en#$men makkeli*k k%nnen ebroken
worden via dithiotreitol 4,((7 onder milde condities. ,e activiteit van de thiol roepen
kan aanepast worden door de p) te laten vari9ren #odat de dis%lfide bindin evormd
worden met een hoo rendement en de thiol reactieve adsorbent een hoe specificiteit
kri*en. 42rena en 2atista-.iena- 200&7
De algemene eigenschappen van de geïmmobiliseerde enzymen
)et immobili#eren van en#$men kan er toe leiden dat sommie eienschappen #oals de
catal$tische activiteit of de thermische stabiliteit ewi*#id #i*n ten op #ichte van #i*n vri*e
en#$men. ,e#e wi*#iin kan veroor#aakt #i*n door ener#i*ds veranderin in de
inwendie activiteit van het en#$me of door het veranderin in de 3 dimensionale
str%ct%%r veroor#aakt door de bindin van het en#$me met de matri+. ,e operationele
stabiliteit van het en#$m wordt heel vaak verbetert door het immobiliseren op een vaste
matri+ waarbi* de proteinen door meerdere p%nten via covalente bindin worden
bevestid. .olens een st%die van enkele wetenschappers bli*kt dat de stabilisatie van
de en#$men en het aantal covalente bindinen samenhanend #i*n op een min of meer
lineaire manier. 0en nadeel van het immobiliseren van en#$men is het verlies aan
catal$tische activiteit op macromolec%laire s%bstraten. )ierbi* is de elimiteerd
bereikbaarheid van het s%bstraat voor de actieve plaats van het en#$me van rote
invloed. ,e sterische restrictie van het s%bstraat kan het karakterisiteke patroon van de
emaakte prod%cten veranderen #odat er bi*voorbeeld minder prod%cten evormd
worden of #elfs andere prod%cten. 1en kan de#e sterische problemen voorkomen door
specifiek de matri+en te selecteren of te s$nthetiseren.
2esl%it
)et aanbrenen van en#$men op vaste oppervlakken 4matri+en7 #ort ervoor dat de
en#$men op de plaats bli*ven waar h%n activiteit het meest vereist is. )et #ort ook voor
beschermin voor veranderende of e+treme reactor condities #odat men voorkomt dat
de heel kostbare en#$men vernietid of beschadid worden. ,aarom is de#e techniek
van #eer root belan in ind%stri9le processen om #o optimaal moeli*k en met #o min
moeli*ke kosten ti*dens het prod%ctie proces de ewenste eind prod%cten te verkri*en.
:nder#oek in de 2iochemie naar de verschillende krachten en reacties op en#$men in
een bioreactor is #eer belanri*k en wordt door vele wetenschappers in acht esteld voor
het ontwikkelen van steeds beter e3mmobiliseerde en#$men.
DE?: http://en.wikipedia.or/wiki/?iand
DE?: http://www.rpi.ed%/dept/chem-en/2iotech-0nviron/!11:2/oel2nd.htm 41.<.
6oel- '9947
DE?: http://www.sprintechnoloies.com/sprin/servlets/File,ownloadFfile;athG%2Fhome
%2Fhttpd%2Fvhosts%2Fsprintechnoloies.com%2Fhttpdocs%2Fsprin-docs
%2Fconten%ti%2Fdoc%menti%2FH3Ifile/ameG2009%200n#$me%20!mmobili#ation
%20(echniJ%es.pdfIfileContent($peGapplication/pdf 4Dlf )anefeld-200B7
DE?: http://www.flandersfood.com/artikel/2009/04/02/immobilisatie-van-%C3%9F-
alactosidase
Chen- @.- Chen- ).- Kia- L.- Lan- 5.- Chao- 5.- (ian- F.- Chan- ).;. I Chan- ). 420097:
)aider- (. I )%sain- M. 420097