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Bioquímica I (Lic.

Ciências da Saúde) 2012/2013 Trabalho Nº 5

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REACÇÕES CARACTERÍSTICAS DOS GLÍCIDOS


1. Objectivo e introdução do trabalho

Este trabalho tem por objectivo a verificação de algumas reacções coradas dos glícidos que se baseiam
no seu carácter redutor e/ou na sua estrutura química. Adicionalmente, pretende-se determinar o
conteúdo em glícidos redutores de farinhas alimentares através da aplicação do método do 3,5-
dinitrosalicilato (DNS).
Os glícidos podem ser definidos, quanto à sua estrutura química, como sendo polihidroxialdeídos ou
polihidroxicetonas e seus derivados. Estes compostos constituem um grupo de grande importância
biológica pois funcionam quer como fonte de energia para os processos vitais, quer como componentes
estruturais de um organismo ou ainda como fontes de carbono para a síntese de novas biomoléculas.
Os glícidos subdividem-se, genericamente, nas seguintes classes:
1. oses - classe que inclui os glícidos não hidrolizáveis; estes podem ter entre 3 a 9 átomos de
carbono e, consoante apresentem um grupo cetona ou aldeído, são designadas por,
respectivamente, cetoses ou aldoses;
2. ósidos - classe que inclui os glícidos hidrolizáveis que, por sua vez, se subdividem em:

2.1. oligósidos - constituídos por 2 a 10 resíduos de ose;
2.2. poliósidos - constituídos por mais do que 10 resíduos de ose.

Os ósidos que, por hidrólise, originam apenas oses designam-se de holósidos, sendo heterósidos aqueles
que dão origem a moléculas de oses diferentes e homósidos os que originam moléculas de ose iguais.
Outros ósidos, como a heparina, o ácido hialurónico, as glicoproteínas e outros dão origem a oses e a
outro tipo de compostos após sofrerem um tratamento hidrolítico.
Na primeira parte deste trabalho, ir-se-ão estudar as seguintes reacções características dos glícidos:
Teste de Benedict - o reagente de Benedict é uma solução alcalina de CuSO4 com Na2CO3 e citrato de
sódio. O ião citrato forma um complexo com o ião Cu
2+
, impedindo que este precipite da solução
sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou CuO (de cor preta). O Cu
2+
do reagente de Benedict oxida
os glícidos redutores presentes numa solução, originando uma variedade de produtos ao mesmo
tempo que é reduzido a Cu
+
. Este precipita da solução sob a forma de Cu2O (óxido cuproso;
precipitado de cor vermelha).
Teste de Barfoed - as oses e os diósidos apresentam uma velocidade de reacção distinta com uma
solução de acetato de cobre em ácido acético, o que permite diferenciá-las. Neste teste, como no
anterior, as oses são oxidadas, originando uma variedade de produtos, e o Cu
2+
presente no
reagente de Barfoed é reduzido a Cu
+
, precipitando sob a forma de Cu2O (de cor vermelha).
Teste do Iodo - os poliósidos e os seus produtos de degradação originam uma cor característica quando
tratados com uma solução de iodo em KI. O amido produz uma cor azul intensa que é devida à
formação de um complexo amido-iodo. Este complexo consiste num arranjo aproximadamente
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linear de aniões I5
-
dentro da cavidade da amilose. Com efeito, a amilose existe sob a forma de
uma hélice com 6 resíduos de glucose por “volta”. Para a formação do complexo com o iodo, é
necessário um mínimo de 6 “voltas” da hélice (isto é, 36 resíduos de glucose). Os poliósidos
ramificados que apresentam hélices interrompidas (por ex., a amilopectina) originam complexos de
cores menos intensas; por sua vez, os poliósidos muito ramificados que possuem apenas
pequenos segmentos helicoidais na sua estrutura (por ex., o glucogénio), formam complexos
castanho-avermelhados pouco intensos.
Na Fig.1 apresenta-se a estrutura de alguns dos glícidos a testar:

Gl ucose Frutose
(-D-gl ucopi ranose) ( -D-frutofuranose)
Ri bose
(-D-ri bose)
Sacarose (Gl c 1 2) Fru)
Gl ucose Frutose Gal actose Gl ucose
Lactose (Gal 1 4) Gl c)
CH
2
OH OH
H
O
OH
H
H
H
OH
HO
CH
2
OH
H OH
OH H
O
H

H
H
OH
1
2 3
5
6
4
O
CH
2
OH
OH H
H HO
H
OH CH
2
OH
1
2
3
4
5
6
HO
CH
2
OH
H OH
OH H
O
H
O
O
CH
2
OH
CH
2
OH
OH H
H
H
HO
H

H
1
2 3
4
5
6
1( 2()
3
4
5
6
6
5
4
3 2
CH
2
OH
H OH
OH H
O

H
HO
H
4
6
5
3 2
1
CH
2
OH
H OH
OH H
O
H

H
OH
H
O
1()
H

Figura 1. Estrutura de alguns dos glícidos a estudar.

O desenvolvimento de métodos que permitam dosear os glícidos presentes nos alimentos é extremamente
importante, uma vez que estes compostos são um dos constituintes fundamentais da nossa dieta. Com
efeito, os poliósidos glucogénio e amido são importantes formas de armazenamento de energia, estando
presentes em tecidos animais e vegetais, respectivamente. A capacidade redutora dos glícidos tem
constituído a base química de vários métodos de análise quantitativa destes compostos. Na segunda parte
deste trabalho, pretende-se determinar o conteúdo em glícidos redutores de farinhas alimentares através da
aplicação do método do 3,5-dinitrosalicilato (DNS). Em meio alcalino, e quando aquecido na presença de
glícidos redutores, o DNS forma um produto de redução castanho-avermelhado, o 3-amino-5-nitrosalicilato
que pode ser doseado espectrofotometricamente a 540 nm.

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2. Procedimento experimental

2.1. Material e reagentes

- Ribose 0,1 M
- Glucose 0,1 M
- Frutose 0,1 M
- Sacarose 0,1 M
- Lactose 0,1 M
- Amido 1% (m/v)
- Glucogénio 1% (m/v)
- reagente de Benedict
(dissolver 173 g de citrato trisódico dihidratado e 100 g de Na2CO3 anidro em 600 mL de
água. Aquecer até ocorrer a dissolução dos sais e filtrar a solução em seguida, se
necessário. Diluir para 850 mL com água destilada. Dissolver à parte 17,3 g de CuSO4.5H2O
em 150 mL de água destilada e adicionar, lentamente e com agitação, esta solução à
anterior)
- solução de Iodo
(I2 0,01 M e KI 0,12 M - dissolver 10 g de KI em 500 mL de água destilada. Adicionar 12,5 g
de iodo e agitar vigorosamente (com o auxílio de um agitador magnético) até dissolver. Esta
solução é estável durante um mês. Guardar o reagente num frasco escuro)
- reagente de Barfoed
(dissolver 13,3 g de acetato cúprico (monohidratado) em 200 mL de água destilada. Filtrar,
se necessário, e adicionar 1,8 mL de ácido acético glacial)
- farinha alimentar
- H2SO4 1,5M
- NaOH 10% (m/v)
- Reagente de DNS
(Dissolva 10g de ácido 3,5-dinitrosalicílico em 200 mL de NaOH 2N, aquecendo e agitando
vigorosamente. Dissolva 300 g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado em 500 mL de água
destilada. Misture as duas soluções e perfaça o volume para 1 L com água destilada)
- Solução de glucose 5 mg/mL

- vidro de relógio
- almofariz e pilão
- espátula
- tubos de ensaio
- balão volumétrico de 50 mL
- balões volumétricos de 25 mL
- erlenmeyer com rolha de 50 mL
- funil
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- papel de filtro Whatmann nº 1
- pipetas volumétricas de 1,0 mL
- pipetas volumétricas de 2,0 mL
- pipetas volumétricas de 5,0 mL
- pipetas de Pasteur



2.2. Reacções características dos glícidos

2.2.1. Teste de Benedict

Para cada glícido, adicione 5,0 mL de reagente de Benedict a um tubo de ensaio e junte 1,0 mL da
respectiva solução de glícido a testar. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado.
Aqueça as várias soluções preparadas num banho de água em ebulição durante 5 min. Arrefeça os
tubos à torneira, observe-os e anote os resultados.
Resultado positivo: a presença de glícidos redutores é indicada através da formação de um precipitado
amarelo, verde, ou vermelho. A mera alteração da cor da solução não indica um resultado positivo.
A cor do precipitado obtido varia com o tamanho das partículas formadas (em geral, as partículas
de maiores dimensões, produzidas por reacções lentas, formam um precipitado vermelho; as
partículas mais pequenas, resultantes da ocorrência de reacções rápidas, formam um precipitado
esverdeado).

2.2.2. Teste de Barfoed

Para cada glícido, adicione 2,0 mL de reagente de Barfoed a um tubo de ensaio e junte 1,0 mL da
respectiva solução de glícido a ensaiar. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado.
Coloque as soluções preparadas num banho de água em ebulição e inicie imediatamente a contagem
do tempo de incubação. Se o banho se mantiver em ebulição, mantenha os tubos de ensaio no banho
durante exactamente 1 min. Após a sua remoção, deixe os tubos de ensaio arrefecer à temperatura
ambiente. Examine os tubos de ensaio e anote os resultados, registando em particular a quantidade
de precipitado formado em cada caso.
Atenção: um aquecimento prolongado das soluções pode originar um falso resultado positivo
Resultado positivo: um teste positivo é caracterizado pela formação de um precipitado avermelhado
abundante.



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2.2.3. Teste do Iodo

Adicione 5,0 mL de cada uma das soluções de glícido a ensaiar a um tubo de ensaio e junte quatro
gotas da solução de iodo. Agite bem. Prepare um controlo do ensaio adequado.
Observe os tubos e anote os resultados obtidos.
Resultado positivo: a obtenção de uma cor azul indica um teste positivo para o amido; uma cor
amarelo-acastanhada indica um teste positivo para o glucogénio e para os produtos de degradação
do amido (dextrinas).

2.3. Doseamento de glícidos redutores numa farinha alimentar

2.3.1. Preparação da amostra

Pese aproximadamente 80 mg da farinha alimentar a analisar e reduza-a a pó fino com o auxílio de um
almofariz.
Pese então uma amostra com cerca de 50 mg, registando a massa até ao décimo de mg.
Transfira o material pesado para um tubo de ensaio e adicione 10 mL de H2SO4 1,5 M. Aqueça o tubo de
ensaio num banho de água em ebulição durante 20 min na “hotte”, e agitando de vez em quando.
Arrefeça o tubo à torneira e transfira o seu contéudo para um erlenmyer de 50 mL com rolha. Lave o tubo
de ensaio cuidadosamente com 12 mL de NaOH a 10% e transfira a solução para o erlenmyer anterior.
Aqueça ligeiramente o erlenmyer contendo o hidrolisado e filtre, enquanto quente, para um balão de 50
mL. Se a amostra não estiver aquecida, a filtração far-se-á lentamente. Lave o erlenmyer com água
destilada quente e adicione-a ao papel de filtro, de modo a que o material hidrolisado seja todo
transferido. Perfaça o volume do balão até 50 mL. Agite bem.
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2.3.2. Curva de calibração do método do dinitrosalicilato

Prepare a curva de calibração do método do DNS de acordo com o Quadro I:

Quadro I- Curva de calibração do método do DNS.
Reagente Tubo Nº
(mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Glucose
5 mg/mL
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,7 -
Hidrolisado
- - - - - - - 1,3 1,6 2,0
Reagente de
DNS
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Água destilada
3,0 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,3 1,7 1,4 1,0
o após colocar as tampas adequadas, aqueça os tubos de ensaio anteriores num banho de
água em ebulição durante exactamente 5 min;
o arrefeça todos os tubos à torneira e transfira cuidadosamente o volume de cada tubo de
ensaio para um balão volumétrico de 25 mL, perfazendo o seu volume com água destilada.
Misture por inversão.
o leia a absorvência de cada solução a 540 nm, após acertar o zero do espectrofotómetro com
água destilada.


3. Bibliografia

Switzer, R. e Garrity, L. (2003) Experimental Biochemistry. Theory and Exercises in Fundamental
Methods, 3
rd
. ed., W.H. Freeman: New York, pp. 175-178.
Holme, D.J. e Peck, H. (1998) Analytical Biochemistry Cap.9, Addison Wesley Longman: New York.
Mathews, C.K., e van Holde, K.E. (1996) Biochemistry, 2ª ed., Benjamin/Cummings Co: Menlo Park,
pp.68-81.
Bittman, R. (1974) “Analysis of reducing sugars in breakfast cereal and other foods. A general chemistry
experiment” J. Chem. Ed. 51: 46-47
Miller, G.L. (1959) “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar” Anal. Chem.
31: 426-428.
Reed, R., Holmes, D., Weyers, J., Jones, A. (2003) Practical Skills in Biomolecular Science, 2
nd
ed.,
Pearson - Prentice Hall: Harlow, pp. 359-363.

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RELATÓRIO


Data: ___________ Alunos: _____________________________________________
Turma : _________ _____________________________________________
Grupo N.º: _______ _____________________________________________
_____________________________________________


Prepare o relatório do trabalho prático efectuado atendendo às seguintes instruções gerais:

1. Resumo

2. Apresentação e Discussão de Resultados

2.1. Testes de identificação de glícidos

2.1.1. Complete a seguinte chave dicotómica de identificação de glícidos, atendendo à legenda:
1. glícido ou grupo de glícidos que é identificado pelo teste.
2. resultado positivo característico do teste .
3. glícido ou grupo de glícidos que dá um resultado negativo no teste.

Chave dicotómica de identificação de glícidos

Glícido

Teste de Benedict

+ -
1. ___________ 3. ____________
2. ___________

Teste do Barfoed Teste do Iodo

+ - + + -
1. ___________ 3. __________ 1. ___________ 1. ___________ 3. ________
2. ___________ 2. ___________ 2. ___________



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2.1.2. Complete o seguinte quadro resumo dos resultados obtidos:

Teste Solução Observações Resultado

estudada

água
Benedict ribose
glucose
frutose
sacarose
lactose
amido
glucogénio
água
ribose
Barfoed glucose
frutose
sacarose
lactose
amido
glucogénio
água
ribose
Iodo glucose
frutose
sacarose
lactose
amido
glucogénio

2.1.3. Discuta brevemente os resultados obtidos nos vários testes realizados, relacionando-os com a
estrutura química dos glícidos estudados.



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2.2. Doseamento de glícidos redutores numa farinha alimentar

Resuma o trabalho efectuado sob a forma de um fluxograma comentado.
Apresente o esquema da reacção do método do dinitrosalicilato.
Preencha o quadro seguinte com os valores de absorvência a 540 nm referentes aos padrões e às
amostras utilizadas na determinação de glícidos redutores pelo método do dinitrosalicilato:

Tubo Nº
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[glucose]
(mg/mL)

Abs540 nm
Represente a curva de calibração do método do DNS e calcule a percentagem (m/m) de glícidos
redutores (em termos de glucose) na amostra de farinha alimentar de que partiu.
Compare o valor obtido com o indicado no pacote da farinha analisada e discuta possíveis causas
para a diferença registada.

3. Bibliografia

4. Questões a desenvolver

4.1. A forma predominante da glucose em solução é a estrutura em anel representada pela projecção
de Haworth. Porque é que a glucose dá um resultado positivo, reagindo completamente, nas
reacções características da sua forma em cadeia aberta?
4.2. Apesar de possuírem uma extremidade redutora, o amido e o glucogénio dão um resultado
negativo nos testes de detecção de glícidos redutores. Justifique.
4.3. Como explica a obtenção de um falso resultado positivo se efectuar um aquecimento prolongado
de algumas soluções de glícidos no teste de Barfoed?
4.4. Por que foi necessário proceder à hidrólise ácida da farinha alimentar previamente á aplicação do
método do DNS?