You are on page 1of 4

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.

FACULTAD
DE QUÍMICA. BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL. RENGEL GARCÍA
CHRISTIAN RODOLFO. EQUIPO 4. GPO. 2 PRÁCTICA 2.
“Purificación de una proteína a través de un sistema simulado”
INTRODUCCIÓN.
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la
purificación de las sustancias de estudio, ya sea parcial o total.
Para ello se necesita de un gran trabajo, ya que una célula
contiene miles de sustancias diferentes, la molécula que
buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a
concentraciones muy bajas. Sin embargo, el conocimiento del
proteoma (conjunto de proteínas de un organismo), ha pasado
a ser el reto de la comunidad científica y de las empresas
biotecnológicas, una vez que ya se ha completado la
secuenciación del genoma de varios organismos incluyendo el
genoma humano.
El método de purificación debe diseñarse desde un principio
teniendo en cuenta la cantidad de proteína que se requiere.
Hay etapas de purificación que se pueden aumentar de escala
fácilmente y otras en que no es posible hacerlo. El grado de
pureza necesario dependerá del uso que se va a dar a la
proteína, desde investigación y terapia, hasta uso industrial. Si
el interés está en la proteína y no importa el organismo de
origen, conviene buscar una fuente fácil de obtener, barata,
que contenga esa proteína en abundancia, es preferible partir
de organismos enteros o de células en cultivo, aunque lo
óptimo es producir la proteína por métodos de DNA
recombinante.
Dependiendo de la finalidad, la proteína debe ser obtenida en
estado nativo o puede estar desnaturalizada. Para determinar
su actividad biológica (enzimas) debe estar nativa y para
determinar estructura primaria, puede estar desnaturalizada.
Se debe seleccionar un método de determinación específico de
la proteína en cuestión, por ejemplo su actividad, si se trata de
una enzima, su unión de ligando a un receptor o a un
anticuerpo específico. Y un método para determinar la
proteína total. Debe tenerse en cuenta que, salvo la
determinación de proteína por análisis de aminoácidos o por
peso seco, todos los demás métodos son semicuantitativos, a
menos que se los estándar dice con la propia proteína en
estudio. Entre estos métodos se pueden mencionar:
espectrofotometría en el UV (280 nm, Trp; 210-215 nM, unión
peptídica); Biuret (Cu2+ alcalino); Lowry (Cu
2+
alcalino +
reactivo de Folin-Ciocalteau); Bradford (Coomassie Blue); unión
de Ag.
La actividad específica (AE) es igual a la relación entre la
cantidad de proteína que se purifica sobre la cantidad de
proteína total. El grado de purificación es el cociente de la AE
en la etapa 2 sobre la AE en la etapa 1 (la purificación global,
AE final sobre AE inicial) Se debe utilizar un método adecuado
para juzgar la pureza de la proteína obtenida; actualmente se
utiliza SDS-PAGE, monodimensional o, preferentemente,
bidimensional. En otras épocas, se utilizó la ultracentrifugación
analítica.
Se debe evitar la proteólisis de la proteína en estudio durante
su purificación, utilizando mezclas de inhibidores de proteasas,
y trabajando tan rápido como sea posible y en frío, para
minimizar su acción.
En general el aislamiento de la proteína tiene este esquema
general:
1) Separación de las células.
2) Si la proteína es intracelular, ruptura celular y separación de
restos.
3) Concentración.
4) Aislamiento primario.
5) Purificación de alta resolución.
6) Producto final.
Así entonces podemos plantear que entre más eficiente sea el
proceso de purificación, mayor será la cantidad de proteína o
enzima obtenida al final, y menor la de los demás
contaminantes y otras proteínas presentes en la muestra
(idealmente la cantidad de estas debe ser igual o lo más
cercano a cero).
En esta ocasión se realizo una simulación en un sistema
computacional, donde se puede evaluar de una forma muy
rápida los distintos métodos de separación, así mimo
brindando un panorama inicial de lo complejo e importante
que es este proceso. El programa utilizado es el ProteinLab
(Protein Purification, A. G. Booth, Faculty of Biogical Sciencies
University of Leeds United Kingdom), con el que se evaluó las
proteínas nombradas como número 1 y número 11. Las cuales
por sus características y condiciones de manejo fueron
purificadas a través de métodos como la precipitación por
salado (con sulfato de amonio), por tratamiento con calor y a
por punto isoeléctrico, por lo que la cuestión a responder en
este experimento es el saber cuál es el método más adecuado
de purificación para estas proteínas en particular, así como
determinar su peso molecular.
RESULTADOS.
La proteína 1, es estable por varias horas hasta los 40 °C, y en
un intervalo de pH entre 2.5 y 9.5. Primeramente fue sometida
a una precipitación con sulfato de amonio al 65 % y después se
realizo una electroforesis, confirmando que aún presentaba
gran cantidad de contaminantes. También se realizo una
prueba inmunológica, la cual nos permitió detectar y localizar
la proteína, y un valor aproximado de su punto isoeléctrico, el
cual utilizamos para proceder a precipitarla.

Fig. 1.1. Electroforesis de dos dimensiones de la muestra de
proteína después de la precipitación por salado.

Fig. 1.2. Electroforesis de dos dimensiones después de la
precipitación por punto isoeléctrico.

Fig. 1.3. Determinación de la fracción de la muestra que
presenta la actividad enzimática.


Tabla 1. Reporte de progreso de la purificación de la proteína 1.
Ahora bien, la proteína 11, es estable hasta 50 °C entre un
intervalo de pH de 3.0 a 11.0. Por ende esta muestra fue
tratada inicialmente con calor (50° C durante 60 minutos) y
después dos horas más a la misma temperatura. Como el valor
de contaminantes no bajo considerablemente, se realizo la
precipitación por punto isoeléctrico, el cual fue identificado a
través de una electroforesis de dos dimensiones.

Fig. 2.1 Determinación de la fracción con actividad enzimática.
Fig. 1.4. Electroforesis de una
dimensión de la muestra después
de la precipitación por punto
isoeléctrico.

Fig. 2.2. Electroforesis de dos dimensiones de la proteína 11,
después de la separación por punto isoeléctrico.

Tabla 2. Reporte del progreso de purificación de la proteína 11.
Posteriormente se determino un valor aproximado de los pesos
moleculares, obteniendo los factores de retención para cada
marcador de peso molecular, graficando log(PM) VS Rf. Se
obtiene la ecuación de la recta, y como de cada muestra
problema se tiene su Rf, solo se interpola y se obtiene el valor
del peso molecular aproximado de la proteína.
Proteína Peso molecular (KD)
1
11
Tabla 3. Pesos moleculares obtenidos de las proteínas.
ANALISIS DE RESULTADOS.
En el caso de la proteína 1, se observa que la concentración de
sulfato de amonio (65 %) se pudo eliminar una buena parte de
los contaminantes sin llevarnos de por medio parte de la
enzima, sin embargo la cantidad de contaminantes aún era
grande y eso lo refleja la electroforesis (fig 1.2). Anteriormente
se había hecho otros ensayos probando distintas
concentraciones de sulfato de amonio, pero a menores
concentraciones la cantidad de contaminantes eliminados fue
menor, lo que tiene sentido, teniendo en cuenta que en este
método se busca llegar a una alta concentración de la sal para
que se solubilice la proteína, claro que tampoco puede ser
demasiado alta, como se evaluó previamente también, ya que
a concentraciones mayores a 65 % la cantidad de
contaminantes eliminados es casi total, sin embargo la
precipitación de la enzima también se ve favorecida, lo que nos
produce una gran pérdida y un muy bajo rendimiento, nada
ideal para el proceso. Por eso solamente se uso esta
concentración, posteriormente se uso el punto isoeléctrico, el
cual estaba alrededor de 8, por lo que se estableció un
gradiente de 7 a 9, obteniendo buenos resultados puesto que
se elimino totalmente las contaminaciones, sin embargo
también se perdió un poco de la proteína en el proceso, si esto
se quisiera modificar, solo se tendría que abrir el un poco más
el gradiente de pH, lo que evitaría perder un poco de la enzima,
claro que con el riesgo de no poder eliminar todos los
contaminantes, pero eso ya dependerá de lo parecidos o no
que son la proteína estudiada y las demás. Hablando de costos
el proceso es muy accesible, y con un alto grado de
enriquecimiento.
En el caso de la proteína 11, sabíamos que resistía
temperaturas de 50 °C, por ello la sometimos a calor, puesto
que la mayoría de la proteínas se desnaturalizan a 40°C, y
sometiendo la muestra a la temperatura limite de nuestra
proteína podemos asegurar que gran parte de las
contaminantes serán eliminadas, y así fue, después del
tratamiento se logro eliminar más de la mitad. Se volvió a
someter al calor, y más tiempo, pero ya no se pudo eliminar
más, seguramente porque los contaminantes también
presentes son igual o más resistentes a 50 °C. Así mismo
también se prosiguió a terminar la purificación mediante la
separación por punto isoeléctrico, donde al igual que la
proteína 1, se logro purificar totalmente a la proteína, con un
cierto grado de pérdida, debido al gradiente de pH manejado,
en este caso de 4 a 6, puesto que su PI estaba alrededor de 5;
de igual forma el aumentar un poco más el gradiente reduciría
la perdida.
En ambos casos se trato de purificar por cromatografía de
intercambio iónico, sin embargo no fue factible debido a que
Fig. 2.3 Electroforesis de una
dimensión, posterior a la
separación por punto
isoeléctrico.
ambas proteínas tiene un amplio intervalo de pH a la cual son
estables.
CONCLUSIONES.
Se sometieron a purificación dos muestras de proteínas, a
través de una simulación en computadora, obteniéndose
rendimientos de 95.7% para ambas muestras.
La proteína 1 se pudo purificar a través de una precipitación
inicial con sulfato de amonio al 65%, con una posterior
separación por punto isoeléctrico.
La proteína 11, se purifico a través de tratamiento con calor y
separación por punto isoeléctrico.
Los costos simulados de los procesos son bajos y accesibles.
BIBLIOGRAFÍA.
Voet. Bioquímica. 3ª Edición. Editorial Medica Panamericana.
2006. Pp. 135-158.