You are on page 1of 20

Universidade Nova de Lisboa – Faculdade de Ciências e Tecnologia

Tecnologia de enzimas


Estudo da actividade da enzima
invertase de células de Saccharomyces
Bayanus



Ana Raquel Sousa, nº 35372 LBq
Marisa Coelho, nº 34648 LQA
Susana Pulido, nº31438 LQA

Docente: Prof.ª Cecília Roque



Ano Letivo 2013/2014
Campus de Caparica, 26 de Maio de 2014.


2
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Índice

Abreviaturas ....................................................................................................................................... 3
Resumo ............................................................................................................................................... 4
Abstract .............................................................................................................................................. 4
1. Introdução .................................................................................................................................. 5
2. Parte experimental ..................................................................................................................... 6
2.1. Materiais e Reagentes ........................................................................................................ 6
2.2. Método ............................................................................................................................... 7
3. Apresentação e Discussão de Resultados .................................................................................. 7
3.1. Trabalho 1 - Estudo da actividade da invertase de células de Saccharomyces bayanus ....... 7
3.2. Trabalho 2 - Estudo da actividade da invertase imobilizada covalentemente a um suporte
inorgânico (sílica porosa) ................................................................................................................... 9
3.3. Trabalho 3 - Estudo da atividade da invertase de células de Saccharomyces bayanus
imobilizadas em alginato de cálcio ................................................................................................... 12
4. Conclusão/Conclusion .............................................................................................................. 15
5. Bibliografia ................................................................................................................................ 16
6. Apêndice...................................................................................................................................16














3
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Abreviaturas

As abreviaturas utilizadas ao longo do texto são aqui apresentadas, seguidas da correspondente
definição. No texto são explicadas quando aparecem, mantendo-se as abreviaturas na forma em que são
reconhecidas internacionalmente.
Vo – Velocidade inicial
KM – Constante de Michaelis
Vmáx – Velocidade máxima
ηglobal – Factor de efectividade global
ηglobal médio – Factor de efectividade global médio
ε – Porosidade interna
a – área superficial da partícula por unidade de volume
D – Difusividade do substrato
De – Difusividade efectiva
μ – Módulo do substrato, dá uma razão entre os efeitos difusionais e os cinéticos
ζ – Tortuosidade
KL – coeficiente de transferência de massa do substrato
φ – Módulo de Thiele – representa a importância relativa dos efeitos cinéticos face aos difusionais
Vcinética – Velocidade cinética
βB – Concentração adimensional do substrato
β’B – Concentração adimensional do subtrato
Vobs – Velocidade observada
V’obs – Velocidade observada à superfície dos poros da matriz
ηinterno – Factor de efectividade interno
ηexterno – Factor de efectividade externo
Ss – Concentração de substrato à superfície da matriz
Ss’ – Concentração de substrato à superfície dos poros da matriz
[Sac] – concentração de sacarose







4
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Resumo

Nestes trabalhos práticos pretendeu-se estudar a actividade do enzima invertase de células de levedura
Saccharomyces bayanus para a determinação dos parâmetros cinéticos (V0, KM e Vmáx) da hidrólise da
sacarose, em três condições diferentes: células livres, imobilizadas covalentemente a um suporte inorgânico
de sílica porosa e imobilizadas em alginato de cálcio. Para tal, foram realizados ensaios com diferentes
concentrações de sacarose (10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 80, 90 e 100 g/L). O nosso grupo de trabalho operou
com as concentrações de 35, 70 e 100 g/L.
A quantidade de produto foi determinada colorimetricamente pelo método do 3,5-dinitrossalicilico
(DNS), após a recolha de amostras de solução enzima-substrato ao longo do tempo e a sua concentração foi
obtida a partir da leitura da densidade óptica a 540 nm.
A determinação dos parâmetros cinéticos foi possível admitindo uma cinética de Michaelis-Menten, o
que permitiu calcular as velocidades iniciais da reação para cada uma das concentrações de sacarose e em
cada situação. A velocidade máxima (Vmáx) e a constante de Michelis-Menten (KM), foram determinadas a
partir das linearizações da equação de Michelis-Menten: Lineweaver-Burk, Hanes Woolf e Eadie Hofstee.
No estudo com o enzima livre obteve-se um KM de 64,100 g/L e um Vmáx de 0,231 g/L.min, com o enzima
imobilizada covalentemente a um suporte inorgânico um KM de 565,123 g/L e um Vmáx de 0,982 g/L.min e,
finalmente, para o enzima imobilizada em alginato de cálcio um KM de 66,453 g/L e um Vmáx de 0,183
g/L.min.
Abstract

The aim of this work was to study the activity of the enzyme invertase of Saccharomyces bayanus
yeast cells, for the determination of kinetic parameters (Vo, Km and Vmax) for hydrolysis of sucrose in three
different conditions: free cells, immobilized covalently to a inorganic porous silica support and immobilized
in calcium alginate. To this study, trials with different sucrose concentrations (10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 80,
90 and 100 g/L) were used. Our working group operated with concentrations of 35, 70 and 100 g / L.
The amount of product was determined colorimetrically by the 3,5- dinitrosalicylic (DNS ) method
after sampling the enzyme-substrate solution over time and its concentration was obtained from reading
the optical density at 540 nm.
The determination of the kinetic parameters is possible assuming a Michaelis- Menten kinetics,
which allowed us to calculate the initial rates of reaction for each concentration of sucrose and in each
case. The maximum velocity (Vmax) and the Michelis-Menten constant (KM) , were determined from the
linearization of the Michelis-Menten equation: Lineweaver-Burk, Hanes Woolf and Eadie Hofstee.
In the study with the free enzyme was obtained a KM of 64.100 g/L and Vmax of 0.231 g/L.min,
with the immobilized covalently to a inorganic porous silica support a KM of 565.123 g/L and a Vmax of
0.982 g/L.min and finally to the enzyme immobilized in calcium alginate, KM of 66.453 g/L and Vmax of
0.183 g/L.min .

5
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
1. Introdução
Os organismos, como a Saccharomyces bayanus, necessitam de energia, para sobreviver, que obtêm
através de processos metabólicos. No entanto, esses processos metabólicos são, muitas vezes, demasiado
lentos e, assim, sem viabilidade para o organismo, por isso é necessário a existência de biocatalisadores –
enzimas
1
.
Os enzimas têm a capacidade de acelerar as reações químicas, sem interferir com o equilíbrio químico,
bem como aumentar a especificidade para o substrato, devido à carga, tamanho e/ou características
hidrofóbicas/hidrofílicas
2
.
Ao longo dos trabalhos práticos, estudou-se a actividade de um enzima em particular, a -
frutofuranosidase (invertase) da Saccharomyces bayanus. Esta catalisa a hidrólise da sacarose (dissacárido
composto por -D-frutose e -D-glucose ligadas através de uma ligação glicosídica -1,4) em glucose e
frutose
3
. (Figura 1)
Figura 1. Reação de hidrólise da sacarose, catalisada pelo enzima invertase
4
.
De forma a estudar a cinética da hidrólise, admitiu-se uma cinética de Michaelis-Menten e recorreu-se a
um método colorimétrico com DNS. Este método baseia-se no facto do DNS apenas sofrer uma redução na
presença de açúcares redutores, como a glucose e a frutose; a sua forma reduzida (3-amino-5-
nitrossalicílico) possui uma elevada absorvância a 540nm e identifica-se facilmente pela coloração
acastanhada
5
.
Os trabalhos experimentais tiveram como objectivo o estudo da actividade da invertase em três
condições distintas: o enzima livre, o enzima imobilizada covalentemente a um suporte inorgânico (sílica
porosa) e as células de Saccharomyces bayanus imobilizadas em alginato de cálcio. Assim, é possível
perceber a forma como afectam a cinética da invertase.
A imobilização de um enzima apresenta várias vantagens, entre elas destacam-se o facto de aumentar a
resistência a alterações de temperatura e pH do meio e de permitir, após a reação, a separação entre o
enzima e os produtos formados, o que possibilita a sua reutilização, aumentando, desta forma, a viabilidade
do enzima
6
.
No entanto, a imobilização de enzimas também acarreta algumas desvantagens, como o aumento do
custo de todo o processo e a diminuição da actividade enzimática devido aos efeitos de imobilização. Os
efeitos de imobilização incluem: efeitos estereoquímicos, a imobilização provoca uma obstrução do centro
ativo do enzima; efeitos conformacionais – modificação da estrutura terciária do centro ativo; efeitos de
partição entre micro e macro ambientes, onde se verifica uma variação do pH ótimo do enzima e, por
último, os efeitos de transferência de massa (externos e internos) que estão relacionados com a resistência
à difusão do substrato para o centro ativo e do produto
7
.
Relativamente ao Trabalho número 2, utilizou-se o método de imobilização por ligação covalente a um
suporte de sílica porosa. A ligação covalente é estabelecida entre os grupos aldeído do suporte e os grupos
amina dos aminoácidos do enzima invertase. (Figura 2) Uma das vantagens deste método de imobilização é
a forte ligação entre o suporte e o enzima, o que confere uma maior estabilidade ao complexo formado
8
.

6
Tecnologia de Enzimas 2013/2014


















Figura 2. Representação da ativação das partículas de sílica porosa com 3-aminopropiltrietóxisilano, reação com
glutaraldeído e imobilização de um enzima ao suporte inorgânico 4.

Em relação ao Trabalho número 3, recorreu-se o método de aprisionamento de células em gel. As
células de Saccharomyces bayanus são incorporadas numa solução de alginato de sódio que, por conter
iões monovalentes (Na
+
), é solúvel em água e, posteriormente, são adicionados a uma solução de cloreto de
cálcio. Tendo em conta a presença de iões divalentes (Ca
2+
), forma-se um gel (gelificação por troca iónica)
no qual estão aprisionadas as células (biocatalisadores)
9
. (Figura 3) Este método apresenta vantagens como
a possibilidade de utilizar as vários enzimas do biocatalizador e evita a sua extração do mesmo 4.






Figura 3. Representação do processo de gelificação, por troca iónica, e imobilização do biocatalizador 4.

2. Parte experimental
2.1. Materiais e Reagentes

Tabela 1. Material utilizado no presente trabalho e as respectivas marcas.



Material Marca
Espectrofotómetro Utrospec 3100 pro
Balança analítica Sartoruis
Reator -
Banho termostatizado -
Material corrente de laboratório -

7
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Tabela 2. Reagentes utilizados no presente trabalho e as respectivas marcas.
Reagente Marca
Sacarose Pam reac
Alginato de cálcio Sigma
DNS Sigma
Sílica Sigma
Células Saccharomyces bayanus -

2.2. Método

Para a realização do presente trabalho experimental seguiu-se o protocolo fornecido pelo docente 4,
contudo foram efetuadas algumas modificações: 1) Foram utilizadas todas as concentrações de sacarose
(15, 25, 35, 45, 55, 70, 80, 90 e 100 g/L) à exceção da concentração de 10 g/L no trabalho nº1 e 2, e da
concentração 100 g/L no trabalho nº2; 2) O nosso grupo de trabalho executou os ensaios com as
concentrações de sacarose de 35, 70 e 100 g/L, e as respectivas temperaturas dos ensaios encontram-se na
tabela 3;
A etapa de adição do ácido 3,5-di-nitrosalicílico (DNS) cessa a reação da sacarose com a invertase e, com
o posterior aquecimento, ocorre a desnaturação das proteínas e o fim da ação catalítica do enzima. A etapa
de adição da água, após o aquecimento, tem como finalidade a diluição das solucões, para as
concentrações estarem dentro da faixa de sensibilidade do método.

Tabela 3. Temperatura (˚C) dos ensaios efectuados por o nosso grupo nos vários trabalhos experimentais.
[Sacarose] (g/L)
Trabalhos experimentais 35 70 100
1 44 43,5 44
3 44,5 44,5 44,5
3. Apresentação e Discussão de Resultados
Neste trabalho foram executados e estudados dois métodos de imobilização de enzima de modo a ser
possível comparar parâmetros cinéticos da hidrólise da sacarose pelo enzima invertase de células de
Saccharomyces bayanus. No trabalho 2 utilizou-se uma imobilização por ligação covalente por sílica porosa
e no trabalho 3 utilizou-se uma imobilização de adsorção por alginato de cálcio.
Através da cinética de Michaelis-Menten, determinaram-se as constantes KM e Vmáx, KM corresponde à
afinidade enzima-substrato e corresponde à concentração de substrato para metade da velocidade máxima,
e Vmáx à velocidade máxima que corresponde à velocidade inicial quando se atinge a saturação,
respectivamente.

3.1. Trabalho 1 - Estudo da actividade da invertase de células de Saccharomyces bayanus

Neste primeiro trabalho em que as células não estão imobilizadas, permitiu estudar a cinética do enzima
livre células Saccharomyces bayanus, sem limitações difusionais, pois não existem efeitos conformacionais
e estereoquímicos que possam resultar da imobilização do enzima e influenciar a atividade da mesma,
servindo assim como meio de comparação com os outros estudos nos quais existe imobilização.
Determinaram-se as diferentes concentrações de açúcares redutores - Produto (tabela 5) em que foram
retiradas, do reator, amostras de enzima-substrato de um em um minuto até se atingir sete minutos de
reação, para as diferentes concentrações de sacarose. De seguida a quantidade de açúcares redutores
produzida foi determinada colorimétricamente através do método de DNS. Por fim, leu-se a absorvância
das amostras num comprimento de onda de 540 nm (tabela 4). Para a obtenção de melhores resultados
foram desprezadas algumas concentrações de sacarose, tais como, as concentrações 55, 80 e 90 g/L.

8
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
De todos os valores de concentração obtidos foram tidos em conta os que permitiram uma melhor
linearização, isto é, um índice de correlação próximo de 1, obtendo-se o gráfico da figura 4.
A partir dos resultados obtidos, é possível comparar os parâmetros cinéticos da hidrólise de sacarose
pelo enzima invertase de células Saccharomyces bayanus por uma técnica de enzima livre e imobilizada.
Neste trabalho não foram utilizados quaisquer métodos de imobilização.

Tabela 4. Absorvância medida a 540 nm do
produto obtido, para cada concentração,
durante 7 min.

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 70 100

0 0 0 0 0 0 0
1 0,012 0,005 0,052 0,044 0,043 0,067
2 0,051 0,076 0,093 0,091 0,056 0,189
3 0,084 0,106 0,115 0,138 0,190 0,216
4 0,088 0,247 0,182 0,234 0,279 0,312
5 0,140 0,205 0,226 0,302 - 0,402
6 0,158 0,206 0,345 0,383 - 0,548
7 0,185 0,233 0,330 0,386 0,513 0,623



Tabela 5. Concentração (g/L) dos produtos
obtidos.


A partir da figura 4, concentração de produto (g/L) em função do tempo (min), é possível calcular as
velocidades inicias (Vo) da reação para cada concentração de sacarose, correspondente ao declive de
cada reta.
Os cálculos realizados para a obtenção das concentrações dos açúcares redutores ([Produto]) –
Figura 4 e velocidades iniciais (Vo) encontram-se em anexo (Anexo II).
No caso em estudo, apenas acompanhamos o momento inicial da reação, por isso, conseguimos
obter diretamente a velocidade inicial pelo declive. Como era espectável, para concentrações de
substrato maiores verificam-se valores de velocidade inicial mais elevados. A partir destes valores
aplicaram-se as linearizaçõesde Lineweaver-Burk, Hanes Woolf e Eadie Hofstee, de modo a obter os
parâmetros cinéticos KM e Vmáx.




Figura 4. Representação da concentração de Produto obtido (g/L) em função do tempo (min).




y = 0,044x
R² = 0,9812
y = 0,0644x
R² = 0,8327
y = 0,082x
R² = 0,9607
y = 0,0972x
R² = 0,9757
y = 0,1157x
R² = 0,9541
y = 0,1442x
R² = 0,9833
0,0
0,5
1,0
1,5
0 2 4 6 8
[
P
r
o
d
u
t
o
]

(
g
/
L
)
Tempo (min)
[Produto] vs Tempo
15 g/L
25 g/L
35 g/L
45 g/L
70 g/L
100 g/L
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 70 100

0 0 0 0 0 0 0
1 0,0202 0,0084 0,0875 0,0740 0,0723 0,1127
2 0,0858 0,1279 0,1565 0,1531 0,0942 0,3180
3 0,1413 0,1783 0,1935 0,2322 0,3197 0,3634
4 0,1480 0,4155 0,3062 0,3937 0,4694 0,5249
5 0,2355 0,3449 0,3802 0,5081 - 0,6763
6 0,2658 0,3466 0,5804 0,6443 - 0,9219
7 0,3112 0,3920 0,5552 0,6494 0,8631 1,0481

9
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Tabela 6. Velocidades iniciais (Vo) calculadas para cada concentração.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,044
25 0,064
35 0,082
45 0,097
70 0,116
100 0,144
É possível verificar que a velocidade inicial aumenta gradualmente com o aumento da concentração
de sacarose, uma vez que a reação segue a cinética de Michelis-Menten – Figura 4.

- Linearizações da equação de Michaelis-Menten
Admitindo uma cinética de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais para
diferentes concentrações de sacarose, é possível obter a constante de Michaelis-Menten (KM) e a
velocidade máxima (Vmáx). A equação de Michelis-Menten pode ser rearranjada em três linearizações,
para a determinação desses parâmetros, a linearização de Lineweaver-Burk, a linearização de Eadie
Hofstee e a linearização de Hanes-Woolf.

Tabela 7. Parâmetros das linearizações de Michaelis-Menten.
[Sacarose] (g/L) Vo 1/Vo 1/[S] Vo/[S] [S]/Vo
15 0,044 22,727 0,067 0,003 340,909
25 0,064 15,528 0,040 0,003 388,199
35 0,082 12,195 0,029 0,002 426,829
45 0,097 10,288 0,022 0,002 462,963
70 0,116 8,643 0,014 0,002 605,013
100 0,144 6,935 0,010 0,001 693,481


Tabela 8. Valores de KM, Vmax e linearizações obtidos.
Linearização KM (g/L) Vmáx (g/L.min) Equação Linearizações obtidas
Lineweaver-Burk 63,351 0,229
1

=
1
á
+

á []

y=276,05x + 4,3575
R
2
=0,9987
Eadie-Hofstee 63,431 0,230 = á −

[]

y=-63,431x + 0,2298
R
2
=0,9777
Hanes-Woolf 65,517 0.234

=

á
+
1
á
[]
y=4,2708x + 279,81
R
2
=0,9895
Média 64,100 0,231


Como se pode observar, com o aumento de concentração de substrato, os valores de
velocidade inicial vão aumentando e aproximam-se de Vmáx, o que demonstra a proximidade à
concentração de substrato saturante, que é quando o enzima se encontra totalmente complexada com
o substrato. Uma vez compreendida a cinética do enzima em células livres, faz agora sentido estudar o
enzima em células imobilizadas.
3.2. Trabalho 2 - Estudo da actividade da invertase imobilizada covalentemente a um
suporte inorgânico (sílica porosa)

A imobilização em sílica envolve a criação de ligações covalentes entre o enzima e os grupos reativos
do suporte originando biocatalizadores muito estáveis. Neste tipo de imobilização, a ligação pode inibir
o movimento do enzima e assim reduzir a sua atividade não permitindo mudanças conformacionais.

10
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
y = 0,0221x
R² = 0,835
y = 0,0325x
R² = 0,9386
y = 0,0478x
R² = 0,8819
y = 0,0584x
R² = 0,9801
y = 0,074x
R² = 0,9143
y = 0,0844x
R² = 0,9877
y = 0,1185x
R² = 0,9559
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
0 2 4 6 8 10
[
P
]
Tempo (min)
15 g/L
25 g/L
35 g/L
45 g/L
55 g/L
70 g/L
90 g/L
Tal como nos estudos anteriores, a imobilização do enzima em sílica permite analisar os efeitos de
transferência de massa envolvidos, permitindo a comparação com outro tipo de suporte.
Foram calculados os valores de velocidade inicial (tabela 11) e comparados com os obtidos
anteriormente (tabela 6), verificando-se que os mais elevados são os do enzima livre, tal como seria de
esperar, apesar das diferenças não serem muito acentuadas.
Para a obtenção de melhores resultados foram desprezadas algumas concentrações de sacarose, tais
como, a concentração de 80 g/L.

Tabela 9. Absorvâncias a 540nm do produto obtido para cada
concentração (a vermelho são pontos desprezados).

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 90

0 0 0 0 0 0 0 0
1 0,052 0,044 0,096 0,015 0,108 0,071 0,061
2 0,022 0,020 -0,003 0,045 0,113 0,099 0,075
3 0,032 0,049 0,014 0,087 0,180 0,135 0,188
4 0,035 0,066 0,060 0,070 0,196 0,219 0,359
5 0,076 0,092 0,119 0,196 0,198 0,276 0,406
10 0,135 0,21 0,289 0,348 0,417 0,485 0,668

Tabela 10. Concentração (g/L) dos produtos obtidos.

Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 90

0 0 0 0 0 0 0 0
1 0,087 0,074 0,162 0,025 0,182 0,119 0,059
2 0,037 0,034 -0,005 0,076 0,190 0,167 0,079
3 0,054 0,082 0,024 0,146 0,303 0,227 0,108
4 0,059 0,111 0,101 0,118 0,330 0,368 0,214
5 0,128 0,155 0,200 0,330 0,333 0,464 0,367
10 0,227 0,353 0,486 0,585 0,702 0,816 0,559


Os cálculos realizados para a obtenção das concentrações dos açúcares redutores (indicado
como produto) – Figura 5 e velocidades iniciais (Vo) encontram-se em anexo. (Anexo II)
Figura 5. Representação da concentração de produto (g/L) em função do tempo (min).

Tabela 11. Velocidades iniciais (Vo), calculadas para cada concentração.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,022
25 0,033
35 0,048
45 0,058
55 0,074
70 0,084
90 0,119


11
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
De modo a completar e corroborar os parâmetros cinéticos foram feitas as linearizções de
Michaelis-Menten.

- Linearizações da equação de Michaelis-Menten
Admitindo uma cinética de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais para
diferentes concentrações de sacarose, é possível calcular os parâmetros cinéticos (Vmáx e KM).

Tabela 12. Valores de KM e Vmáx obtidos.
Linearização KM (g/L) Vmáx /g/L.min) Equação Linearizações obtidas
Lineweaver-Burk 243,344 0,399
1

=
1
á
+

á []

y=663,19x + 2,1411
R
2
=0,9921
Eadie-Hofstee 38,782 0,123
= á −

[]

y=-195,62x + 0,3214
R
2
=0,2501
Hanes-Woolf 1413,243 2,425

=

á
+
1
á
[]
y=1,0075x + 709,38
R
2
=0,3085
Média 565,123 0,982 - -
.
Como se pode constatar o KM é bastante superior relativamente ao KM do trabalho 1, e isto
deve-se ao facto das ligações covalentes poderem alterar quimicamente o enzima, fazendo com que
este diminua a sua afinidade para com o substrato, no entanto, os resultados das linearizações foram
muito diferentes entre si, e por isso estes valores de KM poderão não ser fiáveis. O Vmáx exibe um valor
superior, porém seria de esperar um valor inferior, pois com a ligação covalente o enzima perde
atividade, no entanto, tal como os valores de KM, estes valores resultantes das linearizações também
são muito diferentes entre si, o que torna estes valores não muito credíveis.

Tabela 13. Velocidades iniciais do enzima livre.
Enzima Livre
[Sacarose] (g/L) Velocidades iniciais (g/L.min)
10 0,327
15 0,399
25 0,555
45 0,582
55 0,666
70 0,794
100 0,940

De acordo com os dados disponibilizados no protocolo para o enzima livre, determinaram-se a Vmáx e
o KM e, consequentemente, foi possível calcular a efetividade global para cada concentração de
substrato, bem como o fator de efetividade médio.
Para a obtenção de melhores resultados, excluiu-se a concentração de sacarose de 80 g/L, pois os
resultados obtidos laboratorialmente (do enzima em estudo) não foram os esperados. Para os cálculos
dos parâmetros das linearizações de Michaelis-Menten, procedeu-se tal como no trabalho nº 1,
obtendo-se os resultados da Tabela 14.


Tabela 14. Valores de KM e Vmáx obtidos para o enzima livre.
Linearização KM (g/L) Vmáx /g/L.min) Equação Linearizações
Lineweaver-Burk 19,184 0,937
1

=
1
á
+

á []

y= 20,473x+1,0672
R
2
= 0,9619
Eadie-Hofstee 20,883 0,980
= á −

[]

y = -20,883x + 0,9802
R
2
= 0,8
Hanes-Woolf 31,435 1,154

=

á
+
1
á
[]
y= 0,8662x + 27,229
R
2
= 0,9362

Em anexo apresentam-se os cálculos da velocidade cinética do enzima livre (Vcinético) e do factor de
efetividade global (ηglobal). Para os cálculos foram utilizados os valores de Vmáx e KM do enzima livre
obtidos por linearização de Lineweaver-Burk por se ter obtido um R
2
mais próximo de 1.

12
Tecnologia de Enzimas 2013/2014

Tabela 15. Valores de Vcinético (enzima livre) e Vobservado

(enzima em ligação covalente – equivalente à velocidade
inicial) utilizados para o cálculo do fator de efetividade.
[Sacarose] (g/L) Vcinético (g/L.min) Vobservado’ (g/L.min) ηglobal
10
0,411 0,024 0,059
15
0,530 0,036 0,068
25
0,605 0,043 0,071
45
0,657 0,063 0,096
55
0,695 0,082 0,118
100
0,735 0,094 0,127
ηglobal médio
0,099

A retenção de atividade (RA) é outro parâmetro que permite comparar a atividade, neste caso
velocidade máxima, do enzima livre com a do enzima imobilizado. Para tal, calculou-se a velocidade
cinética do enzima livre, através de valores de velocidade inicial e concentração de substrato fornecidos
no protocolo. Com os valores fornecidos foi também possível determinar o ηglobal, apresentando-se
todos os cálculos necessários no anexo (Anexo II).
A retenção de atividade é calculada através das velocidades máximas dos enzimas (livres e em
ligação covalente), sendo utilizado para ambas o valor obtido pelas linearizações de Lineweaver-Burk.

Retenção de atividade =
atividade inicial (ligação covalente)
atividade inicial (livre)
x 100% ↔ R. A =
0,399
0,937
x 100%
↔ R. A = 42,571 %

Então, a retenção de atividade é igual a 42,571%, este valor diz-nos que a atividade do enzima
imobilizada é 42,571% inferior à atividade do enzima livre.
O valor obtido para a retenção é superior ao esperado, uma vez que as condições reacionais de
imobilização poderiam desnaturar o enzima, alterando-o quimicamente e obstruindo o centro ativo e
por isso obter-se-ia um valor de RA mais baixo. Relativamente aos valores de ηglobal, verifica-se que a
média é um valor muito reduzido, o que permite concluir que se sentiram limitações difusionais.
3.3. Trabalho 3 - Estudo da atividade da invertase de células de Saccharomyces bayanus
imobilizadas em alginato de cálcio
A imobilização de biocatalizadores garante a retenção de atividade catalítica e a sua utilização
repetida ou contínua mas pode também alterar a sua atividade, pois irão existir outras interações além
da interação enzima-substrato, refletindo-se nos seus parâmetros cinéticos. Estas alterações podem
ocorrer devido a vários fatores, tais como, efeitos conformacionais e estereoquímicos, efeitos de
partição ou efeitos de transferência de massa ou difusão.
No caso em estudo, estão apenas a ser analisados os efeitos de transferência de massa, que provém
das resistências difusionais ao transporte do substrato até ao centro ativo da enzima e do produto para
o meio reacional. Foram então calculados os valores de velocidade inicial do enzima nas células
imobilizadas em alginato de cálcio, do mesmo modo que foram calculados para as células livres.

Tabela 16. Absorvâncias a 540nm do produto obtido para cada concentração.
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 80 90 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0,098 0,150 0,121 0,063 0,1315 0,099 0,039 0,046 0,145
6 0,096 0,194 0,257 0,207 0,414 0,298 0,235 0,088 0,365
9 0,193 0,520 0,345 0,361 0,637 0,49 0,44 0,215 0,633
12 0,223 0,624 0,433 0,53 0,897 0,737 0,62 0,376 0,908
15 0,323 0,853 0,553 0,688 1,1075 0,908 0,829 0,508 1,177



13
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
Tabela 17. Concentração (g/L) dos produtos obtidos.
Tempo
[Sacarose] (g/L)
15 25 35 45 55 70 80 90 100
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0,165 0,252 0,204 0,106 0,221 0,167 0,066 0,077 0,244
6 0,162 0,326 0,432 0,348 0,697 0,501 0,395 0,148 0,614
9 0,325 0,875 0,580 0,607 1,072 0,824 0,740 0,362 1,065
12 0,375 1,050 0,728 0,892 1,509 1,240 1,043 0,633 1,528
15 0,543 1,435 0,930 1,157 1,863 1,528 1,395 0,855 1,980




Figura 6. Representação da concentração de produto (g/L) em função do tempo (min).

Tabela 18. Velocidades iniciais (Vo), calculadas para cada concentração.
[Sacarose] (g/L) Velocidades Iniciais (g/L.min)
15 0,034
25 0,090
35 0,063
45 0,073
55 0,122
70 0,098
80 0,086
90 0,050
100 0,125
Seria de esperar uma diminuição das velocidades inicias neste trabalho, uma vez que as células
estavam imobilizadas com alginato, e o substrato teria de difundir através dos poros até chegar ao
enzima, havendo portanto, uma maior resistência do que se as células estivessem livres, e por isso a
velocidade inicial teria de ser inferior, mas tal não se verifica.
Comparando as velocidades iniciais do enzima nas células livres (tabela 6) e imobilizadas com
alginato (tabela 18) pode se observar que os valores oscilam muito, não podendo afirmar-se que existe
um padrão.





y = 0,0344x
R² = 0,9554
y = 0,0903x
R² = 0,9615
y = 0,0629x
R² = 0,9926
y = 0,0726x
R² = 0,9733
y = 0,1223x
R² = 0,9902
y = 0,0984x
R² = 0,981
y = 0,0862x
R² = 0,9584
y = 0,0501x
R² = 0,9158
y = 0,1253x
R² = 0,9825
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[
P
r
o
d
u
t
o
]

(
g
/
L
)
Tempo (min)
[Produto] vs Tempo
15 g/L 25 g/L 35 g/L 45 g/L 55 g/L 70 g/L 80 g/L 90 g/L 100 g/L

14
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
- Linearizações da equação de Michaelis-Menten
Admitindo uma cinetica de Michaelis-Menten e correlacionando as velocidades iniciais
para diferentes concentracoes de sacarose, e possivel calcular os parametros cineticos (Vmax e KM).

Tabela 19. Valores de KM, Vmáx e linearizações obtidos.
Linearização KM (g/L) Vmáx (g/L.min) Equação Linearizações
Lineweaver-Burk 62,105 0,176
1

=
1
á
+

á []

y=352,74x + 5,6797
R
2
=0,9852
Eadie-Hofstee 60,872 0,176
= á −

[]

y=-60,872x + 0,1757
R
2
=0,7224
Hanes-Woolf 76,382 0,198
= á −

[]

y=5,0416x + 385,09
R
2
=0,8111
Média 66,453 0,183 - -

Sendo o KM um fator de afinidade, o seu aumento relativamente ao do enzima livre era de
esperar, uma vez que a imobilização das células leva a uma diminuição de afinidade do enzima para com
o substrato, no entanto este aumento foi pouco acentuado (de 64,100 para 66,453).
O valor de Vmáx é menor, o que nos indica que o enzima irá converter o substrato em produto
mais devagar, embora no caso do alginato, a diferença não seja muito significativa. Posto isto, faz
sentido calcular o fator de efetividade externo e interno, visto estarmos na presença de efeitos
difusionais externos e internos que podem afetar diretamente a velocidade e cuja influência deve ser
estimada em separado (anexo II). Uma vez determinada a influência de cada um, estima-se o fator de
efetividade global, através do produto destes dois fatores.
Quando este fator está próximo de 1 significa que as limitações difusionais são poucos sentidas
e quando está próximo de 0 quer dizer as limitações difusionais são muito sentidas, e neste caso, sendo
que os valores de ηexterno e ηinterno estão muito próximos de 0, mostra como as resistências externas
e internas são ambas muito sentidas. Todos os cálculos necessários para a elaboração da tabela seguinte
encontram-se no anexo II.


Tabela 20. Valores obtidos para Vobs’ (a velocidade observada’ corresponde a velocidade inicial (Vo)), velocidade
cinetica (Vcinética), factor de efectividade externo, interno e global (ηexterno, ηinterno, ηglobal), concentracoes de
substrato a superficie da matriz (SS) e à superficie dos poros da matriz (Ss’).
[sacarose]
g/L
Vobservado
(g/L.min)
Vcinético
(g/L.min)
ηexterno ηinterno ηglobal Ss
(g/L)
Ss’ (g/L) ηglobal*
15 0,005 0,034 0,150 0,180 0,027 1,888 15,345 1,019
25 0,008 0,050 0,160 0,150 0,024 3,039 64,475 1,801
35 0,013 0,063 0,200 0,170 0,034 4,925 34,697 0,994
45 0,019 0,074 0,250 0,185 0,046 7,461 43,554 0,981
55 0,023 0,083 0,280 0,187 0,052 9,650 133,080 1,473
70 0,028 0,094 0,300 0,190 0,057 12,087 76,956 1,046
80 0,032 0,100 0,320 0,193 0,062 14,077 58,951 0,861
90 0,035 0,105 0,330 0,195 0,064 15,571 24,982 0,475
100 0,037 0,110 0,340 0,200 0,068 17,058 143,388 1,137
Média 0,048
* - calculado sem ter em conta limitações difusionais.

Tabela 21. Parâmetros das linearizações de Michaelis-Menten.
[Sacarose] (g/L) Vo 1/Vo 1/[S] Vo/[S] [S]/Vo
15 0,034 29,070 0,067 0,002 436,047
35 0,063 15,898 0,029 0,002 556,439
45 0,073 13,774 0,022 0,002 619,835
70 0,098 10,163 0,014 0,001 711,382
80 0,086 11,601 0,013 0,001 928,074
100 0,125 7,981 0,010 0,001 798,085


15
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
O fator de efetividade global pode ainda ser calculado pela divisão da velocidade observada´
(velocidade inicial) pela velocidade cinética, não tendo em conta os parâmetros difusionais reais
presentes no ambiente, que revelaram valores de ηglobal mais elevados do que quando se teve em
conta os parâmetros difusionais.
Relativamente às concentrações de substrato à superfície da matriz (Ss) e à superfície dos poros
da matriz (Ss´), verifica-se que valores obtidos não foram os esperados. Os valores de Ss´ deveriam ser
inferiores ou iguais aos valores de Ss, que por sua vez seriam inferiores aos de SB. Isto porque, a
concentração de substrato está dependente das limitações difusionais externas até atingir a superfície
da matriz e ao atravessar os poros desta, ficará exposta às limitações internas até conseguir por fim
atingir o centro ativo.
4. Conclusão
Em suma, observando os valores de Vo, nota-se que estes aumentam com a concentração.
Ao ser imobilizado, o enzima vai influenciar a velocidade máxima da reacção que catalisa,
alterando também a afinidade da enzima para com o substrato.
O método que permite ao enzima ter uma maior afinidade é o método de enzima livre, uma vez
que o Km nesta experiência é o mais baixo (23,834 g/L), ao passo que o método ao qual se atribui uma
maior velocidade máxima é o método do enzima livre também (1,024 g/L.min). Concluiu-se, assim, que
os resultados obtidos não estão de acordo com o esperado provavelmente devido a variações de
temperatura nos vários ensaios ou a imprecisão na execução do protocolo.
Para o enzima imobilizado em sílica, o fator de efetividade média foi de 0,099 devido a
possíveis alterações estruturais da enzima que consequentemente alteram a velocidade de conversão
de substrato, como foi demonstrado também pela baixa retenção de atividade (42,571%).
Não é possível comparar os valores de Km do enzima imobilizado em sílica (565,123 g/L) e em
alginato de cálcio (66,453 g/L), uma vez que o valor de Km do enzima imobilizado em sílica pode não ser
fiável. Seria de esperar que a imobilização em alginato de cálcio apresentasse uma maior afinidade do
enzima ao substrato, devendo ser este o método que apresenta menores limitações difusionais, quando
comparado com o método da sílica porosa; uma vez que, quando o biocatalisador é imobilizado em
silica porosa, perde grande parte da sua actividade, por sua vez, quando é imobilizado em alginato de
cálcio, este tem grandes limitações difusionais, logo não nos é possível concluir qual é o melhor método
de imobilização.

Tabela 22. Comparação dos parâmetros cinéticos obtidos para as quatro condições de trabalho.
Condições KM (g/L) Vmáx (g/L.min) Retenção de actividade (%)
Células livres 64,100 0,231 -
Enzima imobilizado covalentemente 565,123 0,982 42,571 *
Células imobilizadas em alginato de cálcio 66,453 0,183 -
Enzima livre 23,834 1,024 -
*Em relação ao enzima livre
Conclusion
In short, looking at the values of Vo, it shows that these increase with the concentration.
When immobilized, the enzyme will influence the maximum rate of reaction that catalyzes also
altering the affinity of enzyme towards the substrate.
The free enzyme method allows a higher affinity of enzyme-substrate, since the Km in this
experiment is lower (23.834 g/ L), whereas the method which is assigned a higher maximum speed is
also the method of free enzyme (1.024 g / L.min). Thus it was concluded that the results are not as
expected probably due to temperature variations in the various tests or imprecision in the execution of
the protocol.
For the enzyme immobilized on silica, the average effectiveness factor was 0.099 due to
possible structural changes of the enzyme that consequently alter the rate of conversion of substrate, as
was demonstrated by the low retention of activity (42.571 % ).

16
Tecnologia de Enzimas 2013/2014
It is not possible to compare the Km values of the enzyme immobilized on silica ( 565.123 g / L)
and calcium alginate (66.453 g/L) , since the Km value of the enzyme immobilized on silica could be
unreliable. It would be expected that the immobilization in calcium alginate would present a greater
affinity to the substrate and, therefore, it should be the method that has lower diffusional limitations
compared to the method of the porous silica; since, when the biocatalyst is immobilized on porous
silica, loses much of its activity, in turn, when it’s immobilized in calcium alginate, this has large
diffusional limitations, then we cannot conclude which is the best method of immobilization .

Table 22. Comparison of the kinetic parameters obtained for the four conditions.
Conditions KM (g/L) Vmáx (g/L.min) Retention of activity (%)
Free cells 64,100 0,231 -
Covalently immobilized enzyme 565,123 0,982 42,571 *
Cells immobilized in calcium alginate 66,453 0,183 -
Free enzyme 23,834 1,024 -
* Compared to the free enzyme.

5. Bibliografia

1
D.L. Nelson, M. M. Cox. “Enzymes” in Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman, 4th ed.,
2004, 190-192.
2
K. E. Jaeger, T. Eggert. “Enantioselective biocatalysis optimized by directed evolution”, Current opinion
in Biotechnology, 15, 2004, 305-313.
3
N. P. Neumann, J. O. Lampen. “Purification and Properties of yeast invertase”, Biochemistry, 6, 1967,
468-475.
4
M. J. T. Carrondo, A. C. A. Roque, R. Branco. Guia de trabalhos laboratoriais – Tecnologia de Enzimas,
2013-2014.
5
G. L. Miller. “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars”, Analitic
Chemistry, 31, 1959, 426-428.
6
S. Datta, et al. “Enzyme immobilization: an overview on techniques and support materials”, 3 Biotech,
3, 2013, 1-9.
7
C. L. Cardoso, et al. “Imobilização de enzimas em suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca
por substâncias bioactivas”, Química Nova, 32, 2009, 175-187.
8
M. D. Trevan. “Enzyme immobilization by covalent bonding”, Biological Sciences, 3, 1988, 495-510.
9
O. Smidsrød, et al. “Alginate as immobilization matrix for cells”, Trends in Biotechnology, 8, 1990, 71-
78.









17
Tecnologia de Enzimas 2013/2014


6. Apêndice
6.1. Anexo I – Velocidade inicial (Vo) e constantes cinéticas – Trabalhos 1, 2 e 3.
Para ser possível calcular a velocidade inicial e, consequentemente, o KM e Vmáx, recorreu-se a uma
reta de calibração e à lei de Lambert-Beer onde se calculou a concentração do produto da hidrólise de
sacarose.
Tabela 23. Concentrações de sacarose (g/l) e absorvância medida a 540 nm para a realizacão da recta de calibração
Concentração (g/L) Abs 540 nm
0 0
0,1 0,046
0,2 0,109
0,3 0,162
0,4 0,223
0,5 0,288
0,6 0,341
0,7 0,447
0,8 0,496
0,9 0,561
1,0 0,561


Figura 7. Reta de calibração.

6.2. Anexo II

- Exemplo do cálculo da concentração do produto de hidrólise:

[Sacarose] (g/L) Absorvância 540 nm Tempo (min)
15 0.045 3

Lei de Lambert-Beer: A=b ε c A – Absorvância (y).
B – Distância que a luz atravessa pela célula.
ε - Absortividade molar.
C – Concentração (x).

Recta de calibração: y = 0.5944x, então: 0,045 = 0,5944 x ↔ x = 0,076 g/L

y = 0,5944x
R² = 0,9897
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
A
b
s

5
4
0

n
m
Cocncentração (g/L)

18
Tecnologia de Enzimas 2013/2014

A velocidade inicial (Vo) é calculada através do gráfico da concentração do produto (g/L) em função
do tempo, sendo este valor o do declive da reta.

Cálculos da velocidade cinética (Vcinético) e do fator de efetividade (ηglobal) - Trabalhos 2 e 3.

Após a realização das linearizações de Michaelis-Menten e, consequentemente, da obtenção da
velocidade máxima, é possível calcular a velocidade cinética da enzima livre e o fator de efetividade com
as seguintes fórmulas:

Vcinético =
Vmax ∗ [sacarose]
Km + [sacarose]
ηglobal =
Vobservado
Vcinético

Vmáx e KM – relativo à enzima livre.
Vobservado – relativo à velocidade inicial (Vo) da enzima em ligação covalente

- Exemplo do cálculo da velocidade cinética e do factor de seletividade:

Vmax (g/L.min) KM (g/L) [Sacarose] (g/L) Vcinético (g/L.min)
0.937 19.184 10 0.04


Vcinético =
Vmax∗[sacarose]
Km+[sacarose]
↔Vcinético =
0,937 x 10
19,184+10
↔Vcinético = 0,321g/L. min

ηglobal =
Vobservado
Vcinético
↔ ηglobal =
0,04
0,321
↔ ηglobal = 0,123


- Cálculos dos factores de efectividade (externo, interno e global) e das concentrações de
substrato a superfície dos poros da matriz e a superfície da matriz (tabela 20) – Trabalho nº 3

Vmax (g/L.min) Km (g/L) [Sacarose] (g/L) Vobservado’ (g/L.min)
0,198 76,382 15 0,005

Vobservado

=
Vmaxi∗Ss′
Kmi+Ss′
↔ 0,005 =
0,198∗Ss′
76,382+Ss′
↔ Ss

= 1,978 g/L

Vmaxi – Velocidade máxima da enzima imobilizada (g/L.min).
Kmi – Constante de Michaelis-Menten da enzima imobilizada (g/L).
Vobservado’ – Velocidade inicial (Vo) (g/L.min).
Ss’ – Concentração do susbtrato à superfície dos poros da matriz (g/L).

Dados fornecidos no protocolo:
Porosidade interna: 0,3
Tortuosidade: 3
Difusividade do substrato: 3x10-10m2/s
Coeficiente de transferência de massa do substrato: 2x10-7m/s

Modulo do substrato: μ =
Vmaxi /Kmi
Kl∗a

Area a superficial da particula (particulas esfericas): =
6
Dp

Concentracao do substrato adimensional: Bb =
SB
Km i


Vmaxi – velocidade maxima da enzima imobilizada;
Kmi – Constante de Michaelis- Mentem;
KL- Coeficiente de transferencia de massa;
Dp – Diametro da particula;
SB – Concentracao de sacarose (g/L).


19
Tecnologia de Enzimas 2013/2014


Tabela 24. Valores dos diversos parâmetros para o cálculo do factor de efetividade externo
[sacarose] (g/L) Diametro da particula (m) a Bb µ
15 0,003 2000,000 0,226 6,898
25 0,004 1363,636 0,376 10,118
35 0,004 1500,000 0,527 9,198
45 0,004 1500,000 0,677 9,198
55 0,004 1500,000 0,828 9,198
70 0,004 1500,000 1,053 9,198
80 0,004 1500,000 1,204 9,198
90 0,004 1500,000 1,354 9,198
100 0,004 1500,000 1,505 9,198

Para se calcular o valor do fator de efetividade externo utilizou-seo gráfico representado na figura 8.
(f(Bb,µ))

Figura 8 . Factor de efetividade externo em função do módulo do substrato. As linhas correspondem à
concentração adimensional do substrato.


- Concentração do substrato à superfície da matriz (Ss)

A concentração de substrato é calculada através da velocidade observada (Vobservda) pela seguinte
fórmula:

Vobservado =
Vmaxi x Ss
Kmi + Ss
= Vcinético x ηexterno

D – Difusidade do substrato.
– Porosidade interna;
ζ - Tortuosidade;
L – raio do suporte (particula);
Ss – concentracao do substrato a superficie da matriz.

Factor de efectividade interno (ηinterno):
Difusidade efetiva: De = D x

ξ

Modulo de Thiele: ϕ = √
Vmaxi
Kmi x De


=

Tabela 25. Valores dos diversos parâmetros para o calculo do fator de efetividade externo.
[Sacarose] (g/L) Ss (g/L) L (m) ф B’ De

20
Tecnologia de Enzimas 2013/2014

15 1,888 0,0015 14,386 35,201



3E-11

25 3,039 0,002 21,099 21,863
35 4,925 0,002 19,181 13,493
45 7,461 0,002 19,181 8,907
55 9,650 0,002 19,181 6,887
70 12,087 0,002 19,181 5,498
80 14,077 0,002 19,181 4,721
90 15,571 0,002 19,181 4,268
100 17,058 0,002 19,181 3,896

Para se calcular o fator de efetividade interno utilizou-se o gráfico representado na figura 9. Fator de
efetividade interno (ηinterno): f (B’, Φ)


Figura 9. Fator de efetividade interno em função do módulo de Thiele. As linhas correspondem ao β’.

- Cálculo da concentração do substrato à superfície dos poros da matriz (Ss)

A partir dos valores obtidos do fator de efetividade interno calculou-se a velocidade observada’
e consequentemente a concentração do substrato a superfície dos poros da matriz.

η interno =
Vobservado′
Vobservado
Vobservado =
Vmaxi x Ss′
Kmi+ Ss′